Immunologische charakterisierung der isoenzyme der alanin-aminopeptidase

CLINICA

CHIMICA

277

ACTA

IMMUNOLOGISCHE

CHARAKTERISIERUNG

DER

ISOENZYME

DER

ALANIN-AMINOPEPTIDASE

JORG E. PETERS, NORBERT REINH.4RD J. HASCHEN Institut

fiiv Klinische

(Revidicrtes

Biochemie*

hlanuskript

REHFELD,

LOTHAR

BEIER

der Martin-Luther-Univevsitat,

eingegangen

den 9. Oktober,

UND

Halla/Saale

(D.D.R.)

1967)

SUMMARY

Immunological

Characterization

of the Isoenzymes

of Alanine

Aminopeptidase

By former investigations it has been shown that human alanine aminopeptidases (ANAases) from different organs are isoenzymes. These isoenzymes are now characterized immunologically by agar gel precipitation techniques and inhibition studies with antisera. Human ANAases are very similar in their antigenic structures. Antisera to ANAase-I from liver and ANAase-5 from duodenal mucosa precipitate all the ANAases of various human organs, There is a complete fusion of precipitation lines. The inhibition obtainable by both antisera is equal for purified isoenzymes I and 5 and also for ANAases in homogenates or preparations obtained by electrophoretic isolation. In contrast, there are distinct differences between ANAases of different species. Liver ANAases of mouse, rat and guinea pig are not precipitated by antisera to human ANAase-r ; the inhibition of enzyme activity is significantly less than the inhibition found in the homologous system.

Im menschlichen Organismus wurden 5 elektrophoretische Varianten einer Aminopeptidase nachgewiesen, die vorzugsweise r_-Alanin-@-naphthylamid (ANA**) llydrolysiert1~2. Dieser Befund wurde an den gereinigten Enzymen aus Leber und und Duodenalschleimhaut bestatigF. Fur die ursprtinglich als Aminosaurearylamidasen bezeichneten Enzyme wurde daher die Benennung L-Alan311-peptidlz~drolasen (Alanin-aminopeptidasen) vorgeschlagen. Sie sind durch Substratspezifitat, pH-Optimum und Einfluss von Effektoren biochemisch eindeutig von der LAP und anderen Aminopeptidasen abgrenzbar. Die ANAasen verschiedener Organe tragen den Charakter von Isoenzymen. Einige physikalische und kinetische Eigenschaften sind in Tabelle I zusammengestellt. Sie stimmen hinsichtlich Substratspezifitat, Substrataffinitat, Molmasse und Beeinflussung durch Effektoren weitgehend tiberein. Unterschiede bestehen besonders im elektrophoretischen Verhalten, ferner in der * Direktor: Prof. Dr. Reinhard J. Haschen. ** Folgcnde hbktirzungen wurden verwandt: ANA = DI.-Alanin-p-naphthylamid-hydrochlorid; LN.4 = L-Lcucin-P-naphthylamid-hydrochlorid; ANAase = Alanin-aminopeptidase; L4P Leucin-aminopeptidase; LDH = Lactat-dehydrogenase. Clin.

Chim.

Acta,

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=

277-286

27s

mxms

et al.

Abhgngigkeit der Michaelis-Konstanten und der Maximalgeschwindigkeit vom pH, sowie in der Temperaturstabilitgt der Enzyme. Diese Unterschiede diirften auf geringe Abweichungen in der Nettoladung und der PrimZrstruktur zurtickzufiihren sein. Die Isoenzyme mit der h6chsten (Leber) und geringsten (Duodenalschleimhaut) Beweglichkeit in der SWkeblockelektrophorese wurden gereinigt und im HybridisieMobilit%t rungsversuch eingesetzt ly3. Die Bildung der Enzyme mit elektrophoretischer entsprechend den ANAasen z-4 unterstreicht die Isoenzymnatur der ANAasen. In Erweiterung der biochemischen Charakterisierung wird in der lrorliegenden Arbeit das immunologische Verhalten der ANAasen untersucht. MIITHODIK

