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Incidencia de las mutaciones a1555g en el adn mitocondrial y 35delg en el gen gjb2 (conexina 26) en familias con hipoacusia neurosensorial postlocutiva no sindrómica en cantabria
Acta Otorrinolaringol Esp 2002; 53: 563-571
INVESTIGACIÓN BÁSICA O CLÍNICA
INCIDENCIA DE LAS MUTACIONES A1555G EN EL ADN MITOCONDRIAL Y 35delG EN EL GEN GJB2 (CONEXINA 26) EN FAMILIAS CON HIPOACUSIA NEUROSENSORIAL POSTLOCUTIVA NO SINDRÓMICA EN CANTABRIA J. GALLO-TERÁN*, C. MORALES-ANGULO*, I. DEL CASTILLO**, M. VILLAMAR**, M. Á. MORENO-PELAYO**, J. GARCÍA-MANTILLA*, F. MORENO** *SERVICIO
DE
OTORRINOLARINGOLOGÍA. HOSPITAL SIERRALLANA. TORRELAVEGA (CANTABRIA). **UNIDAD MOLECULAR. HOSPITAL RAMÓN
Y
DE
GENÉTICA
CAJAL. MADRID
RESUMEN
I
ntroducción: La hipoacusia neurosensorial es un trastorno con una gran trascendencia social, que afecta aproximadamente al 10% de la población general. Se calcula que en más del 50% de los casos tiene una causa genética. Las dos mutaciones más frecuentemente encontradas en la población española responsables de hipoacusia neurosensorial son la mutación A1555G en el gen del RNA ribosómico 12S del genoma mitocondrial y la mutación 35delG en el gen GJB2 (conexina 26, cromosoma 13). Métodos: Mediante estudio genético se ha determinado la frecuencia de las mutaciones A1555G en el ADN mitocondrial y 35delG en el gen de la conexina 26 en 21 pacientes pertenecientes a 21 familias no consanguíneas y no relacionadas entre sí, con hipoacusia neurosensorial bilateral postlocutiva no sindrómica de
Cantabria. Resultados: El estudio mostró la presencia de la mutación A1555G en 6 pacientes, de los cuales 5 tenían antecedentes de exposición a aminoglucósidos. En todos ellos la pérdida auditiva afectaba sobre todo a altas frecuencias. No se detectó la mutación 35delG en ningún paciente. Conclusiones: La mutación A1555G del ADN mitocondrial es frecuente en la población de Cantabria. Debe sospecharse esta mutación y evitar la administración de aminoglucósidos en pacientes pertenecientes a familias con transmisión materna de la hipoacusia y con presencia de miembros con sordera inducida por estos fármacos. La mutación 35delG en el gen GJB2 no parece constituir una causa frecuente en casos familiares de hipoacusia neurosensorial no sindrómica de manifestación postlocutiva en nuestro medio.
PALABRAS CLAVE: Hipoacusia neurosensorial. Hereditaria. Hipoacusia no sindrómica.
ABSTRACT INCIDENCE OF THE MUTATIONS A1555G IN THE MITOCHONDRIAL DNA AND 35delG IN THE GJB2 GENE (CONNEXIN-26) IN FAMILIES WITH LATE-ONSET NON-SYNDROMIC SENSORINEURAL HEARING LOSS FROM CANTABRIA
I
ntroduction: Sensorineural deafness is a very common disorder in humans, which affects approximately 10% of the population. Genetic causes are suggested to be responsible for more than half of the cases. The A1555G mutation in the mitochondrial 12S rRNA gene and the 35delG mutation in the GJB2 gene are the most common mutations for sensorineural deafness in the Spanish population. Methods: A genetic study was carried out in order to determine the frequency of the mutations A1555G in the mitochondrial DNA and 35delG in the connexin-26 gene in 21 patients from 21 non-consanguineous unrelated families affected by late-onset bilateral non-syndromic sensorineural hearing loss from Cantabria. Results: The A1555G mutation was
found in 6 patients. Five of these 6 patients had been treated with aminoglycosides. In all of them the auditory impairment affected mainly the high frequencies. The 35delG mutation was not found in any of the patients. Conclusions: The A1555G mutation in the mitochondrial DNA has been found to be the most common amongst the Cantabrian population. The A1555G mutation should be suspected in those members of families affected by sensorineural hearing impairment with a maternal inheritance pattern and ototoxicity from treatment with aminoglycoside antibiotics. The 35delG mutation in the GJB2 gene does not seem to be a major cause of deafness in families with late-onset non-syndromic sensorineural hearing loss in our area.
