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Influence des lipides de la muqueuse intestinale de rat sur son activité phospholipasique
BIOCHIMIE, 1978, 60, 521-524.
Influence des lipides de la muqueuse intestinale de rat sur son activit6 phospholipasique. M. J. BO,NN~E,FIS, J. M A R M O U Y E T , G. REY, J. P. T H O U V E N O T et L. DO U S T E - B L A Z Y <>.
I N S E R M U n i t d 101, B i o c h i m i e d e s L i p i d e s , H d p i t a l P u r p a n , 31052 T o u l o u s e .
(~7-1~-1977).
L e s h o m o g 6 n a t s d~e m u q u e u s e i n l e s l i n a l e d e r a t p r 6 s e n l e n ¢ u n e a c t i v i t 6 p h o s p h o l i p , a s i q u e Au et un,e a c t i v i t 6 lysophosohc*li~)asiq~te A1 [1] se i r a d,ui,s a n l p a r u n e aciivi,t6 p l ~ o s p h o l i p a s i q u e B glob a l e . Genre sp~c*ifici~6 esi s e m b ~ a b l e A cel le d e 1,a p h o s p h o . H p a s e l~ d,e P e n i c i l l i u m n o t a t u m [2]. L ' h y d r o l y s e d e s PC,, F i n s ,len.t,e clue c e l l e d e s P E [3] n,bcess~te l a ~r6s,erme d ' a c i d e s gras. l i b r e s exog~ne,s [4, 5]. I1 ,en es1 d'e m 6 m e p~)n~r l,a p h o s pholip~as, e A~ d e v e n i n d ' . a b e i ~ e [6] e t p o u r d ' a u i r e s e n z y m e s q~ui ~agissent s , e ~ e m e n l e n p r e s e n c e d e lipi,4es [7, 8, 9, 10]. C;est ai~nsi q u e 1,e l r ~ t e m e n t d e la m u q u e u s e intes,tin~a~e p a r l'a,c6ione et le but*anol s u p p r i m e l ' a c t i v i ~ 6 p h o s p . h o ~ h p a s i q u e B et d i m i n u e fort,emen~ l ' a c ~ i v i t 6 t y s o p h , o s p b e ~ i p a ~ i q a e [5]. G e p e n d a r r t la pert,e de, l',activi~6 p rovocfu6e p ~ r la d,61ipid~ation n e c , o n s t i t t m p,as t m crit~r.e s~ffisarrt p o u r a f f i r m e r l~a d6pend~an.ce t o ~ l e d e l ' e n z y m e v i s - h - v i s d e s ,IipidLes ; o n p e n t 6voque,r u n e d6.n, a l u r a t i o n n*o'n 14pidiqtm, o u e n c o r e F a c t i o n i,n h i ' b i l r i c , e d e s s , o l v a n t s [11] o u d e 1.e.urs c o n t a m i n,a n t s [12, 13, 14]. C'.esi p,aurqu~oi p o u r a f f i r m e r c e t i e d ~ p e n d a n : c e , il est n,6cessair,e d,e co,rr~61er d'abo'rd l a pe,rte d~'activil6 ~ v e c la d i s p a r i t i o n d e s t i p i d e s d u m i l i e ~ ,d'in,cubati.on et en.s~ile d e r e s t a u t e r l'activi,t,6 ap,r~s a,d'd'il~ion fl~es 15pities [15]. No,us a v o n s p a ain,si m v t l r e e n 6 v i d e n c e , d,ans ce t.ravai'l, l a lip,icto-d*6pe,nda~nee d e s p h o s p h o l . i p , a s e s c~e ,la m u q u e u s e in.lest.in,ale d e ra~ et n ~ u s avo,ns p r 6 c i s 6 l a n a t u r e ties lipid,es i m p l i q u , ~ s dans. c e t t e a.ctivi,t6 e n z y m a f i q ~ e .
Abr~viations : PC : phosphatidylcholine. PE : p h o s p h a t i d y l J t h a n o l a m i n e . LPC : lysophosphatidylcholine. GPC : glyc~rophosphorylcholine. © A qui route correspondance doit ~tre adressde.