ALVAase,: Mcnschliche Leber wurde im Glashomogenisator nach l’otterElvehjem homogenisiert. Das Homogenat wurde eingefroren, wieder auigetaut und zentrifugiert (3000 8). Der Homogenatiiberstand wurde gegen \Vasser dialysiert, dann

ISOENZYME DER ALANIS-AMIXOPEPTIDASE

279

eingeengt und im Starkeblock (Veronal-Na/HCl Puffer; ,u = 0.05, pH 8.6) elektrophoretisch aufgetrennt. Die ANAase-Fraktion wurde eluiert. Das dialysierte und eingeengte Eluat wurde der Gelfiltration an Sephadex G-ZOO (Pharmacia, Uppsala/ Schweden) unterworfen. Nach anschliessender Rechromatographie an Sephades G-zoo wurde eine spezifische Aktivitat von 6.5 U/mg Protein erreicht. Das entspricht einem Anreicherungsfaktor von ca. 2500 gegentiber dem Ausgangshomogenat. ASA use, : Menscl~licl~eDuodenalschleiml~aut wurde nach grtindlicher Sauberung des Homogenates wurden LAP und homogenisiert. Durch 6os/b (NH&SO,-Sattigung andere Fremdproteine ausgefallt ; ANAase blieb in Losung. Der cberstand wurde nach Dialyse und Einengung der Starkeblockelektrophorese unterworfen. Die Eluate mit der Hauptmenge an ANAase wurden an Sephadex G-ZOO filtriert. Es wurde eine spezifische Aktivitat von 6.6 U/mg Protein erreicht. Das entspricht einem Anreicherungsfaktor

von 88 gegentiber

dem Rohhomogenat.

Je 4 Kaninchen (Gewicht 2-3000 g) wurden gegen menschliche ANAase, bzw. ANAase, immunisiert. Verwendet wurden ANAase, nach Elektrophorese von Leberhomogenat (durchschnittliche spezifische Aktivitat 0.1 U/mg Protein) bzw. ANAase, aus Duodenalschleimhaut nach (NH,),SO,-Sattigung (spezifische Aktivitat 0.5 U/mg Protein). Jedes Kaninchen erhielt 2 subcutane Injektionen /Woche unter Verteilung des Gesamtvolumens (z ml) auf die 4 Extremitaten. Nach jeweils 2 Wochen wurde I Woche Pause eingeschaltet. Die Erstinjektion erfolgte zusammen mit inkomplettem Freund’schem Adjuvans. Spater wurden resuspendierte AllEiweiss-Prazipitate verabreicht (Ausfallung des Proteins durch Zusatz von IS’, AlCl, bei pH N 4.5; nach Zentrifugation Aufnahme des Prazipitates in 0.154 izir NaCl-Losung). Van der 9. Injektion ab wurden die nativen ANAase-Priiparationen verwandt. Die Tiere erhielten insgesamt 17721 Injektionen. Die Hauptversuche wurden mit demselben ANAase,- bzw. ANAase,-Antiserum durchgeftihrt.

Die

zweidimensionale

Doppeldiffusion

wurde

in I”,;

Agargel

durchgeftihrt

(Difco-Bacto-Agar in 0.05 JI Phosphatpuffer, pH 7.5; 20 mg NaN,/roo ml). Nach 24-4s Stunden wurden die nicht prazipitierten Proteine mit 0.154 Ill NaCl-LBsung (24-4s Stunden unter mehrmaligem Wechsel) ausgewaschen. Zur Identifizierung der prazipitierten ANAasen wurden die Praparate anschliessend mit ANA (1.0 mill, bezogen auf die L-Komponente) oder LNA (1.7 mU) in Phosphatpuffer (pH 7.0; 50 mJl) inkubiert. Als Kupplungskomponente fur das enzgmatisch freigesetzte B-Naphthylamin diente Echtblausalz B (IO mg/zo ml). Die Farbung erfolgte nach Sicht. LAP in Rohllomogenatcn oder nach elektrophoretischer Anreicherung aus Leber lies3 sich unter diesen Bedingungen farberisch nicht darstellena. Agargel Elektvo$horese Fur die Agargel Elektrophorese wurde 19~ Difco-Special-Agar-Noble in Veronal-Na/HCl Puffer (,u = 0.05; pH 8.6) benutzt. Die Elektrophorese wurde nach der Methode von Wieme5 unter Petrolather im Kiihlschrank durchgeftihrt. Zur Verlangerung der nutzbaren Trennstrecke wurden aber Glasplatten von IOO x 26 mm als Geltrager verwendet. Die Hohe der Agarschicht betrug etwa 2 mm. Wahrend der