KEY WORDS: Sensorineural hearing loss. Hereditary. Non-syndromic hearing loss. Correspondencia: Carmelo Morales Angulo. Alto de las Veneras, nº 8. Puente Arce 39478. Cantabria. E-mail:[email protected] Fecha de recepción: 22-1-2002 Fecha de aceptación: 2-7-2002 Acta Otorrinolaringol Esp 2002; 53: 563-571
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J. GALLO-TERÁN ET AL. HIPOACUSIA HEREDITARIA
INTRODUCCIÓN La hipoacusia es un trastorno con una gran trascendencia social, que aproximadamente afecta al 10% de la población general: a 1 de cada 1.000 recién nacidos1,2 y al 10% de las personas mayores de 65 años3. La sordera puede ser debida a factores ambientales y factores hereditarios. La progresiva identificación y control de las causas ambientales de sordera como son las infecciones perinatales, trauma acústico, hiperbilirrubinemia o fármacos ototóxicos como los aminoglucósidos, ha producido un incremento relativo en la proporción de causas genéticas de sordera en los últimos años. Se calcula que la sordera congénita tiene una base genética en más del 50% de los casos2,4. Sin embargo, no existen estudios sistemáticos que determinen la frecuencia y modo de herencia de la hipoacusia neurosensorial postlocutiva. La hipoacusia de causa genética puede clasificarse como sindrómica o no sindrómica. El término sindrómico se refiere a formas específicas de combinación de la hipoacusia con otras alteraciones. Entre los ejemplos más característicos se incluyen los síndromes de Waardenburg, Usher, Pendred y Alport. Se denomina hipoacusia no sindrómica cuando aparece de forma aislada (aproximadamente 70% de los casos)5. A lo largo de los últimos ocho años se han encontrado numerosos loci (pequeñas regiones cromosómicas) donde deben residir genes responsables de sorderas sindrómicas y no sindrómicas. Muchos de estos genes ya han sido identificados. Debe tenerse en cuenta que se ha estimado que mutaciones en más de un centenar de genes podrían causar hipoacusia2. Hasta el momento se han identificado 66 loci de sordera no sindrómica: 32 loci de sordera no sindrómica autosómica dominante (DFNA), 29 de sordera no sindrómica autosómica recesiva (DFNB) y 5 de sordera no sindrómica ligada al cromosoma X (DFN)6. Más de veinte genes responsables de hipoacusia no sindrómica ya han sido identificados. Por otra parte, mutaciones en los genes del ADN mitocondrial también pueden ser responsables de sordera no sindrómica7. A pesar del gran número de loci responsables de hipoacusia no sindrómica identificados, un solo locus, DFNB1, representa una gran parte de los casos (hasta el 50% de los casos de sordera prelocutiva no sindrómica), con ligeras variaciones en frecuencia en las diferentes poblaciones. El gen implicado en este tipo de sordera es GJB2 (Gap Junction Beta 2), que codifica la proteína conexina 26 (Cx26)8. Se han identificado numerosas mutaciones di-
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ferentes en el gen de la conexina 26 que producen hipoacusia no sindrómica autosómica recesiva. La mutación más frecuente es la 35delG (también llamada 30delG), que se produce en una serie de seis residuos G en las posiciones 30-35 de la secuencia de ADN del gen GJB2. Esta mutación se encuentra en más de dos terceras partes de las personas con DFNB1, fundamentalmente en la región mediterránea, en personas de diferentes etnias9-12. Se han descrito otras muchas mutaciones en el gen de la conexina 26, la mayoría en unos pocos pacientes, responsables tanto de hipoacusias sindrómicas como no sindrómicas13-20. Mutaciones en los genes de otras conexinas también pueden causar sordera21-23. Por otra parte, mutaciones en el ADN mitocondrial son en nuestro país causa frecuente de hipoacusia, la cual generalmente se presenta de forma no sindrómica24. En los casos en los que aparece asociada a otras alteraciones, es frecuente que las mutaciones mitocondriales produzcan fenotipos diferentes en distintas familias o pacientes. Se han descrito en el genoma mitocondrial cinco mutaciones productoras de hipoacusia no sindrómica. Sin embargo, para tres de esas cinco mutaciones se han encontrado en los pacientes síntomas adicionales acompañando a la hipoacusia. Con excepción de la mutación más frecuente, A1555G en el gen del rRNA 12S, todas las mutaciones responsables de hipoacusias no sindrómicas están localizadas en el gen del tRNA Ser (UCN)6. La mutación A1555G en el gen del rRNA 12S se encontró en familias con hipoacusia no sindrómica de herencia materna y en pacientes y familias con hipoacusia por ototoxicidad inducida por aminoglucósidos 25,26. Esta mutación parece ser más frecuente en ciertas poblaciones, incluyendo la española27 y la japonesa28. La mutación hace a los individuos susceptibles al daño coclear por el tratamiento con aminoglucósidos a concentraciones que normalmente no afectarían la audición. Con carácter general, se ha descrito que hasta el 25% de las personas que reciben este tipo de antibióticos desarrollan sordera29. Se ha calculado que la probabilidad de que una persona con la mutación A1555G desarrolle hipoacusia a la edad de 30 años es del 95% si se trata con aminoglucósidos y del 40% si no recibe tratamiento27. La mutación A1555G se localiza en el gen del rRNA 12S, afectando a una región del RNA ribosómico que, en su homólogo bacteriano, está implicada en la unión al aminoglucósido. Se supone que la mutación haría su estructura secundaria más semejante a la bacteriana, produciendo una mayor susceptibilidad a los aminoglucósidos6.
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ACTA OTORRINOLARINGOLÓGICA ESPAÑOLA
El objetivo de este estudio es determinar la frecuencia de las mutaciones A1555G en el ADN mitocondrial y 35delG en el gen de la conexina 26 en familias con hipoacusia neurosensorial bilateral postlocutiva en Cantabria.
MÉTODOS Fueron incluidos en nuestro estudio 21 pacientes pertenecientes a 21 familias, no consanguíneas y no relacionadas, con al menos dos miembros afectos de hipoacusia neurosensorial bilateral no sindrómica postlocutiva. Todos ellos eran residentes en el área sanitaria de Torrelavega-Reinosa (Cantabria), y fueron estudiados en el Servicio de Otorrinolaringología del Hospital Sierrallana (Torrelavega). Se excluyeron del estudio los pacientes cuya causa podía ser justificada únicamente por un factor ambiental, como por ejemplo trauma acústico crónico. Se obtuvo un consentimiento informado para el análisis genético de todos los pacientes que participaron en el estudio. Se recogieron de la historia clínica los siguientes datos: edad actual, sexo, edad de inicio de la hipoacusia, factor desencadenante de la misma, perfil audiométrico y grado de pérdida auditiva. Se realizó un árbol genealógico de cada familia, recogiéndose los miembros afectos. Se clasificó a las familias como autosómicas dominantes, autosómicas recesivas, ligadas al sexo, mitocondriales o de patrón de herencia ambiguo, de acuerdo con los modelos de transmisión de la sordera30. Para determinar el perfil audiométrico se utilizó la clasificación de Liu y Xu31. La intensidad de la hipoacusia se registró mediante la clasificación audiométrica de las deficiencias auditivas (recomendación biap 02/1 - Lisboa 1997) en ligera (21-40 dB), moderada (41-70 dB), severa (71-90 dB), profunda (91-119 dB) y total o cofosis (120 dB). Se realizó una extracción sanguínea a todos los pacientes, obteniéndose 3 tubos de 5 cc para el estudio genético. De cada muestra de sangre se extrajo el ADN, para utilizarlo en la detección de la mutación A1555G en el ADN mitocondrial y de la mutación 35delG en el gen de la conexina 26. El estudio genético fue realizado en la Unidad de Genética Molecular del Hospital Ramón y Cajal de Madrid.