Mat6riel et M6thodes. A --
SUBSTRATS.
1) Les PC [14C] sont pr~par~es h p a r t i r de foie de r a t a y a n t r e i n une i n j e c t i o n intrap~riton~ale de ehlorh y d r a t e de choline [14C~_~] en solution isotonique (20,3 m C i / m m o l e - - C.E.A. Saelay, France) [16, 17]. ~) Les 1-acyl-glye~rophosphorylcholines [14C] sont obtenues h p a r t i r de ces PC [1]. B
--
DI~LIPIDATION
ET
SOLUBIL1SATION DES
pROT~INES
ENZYMATIQUES.
Nons avons adopt~ la t e c h n i q u e de d~lipidation p a r le n - b u t a n o l d~jh utilis~e p o u r purifier les lysophospholipases de foie et de pancr6as de boeuf [18, 19]. 1) Par le butanol. A u n volume d ' h o m o g 6 n a t [1] est ajout6 u n volume de n - b u t a n o l froid Saturd d'eau. Le m61ange est agit6 v i g o u r e u s e m e n t p e n d a n t 5 m i n u t e s puis centrifug6 h 1500~0 g/15 mn. La phase aqueuse (I) est d~barass6e du b u t a n o l sous e o u r a n t d'azote. La phase b u t a n o l i q u e (L1), mise h sec sous u n cour a n t d'azote, est reprise p a r des qua~tit~s v a r i a b l e s de phase aqueuse. Les m~langes sont alors soumis aux u l t r a - s o n s 3 × 1 m n h 0°C. Les r~sultats rapport6s c o r r e s p o n d e n t h u n in61ange c o n t e n a n t 1 volume de I et 2 volumes de L1. D'autrc part, pour a n a I y s e r le c o n t e n u lipidique, la phase b u t a n o l i q u e est c h r o m a t o g r a p h i 6 e sur t o u c h e mince, soit dans le solvant des p h o s p h o l i p i d e s ehlorof o r m e - m ~ t h a n o l - e a u 65/35/4 v : v : v , soit d a n s le solv a n t des lipides neutres c h l o r o f o r m e - ~ t h e r de p6troleacide ac6tique 65/33/2, v :v :v. Chaque f r a c t i o n lipidique est pr6lev6e, ~lu6e, et remise en suspension dans u n volume identique a u volume de la p h a s e b u t a n o l i q u e , de m a n i 6 r e h conserver les m~mes p r o p o r t i o n s de phase aqueuse et de phase organique. Les prot~ines localis~es h l ' i n t e r f a e e b u t a n o l - e a n sont sdch~es sur gaze, et homog6n~is6es dans u n volume de t a m p o n identique ~ celui de l'homog6nat. 23 Par d'autres solvanls. L ' a d d i t i o n de p e n t a n o l a 6t6 pr~conis6e p a r Roelofsen et co11. [20] p o u r divers enzymes m e m b r a n a i r e s .
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M. J. B o n n e f i s et coll.
L'homog6nat a ~t6 solubilis~ selon les m~mes proportions par le n-pentanol (H -4- L~); n-butanol/n-pentanol 1/1 v:v (III -4- .La) et le n-butanol/6ther isopropylique 4d6, v :v (I,V + L~).
n o l i q u e test6e a p r b s ,6vap,or~i~n d~ b~atanol so~s cotrran~t d ' a z o t e et 6'mu,lS~i'onn,6e dans~ KCI 0,2 M, p H 7,0. p,ar soni.cation.
Les activit6s phospholipasique B e t lysophospholipasique Aa sont ddtermin6es respectivement h l'aide de phosphatidylcholine [14(]] et ~ l'aide de 1-acyl-glyc6rophosphorylcholine [14(]] [1]. Le phosphore lipidique est dos6 par la m~thode de (]hen et coll. [21] et les protdines par la m6thode colorim~trique de Lowry [22].