PETERS

280

et

al.

Elektrophorese wurde die Stromstarke pro Geltrager bei 12 mA gehalten. Insgesamt konnten 5 Elektropherogramme gleichzeitig angefertigt werden. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde die Enzymreaktion angesetzt. ANAase-Restimmung und Hemmversuche in v&o Die Enzymbestimmung wurde mit ANA (0.75 mX, bezogen auf die L-Komponente) in Phosphatpuffer pH 7.0 durchgeftihrt6. Die Ansatze enthielten 1.0 ml Substrattpuffer-LBsung und 0.02 ml Untersuchungsgut. Bei den Immunhemmversuchen wurden Antigen und Antiserum stets in gleichen Volumina (je 0.01 ml) eingesetzt, variiert wurde je nach Bedarf die Konzentration der Reaktionspartner. Bei den Kontrollansatzen wurde zu 0.01 ml Antigen bzw. Antiserum die gleiche Menge Wasser oder 0.154 M NaCl Losung zugesetzt. Die Reaktion zwischen Antigen und Antikorper (Prainkubation) lief stets bei 25’ ab. Inkubiert wurde 60 min bei 25’. Anschliessend wurde die Reaktion mit 2.0 ml 0.4 N HCl unterbrochen und mit 2.0 ml 4’: O Losung von @-Din~ethylaminobenzaldel~yd in Methanol ein gelber ITarbstoff erzeugt. Die Messung erfolgte am Spekol (VEB Carl Zeiss, Jena) bei 450 nm und I cm Schichtdicke. ERGEUIiISSE

Elektro@horetische Beweglichkeit der ANAasen vevschiedener Organe im Agargel In Fig. I ist die elektrophoretische Beweglichkeit der ANAasen aus Leber, Pankreas, Niere, Ileum- und Duodenalschleimhaut im Agargel dargestellt. Es wurden Homogenattiberstande nach Dialyse (Aktivitat ca. zoo U/l) eingesetzt. Das Leber-

Fig. 1. Elcktrophoretische Beweglichkeit der ANAasen im Agargel. I Leber (ANAase,), (ANAasc,), 3 Niere (AN_4ase,), 4 Ileumschleimhaut (ANAase,), 5 Duodcnalschleimhaut Cl&.

Chim.

Acta,

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277-281,

L I’ankreas (,\NAase,).

ISOENZYME

DER

enzym wanderte

281

ALANIN-AMINOPEPTIDASE

am weitesten

anodisch,

das Enzym

aus Duodenalschleimhaut

am

weitesten kathodisch. Das Nierenenzym war in Startnahe lokalisiert. Wurde normales Serum eingesetzt, dann fand sich eine schwach gefarbte ANAase,-Bande. Es ist auffallend, dass sich in jedem Organ nur ein Isoenzym nachweisen liess. k’erhalten der ANAasen bei dev Immundi’usion Die hochgereinigten Isoenzyme I und 5 werden sowohl durch Anti-ANAase, als such durch Anti-ANAase, prazipitiert (Fig. 2). In dem in der Fig. 3 dargestellten Versuch wurden dialysierte Homogenate aus Leber, Pankreas, Niere, Ileum- und Duodenalschleimhaut gegen ANAase,-Antiserum eingesetzt, ausserdem mit ANAase, angereichertes Serum. Neben Fremdproteinprazipitaten (innere Banden in Fig. 3)

