Functional genomic analysis of the Drosophila immune response

Functional genomic analysis of the Drosophila immune response

Accepted Manuscript Functional genomic analysis of the Drosophila immune response Susanna Valanne PII: DOI: Reference: S0145-305X(13)00134-1 http://d...

831KB Sizes 4 Downloads 120 Views

Accepted Manuscript Functional genomic analysis of the Drosophila immune response Susanna Valanne PII: DOI: Reference:

S0145-305X(13)00134-1 http://dx.doi.org/10.1016/j.dci.2013.05.007 DCI 1954

To appear in:

Developmental & Comparative Immunology

Please cite this article as: Valanne, S., Functional genomic analysis of the Drosophila immune response, Developmental & Comparative Immunology (2013), doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.dci.2013.05.007

This is a PDF file of an unedited manuscript that has been accepted for publication. As a service to our customers we are providing this early version of the manuscript. The manuscript will undergo copyediting, typesetting, and review of the resulting proof before it is published in its final form. Please note that during the production process errors may be discovered which could affect the content, and all legal disclaimers that apply to the journal pertain.

Functional genomic analysis of the Drosophila immune response  Susanna Valanne1    1

 Institute of Biomedical Technology and BioMediTech, Tampere University, 33520 Tampere, Finland. 

[email protected] , tel. +35840 1909728.      Abstract    Drosophila melanogaster has been widely used as a model organism for over a century now, and also as an  immunological  research  model  for  over  20  years.  With  the  emergence  of  RNA  interference  (RNAi)  in  Drosophila as a robust tool to silence genes of interest, large‐scale or genome‐wide functional analysis has  become a popular way of studying the Drosophila immune response in cell culture. Drosophila immunity is  composed of cellular and  humoral  immunity mechanisms, and  especially the systemic, humoral response  pathways  have  been  extensively  dissected  using  the  functional  genomic  approach.  Although  most  components  of  the  main  immune  pathways  had  already  been  found  using  traditional  genetic  screening  techniques,  important  findings  including  pathway  components,  positive  and  negative  regulators  and  modifiers  have  been  made  with  RNAi  screening.  Additionally,  RNAi  screening  has  produced  new  information on host‐pathogen interactions related to the pathogenesis of many microbial species. 

  Keywords  Drosophila;  immune  response;  RNA  interference;  host‐pathogen  interactions;  NF‐kappaB  signaling;  JAK/STAT signaling    Abbreviations  RNAi,  RNA  interference;  AMP,  antimicrobial  peptide;  imd,  immune  deficiency;  Jak‐STAT  pathway,  Janus  kinase ‐ Signal Transducer and Activator of Transcription pathway; dsRNA, double‐stranded RNA; RNAi, RNA  interference; siRNA, small interfering RNA; TLR, Toll‐Like Receptor; I B, Inhibitor of  B; PGRP, peptidoglycan  recognition protein; UAS, upstream activating sequence   

1   

Contents  Abstract  Introduction  1. RNAi methodology for large‐scale screening   2. Functional analysis of the Drosophila immune response  2.1. Drosophila cellular response  2.1.1. Phagocytosis  2.2. Drosophila humoral immune response  2.2.1. Drosophila Imd pathway  2.2.2. Drosophila Toll pathway  2.2.3. Drosophila JAK/STAT pathway  2.2.4. Drosophila RNAi pathway  2.3. RNAi screening in Drosophila as a tool to study host‐pathogen interactions  3. Concluding remarks  Acknowledgements  Conflict of Interest  References

2   

  Introduction    The fruitfly, Drosophila melanogaster, has been successfully used as a model organism for over a hundred  years  now.  As  invertebrates  flies  are  ethically  ideal  for  use  in  research.  Possibilities  for  genetically  manipulating them are excellent, and many sophisticated and powerful tools for fly research are available.  Importantly,  many  biological  processes  are  conserved  between  flies  and  vertebrates.  Drosophila  is  a  remarkable  tool  for  making  large  genetic  mutation  screens  (St  Johnston,  2002),  but  it  is  also  increasingly  used in high‐throughput RNAi screening for functional genomic analyses (Valanne et al., 2012).     Insects and microbes partially share the same environment, since insects, including Drosophila, often feed  on rotting fruit containing a rich collection of microorganisms. As a result, Drosophila has evolved sensitive  mechanisms  for  pathogen  recognition  and  many  strategies  to  defend  itself  against  bacteria,  fungi,  parasites,  and  viruses  (Lemaitre  and  Hoffmann,  2007).  To  combat  infection  Drosophila  relies  on  several  innate  immunity  reactions,  many  of  which  are  shared  with  higher  organisms.  Therefore,  Drosophila  was  developed  as  a  model  system  to  study  innate  immunity  in  the  early  1990s,  e.g.  (Kylsten  et  al.,  1990,  Samakovlis et al., 1991, Wicker et al., 1990, Reichhart et al., 1992). Work on insects and other invertebrates  has  played  an  important  role  in  understanding  innate  immune  mechanisms  in  general  (Hultmark,  1993,  Hultmark,  1994,  Hultmark,  2003,  Lemaitre  and  Hoffmann,  2007).  Drosophila  lacks  the  adaptive  immune  response.  This too makes it a good model for innate immunity studies, since results are easier to interpret.    1. RNAi methodology for large‐scale screening    RNA interference (RNAi) is an ancient gene silencing mechanism for host defense against invading genetic  material.  In  1998  future  Nobel  laureates  Fire  and  Mello  (Fire  et  al.,  1998)  showed  that  target  gene  expression  is  silenced  in  Caenorhabditis  elegans  by  the  RNAi  mechanism.  Soon  it  became  clear  that  this  phenomenon is a very useful tool in research. And when it was shown that RNAi works efficiently also in  Drosophila  (Hammond  et  al.,  2000),  large  scale  gene  silencing  applications  for  Drosophila  cells  were  developed (Rämet et al., 2002, Lum et al., 2003, Kiger et al., 2003, Boutros et al., 2004). Drosophila cells are  optimal for large‐scale screening, because they can bind and internalize long double‐stranded RNA (dsRNA)  fragments  through  receptor‐mediated  endocytosis  (Saleh  et  al.,  2006,  Ulvila  et  al.,  2006),  reviewed  in  (Valanne et al., 2012). Long dsRNA fragments are then diced into small interfering RNA (siRNA) fragments  inside the cell by its intact RNAi machinery. siRNA fragments result in silencing of the gene in a sequence‐ specific  way.  Although  off‐target  effects  have  been  shown  for  short  homology  stretches  (Kulkarni  et  al., 

3   

2006,  Ma  et  al.,  2006),  the  silencing  effect  can  be  totally  specific  as  shown  for  a  chitinase‐like  protein  CG5210 in a microarray (Kleino et al., 2005, Fig. 1A). A schematic drawing of RNAi screening in Drosophila  cells is shown in Figure 1.    In  the  past  few  years  RNAi  screening  in  Drosophila  in  vivo  has  also  become  widely  used  because  of  the  availability of many RNAi fly line collections, such as the Vienna collection in Austria (Dietzl et al., 2007), the  collection  in  the  National  Institute  of  Genetics  Fly  Stock  Center,  Kyoto,  Japan  and  the  TRiP  collections  in  Harvard,  USA  (Ni  et  al.,  2008,  Ni  et  al.,  2011).  Drosophila  in  vivo  RNAi  is  based  on  the  binary  UAS‐GAL4  system (Brand and Perrimon, 1993), adapted from yeast. With this approach, a single cross between flies  carrying an Upstream Activating Sequence coupled to a transgene of choice (UAS‐Gene X) and flies carrying  a tissue‐specific GAL4 driver, results in the overexpression of the transgene in the chosen tissue in the F1  progeny flies (Brand and Perrimon, 1993, Duffy, 2002). RNAi lines contain an inverted repeat sequence of  the  targeted  gene  under  the  UAS,  so  overexpression  of  that  sequence  results  in  silencing  of  the  corresponding gene in the tissue where GAL4 is expressed. Gene silencing with this method is usually very  effective  and  RNAi  phenotypes  compare  well  with  chromosomal  mutations  (Dietzl  et  al.,  2007,  Ni  et  al.,  2008, Ni et al., 2011).    The  original  method  for  generating  UAS‐driven  RNAi  fly  line  collections  was  to  insert  a  UAS‐construct  containing  the  inverted  repeat  sequence  of  the  targeted  gene  into  the  fly  genome  randomly  using  P‐ element‐mediated transformation (Dietzl et al., 2007). However, this sometimes resulted in false negatives  due  to  variable  expression  because  of  the  random  landing  site  of  the  RNAi  hairpin  construct.  Therefore,  improvements  were  made  to  the  second  generation  of  RNAi  lines  by  cloning  the  RNAi  constructs  into  a  vector  with  a  phiC31  site  for  site‐specific  integration  into  the  Drosophila  genome  (Ni  et  al.,  2008).  The  biggest  advantage  of  this  method  is  that  the  random  integration  of  the  RNAi  construct  into  poorly  expressed  loci  is  eliminated  and  the  construct  is  inserted  into  an  optimal  target  site  (Ni  et  al.,  2008).  Furthermore, in 2011, a growing resource of Drosophila RNAi lines with constructs specifically tested to be  effective  in  the  female  germline  was  published.  In  these  Drosophila  lines  silencing  is  generated  using  articifial micro‐RNAs, so‐called short hairpin (sh)RNAs (Ni et al., 2011).    With additional tools, such as the temperature‐specific allele of the GAL4 repressor GAL80 or the hormone‐ inducible  GAL4‐progesterone  receptor  chimera,  RNAi  silencing  can  be  spatially  or  temporally  controlled  (McGuire  et  al.,  2004).  Turning  on  the  UAS‐GAL4  system  for  gene  silencing  at  a  chosen  time  overcomes  lethality issues of silencing genes essential for development. Moreover, tissue‐specific silencing is possible  using a vast collection of GAL4 lines with differing expression patterns, meaning that genes can be silenced 