do en la determinación precisa del tamaño de un fragmento de ADN de 122 pares de bases (pb), amplificado por PCR, que incluye la posición nucleotídica 35 del gen Cx26. Para la amplificación del fragmento se utiliza una pareja de primers, uno de ellos marcado con fluorescencia (marcaje con TET, FAM o HEX). Los fragmentos amplificados se resuelven por electroforesis capilar en el analizador ABI-Prism 310 de la casa comercial Perkin-Elmer. Los posibles resultados respecto a esta mutación serán: • En el caso de un individuo que porte el alelo silvestre en homozigosis, sólo aparecerá un pico de electroforesis con un tamaño de 122 bases. Será un individuo sano, no portador. • En el caso de un individuo que porte en homozigosis el alelo mutado 35delG (pérdida de la guanina en la posición 35 del gen Cx26) sólo aparecerá un pico de electroforesis de 121 bases (una menos que en el caso anterior). • Los individuos portadores de la mutación presentarán dos picos de electroforesis, de 121 y 122 bases, que corresponden a los alelos 35delG y silvestre, respectivamente. Serán individuos portadores normoyentes. Detección de la mutación A1555G en el ADN mitocondrial Para el estudio de la mutación A1555G, la muestra de ADN de cada individuo se utilizó para amplificar, por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un fragmento de ADN mitocondrial de 358 pb. Este producto de la PCR se sometió a digestión con la endonucleasa de restricción Alw26I. Los fragmentos resultantes se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para determinar su tamaño. El fundamento de esta prueba genética radica en que el fragmento amplificado de 358 pb tiene una única diana de corte para la enzima Alw26I en los individuos normales. En dichos individuos la digestión del fragmento de 358 pb produce dos fragmentos más pequeños, uno de aproximadamente 230 pb y otro de unos 130 pb. En los portadores de la mutación se pierde dicha diana, por lo que el fragmento no resulta digerido. Finalmente, la presencia de la mutación se confirmó mediante secuenciación del ADN.
Detección de la mutación 35delG (conexina 26)
RESULTADOS
Para el análisis de la mutación 35delG en el gen de la conexina 26 se empleó un método basa-
En la Tabla 1 se detallan los principales datos obtenidos.
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Tabla 1: Resultados Familia
Edad
Sexo
Nº afect.
Patrón
Desenc
Grado
Perfil
Mutación
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
50 33 45 9 58 40 38 26 57 73 56 46 55 50 42 38 13 62 44 58 50
M M V V M M M M M V V M M M M V V M M M V
13 11 3 9 7 3 4 5 7 14 6 8 4 3 2 2 2 3 13 13 5
Mitoc Ambiguo Mitoc Ambiguo Mitoc AD Ambiguo Mitoc AD Mitoc AD Ambiguo Ambiguo Mitoc Ambiguo Ambiguo Ambiguo Ambiguo AD AD Mitoc
Aminogluc
Moderada Moderada Severa Severa Severa Moderada Ligera Ligera Moderada Severa Severa Profunda Profunda Moderada Moderada Moderada Ligera Severa Moderada Moderada Severa
Descend. Ascend. R Descend. Plana Descend. Descend. R Descend. R Descend. En U R Descend. Descend. Residual Residual Ascend. Plana Descend. Descend. Descend. Plana Descend. R Descend.
A1555G No A1555G No A1555G No No A1555G No A1555G No No No No No No No No No No A1555G
Aminogluc Aminogluc
Aminogluc
Aminogluc
Aminogluc
Nº Afect: número de familiares afectados. Desenc.: desencadenante de la hipoacusia. M: mujer. V: varón. Aminogluc.: aminoglucósidos. Descend.: descendente. Ascend.: ascendente. R. Descend.: rápidamente descendente. Mitoc: mitocondrial. AD: autosómica dominante.
En los 21 pacientes estudiados la media de edad fue de 44,9 años (rango 9-73 años). En 14 casos se trataba de mujeres (66,6%) y en 7 de varones (33,3%). El número de pacientes afectados en cada familia osciló entre 2 y 14 (media 6,5). El inicio de la hipoacusia fue postlocutivo en todos los pacientes. El grado de hipoacusia fue ligero en 3 pacientes (14,2%), moderado en 9 (42,8%), severo en 7 (33,3%) y profundo en 2 (9,5%). El perfil audiométrico fue descendente en 8 casos (38,0%), rápidamente descendente en 5 (23,8%), plano en 3 (14,2%), en U en 1 (4,7%), residual en 2 (9,5%) y ascendente en 2 (9,5%). El patrón de herencia de la hipoacusia era compatible con una transmisión materna (mitocondrial) en 7 familias (33,3%) (Tabla 2), autosómico dominante en 5 (23,8%) (Tabla 3) y ambiguo en 9 (42,8%) (Tabla 4). El estudio genético mostró la presencia de la mutación A1555G del ADN mitocondrial en seis pacientes (28,5%). Se comprobó que en las 6 familias con la mutación A1555G la herencia era materna.
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De los 6 pacientes que presentaban la mutación A1555G, en 4 (66,6%) el perfil audiométrico era rápidamente descendente, siendo de tipo descendente en los dos restantes. Sólo en uno de los pacientes no portadores de la mutación A1555G aparecía el perfil de tipo rápidamente descendente. La media de afectados en las familias que presentaron la mutación fue de 7,8 miembros, mientras que en el resto de familias la media de afectados fue de 6 miembros. Se recogió el antecedente de exposición a aminoglucósidos (estreptomicina) como posible desencadenante de la sordera en 6 pacientes (28,5%), de los que en 5 aparecía la mutación A1555G. La familia del sexto paciente que refería el antecedente de exposición a aminoglucósidos, pero en el que no se demostró la mutación, presentaba un patrón de herencia de la hipoacusia que podría ser compatible con modelos autosómico dominante o mitocondrial. No se registró en ningún caso la mutación 35delG en el gen de la conexina 26.
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Tabla 2: Árboles genealógicos de los pacientes con patrón de herencia de la hipoacusia materno (mitocondrial)
?
Familia 1
?
N
N
?