Fig. 2. Verhalten der hochgereinigten ANAasen bei der Immundiffusion. A ANAase,, l3 .4NAasc, (spezifische Aktivitkt jeweils ca. 6.5 U/mg Protein), I Antiserum gegen ANAase,, \’ Antiserum dcr Enzym~Antienz~m-Precipitate gegen ANAase, (Verdiinnung jeweils I : 5). Idcntifizieruq mie unter Methodik angegeben. Fig. 3. Verhalten nicht gereinigter ANAasen bei der Immundiffusion. I AiX;.4asc, (Leber), L -\X& asez (Pankreas), 3 ANAase, (Niere), 4 ANAase, (Ileumschleimhaut), 5 ANAascj (Duodenalschleimhaut), 6 ANAase, (mit ANAase, angereichertes Serum), I .i\ntiserum gegen XN.4ase,. Identifizierung der Enzym-Antienzym-Prgzipitate (Bussere Rande) wie unter Mcthodik angegeben.

wurden Enzym-Antienzym-Prazipitationslinien loch und jedem Antigenreservoir identifiziert.

zwischen dem zentralen AntiserumDie Banden gingen komplett inein-

ander tiber, Sporne oder Hemmung waren nicht nachweisbar. Bei Verwendung von Antiserum gegen ANAase, ergab sich der gleiche Befund. Danach liegt der Reaktionstyp I nach Ouchterlony’ vor, und unsere Versuche sprechen fur eine sehr enge Verwandtschaft der ANAasen aus verschiedenen menschlichen Organen. Eine IsoenzymSpezifitat der Antikijrper besteht also nicht. Dagegen wurde genuine LAP aus menschlicher Leber durch beide Antiseren nicht prazipitiert und liess sich somit such immunologisch von den ANAasen abtrennen4. Hemmung der ANAasen durch Antiseren in vitro Zur weiteren Charakterisierung der ANAase--Anti-ANAase-Systeme Clin.

Chim.

Acta,

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wurde in ~77-286

PETERS et al.

282

Ausnutzung

der doppelten

Spezifitat

des Enzymproteins

der Einfluss

der Antiseren

auf die Aktivitat der Isoenzyme untersucht. Zunachst wurde der zeitliche Ablauf der Enzymhemmung durch homologe Antiseren geprtift (Fig. 4). Die hochgereinigten Isoenzyme wurden in einer Konzentration von ca. 65 U/l eingesetzt, Anti-ANAase, wurde I : 2, &Anti-ANL4ase, I : j verdtinnt. Schon nach 30 min war die Hemmung fast maximal, Die Restaktivitat lag in diesem \‘ersuch fur ANAase, bei etwa 17~6, fur ANAase, bei etwa 267;. Fur die weiteren \‘ersuche wurde die Prainkubationszeit

auf I Stunde festgesetxt.

100)

\\Turden steigende Antiserumkonzentrationen gegen konstante Mengen hocligereinigter Enzyme (70 [J/l) eingesetzt, dann ergaben sic11 typisclle Enzymhemnkurven, die nach steilem initialem Abfall und einer j!bergangspllase annahernd parallel zur L1bszisse verliefen (Fig. 5). Es zeigte sich weiter, dass bcide L4NAaseIsoenzyme durch beide Antiseren gehemmt wurden. Das Ausmass der Hemmung war im I
ISOENZYME

DER ALANlN-AMINOPEPTIDASE

283

1.5 F

!s-n ANAasel ohne Antiserum G--C ANAore,-Anti-ANAase$ _

ANAose-Anti-ANAoseg

0 I?

_//i

Enzymkonzentration

Antiserumkonrentration

Fig. 5. Hemmung hochgereinigtcr AN.L\ase, bzw. ANAase, (jeweils 70 U/l) durch abgestufte Antiserumkonzentrationcn. .4ntiserumkonzentration 1.0 = unverdiinnt. Enzymkonzentration ohne Antiserum = 100%. Fig. 6. I~elnrnnn~ abgestufter Konzentrat~one~ Anti-AN&se, (I : 4 vcrcliinnt) und Anti-ASAase,

ele~trol~horetisch : 3 verdiinnt).