4   

e.g.  only  in  immune  tissues  such  as  the  fatbody  or  hemocytes.  This  way  the  silencing  effects  in  other  tissues, where the gene of interest may have a non‐immune role, can be avoided.  A schematic drawing of Drosophila in vivo screening is shown in Figure 1.     2. Functional analysis of the Drosophila immune response    Most Drosophila immune response genes had been found in mutation screens before the RNAi screening  era, e.g. the Toll‐Dorsal pathway core components (Belvin & Anderson, 1996), imd (Lemaitre et al., 1995),  DIF (Rutschmann et al., 2000a) and IKK gamma (Rutschmann et al., 2000b). However, when RNAi became  available, allowing individual genes to be easily knocked down in cell culture systems or whole organisms to  identify genes related to loss‐of‐function genotypes, this reverse genetics method was also applied to the  search  for  immune related genes. The first such screen  was  a phagocytosis  screen, which  resulted  in  the  identification  of  the  Imd  pathway  receptor  peptidoglycan  recognition  protein  LC  (PGRP‐LC;  Rämet  et  al.,  2002). Thereafter, this functional analysis approach has been utilized extensively to find new components  of  many  immune‐related  mechanisms  in  Drosophila.  The  main  findings  from  Drosophila  RNAi  screens  regarding immunological mechanisms are summarized in Table I. To combat infections Drosophila relies on  cellular and humoral immune responses. Both these mechanisms are important, and the balance between  them depends on the invading pathogen (Nehme et al., 2011).    2.1. Drosophila cellular response    Drosophila lacks a closed circulatory system, and the hemolymph i.e. the Drosophila blood, floats freely in  its  body  cavity.  Drosophila  blood  cells,  or  hemocytes,  are  present  in  the  hemolymph  ready  to  combat  infections  and  participate  in  wound  healing.  There  are  three  classes  of  hemocytes  in  Drosophila:  plasmatocytes,  lamellocytes  and  crystal  cells.  Plasmatocytes  are  professional  phagocytes  and  make  up  about  95%  of  the  hemocytes  in  a  healthy  Drosophila  larva,  and  the  remaining  5%  is  composed  of  crystal  cells  that  are  responsible  for  melanization  and  wound  repair  (Williams,  2007).  Cells  of  the  third  class,  lamellocytes,  are  not  present  in  a  healthy  animal,  but  are  induced  by  for  example  the  parasitic  wasp,  Leptopilina  boulardi  (Williams  et  al.,  2005).  The  most  important  mechanisms  of  the  Drosophila  cellular  response are phagocytosis and encapsulation, of which the former has been substantially analyzed by RNAi  screening.    2.1.1. Phagocytosis   

5   

Phagocytosis probably originates from the engulfment of nutrients by unicellular organisms, and it is one of  the oldest forms of host defense (reviewed in (Ulvila et al., 2011)). In Drosophila, the phagocytic activity of  plasmatocytes  has  been  shown  to  be  important  for  immunity,  although  antimicrobial  peptides  (AMPs)  produced  via  NF‐ B  signaling  pathways  play  a  much  more  prominent  role.  Also,  communication  between  Drosophila  phagocytes  and  the  fatbody  tissue,  which  is  involved  in  AMP  production,  has  been  shown  at  least  in  larval  stages  (Basset  et  al.,  2000,  Brennan  et  al.,  2007,  Charroux  and  Royet,  2009,  Defaye  et  al.,  2009),  reviewed  in  (Ulvila  et  al.,  2011).  Drosophila  can  be  used  as  a  phagocytosis  model,  because  phagocytic  mechanisms  have  been  well  conserved  in  evolution.  Moreover,  Drosophila  S2  cells  are  well  suited for phagocytosis RNAi screening:  Firstly, they recognize and engulf bacteria in a manner comparable  to plasmatocytes (Rämet  et  al.,  2001) and  secondly,  they  internalize dsRNA  directly  from the  cell culture  medium via receptor‐mediated endocytosis (Ulvila et al., 2006). The genes important for the phagocytosis  of  several  different  micro‐organisms,  such  as  Escherichia  coli  (Rämet  et  al.,  2002,  Ulvila  et  al.,  2011),  mycobacteria  (Philips  et  al.,  2005),  Listeria  monocytogenes  (Agaisse  et  al.,  2005),  Candida  albicans  (Stroschein‐Stevenson et al., 2006) and Leishmania donovani (Peltan et al., 2012) have been screened for in  Drosophila cells. The identified genes include microbe‐specific host factors (reviewed in section 2.3.) as well  as  components  needed  for  general  phagocytic  mechanisms,  including  mainly  actin‐related  proteins  and  genes important for endocytosis and intracellular vesicle trafficking (reviewed in (Ulvila et al., 2011)).    2.2. Drosophila humoral immune response    Microbes that manage to escape local and cellular defenses are faced with the humoral immune response,  which  includes  the expression of  a spectrum  of antimicrobial  peptides  (AMPs). At least 34 AMPs  in  eight  families  have  been  found  in  Drosophila  (Hultmark,  2003).  AMPs  are  produced  mostly  in  the  fatbody,  the  functional  equivalent  of  the  human  liver,  and  thereafter  secreted  into  the  hemolymph,  the  insect  blood.  They  can  act  on  invading  micro‐organisms  in  various  ways,  for  example  by  permeabilizing  and  disrupting  the  microbial  cell  membranes.  AMPs  can  be  broad  spectrum  effectors  such  as  cecropins  that  kill  both  Gram‐negative  and  Gram‐positive  bacteria  and  also  fungi.  Other  AMPs  such  as  diptericins,  attacins  and  drosomycin, are more specialized (Hultmark, 2003). Two highly conserved pathways, namely the Toll and  Imd pathways, control these responses by initiating the activation of NF‐ B‐like transcription factors and the  subsequent  transcription  of  AMPs  (reviewed  in  (Valanne  et  al.,  2012)).  Also  the  JAK/STAT  pathway  regulates  some  immune  response  genes  whose  functions  are  still  unclear.  In  anti‐viral  defense,  the  Drosophila RNAi pathway is an important humoral immunity mechanism.    2.2.1.  Drosophila Imd pathway 

6   

  The Drosophila Imd pathway is a dedicated signaling pathway for generating a systemic immune response  against  invading  micro‐organisms.  Initially,  the  pathway’s  key  component,  imd,  was  found  by  analyzing  a  Black cell mutant fly line, whose ability to express AMPs was shown to be severely compromised. Further  analysis revealed a mutation independent of the black cell phenotype in a nearby gene that turned out to  be imd (immune deficiency) (Lemaitre et al., 1995). For a number of years the pathway receptor remained  unknown until in 2002 PGRP‐LC was identified by three groups at the same time (Choe et al., 2002, Gottar  et  al.,  2002,  Rämet  et  al.,  2002).  The  study  by  Rämet  et  al.  (2002)  was  the  first  large‐scale  RNAi  screen  carried out in Drosophila S2 cells, and it immediately showed the power of this screening approach. Upon  binding a DAP‐type peptidoglycan PGRP‐LC receptors dimerize and the pathway is activated (Kaneko et al.,  2004, Leulier et al., 2003). Another peptidoglycan recognition protein, namely  PGRP‐LE, has also a role in  binding peptidoglycan (Kaneko et al., 2006, Lim et al., 2006, Takehana et al., 2004), especially in the gut, as  was shown recently (Bosco‐Drayon et al., 2012, Neyen et al., 2012). Activation of the pathway leads to the  binding  of  Imd,  which  recruits  Fas‐associated  death  domain  (FADD),  and  FADD  in  turn  recruits  a  caspase  called  death‐related  ced‐3/Nedd2‐like  protein  (Dredd)  into  the  complex.  The  signal  propagates  in  a  sequential way ultimately resulting in the activation and nuclear translocation of the NF‐ B factor Relish and  the transcription of immune effector genes, as reviewed in (Valanne et al., 2012)).     The  importance  of  large‐scale  RNAi  screens  in  Drosophila  NF‐ B  signaling  research  has  been  reviewed  in  great detail recently (Valanne et al., 2012), and therefore this subject is described relatively briefly here. To  summarize the screens of recent years: The first large‐scale RNAi screen for Imd pathway components was  published  by  Foley  &  O’Farrell  (2004),  the  main  finding  of  which  was  the  identification  of  Dnr1  as  an  inhibitor  of  Dredd.  This  screen  was  soon  followed  by  two  screens,  both  of  which  identified  Inhibitor  of  apoptosis 2 (Iap2) and TAK1‐associated binding protein 2 (Tab2/TAB/CG7417) as essential components of  the  Imd  pathway  (Gesellchen  et  al.,  2005,  Kleino  et  al.,  2005).  Later  on,  based  on  the  Gesellchen  et  al.  (2005) screen, an evolutionarily conserved nuclear factor Akirin was identified as essential for the normal  function of the Imd pathway (Goto et al., 2008).     An RNAi screening approach has been taken to study also the negative regulation of the Imd pathway. In a  follow‐up  study  to  Gesellchen  et  al.  (2005)  it  was  shown  that  Ras/MAPK  signaling  attenuates  the  Imd  signaling response (Ragab et al., 2011) via Pirk, a negative regulator of the Imd pathway identified earlier  (Aggarwal  et  al.,  2008,  Kallio  et  al.,  2005,  Kleino  et  al.,  2008,  Lhocine  et  al.,  2008).  Ras/MAPK  signaling  downregulates  the  transcription  of  Pirk  when  activated  via  the  PDGF/VEGF  receptor  (PVR)(Ragab  et  al.,  2011). PVR has been shown to be a negative regulator of the Imd pathway also in the Kleino and coworkers’ 