L a pha~e a q u e u s ¢ (I) (,tableau I) p'~6sen~e de faibles, activitfs, phosph.ol.ipas'iffue B ( m o i n s de 5 p. c e n t ,de ,l'acfivit6 ini*ia~e d e l".hom~g6na¢) et l y s o p h o s p h o l i p a s i q u e Ax f ~ e .l'ord're 4 e 29 p. cent).
R6sultats
et Discussion.
L ' a c ' t i o n s6par6e ,o,u c o m b i n ~ e d e s d,iff6rents, solr a n t s p e r m e t ,l~a so.lubHis,ali'on des p h v s p h o l . i p a s e s d a n s l~a p h a s e a q u e u s e . A. LIPIDO-DI~PENDANCE DES PHOSPHOLIPASES.
1) Traitement par le butanol. Les pro£6i,nes s e dist,rib:u,en,t e.nCre la p h a s e a q u e u s e et l ' i n l e r f a c e (4~ ~ p. c e n t et 60. p. ceaa¢
L o r s q u e d e ~ x vobumes d e r e x t r a L t b u t a n o l i q u e s o n l 6mulsionnds~ c h n s t m vol,ume de p h a s e a q u e u s e , ,rapp'ort o p t i m a l (I + 2 L1), p l u s de l~a m o i l i 6 d e l'ac,tivit,6 p h o s p h o ' l ' i p a s i q u e d e t y p e B est resta~rr6e ; les prat~in,es , e n z y m a t i q u e s s~nt don.c clans la f r a c t i o n a~qtmuse. D ' a ~ t r e p a r t , a u c u n e act.ivit~ n ' e s t obs.erv~e l~.rsqt~e l~es~ c o m p o ,6s de' . l ' i n t e r f a e e sorrt ,aj,ou¢6s ~ 1,a f r a c t i o n a q u e n s e on ~ 1,a fra~Lion bulan,oHqtm. La r6aetivalion itrc~mplgte de l'activit6 phospholip.asique d e t y p e B p,vttt O r e .dl~e au fair qtm le mili'eu e n ~ i r a n n a n t i n i t i a l n~es~ ' qtre p , a r t i e l l e m e n t reeonst.itu6. C~tte op~ra~ion peu,t e n effet e x i g e r d ~ t e m p s t.r6s vatS~bles p o u v a n t a'Her j~sq.u'/~ p l ~ s i e u r s h e u r e s s.elo~n l " e n z y m e cons'i, d6r6e [23].
TABLEAU I.
Influence des lipides de lu muqueuse inlestinale sur les actioitds phospholipasiques. n Homog~nat I II III IV I At- L~ II 71- L.~ 1II -~ L:~ ~V -~- L 4
6 6 2 2 2 6 2 2 2
Prot6iaes mg/ml, 7,6 2,6 2,8 2,8 2,9 2,6 2,8 2,8 2,9
___~2,2 -t- 0,5 ~- 0,6 -t- 0,5 ~ 0,3 ~--~ 0,5 ~ 0,6 ~ 0,5 ~___0.3
Phospholipase B nmoles/ma/mg 3,5 0,25 0,5 0,8 0,019. 2,2 1,5 2.1 0,0095
-4- 0,5 -4- 0,05 -4- 0,1 -4- 0,1 -~- 0,003 -v- 0,3 -Jr- 0,3 ~ 0,3 ~ 0,0015
Lysophospholipase At nmoles/mn/mg 12,5 3,4 0,8 2,1 4,1 0,11 0,15 0,578 4,9
-+- 2 -+- 0,6 ~__ 0,1 ~__ 0,3 ~ 0,4 ~ 0,02 -4-- 0,02 ~ 0,014 ~__ 0 , 4
I, II, III, IV" : Phases aqueuses apr6s extraction des lipides respectivement par le n-butanol, le n-pentanol, le n-hutanol/n-pentanol et le n - b u t a n o l / f t h e r isopropylique, La, Lz, La, L~ : Phases organiques contenant les lipldes extraits respeetivement par le n-butanol, le n-pentanol, le n-butanol/n-pentanol, le n-butanol/~ther isopropylique. Chaque essai (1 ml) eontient un volume de phase aqueuse et deux volumes de l'extrait lipidique eorrespondant ultrasonn~ ; il est ineub6 15 mn h 37°C h pH 6,5 en pr~senee de 5.09 nmoles de pc[14C] ou 5 mn h 37°C h pH 6,5 en pr6se.nce, de 500 nmoles de LPC[14C]. n : nombre d'exp~riences.