Familia 3
?
?
N
Familia 5
Familia 8
?
Familia 10
Familia 14
Familia 21 – varones. Ο – mujeres. Oscurecido - afectados. → - individuo estudiado.
DISCUSIÓN La mutación A1555G del ADN mitocondrial se ha encontrado en múltiples familias de diferentes
países25,32-36. En 1996, Sarduy et al.24 describieron 5 familias españolas y 3 cubanas que presentaban hipoacusia neurosensorial heredada por vía materna, en algunos casos en relación con la adminis-
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Tabla 3: Árboles genealógicos de los pacientes con patrón de herencia de la hipoacusia autosómico dominante
?
2
Familia 6
7
2
3
3
2
3
2
Familia 9
?
Familia 11 Familia 19
Familia 20 – varones. Ο – mujeres. Oscurecido - afectados. → - individuo estudiado.
tración de aminoglucósidos, en las que se detectó la mutación A1555G. En 1998, Estivill et al.27 estudiaron 70 familias españolas con hipoacusia neurosensorial (36 congénitas y 34 de inicio tardío), encontrando en 19 de ellas (27,1%) la mutación A1555G, la mayor parte en hipoacusias de inicio tardío. Estos datos son comparables con los obtenidos en nuestro estudio, en el que el porcentaje de familias que ha presentado la mutación es del 28,5%, aunque únicamente se incluyeron pacientes postlocutivos. De esto se deduce que la mutación A1555G es una causa frecuente de hipoacu-
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sia neurosensorial familiar de inicio postlocutivo en nuestro medio. En todos los pacientes portadores de la mutación A1555G la pérdida auditiva era más acentuada en frecuencias altas. En los individuos portadores de esta mutación está descrita una afectación más intensa de los tonos agudos, respetándose los tonos graves en la mayor parte de los casos. Otros autores también han observado este perfil en hipoacusias tanto sindrómicas como no sindrómicas debidas a diferentes mutaciones del ADN mitocondrial37-40.
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Tabla 4: Árboles genealógicos de los pacientes con patrón de herencia de la hipoacusia ambiguo
Familia 4
Familia 2
?
?
Familia 7
?
?
Familia 12
7
Familia 15
Familia 13
Familia 16
Familia 18 Familia 17 – varones. Ο – mujeres. Oscurecido - afectados. → - individuo estudiado.
De los 6 pacientes que presentaban la mutación A1555G, 5 referían el antecedente de exposición a aminoglucósidos. De ellos en 4 el grado de hipoacusia era severo y en uno moderado. Estudios recientes han comparado las diferentes características clínicas de la sordera profunda inducida por aminoglucósidos entre individuos que portaban
o no la mutación A1555G, presentando los primeros una pérdida de audición progresiva, mejores umbrales residuales en tonos puros, respuestas más bajas en la estimulación eléctrica del promontorio y una función vestibular bien preservada 41. Sólo uno de los pacientes con la mutación A1555G no había sido tratado con aminoglucósi-
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dos, y presentaba un grado de hipoacusia ligero. En ninguno de los casos se trataba de sorderas profundas. Esto coincide con lo publicado en otros estudios, en los que la mayor parte de los pacientes portadores de la mutación que no han recibido tratamiento con aminoglucósidos presentan audición normal o desarrollan una hipoacusia ligera 7. Se trataría de una hipoacusia con una penetrancia variable en función de la edad y que se vería notablemente incrementada por el tratamiento con aminoglucósidos. En uno de los pacientes no portadores de la mutación A1555G también se daba el antecedente de tratamiento con aminoglucósidos. El patrón de herencia de la enfermedad en esa familia es compatible con una transmisión materna (mitocondrial) o autosómica dominante. La mutación A1555G sólo está presente en una pequeña proporción de los pacientes con ototoxicidad por aminoglucósidos. Recientemente se han publicado otras mutaciones en el gen del rRNA 12S que tendrían un efecto similar. Así Tessa et al.42, analizando 80 niños con sordera en busca de mutaciones en el ADN mitocondrial, encontraron uno con hipoacusia severaprofunda y con dos familiares maternos con historia de hipoacusia inducida por aminoglucósidos en el que identificaron la mutación T1095C. Bacino et al.43 analizaron 35 pacientes chinos con ototoxicidad por aminoglucósidos y sin la mutación A1555G, encontrando 3 cambios en la secuencia del gen del rRNA 12S, de los cuales uno podría ser una mutación patogénica: la deleción de una timina en la posición 961, con varias inserciones de citosinas. Posteriormente Casano et al. 44 han encontrado esta misma mutación en una familia con cinco miembros sordos por vía materna después de tratamiento con aminoglucósidos. No ha aparecido en ningún paciente de
nuestra serie la mutación 35delG del gen GJB2 (conexina 26). Esto puede explicarse por el origen de los enfermos incluidos en este estudio, recogidos en la consulta de un centro hospitalario, donde en la mayoría de los casos se trata de hipoacusias de grado moderado-severo, y por haber seleccionado únicamente casos de inicio postlocutivo, mientras que la mutación 35delG produce generalmente sordera profunda y de comienzo precoz 45. También puede ser debido a que se han excluido los casos esporádicos, recogiéndose sólo las familias con dos o más miembros afectos, y dado que el patrón de herencia de esta mutación es autosómico recesivo, es decir, en heterocigotos no se manifiesta la enfermedad, los pacientes con dicha mutación constituyen muchas veces el único miembro de la familia afecto. Como conclusión debe considerarse la mutación A1555G del ADN mitocondrial como causa frecuente de hipoacusia en la población de Cantabria. Debe ser sospechada esta mutación y evitarse la administración de aminoglucósidos en pacientes pertenecientes a familias con transmisión materna de la hipoacusia y con presencia de miembros con sordera inducida por estos fármacos. La mutación 35delG en el gen GJB2 no parece constituir una causa frecuente en casos familiares de hipoacusia neurosensorial no sindrómica de manifestación postlocutiva en nuestro medio.
AGRADECIMIENTOS Nuestro agradecimiento a los miembros de las familias incluidas, a las personas que han colaborado en el estudio clínico, y a la Fundación "Marqués de Valdecilla", por su ayuda para la realización de este trabajo.