7   

screen (2005) as well as in a screen for components of the JNK arm of the Imd pathway (Bond and Foley,  2009).  More  recently,  Myllymäki  and  Rämet  (2012)  demonstrated  that  another  Imd  pathway  inhibitor  identified  earlier  in  their  screen,  zfh1  (Kleino  et  al.,  2005),  acts  at  a  transcriptional  level  in  Drosophila  S2  cells and that its human homologue ZEB1 positively regulates TNFR signaling in HeLa cells (Myllymäki and  Rämet, 2012).  Of note, Pirk (CG15678) was never found with the RNAi in vitro screening approach, which points out some  of the limitations of this method. Pirk was identified in microarray studies for genes induced by Escherichia  coli (Kallio et al., 2005, Valanne et al., 2007), and upon pirk RNAi Attacin reporter activity was elevated in E.  coli ‐induced S2 cells (Kallio et al., 2005). Reasons that Pirk was never identified in the RNAi screens could  be  that  the  elevated  reporter  activity  was  below  the  chosen  threshold  in  large‐scale  screens,  pirk  dsRNA  may not have been present in the libraries used or the library dsRNA did not silence the gene sufficiently.  On the other hand, when genes identified in microarray studies have been studied in detail with the RNAi  approach, sometimes the clear function has been difficult to find, like in the case of Edin (CG32185): edin  was among one of the most induced genes in a microarray of E. coli activated S2 cells (Valanne et al., 2007),  but  despite  an  extensive  study,  edin  RNAi  or  overexpression  was  found  to  have  little  effect  on  immune  response related phenomena (Vanha‐aho et al., 2012). Edin appears to be involved in Enterococcus faecalis  (Vanha‐aho et al., 2012) and Listeria monocytogenes resistance  (Gordon et al., 2008), but further studies  are required to find out the mechanism for how Edin affects the Drosophila immune response.    2.2.2. Drosophila Toll pathway    The Drosophila Toll pathway was originally identified in a genetic saturation mutagenesis screen developed  by C.  Nüsslein‐Volhard and  E. Wieschaus  to  look for genes  important  for the  dorsal‐ventral  patterning  of  the embryo (Belvin  and Anderson,  1996, Anderson  et al., 1985a, Anderson et al.,  1985b).  Later on  it was  demonstrated that in Drosophila the same signaling pathway was important both in embryo development  and immunity, when the Toll receptor was shown to be an immune activator in a cell line (Rosetto et al.,  1995).  In  2011  the  Nobel  Prize  in  Physiology  and  Medicine  was  in  part  rewarded  for  the  research  demonstrating that the Drosophila Toll receptor is important for antifungal resistance in vivo (Lemaitre et  al., 1996), a finding which facilitated the discovery of mammalian Toll‐like receptors (TLRs) (Medzhitov et  al., 1997). Albeit strikingly similar, the fly and mammalian Toll/TLR pathways have important differences as  well:  in  contrast  to  the  mammalian  TLRs,  the  Drosophila  Toll  is  not  a  pattern  recognition  receptor  but  a  cytokine  receptor,  which  is  activated  via  a  cascade  of  proteolytic  events  and  the  binding  of  an  activated  ligand (reviewed in (Valanne et al., 2011). The most important group of pattern recognition proteins in the  fly are the Peptidoglycan recognition proteins (PGRPs), reviewed in (Charroux et al., 2009), which function  in pathogen recognition in both the Imd and the Toll pathways.  8   

  To this point, nine genes  encoding Drosophila Toll receptors and at least 13 genes coding for human TLR  receptors (Roach et al., 2005) have been identified. All Drosophila Tolls share the same molecular structure,  but  except  for  Toll  (Toll‐1)  the  roles  of  the  Drosophila  Tolls  in  immunity  have  remained  elusive.  Since  all  identified  mammalian  TLRs  are  involved  in  the  immune  response,  immune‐related  functions  for  the  remaining eight Drosophila Tolls have been actively searched for. Indeed, some reports for the roles of Toll‐ 5  and  Toll‐9  in  AMP  induction  exist  (Bettencourt  et  al.,  2004,  Luo  et  al.,  2001,  Tauszig  et  al.,  2000).  Furthermore, a role for Toll‐7 in viral recognition and autophagy has been recently proposed (Nakamoto et  al.,  2012),  suggesting  that  other  Tolls  may  be  involved  in  the  recognition  of  specific,  yet  to  be  tested  pathogens.    The canonical Toll pathway has been reviewed in detail in (Valanne et al., 2011) and (Valanne et al., 2012).  Briefly, upon pathway activation, binding of the active Spätzle ligand causes Toll receptors to dimerize. The  dimerized  receptor  binds  a  heterotrimeric  complex  composed  of  dimers  of  MyD88  and  Tube  adaptor  proteins as well as a Pelle kinase dimer (Moncrieffe et al., 2008, Sun et al., 2002). Activation of the MyD88‐ Tube‐Pelle  complex  leads  to  the  phosphorylation  and  degradation  of  the  Drosophila  inhibitor  of  B  (I B)  factor Cactus, and  thereby  the  activation and subsequent translocation  of the NF‐ B  factor  Dorsal and/or  DIF  (Dorsal  related  immunity  factor)  to  the  nucleus.  Binding  of  NF‐ B  to  responsive  sites  in  the  genome  induces  the  transcription  of  the  pathway  target  genes  such  as  Drosomycin,  immune  induced  molecule  1  (IM1) and IM2.      Large‐scale  or  genome‐wide  in  vitro  RNAi  screening  has  revealed  new  modifiers  of  the  Toll  pathway,  although most of the core pathway components were already discovered before the RNAi screens started.  In  a  screen  for  1033  transcription  factors  from  a  genome‐wide  RNAi  library  described  in  (Boutros  et  al.,  2004),  the  authors  identified  Deformed  epidermal  growth factor (Deaf‐1)  as  essential  for  full  Drosomycin  expression (Kuttenkeuler et al., 2010). Moreover, a targeted screen for kinases and phosphatases identified  the endocytic pathway and its component Myopic as important for Toll signaling (Huang et al., 2010). This  finding is supported by another study, where the endocytic pathway was shown to be needed for the Toll  pathway function in embryogenesis as well (Lund et al., 2010). In a genome‐wide RNAi screen around the  same time Valanne et al. (2010) identified an evolutionarily conserved G‐protein coupled receptor kinase 2  (Gprk2)  as  an  important  modifier  of  the  Toll  pathway  that  interacts  with  the  NF‐ B  inhibitor  Cactus.  Silencing  of  the  Gprk2  ortholog  in  zebrafish  embryos  or  the  human  ortholog  GRK5  in  HeLa  cells  caused  impaired  expression of  cytokines  indicating  a  functional  immunological role  also  in  these  systems. This  is  further supported by a study by Patial et al. (2010) who showed that GRK5 mutant mice have an attenuated 

9   

cytokine  response  to  LPS  and  that  GRK5  interacts  with  I B  (Patial  et  al.,  2010).  However,  the  exact  mechanism of Gprk2 action on the Toll pathway remains to be examined.        2.2.3. Drosophila JAK/STAT pathway    The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) pathway mediates cytokine  signaling  to  transcriptionally  activate  various  genes  (Aaronson  and  Horvath,  2002).  In  mammals,  the  JAK/STAT  pathway  is  important  for  the  regulation  and  maintenance  of  hematopoietic  cells,  and  thus  a  malfunction  in  the pathway  can  lead to various  pathological  stages  such  as tumorigenesis. In Drosophila,  the  JAK/STAT  pathway  is  involved  in  many  processes  in  development,  cell  fate  determination  and  immunity,  particularly  the  antiviral  response  (Agaisse  et  al.,  2005,  Dostert  et  al.,  2005,  Hou  et  al.,  2002,  Souza‐Neto et al., 2009).     JAK/STAT signaling begins when an extracellular cytokine ligand binds to a hetero‐ or homodimeric receptor  complex thereby triggering autophosphorylation and the activation of associated JAKs (Fisher et al., 2013).  Activated  JAKs  phosphorylate  the  C‐terminal  tails  of  the  receptors  they  bind  to,  generating  docking  sites  and thereby recruiting the STAT proteins. STATs are bound to the receptors and phosphorylated by JAKs,  which  causes  STATs  to  dissociate,  dimerize  and  translocate  to  the  nucleus  where  they  induce  the  transcription  of  their  target  genes  (Arbouzova  and  Zeidler,  2006,  Ihle,  2001).  In  mammals,  over  fifty  cytokines can activate seven STATs and four JAKs (Kisseleva et al., 2002) via many hetero‐ or homodimeric  combinations  of  cytokine  receptors  that  are  thought  to  offer  tissue  specificity  (Fisher  et  al.,  2013).  In  Drosophila,  there  are  only  three  ligands  (Upd,  Upd2  and  Upd3)  that  activate  one  receptor  (Dome),  from  where  the  signal  is  propagated  via  one  JAK  (hopscotch;  hop)  and  one  STAT  (Stat92E).  Upon  an  immune  challenge,  JAK/STAT  pathway target genes  such  as  the Turandot (Tot)  genes and the thioester‐containing  protein 2 (Tep2) are induced.    Several functional genomic analyses have been carried out for the Drosophila JAK/STAT pathway. By 2010,  three genome‐wide screens for JAK/STAT pathway components/regulators in Drosophila cells in culture had  been  completed  (Baeg  et  al.,  2005,  Kallio  et  al.,  2010,  Muller  et  al.,  2005).  Although  all  these  screens  identified the central pathway components, there is little overlap in the novel genes found in the different  studies. This has been explained at least in part by differences in set‐ups regarding cells, pathway inducers  and readouts. For example, in the Baeg et al. screen over 75% of the findings involved negative regulators  of the pathway, whereas the Muller et al. screen identified mainly positive regulators, probably partly as a  10   