r e s p e ~ t i v e m e n t ) . P a r coWt,re, 1,a p h a s e o r g a n i q u e q u i n,e c o n t i e n t p a s de prot,6in, e~s, r e n f e r m e 72 p. c e n t des l i p i d e s to,tanx
Cepen.d:an~, 'aprbs a x o i r h i s s 6 un 6chantil,l~n sous agi.tation pen~larrt 72 h, l'activit,6 p h o s p h o . l i F a s i q u e est inchan~g6e.
Les activit.6s ph~spholip,asiq,ues ne sont d6ce1,6es ni clans l'inCerface ni dan,s la frac.tion but'a-
La f r a c t i o n aq~a.euse pr6sen, te d o n c ~ l'6tat latent l ' a c t i v i t 6 phospho,litrasique q u i n ' e s l c e p e n d a n t
BIOCHIMIE, 1978, 60, n ° 5.
P h o s p h o l i p a s e s et lipides de la m u q u e u s e i n t e s l i n a l e .
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raise .en 6 v i d e n c e qaae p a r l"addl[tion des lipitles p r d s e n t s d~ans l'h, omo.~daa,al in,t.eslinal,
pasiq.ne A r m a t s son e x t r a i t Iipi,diffu.e ne r e s t a u r e pas l'actiVil6 phosph~l,ip,asique B.
TABLEJrU H.
B - - N~ATURE DES LI'PIDES IMPLIQU]~S DANS LES ACTIVIT~S PHOSPHOLIPASIQUES.
Influence des fractions lipidiques de l'extrait butanolique sur la restauration de l'aetioit~ phospholipasique de type B. Fraction lipidique
0 Glycdrides - AGL MG-DG AGL Cholestdrol PE-PS PC LPC
Activitd phospholipasique B n moles/mn/mg
0,25 2,1 1,0 1,1 0,15 0,41 0,35 0,28
~ 0,05 ~___0,3 -I- 0,2 ~___0,2 ~__ 0,03 ~ 0,08 ~___0,07 ~___0,06
Chaque essai (I ml) contient un volume de phase aqueuse et deux volumes de fraction lipidique ultrasonnds ; il est ineubd 15 nan h 37°C en prdsenee de 500 nmoles de PC[~4C], dmulsionndes dans 1 ml de tampon aeide eitrique/phosphate disodique 0,2 M, pH 6,5. ~(~ : monoglyedrides ; DG : diglyedrides ; TG : triglyedrides ; ~GL : aeides gras libres ; PE : phosphatidydthanolamines ; PS : phosphatidylsdrines • PC : phosphatidyleholines • LI~C : lysophosphatidvleholines. ' " Nombre de mesures = 2.