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571
INVESTIGACIÓN BÁSICA O CLÍNICA
INCIDENCIA DE LAS MUTACIONES A1555G EN EL ADN MITOCONDRIAL Y 35delG EN EL GEN GJB2 (CONEXINA 26) EN FAMILIAS CON HIPOACUSIA NEUROSENSORIAL POSTLOCUTIVA NO SINDRÓMICA EN CANTABRIA J. GALLO-TERÁN*, C. MORALES-ANGULO*, I. DEL CASTILLO**, M. VILLAMAR**, M. Á. MORENO-PELAYO**, J. GARCÍA-MANTILLA*, F. MORENO** *SERVICIO
DE
OTORRINOLARINGOLOGÍA. HOSPITAL SIERRALLANA. TORRELAVEGA (CANTABRIA). **UNIDAD MOLECULAR. HOSPITAL RAMÓN
Y
DE
GENÉTICA
CAJAL. MADRID
RESUMEN
I
ntroducción: La hipoacusia neurosensorial es un trastorno con una gran trascendencia social, que afecta aproximadamente al 10% de la población general. Se calcula que en más del 50% de los casos tiene una causa genética. Las dos mutaciones más frecuentemente encontradas en la población española responsables de hipoacusia neurosensorial son la mutación A1555G en el gen del RNA ribosómico 12S del genoma mitocondrial y la mutación 35delG en el gen GJB2 (conexina 26, cromosoma 13). Métodos: Mediante estudio genético se ha determinado la frecuencia de las mutaciones A1555G en el ADN mitocondrial y 35delG en el gen de la conexina 26 en 21 pacientes pertenecientes a 21 familias no consanguíneas y no relacionadas entre sí, con hipoacusia neurosensorial bilateral postlocutiva no sindrómica de
Cantabria. Resultados: El estudio mostró la presencia de la mutación A1555G en 6 pacientes, de los cuales 5 tenían antecedentes de exposición a aminoglucósidos. En todos ellos la pérdida auditiva afectaba sobre todo a altas frecuencias. No se detectó la mutación 35delG en ningún paciente. Conclusiones: La mutación A1555G del ADN mitocondrial es frecuente en la población de Cantabria. Debe sospecharse esta mutación y evitar la administración de aminoglucósidos en pacientes pertenecientes a familias con transmisión materna de la hipoacusia y con presencia de miembros con sordera inducida por estos fármacos. La mutación 35delG en el gen GJB2 no parece constituir una causa frecuente en casos familiares de hipoacusia neurosensorial no sindrómica de manifestación postlocutiva en nuestro medio.
PALABRAS CLAVE: Hipoacusia neurosensorial. Hereditaria. Hipoacusia no sindrómica.
ABSTRACT INCIDENCE OF THE MUTATIONS A1555G IN THE MITOCHONDRIAL DNA AND 35delG IN THE GJB2 GENE (CONNEXIN-26) IN FAMILIES WITH LATE-ONSET NON-SYNDROMIC SENSORINEURAL HEARING LOSS FROM CANTABRIA
I
ntroduction: Sensorineural deafness is a very common disorder in humans, which affects approximately 10% of the population. Genetic causes are suggested to be responsible for more than half of the cases. The A1555G mutation in the mitochondrial 12S rRNA gene and the 35delG mutation in the GJB2 gene are the most common mutations for sensorineural deafness in the Spanish population. Methods: A genetic study was carried out in order to determine the frequency of the mutations A1555G in the mitochondrial DNA and 35delG in the connexin-26 gene in 21 patients from 21 non-consanguineous unrelated families affected by late-onset bilateral non-syndromic sensorineural hearing loss from Cantabria. Results: The A1555G mutation was
found in 6 patients. Five of these 6 patients had been treated with aminoglycosides. In all of them the auditory impairment affected mainly the high frequencies. The 35delG mutation was not found in any of the patients. Conclusions: The A1555G mutation in the mitochondrial DNA has been found to be the most common amongst the Cantabrian population. The A1555G mutation should be suspected in those members of families affected by sensorineural hearing impairment with a maternal inheritance pattern and ototoxicity from treatment with aminoglycoside antibiotics. The 35delG mutation in the GJB2 gene does not seem to be a major cause of deafness in families with late-onset non-syndromic sensorineural hearing loss in our area.
KEY WORDS: Sensorineural hearing loss. Hereditary. Non-syndromic hearing loss. Correspondencia: Carmelo Morales Angulo. Alto de las Veneras, nº 8. Puente Arce 39478. Cantabria. E-mail:[email protected] Fecha de recepción: 22-1-2002 Fecha de aceptación: 2-7-2002 Acta Otorrinolaringol Esp 2002; 53: 563-571
563
J. GALLO-TERÁN ET AL. HIPOACUSIA HEREDITARIA
INTRODUCCIÓN La hipoacusia es un trastorno con una gran trascendencia social, que aproximadamente afecta al 10% de la población general: a 1 de cada 1.000 recién nacidos1,2 y al 10% de las personas mayores de 65 años3. La sordera puede ser debida a factores ambientales y factores hereditarios. La progresiva identificación y control de las causas ambientales de sordera como son las infecciones perinatales, trauma acústico, hiperbilirrubinemia o fármacos ototóxicos como los aminoglucósidos, ha producido un incremento relativo en la proporción de causas genéticas de sordera en los últimos años. Se calcula que la sordera congénita tiene una base genética en más del 50% de los casos2,4. Sin embargo, no existen estudios sistemáticos que determinen la frecuencia y modo de herencia de la hipoacusia neurosensorial postlocutiva. La hipoacusia de causa genética puede clasificarse como sindrómica o no sindrómica. El término sindrómico se refiere a formas específicas de combinación de la hipoacusia con otras alteraciones. Entre los ejemplos más característicos se incluyen los síndromes de Waardenburg, Usher, Pendred y Alport. Se denomina hipoacusia no sindrómica cuando aparece de forma aislada (aproximadamente 70% de los casos)5. A lo largo de los últimos ocho años se han encontrado numerosos loci (pequeñas regiones cromosómicas) donde deben residir genes responsables de sorderas sindrómicas y no sindrómicas. Muchos de estos genes ya han sido identificados. Debe tenerse en cuenta que se ha estimado que mutaciones