result  of  the  level  of  pathway  stimulation  (Muller  et  al.,  2008).  The  quality  of  the  RNAi  library  is  also  an  issue.  To  explore  the  differences  between  first  and  second  generation  RNAi  libraries,  another  JAK/STAT  screen,  biologically very similar to the Muller et al. (2005) screen, was carried out recently, (Fisher et al.,  2012). The authors also reanalyzed the Muller et al. (2005) screen with newer bioinformatics methods, and  compared  it  to  their  screen.  However,  even  in  these  biologically  very  similar  screens  the  overlap  in  identified genes was surprisingly small (29%). Although the authors discuss the role of off target effects and  related improvements in the new RNAi library design, the poor overlap is not fully explained by differences  in libraries. Even the best screening approaches are only a tool for identifying genes important for a chosen  pathway, and ultimately, downstream validation and secondary assays to confirm the findings are required  (Fisher et al., 2012).     The screening set‐up also affects the findings greatly, as is demonstrated in Kallio et al. (2010). The authors  used a mutant form of the hop kinase, hopTum‐l, as an inducer of the JAK/STAT pathway, since they wanted  to screen for components important for the conserved intracellular part of the signaling cascade (Kallio et  al.,  2010).  With  this  set‐up  they  identified  eye  transformer  (ET)  first  as  a  positive  regulator.  Later  it  was  shown that in a more physiological context, ET RNAi enhances the JAK/STAT phenotypes both in vitro and in  vivo, identifying  ET  as  a  negative regulator of the JAK/STAT pathway.  It  was  shown  that  ET  is  an  intrinsic  component  of  the  Dome  receptor  complex  as  it  interacts  with  both  Dome  and  hop,  and  it  functions  in  regulating  Stat92E  phosphorylation  (Kallio  et  al.,  2010).  Around  the  same  time  Makki  et  al.  (2010)  demonstrated  that  ET/CG14225/Latran  acts  as  an  inhibitor  of  the  JAK/STAT  pathway  also  in  the  lymph  gland,  where  it  induces  massive  differentiation  of  lamellocytes  upon  wasp  parasitization  (Makki  et  al.,  2010).  Other  important  findings  from  genome‐wide  JAK/STAT  screens  include  the  dBRWD3  and  Ptp61F  genes:  disrupted  dBRWD3  expression  and  overexpression  of  Ptp61F  suppressed  the  hopTum‐l‐induced  leukemia‐like  blood  cell  tumors,  bringing  insights  into  a  pathway  relevant  for  human  cancer  mechanisms  (Muller  et  al.,  2005).  Ptp61F  was  also  identified  in  the  Baeg  et  al.  (2005)  screen,  as  were  RanBP3  and  RanBP10,  two  other  putative  negative  regulators  of  the  pathway  (Baeg  et  al.,  2005).  Moreover,  Cnot4/CG31716 was identified in the Kallio et al. screen (2010) and was later shown to be an evolutionarily  conserved positive regulator of the JAK/STAT pathway (Grönholm et al., 2012). Also, in a genome‐wide in  vivo  RNAi  screen  the  JAK/STAT  pathway  was  shown  to  negatively  regulate  survival  during  an  intestinal  Serratia marcescens infection (Cronin et al., 2009). This study was the first in vivo RNAi screen of such scale  and  it  utilized  the  genome‐wide  collection  of  RNAi  lines  available  in  the  Vienna  Drosophila  RNAi  Center  (Dietzl et al., 2007). On the other hand, others have shown that enhanced JAK/STAT signaling is protective  in the guts of S. marcescens infected flies (Jiang et al., 2009, Kallio et al., 2010), possibly indicating that the  JAK/STAT  pathway  activity  level  needs  to  be  particularly  delicately  regulated  and  balanced  for  proper  function and homeostasis.  11   

  2.2.4. Drosophila RNAi pathway    Although  RNAi  has  been  used  as  a  method  in  Drosophila  RNAi  screening  research  for  silencing  specific  genes  (see  section  1),  RNAi  first  evolved  as  an  innate  immune  mechanism  particularly  against  viruses  (Cherry  &  Silverman,  2006).  The  Drosophila  RNAi  pathway  uses  viral  dsRNA  to  induce  host‐mediated  degradation  of  viral  RNA,  and  this  essential  antiviral  function  of  RNAi  in  flies  has  been  demonstrated  in  many  studies  (Galiana‐Arnoux  et  al.,  2006,  Wang  et  al.,  2006,  Zambon  et  al.,  2006).  RNAi  screening  for  components  of  the  RNAi  pathway  revealed  the  importance  of  the  endocytic  pathway  in  dsRNA  internalization in S2 cells (Ulvila et al., 2006, Saleh et al., 2006). The RNAi pathway is reviewed in detail in  this issue of Developmental and Comparative immunology.    2.3. RNAi screening in Drosophila as a tool to study host‐pathogen interactions    Because of the ease and affectivity of Drosophila RNAi in cell culture, in recent years this model has been  adapted  to  study  host  factors  in  response  to  multiple  pathogens.  This  approach  can  potentially  identify  novel therapeutic targets and aid in understanding the complex interactions between pathogens and their  host cells (Cherry, 2008). One of the first genome wide screens for host‐pathogen interactions identified a  specific requirement for high levels of the host translation machinery for picorna‐like viruses both in insects  and mammals (Cherry et al., 2005). In a follow‐up study it was shown that these viruses require at least two  host  encoded  mechanisms  for  their  lifecycle:  the  coat  protein  complex  I  (COPI)  activity  and  fatty  acid  biosynthesis (Cherry et al., 2006). Other genome‐wide screens published around the same time identified  factors  needed  for  the  entry  and  survival  of  intracellular  bacteria:  one  important  finding  was  Peste,  a  member of the CD36 family of scavenger receptors. Peste was identified as required for the uptake of both  Listeria  monocytogenes  (Agaisse  et  al.,  2005)  and  Mycobacterium  fortuitum  (Philips  et  al.,  2005).  Also,  serine  palmitoyltransferase  and  genes  important  for  vacuolar  trafficking  were  shown  to  play  a  role  in  L.  monocytogenes pathogenesis (Cheng et al., 2005). As a follow‐up to the mycobacterial work Philips et al.  (2008)  compared  an  infection  with  M.  fortuitum  to  an  infection  with  the  non‐pathogenic  mycobacterial  species  M.  smegmatis  upon  the  silencing  of  86  selected  genes,  and  showed  that  the  ESCRT  machinery  modulates  a  mycobacterial  phagosome  in  Drosophila  S2  cells  (Philips  et  al.,  2008).  Moreover,  beta‐ hexosaminidase has been shown to control mycobacterial growth in a small screen of about 1000 dsRNAs  (Koo et al., 2008).    Host  factors  needed  for  infection  by  other  intracellular  bacteria,  namely  Francicella  tularensis  and  Chlamydia  spp.  have  been  screened  using  genome‐wide  dsRNA  libraries  in  Drosophila  cells,  identifying  12   

evolutionarily conserved components involved for example in phagosome maturation and actin remodeling  (Akimana et al., 2010, Derre et al., 2007). Also, host factors in viral infections have been studied using this  method.  Firstly,  a  genome‐wide  study  with  the  influenza  virus  identified  three  Drosophila  genes  with  human  homologues  ATP6V0D1,  COX6A1  and  NXF1  as  important  for  virus  replication  (Hao  et  al.,  2008).  Secondly, Dengue virus host factors were studied in a genome‐wide screen in Drosophila cells. After this a  targeted siRNA screen in human cells with homologues of identified Drosophila genes fished out 42 human  host factors important for the dengue virus infection (Sessions et al., 2009). Also, a smaller targeted kinome  screen was carried out for the Vaccinia virus, identifying an AMP‐activated kinase complex needed for viral  entry into Drosophila cells as  well  as  mammalian  cells  (Moser  et  al.,  2010).  Other  small  targeted  screens  have  been  carried  out  for  host  factors  needed  for  at  least  for  a  Cryptococcus  neoformans,  Pseudomonas  aeruginosa,  Brucella  and  Rickettsia  infection.  These  studies  reveal  new  information  on  specific  host‐ pathogen interaction mechanisms for each pathogen (Pielage et al., 2008, Qin et al., 2008, Qin et al., 2011,  Reed et al., 2012, Serio et al., 2010).    3. Concluding remarks    Large‐scale RNAi screening is a powerful method to dissect signaling pathways or specific interactions.  The  last ten years have shown the potential and applicability of this approach to many functions of interest in  Drosophila. Many genes  or processes  relevant to human disease can be found using the Drosophila RNAi  screening  approach,  demonstrating  the  evolutionary  conservation  of  many  mechanisms  from  flies  to  humans.  On  one  hand,  the  emergence  of  mammalian  siRNA  libraries  and  the  possibility  to  carry  out  genome‐wide studies in mammalian cell culture will undoubtedly bring another level of understanding to  the mechanisms studied. On the other hand, the genome‐wide RNAi libraries of flies in vivo will bring about  an increasing number of studies where, depending on the set‐up, genes are silenced in a chosen tissue at a  chosen  time  in  development.  Drosophila  in  vivo  screens  will  most  likely  reveal  cell‐autonomous  mechanisms that cannot be found in cell culture assays. Additionally, Drosophila RNAi lines can be utilized  to  validate  in  vitro  findings  on  the  organismal  scale.  However,  all  screening  approaches  produce  a  vast  amount of data that need to be analyzed critically. Data validation is an important step in screening, since  even the best screens are only a starting point for further validation of the hits and for functional studies.    Acknowledgements    SV  was  funded  by  “Provision  of  support  to  research  career  development  in  biocenters”  grant  from  Biocenter Finland. 

13   

  Conflict of Interest  None to declare.   