L e ,trait,ement de 1,a malqu,euse inles,ti.n,ale p a r le but, anoI enlrain:e ~m,e f o r t e ttimin,ulion de l ' a c t i v i t 6 lysoph, o s p h o l , i p a s i q u e A~ (60' ~ 8'0 p. cent) el l ' a d d i t i o n d;e l'exlra'it l i p i d i q u e e n t ~ a i n e son i n ' h i b i t i o n totare. 2) Traitement par d'autres solvants. La s o l u b i l i s a t i o n d e s p r o t 6 i n e s p a r le penl,an~)l et p a r le bulano~l-peniano,1 e s l id~entique h eerie du bu,tano~l (410, p. c e n I d a,ns la p h a s e a q u e u s e .el 6,0 p. c e n t d a n s l ' i n t e r f a c e ) ; le m d l a n g e b u t a n o l - t i t h e r i s o p r o p y l i q u e s v l u b i H s e 50, p. cen,t ddes p r o l ~ i n e s . Les t r o i s t y p e s de solvants, e x t r a i e n t de 69 h 73 p. c e n l des 1,~p~.d~est o t a u x . L'ad,dition d e Fettle.all llp.idique obt~e.n~ apr6s d 6 1 i p i d a t i o n p a r le n - p e n t a n o l (II d- 2.L2) r e s l a u r e 25 p. c e n l de l'a,ct~vit6 p h o s p h o l i p a s ~ q u e B e t inh, ibe l'ac,tivit6 lyso,phosph'ol4pasique A 1 f f a b l e a u I). D ' a u t r e p a r t l'exi.rait Hpi,dique ~bt~ep~u p a r le m61'ange bulono,l-pentan,o¢ (.'1,13) resi,a:ure l'ac~ivit6 p h o s p h o l f p a s i q u e B m a t s h u n taut( m o i n s 6J.ev6 que Pex.trail b~atanoliqu,e. Le mbl'ange b u l a n o l 6 t h e r i~opropyl~ique f,a~l app,avaitre ffans la ph,ase a q u e u s e (IV) 60 p. c e n t de l ' a c t i v i t d l y s o p h o s p h o l i -
BIOCHIMIE, 1978, 60, n ° 5,
E p s i e i n et co,H. [24] .et Subba4ah et c crl,L [5] o n l monlrr~6 q u e r e x . t r a c t i o n des act, des gras libres' supp r i m a i t t o t a l e m e n t r a c t i v i t 6 i n t e s t i n a l e de t y p e B. H sembl,erait d o n c q u e l ' o n p u i s s e l e u r a t t r i b u e r la r e s i a , u r a t i o n de F a~t'ivitd p h o s p l m l i p a s i q u e B, ta.ndis q u e 1,es ,aci~d,es. p,trospha,tidiques, les p h o s phati, dyl-in.os,itot, ,1,es p h o s p h a t . i d y l - s e r i n e s et le d o d ~ c y l - s u t f a t e de sod~,um n ' o n l a'ucun effet a e t i v a l e u r [5]. L ' e x t r a ' i t butanallique 61arrt le pl~us actif, n a u s a e o n s sdpar6 les fra, etion~ .l.ipidiques d.e eel exCrait p o u r e n v i s a g e r sysl~m~atiquemeni 1,cur a,ction i n d i vid~aelle. Les rr6sultats s o n l r a p p o r t ~ s d'ans le tabl, eau II. L'addi, l,ion de lip'ides n e u l r e s rest'aure 50 p. c e n t d e l ' a c f i v i t 6 ph.ospholi~pasique B a~Lors q u e ~es a c i d e s gras lib~es n e res~auren, t q u e 27 p. c e n t de l'ac¢ivit6 initia,le. L e s p h o s p h ' o l i p i d e s et le c h o l e s t,6rod ne s o n t p,as a c t i v a t e u r s . E n c~ncl'usion, Paclivi,t6 phos, p h o l i p , a s i q u e B glob a l e de la m u q u e u s e ~in,test~in.al:e de rat est f o r t e m e n l inh.ib6e .apr6s ddl,i,pid~ali~n ; pl.us de 95 p. c e n t d,e ,l'activit.6 dis.parail. L'ad~diti'on des glyc6r i d e s el des acid,es g r a s ~res,tauve p.lus de 50 p. c e n t de oette ~c.tivit,6 a l o r s q u e l ' a c t i v i t d l y s , o p h o s p h o l i p a s i q u e f f e s t pas rest.atw6e. Ce r~std~,at 1,~moigne de l~a lipido-d;6pendan, c e d,u sys~,6me e n z y l n a t i q u e de la m u q u e u s e in.teslinale l i b 6 r a n l les d e u x a c i d e s g r a s des p h o s p h a t i d y t c h o l i n e s .