gereinigter

ANAase,

durch

(I

war im System ANAase,-Anti-ANAase, die Restaktivitat bei 12 U/l kleiner als 576, betrug bei 240 U/l jedoch schon annahernd 30%. Die Hemmbarkeit der ANAase, durch Antiseren war von ihrem Rcinheitsgrad abhangig. Bei rohem I~~berholllogenat (90 und 30 U/l) wurde eine maximale Hemmung von 70:/u beobachtet, doch bereits nach dem ersten Reinigungsschritt, der Elektrophorese, wurden etwa S59/6 Hemmung erreicht. Dieser Wert entspricht dem bei hochgereinigtem Enzym (Fig. 5). lihnlich wie ungereinigte AN&se, wurde menschliche ANAase, in verdtinntem Nierenhomogenat (50 U/l) durch die Antiseren beeinflusst. Die AktivitHt des Nierenenzyms wurde durch Anti-ANAase, und AntiANAase, maximal um 70yb gehemmt. Immu?zologisclaes Verhalteu der Leber-ANAaseft verschiedtwer S$ezies Zur Prtifung auf Speziesunterschiede wurden die Leberenzyme von Maus, Ratte, Meerschweinchen und Mensch vergleichend in ihrem Verhalten gegen Antihuman-ANAase, untersucht, einmal im Doppeldiffusionstest (Fig. 7), zum anderen im Enz~ll~llemrntest (Fig. S). D ie relative elektroplloretisc~e Be~,eglichkeit (Start = 0, Albumin = 1.0) lag im St&keblock fur Leber-ANAase van Ratte und Meerschweinthen wie beim Menschen bei 1.0. Zur Agargel-Prazipitation wurden die Leberhomogenate nach Dialyse in durchschnittlicher Aktivitat von 80 U/l in die Blusseren Lecher gegeben, die Antiserumkonzentration im Zentralloch wurde variiert. Irn System menschfiche ANAase,-Anti-ANAase, war neben einem ~remdproteinpr~zipitat (~~ahrscl~einlich Albuulin-Anti-Albumin) ein Enzym-Antienz~-Pr~zipitat nachweisbar. Es wurde durch seine Enzymaktivitat identifiziert. Seine Lage zwischen Antigen- und Antikorper-Reservoir war erwartungsgemass von der Antiserumkonzentration abhangig. In der Fig. 7 ist das Ergebnis bei r : 5 verdtinntem Antiserum CZi+t.Ckil‘Yz.Acfn,

I9 (rg08)

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PETERS

et al.

dargestellt. Bei Maus, Ratte und Meerschweinchen wurde dagegen bei keiner Verdtinnung (unverdtinnt bis I : IOO) ein Enzym-Antienzym-Prazipitat gefunden. Ein Fremdproteinprazipitat war bei der Ratte in einem bestimmten Konzentrationsbereich nachweisbar. Diese Ergebnisse zeigen, dass ANAasen verschiedener Spezies trotz tibereinstimmender elektrophoretischer Beweglichkeit eine unterschiedliche antigene Struktur besitzen.

0.25

0.5

Antiserumkonzentration

n Ratte q Meerschweinchen Fig. 7, Verhalten nicht gereinigter Leber-ASAasen verschicdener Spezics bei der Immundiffusion. A Mensch, B Rlaus, C Katte, D Meerschweinchen. I Antiserum gegcn menschliche A?;hase,. Identifizicrung des Enzyn-Antienzym-Prszipitates (2ussere Bande) wie unter Methodik angegeben. Fig. 8. Hemmung nicht mcnschliche XNAase,. Antiserum = 100”~.