en más de un centenar de genes podrían causar hipoacusia2. Hasta el momento se han identificado 66 loci de sordera no sindrómica: 32 loci de sordera no sindrómica autosómica dominante (DFNA), 29 de sordera no sindrómica autosómica recesiva (DFNB) y 5 de sordera no sindrómica ligada al cromosoma X (DFN)6. Más de veinte genes responsables de hipoacusia no sindrómica ya han sido identificados. Por otra parte, mutaciones en los genes del ADN mitocondrial también pueden ser responsables de sordera no sindrómica7. A pesar del gran número de loci responsables de hipoacusia no sindrómica identificados, un solo locus, DFNB1, representa una gran parte de los casos (hasta el 50% de los casos de sordera prelocutiva no sindrómica), con ligeras variaciones en frecuencia en las diferentes poblaciones. El gen implicado en este tipo de sordera es GJB2 (Gap Junction Beta 2), que codifica la proteína conexina 26 (Cx26)8. Se han identificado numerosas mutaciones di-
564
ferentes en el gen de la conexina 26 que producen hipoacusia no sindrómica autosómica recesiva. La mutación más frecuente es la 35delG (también llamada 30delG), que se produce en una serie de seis residuos G en las posiciones 30-35 de la secuencia de ADN del gen GJB2. Esta mutación se encuentra en más de dos terceras partes de las personas con DFNB1, fundamentalmente en la región mediterránea, en personas de diferentes etnias9-12. Se han descrito otras muchas mutaciones en el gen de la conexina 26, la mayoría en unos pocos pacientes, responsables tanto de hipoacusias sindrómicas como no sindrómicas13-20. Mutaciones en los genes de otras conexinas también pueden causar sordera21-23. Por otra parte, mutaciones en el ADN mitocondrial son en nuestro país causa frecuente de hipoacusia, la cual generalmente se presenta de forma no sindrómica24. En los casos en los que aparece asociada a otras alteraciones, es frecuente que las mutaciones mitocondriales produzcan fenotipos diferentes en distintas familias o pacientes. Se han descrito en el genoma mitocondrial cinco mutaciones productoras de hipoacusia no sindrómica. Sin embargo, para tres de esas cinco mutaciones se han encontrado en los pacientes síntomas adicionales acompañando a la hipoacusia. Con excepción de la mutación más frecuente, A1555G en el gen del rRNA 12S, todas las mutaciones responsables de hipoacusias no sindrómicas están localizadas en el gen del tRNA Ser (UCN)6. La mutación A1555G en el gen del rRNA 12S se encontró en familias con hipoacusia no sindrómica de herencia materna y en pacientes y familias con hipoacusia por ototoxicidad inducida por aminoglucósidos 25,26. Esta mutación parece ser más frecuente en ciertas poblaciones, incluyendo la española27 y la japonesa28. La mutación hace a los individuos susceptibles al daño coclear por el tratamiento con aminoglucósidos a concentraciones que normalmente no afectarían la audición. Con carácter general, se ha descrito que hasta el 25% de las personas que reciben este tipo de antibióticos desarrollan sordera29. Se ha calculado que la probabilidad de que una persona con la mutación A1555G desarrolle hipoacusia a la edad de 30 años es del 95% si se trata con aminoglucósidos y del 40% si no recibe tratamiento27. La mutación A1555G se localiza en el gen del rRNA 12S, afectando a una región del RNA ribosómico que, en su homólogo bacteriano, está implicada en la unión al aminoglucósido. Se supone que la mutación haría su estructura secundaria más semejante a la bacteriana, produciendo una mayor susceptibilidad a los aminoglucósidos6.
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ACTA OTORRINOLARINGOLÓGICA ESPAÑOLA
El objetivo de este estudio es determinar la frecuencia de las mutaciones A1555G en el ADN mitocondrial y 35delG en el gen de la conexina 26 en familias con hipoacusia neurosensorial bilateral postlocutiva en Cantabria.
MÉTODOS Fueron incluidos en nuestro estudio 21 pacientes pertenecientes a 21 familias, no consanguíneas y no relacionadas, con al menos dos miembros afectos de hipoacusia neurosensorial bilateral no sindrómica postlocutiva. Todos ellos eran residentes en el área sanitaria de Torrelavega-Reinosa (Cantabria), y fueron estudiados en el Servicio de Otorrinolaringología del Hospital Sierrallana (Torrelavega). Se excluyeron del estudio los pacientes cuya causa podía ser justificada únicamente por un factor ambiental, como por ejemplo trauma acústico crónico. Se obtuvo un consentimiento informado para el análisis genético de todos los pacientes que participaron en el estudio. Se recogieron de la historia clínica los siguientes datos: edad actual, sexo, edad de inicio de la hipoacusia, factor desencadenante de la misma, perfil audiométrico y grado de pérdida auditiva. Se realizó un árbol genealógico de cada familia, recogiéndose los miembros afectos. Se clasificó a las familias como autosómicas dominantes, autosómicas recesivas, ligadas al sexo, mitocondriales o de patrón de herencia ambiguo, de acuerdo con los modelos de transmisión de la sordera30. Para determinar el perfil audiométrico se utilizó la clasificación de Liu y Xu31. La intensidad de la hipoacusia se registró mediante la clasificación audiométrica de las deficiencias auditivas (recomendación biap 02/1 - Lisboa 1997) en ligera (21-40 dB), moderada (41-70 dB), severa (71-90 dB), profunda (91-119 dB) y total o cofosis (120 dB). Se realizó una extracción sanguínea a todos los pacientes, obteniéndose 3 tubos de 5 cc para el estudio genético. De cada muestra de sangre se extrajo el ADN, para utilizarlo en la detección de la mutación A1555G en el ADN mitocondrial y de la mutación 35delG en el gen de la conexina 26. El estudio genético fue realizado en la Unidad de Genética Molecular del Hospital Ramón y Cajal de Madrid.