Remerciements. Nous remercions Vdronique Roques pour sa prdcieuse collaboration technique. BIBLI'OGRAPHI,E. 1. Bonnefis, M. J., Rey, G., Thouvenot, J. P. & DousteBlazy, L. (197,7) Biochimie, 59, 355-361. 2. Nishijima, M,. & Nojima~ S. (1977) J. Biochem., 81, 5313-537. 3. Schmidt, G., Bessinlan, M. J. & Thannhauser, S. J. (1957) Biochim. Biophys. Acta, 23, 127-128. 4. Epstein, B. & Shapiro, B. (195.7) Nature, 180, 387. 5. Subbaiah, P. V. & Ganguly, J. (19'70) Biochem. J., 118, 233-2.39. 6. Drainas, D., Moores, G. R. & Lawrence, A. J. (1978) FEBS Letters, 8~, 1 4%52. 7. O'Doherty, P. J. A., Smith, N. B. & Kuksis, A. 0977) Arch. Biochem. Biophys., 180, 10-18. 8. Lokesh, B. R., Rao, A.'M. & Murthy, S. K. (1977) Biochim. Bioph!ls. Acta, 486, 341~350. 9. Hiilsmann, W. C. & Kurpershoek-Davidov, R. (1976) Biochim. Biophys. Aeta, 450, 2188-30'0.
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(~7-1~-1977).
L e s h o m o g 6 n a t s d~e m u q u e u s e i n l e s l i n a l e d e r a t p r 6 s e n l e n ¢ u n e a c t i v i t 6 p h o s p h o l i p , a s i q u e Au et un,e a c t i v i t 6 lysophosohc*li~)asiq~te A1 [1] se i r a d,ui,s a n l p a r u n e aciivi,t6 p l ~ o s p h o l i p a s i q u e B glob a l e . Genre sp~c*ifici~6 esi s e m b ~ a b l e A cel le d e 1,a p h o s p h o . H p a s e l~ d,e P e n i c i l l i u m n o t a t u m [2]. L ' h y d r o l y s e d e s PC,, F i n s ,len.t,e clue c e l l e d e s P E [3] n,bcess~te l a ~r6s,erme d ' a c i d e s gras. l i b r e s exog~ne,s [4, 5]. I1 ,en es1 d'e m 6 m e p~)n~r l,a p h o s pholip~as, e A~ d e v e n i n d ' . a b e i ~ e [6] e t p o u r d ' a u i r e s e n z y m e s q~ui ~agissent s , e ~ e m e n l e n p r e s e n c e d e lipi,4es [7, 8, 9, 10]. C;est ai~nsi q u e 1,e l r ~ t e m e n t d e la m u q u e u s e intes,tin~a~e p a r l'a,c6ione et le but*anol s u p p r i m e l ' a c t i v i ~ 6 p h o s p . h o ~ h p a s i q u e B et d i m i n u e fort,emen~ l ' a c ~ i v i t 6 t y s o p h , o s p b e ~ i p a ~ i q a e [5]. G e p e n d a r r t la pert,e de, l',activi~6 p rovocfu6e p ~ r la d,61ipid~ation n e c , o n s t i t t m p,as t m crit~r.e s~ffisarrt p o u r a f f i r m e r l~a d6pend~an.ce t o ~ l e d e l ' e n z y m e v i s - h - v i s d e s ,IipidLes ; o n p e n t 6voque,r u n e d6.n, a l u r a t i o n n*o'n 14pidiqtm, o u e n c o r e F a c t i o n i,n h i ' b i l r i c , e d e s s , o l v a n t s [11] o u d e 1.e.urs c o n t a m i n,a n t s [12, 13, 14]. C'.esi p,aurqu~oi p o u r a f f i r m e r c e t i e d ~ p e n d a n : c e , il est n,6cessair,e d,e co,rr~61er d'abo'rd l a pe,rte d~'activil6 ~ v e c la d i s p a r i t i o n d e s t i p i d e s d u m i l i e ~ ,d'in,cubati.on et en.s~ile d e r e s t a u t e r l'activi,t,6 ap,r~s a,d'd'il~ion fl~es 15pities [15]. No,us a v o n s p a ain,si m v t l r e e n 6 v i d e n c e , d,ans ce t.ravai'l, l a lip,icto-d*6pe,nda~nee d e s p h o s p h o l . i p , a s e s c~e ,la m u q u e u s e in.lest.in,ale d e ra~ et n ~ u s avo,ns p r 6 c i s 6 l a n a t u r e ties lipid,es i m p l i q u , ~ s dans. c e t t e a.ctivi,t6 e n z y m a f i q ~ e .