gereinigter Leber-ANAasen Antiserumkonzentration

verschiedcner Spezies durch Antiserum 1.0 = unverdiinnt, Enzymkorlzclltratiot

gegcn ohne

Das Ergebnis der Immunprazipitation wurde durch den Enzymhemmtest erweitert (Fig. 8). Wahrend menschliche ANAase, in rohem Leberhomogenat-wie in die Hemmden anderen Versuchen-urn etwa 7016 gehemmt wurde, tiberschritten werte bei den anderen untersuchten Spezies nicht 331” und lagen im Mittel bei 15~~;. Erganzend wurde das Enzym aus Meerschweinchenleber such nach elektrophoretischer Reinigung (40 U/l) im H emmtest eingesetzt. Dabei nahm die Hemmbarkeit durch Antihuman-ANAase, weiter ab ; die Restaktivitat stieg auf tiber 900,,. 1)ISKUSSION

Die gereinigten ANAasen, die mit Ausnahme der deutlich verschiedenen elektrophoretischen Mobilitat nur geringe Unterschiede aufweisenlp3, sind such immunologisch sehr eng verwandt. Es wurde nachgewiesen, dass die untersuchten mensclilichen ANAasen unabhangig von Lokalisation und Reinheitsgrad sowohl durch AntiANAase, als such durch Anti-ANAase, prazipitiert werden. Die Antikiirper weisen also keine Isoenzym-Spezifitat auf. Im Immunhemmtest wurde gezeigt, dass die beiden gereinigten Isoenzyme durch beide Antiseren grundsatzlich in etwa gleichem Clin.

Chiwz. .4c/a,

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ISOENZYME

Ausmass

DER ALANIN-AMINOPEPTIDASE

hemmbar

sind. Ebenso

war die maximale

285 Aktivitatshemmung

bei nicht

gereinigten menschlichen Isoenzymen unabhgngig von der Organherkunft (im Model1 Leber- und Nierenhomogenat) und der Art des eingesetzten Antiserums. Gemessen am zeitlichen Ablauf der Immunhemmung, besassen die AntikGrper eine hohe Antigenaffinitgt. Wir hatten bei Voruntersuchungen (vgl. aber such Fig. 5) die Beobachtung gemacht, dass die gereinigten Isoenzyme I und 5 durch unsere ANAase,-Antiseren in niedrigen Konzentrationen geringer gehemmt wurden als durch die AKAase,-Xntiseren. Ein grundsgtzlicher Unterschied liegt aber nicht vor. Die ANAase,-Kaninchen wurden lgnger behandelt als die ANAase,-Kaninchen. Da bei der allgemein vorliegenden heterogenen AntikGrperpopulation (z.B. hemmende und nicht hemmende Antikiirper) der relative Anteil hemmender AntikGrper mit Iginger dauernder Immunisierung zunimmt*, lasst sich der Befund zwanglos als Titerunterschied hemmender Antikijrper deuten. Wghrend menschliche ANAasen verschiedener Lokalisation immunologisch weitgehend iibereinstimmen, wurden ANAasen anderer Spezies durch AntihumanANAase, nicht prszipitiert. Es ist aber bekannt, dass such und ausschliesslicb 16s lithe Enzym-Antienzym-Komplexe mit gehemmter enzymatischer Aktivitat entstehen kiinnen. Im Falle der Aminotransferasen heterologer Spezies wurden sogar weit iiberwiegend liisliche Enzym-Antikiirper-Komplexe mit gehemmter AktivitBlt gefundeng. Urn Riickschliisse auf die Verwandtschaft der ANAasen verschiedener Spezies ziehen zu kennen, wurde zu&zlich der Immunhemmtest durchgefiihrt. Die geringe und hinter dem homologen System eindeutig zurtickbleibende Hemmung in heterologen Systemen zeigt zusammen mit dem Prgzipitationstest, dass ANAasen verschiedener Spezies eine unterschiedliche antigene Struktur besitzen. Diese Befunde unterscheiden sich wesentlich von denjenigen, die bei der LDH erhoben worden sind. Antikijrper gegen LDH, oder LDH, der gleichen Spezies sind isoenzymspezifisch, aber Antiseren gegen reines Isoenzym,, z.B. vom Schwein, pr%zipitieren such die Isoenzyme, und 5 vom MenschenlO. Bei den LDH-Isoenzymen wurden z verschiedene Untereinheiten nachgewiesen, von denen jede unter der Kontrolle eines gesonderten Gens gebildet wirdll. Bei den ANAasen ergibt sich aus unseren Befunden kein Hinweis auf z unterschiedliche Grundtypen. Zu ghnlichen Ergebnissen kam der .4rbeitskreis urn Pfleiderer12,13 bei den Enolasen. Unsere Befunde lassen folgende Interpretationen zu : I. Die ANAasen werden durch mehrere Gene determiniert, doch ist in jedem Organ nur eines aktiv. 2. Die ANAasen werden durch ein Gen kontrolliert; die physikalischen Unterschiede kdnnten z.B. aus sekundgren Vergnderungen am Enzymprotein resultieren. Die letztere Ansicht halten wir fiir wahrscheinlicher. ZUSAMMENFASSUNG