do en la determinación precisa del tamaño de un fragmento de ADN de 122 pares de bases (pb), amplificado por PCR, que incluye la posición nucleotídica 35 del gen Cx26. Para la amplificación del fragmento se utiliza una pareja de primers, uno de ellos marcado con fluorescencia (marcaje con TET, FAM o HEX). Los fragmentos amplificados se resuelven por electroforesis capilar en el analizador ABI-Prism 310 de la casa comercial Perkin-Elmer. Los posibles resultados respecto a esta mutación serán: • En el caso de un individuo que porte el alelo silvestre en homozigosis, sólo aparecerá un pico de electroforesis con un tamaño de 122 bases. Será un individuo sano, no portador. • En el caso de un individuo que porte en homozigosis el alelo mutado 35delG (pérdida de la guanina en la posición 35 del gen Cx26) sólo aparecerá un pico de electroforesis de 121 bases (una menos que en el caso anterior). • Los individuos portadores de la mutación presentarán dos picos de electroforesis, de 121 y 122 bases, que corresponden a los alelos 35delG y silvestre, respectivamente. Serán individuos portadores normoyentes. Detección de la mutación A1555G en el ADN mitocondrial Para el estudio de la mutación A1555G, la muestra de ADN de cada individuo se utilizó para amplificar, por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un fragmento de ADN mitocondrial de 358 pb. Este producto de la PCR se sometió a digestión con la endonucleasa de restricción Alw26I. Los fragmentos resultantes se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para determinar su tamaño. El fundamento de esta prueba genética radica en que el fragmento amplificado de 358 pb tiene una única diana de corte para la enzima Alw26I en los individuos normales. En dichos individuos la digestión del fragmento de 358 pb produce dos fragmentos más pequeños, uno de aproximadamente 230 pb y otro de unos 130 pb. En los portadores de la mutación se pierde dicha diana, por lo que el fragmento no resulta digerido. Finalmente, la presencia de la mutación se confirmó mediante secuenciación del ADN.
Detección de la mutación 35delG (conexina 26)
RESULTADOS
Para el análisis de la mutación 35delG en el gen de la conexina 26 se empleó un método basa-
En la Tabla 1 se detallan los principales datos obtenidos.
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J. GALLO-TERÁN ET AL. HIPOACUSIA HEREDITARIA
Tabla 1: Resultados Familia
Edad
Sexo
Nº afect.
Patrón
Desenc
Grado
Perfil
Mutación
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
50 33 45 9 58 40 38 26 57 73 56 46 55 50 42 38 13 62 44 58 50
M M V V M M M M M V V M M M M V V M M M V
13 11 3 9 7 3 4 5 7 14 6 8 4 3 2 2 2 3 13 13 5
Mitoc Ambiguo Mitoc Ambiguo Mitoc AD Ambiguo Mitoc AD Mitoc AD Ambiguo Ambiguo Mitoc Ambiguo Ambiguo Ambiguo Ambiguo AD AD Mitoc
Aminogluc
Moderada Moderada Severa Severa Severa Moderada Ligera Ligera Moderada Severa Severa Profunda Profunda Moderada Moderada Moderada Ligera Severa Moderada Moderada Severa
Descend. Ascend. R Descend. Plana Descend. Descend. R Descend. R Descend. En U R Descend. Descend. Residual Residual Ascend. Plana Descend. Descend. Descend. Plana Descend. R Descend.
A1555G No A1555G No A1555G No No A1555G No A1555G No No No No No No No No No No A1555G
Aminogluc Aminogluc
Aminogluc
Aminogluc
Aminogluc
Nº Afect: número de familiares afectados. Desenc.: desencadenante de la hipoacusia. M: mujer. V: varón. Aminogluc.: aminoglucósidos. Descend.: descendente. Ascend.: ascendente. R. Descend.: rápidamente descendente. Mitoc: mitocondrial. AD: autosómica dominante.
En los 21 pacientes estudiados la media de edad fue de 44,9 años (rango 9-73 años). En 14 casos se trataba de mujeres (66,6%) y en 7 de varones (33,3%). El número de pacientes afectados en cada familia osciló entre 2 y 14 (media 6,5). El inicio de la hipoacusia fue postlocutivo en todos los pacientes. El grado de hipoacusia fue ligero en 3 pacientes (14,2%), moderado en 9 (42,8%), severo en 7 (33,3%) y profundo en 2 (9,5%). El perfil audiométrico fue descendente en 8 casos (38,0%), rápidamente descendente en 5 (23,8%), plano en 3 (14,2%), en U en 1 (4,7%), residual en 2 (9,5%) y ascendente en 2 (9,5%). El patrón de herencia de la hipoacusia era compatible con una transmisión materna (mitocondrial) en 7 familias (33,3%) (Tabla 2), autosómico dominante en 5 (23,8%) (Tabla 3) y ambiguo en 9 (42,8%) (Tabla 4). El estudio genético mostró la presencia de la mutación A1555G del ADN mitocondrial en seis pacientes (28,5%). Se comprobó que en las 6 familias con la mutación A1555G la herencia era materna.
566
De los 6 pacientes que presentaban la mutación A1555G, en 4 (66,6%) el perfil audiométrico era rápidamente descendente, siendo de tipo descendente en los dos restantes. Sólo en uno de los pacientes no portadores de la mutación A1555G aparecía el perfil de tipo rápidamente descendente. La media de afectados en las familias que presentaron la mutación fue de 7,8 miembros, mientras que en el resto de familias la media de afectados fue de 6 miembros. Se recogió el antecedente de exposición a aminoglucósidos (estreptomicina) como posible desencadenante de la sordera en 6 pacientes (28,5%), de los que en 5 aparecía la mutación A1555G. La familia del sexto paciente que refería el antecedente de exposición a aminoglucósidos, pero en el que no se demostró la mutación, presentaba un patrón de herencia de la hipoacusia que podría ser compatible con modelos autosómico dominante o mitocondrial. No se registró en ningún caso la mutación 35delG en el gen de la conexina 26.
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Tabla 2: Árboles genealógicos de los pacientes con patrón de herencia de la hipoacusia materno (mitocondrial)
?
Familia 1
?
N
N
?
Familia 3
?
?
N
Familia 5
Familia 8
?