14   

  Figure legends    Figure 1: Drosophila RNAi screening in vitro and in vivo. Left: Drosophila cells are cultured in multiwell cell  culture plates. dsRNAs from a large‐scale or genome‐wide library are added to the cells. If needed, reporter  plasmids  and  pathway  inducers  are  transfected.  After  assaying  reporter  activities  (or  using  other  assays,  e.g.  microscopy),  interesting  hit  genes  are  selected.  Thereafter,  initial  findings  need  to  be  confirmed  and  validated,  and  then  analyzed  for  their  function.  Right:  Drosophila  in  vivo  RNAi  screening.  A  collection  of  UAS‐RNAi  fly  lines  are  crossed  with  the  GAL4  driver  line  to  silence  genes  in  a  chosen  tissue  (or  ubiquitously).  After  an  initial  assay  interesting  genes  are  identified  and  validated  with  repeats  and  independent RNAi lines. Functional assays are carried out for example with different GAL4 driver lines to  identify for which tissue the selected genes are important. 

15   

References  Aaronson, D.S., Horvath, C.M., 2002. A road map for those who don't know JAK‐STAT. Science 296, 1653‐ 1655.  Agaisse,  H.,  Burrack,  L.S.,  Philips,  J.A.,  Rubin,  E.J.,  Perrimon,  N.,  Higgins,  D.E.,  2005.  Genome‐wide  RNAi  screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science 309, 1248‐51.  Aggarwal, K., Rus, F., Vriesema‐Magnuson, C., Erturk‐Hasdemir, D., Paquette, N., Silverman, N., 2008. Rudra  interrupts  receptor  signaling  complexes  to  negatively  regulate  the  IMD  pathway.  PLoS  Pathog.  4,  e1000120.  Akimana,  C.,  Al‐Khodor,  S.,  Abu  Kwaik,  Y.,  2010.  Host  factors  required  for  modulation  of  phagosome  biogenesis and proliferation of Francisella tularensis within the cytosol. PLoS One 5, e11025.  Anderson,  K.V.,  Bokla,  L.,  Nüsslein‐Volhard,  C.,  1985a.  Establishment  of  dorsal‐ventral  polarity  in  the  Drosophila embryo: the induction of polarity by the Toll gene product. Cell 42, 791‐8.  Anderson,  K.V.,  Jürgens,  G.,  Nüsslein‐Volhard,  C.,  1985b.  Establishment  of  dorsal‐ventral  polarity  in  the  Drosophila embryo: genetic studies on the role of the Toll gene product. Cell 42, 779‐789.  Arbouzova,  N.I.,  Zeidler,  M.P.,  2006.  JAK/STAT  signalling  in  Drosophila:  insights  into  conserved  regulatory  and cellular functions. Development 133, 2605‐16.  Baeg, G.H., Zhou, R., Perrimon, N., 2005. Genome‐wide RNAi analysis of JAK/STAT signaling components in  Drosophila. Genes Dev. 19, 1861‐70.  Basset,  A.,  Khush,  R.S.,  Braun,  A.,  Gardan,  L.,  Boccard,  F.,  Hoffmann,  J.A.,  Lemaitre,  B.,  2000.  The  phytopathogenic  bacteria  Erwinia  carotovora  infects  Drosophila  and  activates  an  immune  response.  Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 3376‐3381.  Belvin,  M.P.,  Anderson,  K.V.,  1996.  A  conserved  signaling  pathway:  the  Drosophila  toll‐dorsal  pathway.  Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393‐416.  Bettencourt,  R.,  Tanji,  T.,  Yagi,  Y.,  Ip,  Y.T.,  2004.  Toll  and  Toll‐9  in  Drosophila  innate  immune  response.  J  Endotoxin Res. 10, 261‐8.  Bond, D., Foley, E., 2009. A Quantitative RNAi Screen for JNK Modifiers Identifies Pvr as a Novel Regulator  of Drosophila Immune Signaling. PLoS Pathog. 5, e1000655.  Bosco‐Drayon,  V.,  Poidevin,  M.,  Boneca,  I.G.,  Narbonne‐Reveau,  K.,  Royet,  J.,  Charroux,  B.,  2012.  Peptidoglycan  sensing  by  the  receptor  PGRP‐LE  in  the  Drosophila  gut  induces  immune  responses  to  infectious bacteria and tolerance to microbiota. Cell Host Microbe. 12, 153‐165.  Boutros, M., Kiger, A.A., Armknecht, S., Kerr, K., Hild, M., Koch, B., Haas, S.A., Paro, R., Perrimon, N., 2004.  Genome‐wide RNAi analysis of growth and viability in Drosophila cells. Science 303, 832‐5.  Brand, A.H., Perrimon, N., 1993. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating  dominant phenotypes. Development 118, 401‐15. 

16   

Brennan,  C.A.,  Delaney,  J.R.,  Schneider,  D.S.,  Anderson,  K.V.,  2007.  Psidin  is  required  in  Drosophila  blood  cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body. Curr. Biol. 17, 67‐72.  Charroux,  B.,  Rival,  T.,  Narbonne‐Reveau,  K.,  Royet,  J.,  2009.  Bacterial  detection  by  Drosophila  peptidoglycan recognition proteins. Microbes Infect. 11, 631‐636.  Charroux,  B.,  Royet,  J.,  2009.  Elimination  of  plasmatocytes  by  targeted  apoptosis  reveals  their  role  in  multiple aspects of the Drosophila immune response. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 9797‐802.  Cheng,  L.W.,  Viala,  J.P.,  Stuurman,  N.,  Wiedemann,  U.,  Vale,  R.D.,  Portnoy,  D.A.,  2005.  Use  of  RNA  interference  in  Drosophila  S2  cells  to  identify  host  pathways  controlling  compartmentalization  of  an  intracellular pathogen. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 13646‐51.  Cherry, S. 2008. Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host‐pathogen  interactions? Curr. Opin. Microbiol. 11, 262‐270.  Cherry, S., Doukas, T., Armknecht, S., Whelan, S., Wang, H., Sarnow, P., Perrimon, N. 2005. Genome‐wide  RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES‐containing RNA viruses to host translation inhibition.  Genes Dev. 19, 445‐452.  Cherry, S., Kunte, A., Wang, H., Coyne, C., Rawson, R.B., Perrimon, N. 2006. COPI activity coupled with fatty  acid biosynthesis is required for viral replication. PLoS Pathog. 2, e102.  Cherry, S., Silverman, N. 2006. Host‐pathogen interactions in drosophila: new tricks from an old friend. Nat.  Immunol. 7, 911‐917.  Choe,  K.M.,  Werner,  T.,  Stöven,  S.,  Hultmark,  D.,  Anderson,  K.V.,  2002.  Requirement  for  a  peptidoglycan  recognition  protein  (PGRP)  in  Relish  activation  and  antibacterial  immune  responses  in  Drosophila.  Science 296, 359‐62.  Cronin, S.J., Nehme, N.T., Limmer, S., Liegeois, S., Pospisilik, J.A., Schramek, D., Leibbrandt, A., Simoes, R.D.,  Gruber,  S.,  Puc,  U.,  Ebersberger,  I.,  Zoranovic,  T.,  Neely,  G.G.,  von  Haeseler,  A.,  Ferrandon,  D.,  Penninger,  J.M.,  2009. Genome‐Wide  RNAi  Screen  Identifies  Genes  Involved  in  Intestinal  Pathogenic  Bacterial Infection. Science 325, 340‐343.  Defaye, A., Evans, I., Crozatier, M., Wood, W., Lemaitre, B., Leulier, F., 2009. Genetic ablation of Drosophila  phagocytes  reveals  their  contribution  to  both  development  and  resistance  to  bacterial  infection.  J.  Innate Immun. 1, 322‐334.  Derre,  I.,  Pypaert,  M.,  Dautry‐Varsat,  A.,  Agaisse,  H.,  2007.  RNAi  screen  in  Drosophila  cells  reveals  the  involvement of the Tom complex in Chlamydia infection. PLoS Pathog. 3, 1446‐1458.  Dietzl,  G.,  Chen,  D.,  Schnorrer,  F.,  Su,  K.C.,  Barinova,  Y.,  Fellner,  M.,  Gasser,  B.,  Kinsey,  K.,  Oppel,  S.,  Scheiblauer, S., Couto, A., Marra, V., Keleman, K., Dickson, B.J., 2007. A genome‐wide transgenic RNAi  library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature 448, 151‐6.  Dostert,  C.,  Jouanguy,  E.,  Irving,  P.,  Troxler,  L.,  Galiana‐Arnoux,  D.,  Hetru,  C.,  Hoffmann,  J.A.,  Imler,  J.L.,  2005.  The  Jak‐STAT  signaling  pathway  is  required  but  not  sufficient  for  the  antiviral  response  of  Drosophila. Nat. Immunol. 6, 946‐53.  Duffy, J.B., 2002. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis 34, 1‐15.  17   

Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E., Mello, C.C., 1998. Potent and specific genetic  interference by double‐stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806‐11.  Fisher,  K.H.,  Brown,  S.,  Zeidler,  M.P.,  2013.  Designing  RNAi  Screens  to  Identify  JAK/STAT  Pathway  Components. Methods Mol. Biol. 967, 81‐97.  Fisher, K.H., Wright, V.M., Taylor, A., Zeidler, M.P., Brown, S., 2012. Advances in genome‐wide RNAi cellular  screens: a case study using the Drosophila JAK/STAT pathway. BMC Genomics 13, 506‐2164‐13‐506.  Foley, E., O'Farrell, P.H., 2004. Functional dissection of an innate immune response by a genome‐wide RNAi  screen. PLoS Biol. 2, E203.  Galiana‐Arnoux, D., Dostert, C., Schneemann, A., Hoffmann, J.A., Imler, J.L. 2006. Essential function in vivo  for Dicer‐2 in host defense against RNA viruses in drosophila. Nat. Immunol. 7, 590–597.  Gesellchen,  V.,  Kuttenkeuler,  D.,  Steckel,  M.,  Pelte,  N.,  Boutros,  M.,  2005.  An  RNA  interference  screen  identifies  Inhibitor  of  Apoptosis  Protein  2  as  a  regulator  of  innate  immune  signalling  in  Drosophila.  EMBO Rep. 6, 979‐84.  Gordon, M.D., Ayres, J.S., Schneider, D.S., Nusse, R. 2008. Pathogenesis of listeria‐infected Drosophila wntD  mutants is associated with elevated levels of the novel immunity gene edin. PLoS Pathog. 4, e1000111.  Goto, A., Matsushita, K., Gesellchen, V., El Chamy, L., Kuttenkeuler, D., Takeuchi, O., Hoffmann, J.A., Akira,  S., Boutros, M., Reichhart, J.M., 2008. Akirins are highly conserved nuclear proteins required for NF‐ kappaB‐dependent gene expression in Drosophila and mice. Nat. Immunol. 9, 97‐104.  Gottar, M., Gobert, V., Michel, T., Belvin, M., Duyk, G., Hoffmann, J.A., Ferrandon, D., Royet, J., 2002. The  Drosophila  immune  response  against  Gram‐negative  bacteria  is  mediated  by  a  peptidoglycan  recognition protein. Nature 416, 640‐4.  Grönholm, J., Kaustio, M., Myllymäki, H., Kallio, J., Saarikettu, J., Kronhamn, J., Valanne, S., Silvennoinen, O.,  Rämet, M., 2012. Not4 enhances JAK/STAT pathway‐dependent gene expression in Drosophila and in  human cells. FASEB J. 26, 1239‐1250.  Hammond,  S.M.,  Bernstein,  E.,  Beach,  D.,  Hannon,  G.J.,  2000.  An  RNA‐directed  nuclease  mediates  post‐ transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature 404, 293‐6.  Hao, L., Sakurai, A., Watanabe, T., Sorensen, E., Nidom, C.A., Newton, M.A., Ahlquist, P., Kawaoka, Y., 2008.  Drosophila  RNAi  screen  identifies  host  genes  important  for  influenza  virus  replication.  Nature  454,  890‐3.  Hou,  S.X.,  Zheng,  Z.,  Chen,  X.,  Perrimon,  N.,  2002.  The  Jak/STAT  pathway  in  model  organisms:  emerging  roles in cell movement. Dev. Cell 3, 765‐778.  Huang,  H.R.,  Chen,  Z.J.,  Kunes,  S.,  Chang,  G.D.,  Maniatis,  T.,  2010.  Endocytic  pathway  is  required  for  Drosophila Toll innate immune signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 8322‐7.  Hultmark, D., 2003. Drosophila immunity: paths and patterns. Curr. Opin. Immunol. 15, 12‐9.  Hultmark, D., 1994. Insect immunology. Ancient relationships. Nature 367, 116‐117. 

18   

Hultmark, D., 1993. Immune reactions in Drosophila and other insects: a model for innate immunity. Trends  Genet. 9, 178‐183.  Ihle, J.N., 2001. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell. Biol. 13, 211‐217.  Jiang,  H.,  Patel,  P.H.,  Kohlmaier,  A.,  Grenley,  M.O.,  McEwen,  D.G.,  Edgar,  B.A.,  2009.  Cytokine/Jak/Stat  signaling mediates regeneration and homeostasis in the Drosophila midgut. Cell 137, 1343‐55.  Kallio,  J.,  Leinonen,  A.,  Ulvila,  J.,  Valanne,  S.,  Ezekowitz,  R.A.,  Rämet,  M.,  2005.  Functional  analysis  of  immune response genes in Drosophila identifies JNK pathway as a regulator of antimicrobial peptide  gene expression in S2 cells. Microbes Infect. 7, 811‐819.  Kallio,  J.,  Myllymäki,  H.,  Grönholm,  J.,  Armstrong,  M.,  Vanha‐aho,  L.M.,  Mäkinen,  L.,  Silvennoinen,  O.,  Valanne, S., Rämet, M., 2010. Eye transformer is a negative regulator of Drosophila JAK/STAT signaling.  FASEB J. 24, 4467‐4479.  Kaneko,  T.,  Goldman,  W.E.,  Mellroth,  P.,  Steiner,  H.,  Fukase,  K.,  Kusumoto,  S.,  Harley,  W.,  Fox,  A.,  Golenbock,  D.,  Silverman,  N.,  2004.  Monomeric  and  polymeric  gram‐negative  peptidoglycan  but  not  purified LPS stimulate the Drosophila IMD pathway. Immunity 20, 637‐49.  Kaneko, T., Yano, T., Aggarwal, K., Lim, J.H., Ueda, K., Oshima, Y., Peach, C., Erturk‐Hasdemir, D., Goldman,  W.E.,  Oh,  B.H.,  Kurata,  S.,  Silverman,  N.,  2006.  PGRP‐LC  and  PGRP‐LE  have  essential  yet  distinct  functions in the Drosophila immune response to monomeric DAP‐type peptidoglycan. Nat. Immunol.  7, 715‐23.  Kiger,  A.A.,  Baum,  B.,  Jones,  S.,  Jones,  M.R.,  Coulson,  A.,  Echeverri,  C.,  Perrimon,  N.  2003.  A  functional  genomic analysis of cell morphology using RNA interference. J. Biol. 2, 27.  Kisseleva,  T.,  Bhattacharya,  S.,  Braunstein,  J.,  Schindler,  C.W.,  2002.  Signaling  through  the  JAK/STAT  pathway, recent advances and future challenges. Gene 285, 1‐24.  Kleino, A., Myllymäki, H., Kallio, J., Vanha‐aho, L.M., Oksanen, K., Ulvila, J., Hultmark, D., Valanne, S., Rämet,  M., 2008. Pirk is a negative regulator of the Drosophila Imd pathway. J. Immunol. 180, 5413‐5422.  Kleino,  A.,  Valanne,  S.,  Ulvila,  J.,  Kallio,  J.,  Myllymäki,  H.,  Enwald,  H.,  Stöven,  S.,  Poidevin,  M.,  Ueda,  R.,  Hultmark,  D.,  Lemaitre,  B.,  Rämet,  M.,  2005.  Inhibitor  of  apoptosis  2  and  TAK1‐binding  protein  are  components of the Drosophila Imd pathway. EMBO J. 24, 3423‐3434.  Koo,  I.C.,  Ohol,  Y.M.,  Wu,  P.,  Morisaki,  J.H.,  Cox,  J.S.,  Brown,  E.J.,  2008.  Role  for  lysosomal  enzyme  beta‐ hexosaminidase in the control of mycobacteria infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 710‐5.  Kulkarni,  M.M.,  Booker,  M.,  Silver,  S.J.,  Friedman,  A.,  Hong,  P.,  Perrimon,  N.,  Mathey‐Prevot,  B.,  2006.  Evidence  of  off‐target  effects  associated  with  long  dsRNAs  in  Drosophila  melanogaster  cell‐based  assays. Nat. Methods 3, 833‐8.  Kuttenkeuler,  D.,  Pelte,  N.,  Ragab,  A.,  Gesellchen,  V.,  Schneider,  L.,  Blass,  C.,  Axelsson,  E.,  Huber,  W.,  Boutros,  M.,  2010.  A  large‐scale  RNAi  screen  identifies  Deaf1  as  a  regulator  of  innate  immune  responses in Drosophila. J. Innate Immun. 2, 181‐94.  Kylsten,  P.,  Samakovlis,  C.,  Hultmark,  D.,  1990.  The  cecropin  locus  in  Drosophila;  a  compact  gene  cluster  involved in the response to infection. EMBO J. 9, 217‐224.  19   