Friihere Untersuchungen hatten ergeben, dass menschliche Alanin-aminopeptidasen (Aminos2ure-arylamidasen) verschiedener Lokalisation den Charakter von Isoenzymen besitzen. Mit Hilfe der Prgzipitationstechnik im Agargel und durch Immunhemmversuche werden die Isoenzyme immunologisch charakterisiert. Die menschlichen ANAasen stimmen in ihrer Antigenstruktur weitgehend iiberein. Antiseren C&z. Chim. Acta, 19 (1968) 277486

286

PETERS

et at.

gegen ANAase, bzw. ANAase, prazipitieren alle ANAasen verschiedener menschlicher Organe; die Prazipitationsbanden gehen komplett ineinander tiber. Im Immunhemmtest sind die gereinigten Isoenzyme I und 5 durch beide Antiseren in gleichem Ausmass hemmbar, ebenso ANAasen in Homogenaten oder nach elektrophoretischer Isolierung. Dagegen bestehen deutliche Unterschiede zwischen den ANAasen verschiedener Spezies. Leber-ANAasen von Maus, Ratte und Meerschweinchen werden durch Antiseren gegen menschliche ANAase, nicht prazipitiert ; die Aktivitatshemmung bleibt weit hinter der Hemmung im homologen System zurtick. LITERhTUR 1 H. J. HASCHEN, N. REHFELD UND H. GIESXKE, A’atuvwiss., 53 (1966) 434. L N. REHFELD, J, E. PETERS, H. GIESECKE, L. BEIER USD R. J. HASCHEN, Germ., im Truck (1967). 3 N. KEHFELD, J. E. PETERS, H. GIESECKE UND R. J. HASCHES, Acta BioZ. died.

rlcta

8 9 IO II IL Ij

Med.

G%wz., im Druck

(1967). 4 J. E. PETERS, N. REHFELD UND R. J. HASCHES, Cli@. Chzwz. Acta, 17 (1967) 516. 5 K. J, \VI~IE, Clin. Chzm. Acta, 4 (1959) 317. 6 1%‘. F.~RR, r\T.REHFELD, D. REICHELT UKD R. J, HASCHEN, ic.iTfed.Labortechnik, 7

Biol.

in1 Druck

(1967). 0. OUCHTERLONY, in 0. WESTPHAL (bang.), Iwmzmchew~ie, Springer \-et-lag, BerlinPHeidelberg~Ne\v York, 1965, S. 13. XI. BR.ANSTER mm B. ~INADER, 1. Inzunum~., 87 (1961) 18. N. LAXC~ UND S. ~V.IASSARRAT,in H. PEETERS (Hrsg.),Protides oj the Rioh+$ca!. Fluids, Elscvier, 1964, 11.210. Ii. RAJEn-situ, in 0. WESTPHAL (Hrs,o.), Immunchemir, Springer Verlag, Berlin-HeidelbergP New York, 1965, s. 173. c. R. SH.\\V uzln E. BaRTO, PVCX. ,\‘atl. Acad. SCi. U.S., 50 (1963) 211. P. J. I~AVF, R. W. KWLAN UND G. PFLEIDERER, Rzoc/wwz. Z., 315 (1966) 440. C;. I'FLEIDERER,X.SEUFAHRT-I(RRILING, K.1V. I