Abr~viations : PC : phosphatidylcholine. PE : p h o s p h a t i d y l J t h a n o l a m i n e . LPC : lysophosphatidylcholine. GPC : glyc~rophosphorylcholine. © A qui route correspondance doit ~tre adressde.
Mat6riel et M6thodes. A --
SUBSTRATS.
1) Les PC [14C] sont pr~par~es h p a r t i r de foie de r a t a y a n t r e i n une i n j e c t i o n intrap~riton~ale de ehlorh y d r a t e de choline [14C~_~] en solution isotonique (20,3 m C i / m m o l e - - C.E.A. Saelay, France) [16, 17]. ~) Les 1-acyl-glye~rophosphorylcholines [14C] sont obtenues h p a r t i r de ces PC [1]. B
--
DI~LIPIDATION
ET
SOLUBIL1SATION DES
pROT~INES
ENZYMATIQUES.
Nons avons adopt~ la t e c h n i q u e de d~lipidation p a r le n - b u t a n o l d~jh utilis~e p o u r purifier les lysophospholipases de foie et de pancr6as de boeuf [18, 19]. 1) Par le butanol. A u n volume d ' h o m o g 6 n a t [1] est ajout6 u n volume de n - b u t a n o l froid Saturd d'eau. Le m61ange est agit6 v i g o u r e u s e m e n t p e n d a n t 5 m i n u t e s puis centrifug6 h 1500~0 g/15 mn. La phase aqueuse (I) est d~barass6e du b u t a n o l sous e o u r a n t d'azote. La phase b u t a n o l i q u e (L1), mise h sec sous u n cour a n t d'azote, est reprise p a r des qua~tit~s v a r i a b l e s de phase aqueuse. Les m~langes sont alors soumis aux u l t r a - s o n s 3 × 1 m n h 0°C. Les r~sultats rapport6s c o r r e s p o n d e n t h u n in61ange c o n t e n a n t 1 volume de I et 2 volumes de L1. D'autrc part, pour a n a I y s e r le c o n t e n u lipidique, la phase b u t a n o l i q u e est c h r o m a t o g r a p h i 6 e sur t o u c h e mince, soit dans le solvant des p h o s p h o l i p i d e s ehlorof o r m e - m ~ t h a n o l - e a u 65/35/4 v : v : v , soit d a n s le solv a n t des lipides neutres c h l o r o f o r m e - ~ t h e r de p6troleacide ac6tique 65/33/2, v :v :v. Chaque f r a c t i o n lipidique est pr6lev6e, ~lu6e, et remise en suspension dans u n volume identique a u volume de la p h a s e b u t a n o l i q u e , de m a n i 6 r e h conserver les m~mes p r o p o r t i o n s de phase aqueuse et de phase organique. Les prot~ines localis~es h l ' i n t e r f a e e b u t a n o l - e a n sont sdch~es sur gaze, et homog6n~is6es dans u n volume de t a m p o n identique ~ celui de l'homog6nat. 23 Par d'autres solvanls. L ' a d d i t i o n de p e n t a n o l a 6t6 pr~conis6e p a r Roelofsen et co11. [20] p o u r divers enzymes m e m b r a n a i r e s .
522
M. J. B o n n e f i s et coll.
L'homog6nat a ~t6 solubilis~ selon les m~mes proportions par le n-pentanol (H -4- L~); n-butanol/n-pentanol 1/1 v:v (III -4- .La) et le n-butanol/6ther isopropylique 4d6, v :v (I,V + L~).
n o l i q u e test6e a p r b s ,6vap,or~i~n d~ b~atanol so~s cotrran~t d ' a z o t e et 6'mu,lS~i'onn,6e dans~ KCI 0,2 M, p H 7,0. p,ar soni.cation.