Familia 10
Familia 14
Familia 21 – varones. Ο – mujeres. Oscurecido - afectados. → - individuo estudiado.
DISCUSIÓN La mutación A1555G del ADN mitocondrial se ha encontrado en múltiples familias de diferentes
países25,32-36. En 1996, Sarduy et al.24 describieron 5 familias españolas y 3 cubanas que presentaban hipoacusia neurosensorial heredada por vía materna, en algunos casos en relación con la adminis-
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Tabla 3: Árboles genealógicos de los pacientes con patrón de herencia de la hipoacusia autosómico dominante
?
2
Familia 6
7
2
3
3
2
3
2
Familia 9
?
Familia 11 Familia 19
Familia 20 – varones. Ο – mujeres. Oscurecido - afectados. → - individuo estudiado.
tración de aminoglucósidos, en las que se detectó la mutación A1555G. En 1998, Estivill et al.27 estudiaron 70 familias españolas con hipoacusia neurosensorial (36 congénitas y 34 de inicio tardío), encontrando en 19 de ellas (27,1%) la mutación A1555G, la mayor parte en hipoacusias de inicio tardío. Estos datos son comparables con los obtenidos en nuestro estudio, en el que el porcentaje de familias que ha presentado la mutación es del 28,5%, aunque únicamente se incluyeron pacientes postlocutivos. De esto se deduce que la mutación A1555G es una causa frecuente de hipoacu-
568
sia neurosensorial familiar de inicio postlocutivo en nuestro medio. En todos los pacientes portadores de la mutación A1555G la pérdida auditiva era más acentuada en frecuencias altas. En los individuos portadores de esta mutación está descrita una afectación más intensa de los tonos agudos, respetándose los tonos graves en la mayor parte de los casos. Otros autores también han observado este perfil en hipoacusias tanto sindrómicas como no sindrómicas debidas a diferentes mutaciones del ADN mitocondrial37-40.
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Tabla 4: Árboles genealógicos de los pacientes con patrón de herencia de la hipoacusia ambiguo
Familia 4
Familia 2
?
?
Familia 7
?
?
Familia 12
7
Familia 15
Familia 13
Familia 16
Familia 18 Familia 17 – varones. Ο – mujeres. Oscurecido - afectados. → - individuo estudiado.
De los 6 pacientes que presentaban la mutación A1555G, 5 referían el antecedente de exposición a aminoglucósidos. De ellos en 4 el grado de hipoacusia era severo y en uno moderado. Estudios recientes han comparado las diferentes características clínicas de la sordera profunda inducida por aminoglucósidos entre individuos que portaban
o no la mutación A1555G, presentando los primeros una pérdida de audición progresiva, mejores umbrales residuales en tonos puros, respuestas más bajas en la estimulación eléctrica del promontorio y una función vestibular bien preservada 41. Sólo uno de los pacientes con la mutación A1555G no había sido tratado con aminoglucósi-
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J. GALLO-TERÁN ET AL. HIPOACUSIA HEREDITARIA
dos, y presentaba un grado de hipoacusia ligero. En ninguno de los casos se trataba de sorderas profundas. Esto coincide con lo publicado en otros estudios, en los que la mayor parte de los pacientes portadores de la mutación que no han recibido tratamiento con aminoglucósidos presentan audición normal o desarrollan una hipoacusia ligera 7. Se trataría de una hipoacusia con una penetrancia variable en función de la edad y que se vería notablemente incrementada por el tratamiento con aminoglucósidos. En uno de los pacientes no portadores de la mutación A1555G también se daba el antecedente de tratamiento con aminoglucósidos. El patrón de herencia de la enfermedad en esa familia es compatible con una transmisión materna (mitocondrial) o autosómica dominante. La mutación A1555G sólo está presente en una pequeña proporción de los pacientes con ototoxicidad por aminoglucósidos. Recientemente se han publicado otras mutaciones en el gen del rRNA 12S que tendrían un efecto similar. Así Tessa et al.42, analizando 80 niños con sordera en busca de mutaciones en el ADN mitocondrial, encontraron uno con hipoacusia severaprofunda y con dos familiares maternos con historia de hipoacusia inducida por aminoglucósidos en el que identificaron la mutación T1095C. Bacino et al.43 analizaron 35 pacientes chinos con ototoxicidad por aminoglucósidos y sin la mutación A1555G, encontrando 3 cambios en la secuencia del gen del rRNA 12S, de los cuales uno podría ser una mutación patogénica: la deleción de una timina en la posición 961, con varias inserciones de citosinas. Posteriormente Casano et al. 44 han encontrado esta misma mutación en una familia con cinco miembros sordos por vía materna después de tratamiento con aminoglucósidos. No ha aparecido en ningún paciente de
nuestra serie la mutación 35delG del gen GJB2 (conexina 26). Esto puede explicarse por el origen de los enfermos incluidos en este estudio, recogidos en la consulta de un centro hospitalario, donde en la mayoría de los casos se trata de hipoacusias de grado moderado-severo, y por haber seleccionado únicamente casos de inicio postlocutivo, mientras que la mutación 35delG produce generalmente sordera profunda y de comienzo precoz 45. También puede ser debido a que se han excluido los casos esporádicos, recogiéndose sólo las familias con dos o más miembros afectos, y dado que el patrón de herencia de esta mutación es autosómico recesivo, es decir, en heterocigotos no se manifiesta la enfermedad, los pacientes con dicha mutación constituyen muchas veces el único miembro de la familia afecto. Como conclusión debe considerarse la mutación A1555G del ADN mitocondrial como causa frecuente de hipoacusia en la población de Cantabria. Debe ser sospechada esta mutación y evitarse la administración de aminoglucósidos en pacientes pertenecientes a familias con transmisión materna de la hipoacusia y con presencia de miembros con sordera inducida por estos fármacos. La mutación 35delG en el gen GJB2 no parece constituir una causa frecuente en casos familiares de hipoacusia neurosensorial no sindrómica de manifestación postlocutiva en nuestro medio.
AGRADECIMIENTOS Nuestro agradecimiento a los miembros de las familias incluidas, a las personas que han colaborado en el estudio clínico, y a la Fundación "Marqués de Valdecilla", por su ayuda para la realización de este trabajo.
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