Lemaitre, B.,  Hoffmann, J., 2007. The  host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol.  25,  697‐743.  Lemaitre,  B.,  Kromer‐Metzger,  E.,  Michaut,  L.,  Nicolas,  E.,  Meister,  M.,  Georgel,  P.,  Reichhart,  J.M.,  Hoffmann,  J.A.,  1995.  A  recessive  mutation,  immune  deficiency  (imd),  defines  two  distinct  control  pathways in the Drosophila host defense. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92, 9465‐9.  Lemaitre,  B.,  Nicolas,  E.,  Michaut,  L.,  Reichhart,  J.M.,  Hoffmann,  J.A.,  1996.  The  dorsoventral  regulatory  gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell 86,  973‐83.  Leulier,  F.,  Parquet,  C.,  Pili‐Floury,  S.,  Ryu,  J.H.,  Caroff,  M.,  Lee,  W.J.,  Mengin‐Lecreulx,  D.,  Lemaitre,  B.,  2003.  The  Drosophila  immune  system  detects  bacteria  through  specific  peptidoglycan  recognition.  Nat. Immunol. 4, 478‐84.  Lhocine, N., Ribeiro, P.S., Buchon, N., Wepf, A., Wilson, R., Tenev, T., Lemaitre, B., Gstaiger, M., Meier, P.,  Leulier,  F.,  2008.  PIMS  modulates  immune  tolerance  by  negatively  regulating  Drosophila  innate  immune signaling. Cell Host Microbe. 4, 147‐58.  Lim, J.H., Kim, M.S., Kim, H.E., Yano, T., Oshima, Y., Aggarwal, K., Goldman, W.E., Silverman, N., Kurata, S.,  Oh, B.H., 2006. Structural basis for preferential recognition of diaminopimelic acid‐type peptidoglycan  by a subset of peptidoglycan recognition proteins. J. Biol. Chem. 281, 8286‐95.  Lum, L., Yao, S., Mozer, B., Rovescalli, A., Von Kessler, D., Nirenberg, M., Beachy, P.A. 2003. Identification of  Hedgehog pathway components by RNAi in Drosophila cultured cells. Science 299, 2039‐2045.  Lund,  V.K.,  DeLotto,  Y.,  DeLotto,  R.,  2010.  Endocytosis  is  required  for  Toll  signaling  and  shaping  of  the  Dorsal/NF‐kappaB morphogen gradient during Drosophila embryogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.  107, 18028‐33.  Luo,  C.,  Shen,  B.,  Manley,  J.L.,  Zheng,  L.,  2001.  Tehao  functions  in  the  Toll  pathway  in  Drosophila  melanogaster: possible roles in development and innate immunity. Insect Mol. Biol. 10, 457‐64.  Ma,  Y.,  Creanga,  A.,  Lum,  L.,  Beachy,  P.A.,  2006.  Prevalence  of  off‐target  effects  in  Drosophila  RNA  interference screens. Nature 443, 359‐63.  Makki,  R.,  Meister,  M.,  Pennetier,  D.,  Ubeda,  J.M.,  Braun,  A.,  Daburon,  V.,  Krzemien,  J.,  Bourbon,  H.M.,  Zhou,  R.,  Vincent,  A.,  Crozatier,  M.,  2010.  A  short  receptor  downregulates  JAK/STAT  signalling  to  control the Drosophila cellular immune response. PLoS Biol. 8, e1000441.  McGuire,  S.E.,  Mao,  Z.,  Davis,  R.L.  2004.  Spatiotemporal  gene  expression  targeting  with  the  TARGET  and  gene‐switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6.  Medzhitov,  R.,  Preston‐Hurlburt,  P.,  Janeway,  C.A.,Jr,  1997.  A  human  homologue  of  the  Drosophila  Toll  protein signals activation of adaptive immunity. Nature 388, 394‐397.  Moncrieffe, M.C., Grossmann, J.G., Gay, N.J., 2008. Assembly of oligomeric death domain complexes during  Toll receptor signaling. J. Biol. Chem. 283, 33447‐54.  Moser,  T.S.,  Jones,  R.G.,  Thompson,  C.B.,  Coyne,  C.B.,  Cherry,  S.,  2010.  A  kinome  RNAi  screen  identified  AMPK as promoting poxvirus entry through the control of actin dynamics. PLoS Pathog. 6, e1000954.  20   

Muller,  P.,  Boutros,  M.,  Zeidler,  M.P.,  2008.  Identification  of  JAK/STAT  pathway  regulators‐‐insights  from  RNAi screens. Semin. Cell. Dev. Biol. 19, 360‐9.  Muller,  P.,  Kuttenkeuler,  D.,  Gesellchen,  V.,  Zeidler,  M.P.,  Boutros,  M.,  2005.  Identification  of  JAK/STAT  signalling components by genome‐wide RNA interference. Nature 436, 871‐5.  Myllymäki,  H.,  Rämet,  M.,  2012.  Transcription  factor  zfh1  downregulates  Drosophila  Imd  pathway.  Dev.  Comp. Immunol. 39, 188‐197.  Nakamoto,  M.,  Moy,  R.H.,  Xu,  J.,  Bambina,  S.,  Yasunaga,  A.,  Shelly,  S.S.,  Gold,  B.,  Cherry,  S.,  2012.  Virus  recognition by Toll‐7 activates antiviral autophagy in Drosophila. Immunity 36, 658‐667.  Nehme, N.T., Quintin, J., Cho, J.H., Lee, J., Lafarge, M.C., Kocks, C., Ferrandon, D., 2011. Relative roles of the  cellular  and  humoral  responses  in  the  Drosophila  host  defense  against  three  gram‐positive  bacterial  infections. PLoS One 6, e14743.  Neyen, C., Poidevin, M., Roussel, A., Lemaitre, B., 2012. Tissue‐ and ligand‐specific sensing of gram‐negative  infection in Drosophila by PGRP‐LC isoforms and PGRP‐LE. J. Immunol. 189, 1886‐1897.  Ni,  J.Q.,  Markstein,  M.,  Binari,  R.,  Pfeiffer,  B.,  Liu,  L.P.,  Villalta,  C.,  Booker,  M.,  Perkins,  L.,  Perrimon,  N.,  2008.  Vector  and  parameters  for  targeted  transgenic  RNA  interference  in  Drosophila  melanogaster.  Nat. Methods 5, 49‐51.  Ni,  J.Q.,  Zhou,  R.,  Czech,  B.,  Liu,  L.P.,  Holderbaum,  L.,  Yang‐Zhou,  D.,  Shim,  H.S.,  Tao,  R.,  Handler,  D.,  Karpowicz,  P.,  Binari, R., Booker,  M., Brennecke, J., Perkins,  L.A., Hannon, G.J., Perrimon,  N. 2011.  A  genome‐scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nat. Methods 8, 405‐407.  Patial,  S.,  Luo,  J.,  Porter,  K.J.,  Benovic,  J.L.,  Parameswaran,  N.,  2010.  G‐protein‐coupled‐receptor  kinases  mediate  TNFalpha‐induced  NF‐kappaB  signalling  via  direct  interaction  with  and  phosphorylation  of  IkappaBalpha. Biochem. J. 425, 169‐78.  Peltan,  A.,  Briggs,  L.,  Matthews,  G.,  Sweeney,  S.T.,  Smith,  D.F.,  2012.  Identification  of  Drosophila  Gene  Products Required for Phagocytosis of Leishmania donovani. PLoS One 7, e51831.  Philips,  J.A.,  Porto,  M.C.,  Wang,  H.,  Rubin,  E.J.,  Perrimon,  N.,  2008.  ESCRT  factors  restrict  mycobacterial  growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 3070‐5.  Philips, J.A., Rubin, E.J., Perrimon, N., 2005. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required  for mycobacterial infection. Science 309, 1251‐3.  Pielage, J.F., Powell, K.R., Kalman, D., Engel, J.N., 2008. RNAi screen reveals an Abl kinase‐dependent host  cell pathway involved in Pseudomonas aeruginosa internalization. PLoS Pathog. 4, e1000031.  Qin, Q.M., Luo, J., Lin, X., Pei, J., Li, L., Ficht, T.A., de Figueiredo, P., 2011. Functional analysis of host factors  that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathog. 7, e1002078.  Qin, Q.M., Pei, J., Ancona, V., Shaw, B.D., Ficht, T.A., de Figueiredo, P., 2008. RNAi screen of endoplasmic  reticulum‐associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS  Pathog. 4, e1000110. 

21   

Ragab,  A.,  Buechling,  T.,  Gesellchen,  V.,  Spirohn,  K.,  Boettcher,  A.L.,  Boutros,  M.,  2011.  Drosophila  Ras/MAPK signalling regulates innate immune responses in immune and intestinal stem cells. EMBO J.  30, 1123‐36.  Rämet,  M.,  Manfruelli,  P.,  Pearson,  A.,  Mathey‐Prevot,  B.,  Ezekowitz,  R.A.,  2002.  Functional  genomic  analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature 416, 644‐8.  Rämet, M., Pearson, A.,  Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V., Chung, E., Krieger, M., Ezekowitz, R.A.,  2001.  Drosophila  scavenger  receptor  CI  is  a  pattern  recognition  receptor  for  bacteria.  Immunity  15,  1027‐38.  Reed,  S.C.,  Serio,  A.W.,  Welch,  M.D.,  2012.  Rickettsia  parkeri  invasion  of  diverse  host  cells  involves  an  Arp2/3 complex, WAVE complex and Rho‐family GTPase‐dependent pathway. Cell. Microbiol. 14, 529‐ 545.  Reichhart, J.M., Meister, M., Dimarcq, J.L., Zachary, D., Hoffmann, D., Ruiz, C., Richards, G., Hoffmann, J.A.,  1992.  Insect  immunity:  developmental  and  inducible  activity  of  the  Drosophila  diptericin  promoter.  EMBO J. 11, 1469‐1477.  Roach, J.C., Glusman, G., Rowen, L., Kaur, A., Purcell, M.K., Smith, K.D., Hood, L.E., Aderem, A., 2005. The  evolution of vertebrate Toll‐like receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 9577‐9582.  Rosetto,  M.,  Engström,  Y.,  Baldari,  C.T.,  Telford,  J.L.,  Hultmark,  D.,  1995.  Signals  from  the  IL‐1  receptor  homolog, Toll, can activate an immune response in a Drosophila hemocyte cell line. Biochem. Biophys.  Res. Commun. 209, 111‐6.  Rutschmann, S., Jung, A.C., Hetru, C., Reichhart, J.M., Hoffmann, J.A., Ferrandon, D., 2000a. The Rel protein  DIF mediates the antifungal but not the antibacterial host defense in Drosophila. Immunity 12, 569‐80.  Rutschmann, S., Jung, A.C., Zhou, R., Silverman, N., Hoffmann, J.A., Ferrandon, D., 2000b. Role of Drosophila  IKK gamma in a toll‐independent antibacterial immune response. Nat Immunol 1, 342‐7.  Saleh,  M.C.,  van  Rij,  R.P.,  Hekele,  A.,  Gillis,  A.,  Foley,  E.,  O'Farrell,  P.H.,  Andino,  R.,  2006.  The  endocytic  pathway mediates cell entry of dsRNA to induce RNAi silencing. Nat. Cell. Biol. 8, 793‐802.  Samakovlis,  C.,  Kylsten,  P.,  Kimbrell,  D.A.,  Engstrom,  A.,  Hultmark,  D.,  1991.  The  andropin  gene  and  its  product, a male‐specific antibacterial peptide in Drosophila melanogaster. EMBO J. 10, 163‐169.  Serio,  A.W.,  Jeng,  R.L.,  Haglund,  C.M.,  Reed,  S.C.,  Welch,  M.D.,  2010.  Defining  a  core  set  of  actin  cytoskeletal proteins critical for actin‐based motility of Rickettsia. Cell. Host Microbe. 7, 388‐398.  Sessions,  O.M.,  Barrows, N.J.,  Souza‐Neto,  J.A., Robinson,  T.J., Hershey,  C.L.,  Rodgers,  M.A., Ramirez,  J.L.,  Dimopoulos,  G.,  Yang,  P.L.,  Pearson,  J.L.,  Garcia‐Blanco,  M.A.,  2009.  Discovery  of  insect  and  human  dengue virus host factors. Nature 458, 1047‐50.  Souza‐Neto,  J.A.,  Sim,  S.,  Dimopoulos,  G.,  2009.  An  evolutionary  conserved  function  of  the  JAK‐STAT  pathway in anti‐dengue defense. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 17841‐17846.  St Johnston, D., 2002. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat. Rev. Genet. 3,  176‐88. 

22   

Stroschein‐Stevenson, S.L., Foley, E., O'Farrell, P.H., Johnson, A.D., 2006. Identification of Drosophila gene  products required for phagocytosis of Candida albicans. PLoS Biol. 4, e4.  Sun,  H.,  Bristow,  B.N.,  Qu,  G.,  Wasserman,  S.A.,  2002.  A  heterotrimeric  death  domain  complex  in  Toll  signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12871‐6.  Takehana, A., Yano, T., Mita, S., Kotani, A., Oshima, Y., Kurata, S., 2004. Peptidoglycan recognition protein  (PGRP)‐LE and PGRP‐LC act synergistically in Drosophila immunity. EMBO J. 23, 4690‐700.  Tauszig,  S.,  Jouanguy,  E.,  Hoffmann,  J.A.,  Imler,  J.L.,  2000.  Toll‐related  receptors  and  the  control  of  antimicrobial peptide expression in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 10520‐5.  Ulvila, J., Parikka, M., Kleino, A., Sormunen, R., Ezekowitz, R.A., Kocks, C., Rämet, M., 2006. Double‐stranded  RNA is internalized by scavenger receptor‐mediated endocytosis in Drosophila S2 cells. J. Biol. Chem.  281, 14370‐5.  Ulvila, J., Vanha‐aho, L.M., Kleino, A., Vähä‐Mäkilä, M., Vuoksio, M., Eskelinen, S., Hultmark, D., Kocks, C.,  Hallman, M., Parikka, M., Rämet, M., 2011. Cofilin regulator 14‐3‐3zeta is an evolutionarily conserved  protein required for phagocytosis and microbial resistance. J. Leukoc. Biol. 89, 649‐659.  Ulvila,  J.,  Vanha‐Aho,  L.M.,  Rämet,  M.,  2011.  Drosophila  phagocytosis  ‐  still  many  unknowns  under  the  surface. APMIS 119, 651‐662.  Valanne, S., Kallio, J., Kleino, A., Rämet, M., 2012. Large‐scale RNAi screens add both clarity and complexity  to Drosophila NF‐kappaB signaling. Dev. Comp. Immunol. 37, 9‐18.  Valanne, S., Kleino, A., Myllymäki, H., Vuoristo, J., Rämet, M. 2007. Iap2 is required for a sustained response  in the Drosophila Imd pathway. Dev. Comp. Immunol. 31, 991‐1001.  Valanne,  S.,  Myllymäki,  H.,  Kallio,  J.,  Schmid,  M.R.,  Kleino,  A.,  Murumagi,  A.,  Airaksinen,  L.,  Kotipelto,  T.,  Kaustio, M., Ulvila, J., Esfahani, S.S., Engström, Y., Silvennoinen, O., Hultmark, D., Parikka, M., Rämet,  M.,  2010.  Genome‐wide  RNA  interference  in  Drosophila  cells  identifies  G  protein‐coupled  receptor  kinase 2 as a conserved regulator of NF‐kappaB signaling. J. Immunol. 184, 6188‐6198.  Valanne, S., Wang, J.H., Rämet, M., 2011. The Drosophila Toll signaling pathway. J. Immunol. 186, 649‐656.  Vanha‐aho  L.M.,  Kleino,  A.,  Kaustio,  M.,  Ulvila,  J.,  Wilke,  B.,  Hultmark,  D.,  Valanne,  S.,  Rämet,  M.  2012.  Functional characterization of  the  infection‐inducible peptide  Edin  in Drosophila melanogaster.  PLoS  One 7, e37153.  Wang,  X.H.,  Aliyari,  R.,  Li,  W.X.,  Li,  H.W.,  Kim,  K.,  Carthew,  R.,  Atkinson,  P.,  Ding,  S.W.  2006.  RNA  interference directs innate immunity against viruses in adult Drosophila. Science 312, 452‐454.   Wicker,  C.,  Reichhart,  J.M.,  Hoffmann,  D.,  Hultmark,  D.,  Samakovlis,  C.,  Hoffmann,  J.A.,  1990.  Insect  immunity. Characterization of a Drosophila cDNA encoding a novel member of the diptericin family of  immune peptides. J. Biol. Chem. 265, 22493‐22498.  Williams, M.J., 2007. Drosophila hemopoiesis and cellular immunity. J. Immunol. 178, 4711‐6.  Williams, M.J., Ando, I., Hultmark, D., 2005. Drosophila melanogaster Rac2 is necessary for a proper cellular  immune response. Genes Cells 10, 813‐823.  23   

Zambon, R.A., Vakharia, V.N., Wu, L.P. 2006. RNAi is an antiviral immune response against a dsRNA virus in  Drosophila melanogaster. Cell. Microbiol. 8, 880‐889. 

24   

 

25   

Table I: Most important findings from Drosophila immune response RNAi screens.  Main findings 

Reference 

Imd pathway  PGRP‐LC 

Rämet et al., 2002 

Dnr1 

Foley & O’Farrell, 2004 

Iap2, Tab2 (TAB) 

Kleino et al., 2005 

Iap2, Tab2 (CG7417) 

Gesellchen et al., 2005 

Akirin 

Goto et al., 2008 

Ras/MAPK signaling 

Ragab et al., 2011 

PVR 

Bond & Foley, 2009 

zfh1 

Myllymäki & Rämet, 2012 

Toll pathway  Deaf‐1 

Kuttenkeuler et al., 2010 

Gprk2, (ush, pnr, wispy/TAMP) 

Valanne et al., 2010 

endocytic pathway (Myopic) 

Huang et al., 2010 

JAK/STAT pathway  Ptp61F, dBRWD3 

Muller et al., 2005 

Ptp61F, RanBP3, RanBP10 

Baeg et al., 2005 

ET, (Not4/CG31716) 

Kallio et al., 2010, Grönholm et al., 2012 

Ptp61F, Tbp, CG40121 

Fisher et al., 2012 

Phagocytosis (general)  PGRP‐LC 

Rämet et al., 2002 

14‐3‐3 , (Abi, cpa) 

Ulvila et al., 2011 

Specific host‐pathogen interactions (pathogen in brackets)  Translation machinery (picorna‐like viruses)  

Cherry et al., 2005 

Peste (Mycobacteria, Listeria) 

Agaisse et al., 2005, Philips et al., 2005 

Vacuolar trafficking, serine palmitoyltransferase (Listeria  monocytogenes) 

Cheng et al., 2005 

COPI activity, fatty acid biosynthesis (picorna‐like viruses) 

Cherry et al., 2006 

Tom complex (Chlamydia) 

Derre et al., 2007 

ESCRT machinery (Mycobacteria) 

Philips et al., 2008 

beta‐hexosaminidase (Mycobacteria) 

Koo et al., 2008 

ATP6V0D1, COX6A1 and NXF1 (influenza virus) 

Hao et al., 2008 

IRE1 (Brucella) 

Qin et al., 2008 

42 human homologs (Dengue virus) 

Sessions et al., 2009 

PI4KCA, USP22, CDC27 (Francicella tularensis) 

Akimana et al., 2010 

AMP‐activated kinase complex (Vaccinia virus) 

Moser et al., 2010 

Abl tyrosine kinase, Crk, Rac1, Cdc42, p21‐activated kinase 

Pielage et al., 2010 

26   

(Pseudomonas aeruginosa)  profilin, fimbrin/T‐plastin, capping protein, cofilin (Rickettsia) 

Serio et al., 2010 

Autophagy proteins (Cryptococcus neoformans) 

Qin et al., 2011 

WAVE and Arp2/3 complexes (Rickettsia) 

Reed et al., 2012 

 

27   

Functional genomic analysis of the Drosophila immune response  Susanna Valanne    Abstract    Drosophila melanogaster has been widely used as a model organism for over a century now, and also as an  immunological  research  model  for  over  20  years.  With  the  emergence  of  RNA  interference  (RNAi)  in  Drosophila as a robust tool to silence genes of interest, large‐scale or genome‐wide functional analysis has  become a popular way of studying the Drosophila immune response in cell culture. Drosophila immunity is  composed of cellular and  humoral  immunity mechanisms, and  especially the systemic, humoral response  pathways  have  been  extensively  dissected  using  the  functional  genomic  approach.  Although  most  components  of  the  main  immune  pathways  had  already  been  found  using  traditional  genetic  screening  techniques,  important  findings  including  pathway  components,  positive  and  negative  regulators  and  modifiers  have  been  made  with  RNAi  screening.  Additionally,  RNAi  screening  has  produced  new  information on host‐pathogen interactions related to the pathogenesis of many microbial species.   

28   

Functional genomic analysis of the Drosophila immune response  Susanna Valanne    Highlights  ‐ ‐ ‐ ‐

Drosophila is an excellent research model for innate immunity  Many immune mechanisms are conserved in evolution from flies to humans  RNAi is a robust tool for gene silencing in Drosophila in vitro and in vivo  RNAi screening approach has yielded many important findings in Drosophila immunity 

   

29