Les activit6s phospholipasique B e t lysophospholipasique Aa sont ddtermin6es respectivement h l'aide de phosphatidylcholine [14(]] et ~ l'aide de 1-acyl-glyc6rophosphorylcholine [14(]] [1]. Le phosphore lipidique est dos6 par la m~thode de (]hen et coll. [21] et les protdines par la m6thode colorim~trique de Lowry [22].
L a pha~e a q u e u s ¢ (I) (,tableau I) p'~6sen~e de faibles, activitfs, phosph.ol.ipas'iffue B ( m o i n s de 5 p. c e n t ,de ,l'acfivit6 ini*ia~e d e l".hom~g6na¢) et l y s o p h o s p h o l i p a s i q u e Ax f ~ e .l'ord're 4 e 29 p. cent).
R6sultats
et Discussion.
L ' a c ' t i o n s6par6e ,o,u c o m b i n ~ e d e s d,iff6rents, solr a n t s p e r m e t ,l~a so.lubHis,ali'on des p h v s p h o l . i p a s e s d a n s l~a p h a s e a q u e u s e . A. LIPIDO-DI~PENDANCE DES PHOSPHOLIPASES.
1) Traitement par le butanol. Les pro£6i,nes s e dist,rib:u,en,t e.nCre la p h a s e a q u e u s e et l ' i n l e r f a c e (4~ ~ p. c e n t et 60. p. ceaa¢
L o r s q u e d e ~ x vobumes d e r e x t r a L t b u t a n o l i q u e s o n l 6mulsionnds~ c h n s t m vol,ume de p h a s e a q u e u s e , ,rapp'ort o p t i m a l (I + 2 L1), p l u s de l~a m o i l i 6 d e l'ac,tivit,6 p h o s p h o ' l ' i p a s i q u e d e t y p e B est resta~rr6e ; les prat~in,es , e n z y m a t i q u e s s~nt don.c clans la f r a c t i o n a~qtmuse. D ' a ~ t r e p a r t , a u c u n e act.ivit~ n ' e s t obs.erv~e l~.rsqt~e l~es~ c o m p o ,6s de' . l ' i n t e r f a e e sorrt ,aj,ou¢6s ~ 1,a f r a c t i o n a q u e n s e on ~ 1,a fra~Lion bulan,oHqtm. La r6aetivalion itrc~mplgte de l'activit6 phospholip.asique d e t y p e B p,vttt O r e .dl~e au fair qtm le mili'eu e n ~ i r a n n a n t i n i t i a l n~es~ ' qtre p , a r t i e l l e m e n t reeonst.itu6. C~tte op~ra~ion peu,t e n effet e x i g e r d ~ t e m p s t.r6s vatS~bles p o u v a n t a'Her j~sq.u'/~ p l ~ s i e u r s h e u r e s s.elo~n l " e n z y m e cons'i, d6r6e [23].
TABLEAU I.
Influence des lipides de lu muqueuse inlestinale sur les actioitds phospholipasiques. n Homog~nat I II III IV I At- L~ II 71- L.~ 1II -~ L:~ ~V -~- L 4
6 6 2 2 2 6 2 2 2
Prot6iaes mg/ml, 7,6 2,6 2,8 2,8 2,9 2,6 2,8 2,8 2,9
___~2,2 -t- 0,5 ~- 0,6 -t- 0,5 ~ 0,3 ~--~ 0,5 ~ 0,6 ~ 0,5 ~___0.3
Phospholipase B nmoles/ma/mg 3,5 0,25 0,5 0,8 0,019. 2,2 1,5 2.1 0,0095
-4- 0,5 -4- 0,05 -4- 0,1 -4- 0,1 -~- 0,003 -v- 0,3 -Jr- 0,3 ~ 0,3 ~ 0,0015
Lysophospholipase At nmoles/mn/mg 12,5 3,4 0,8 2,1 4,1 0,11 0,15 0,578 4,9
-+- 2 -+- 0,6 ~__ 0,1 ~__ 0,3 ~ 0,4 ~ 0,02 -4-- 0,02 ~ 0,014 ~__ 0 , 4
I, II, III, IV" : Phases aqueuses apr6s extraction des lipides respectivement par le n-butanol, le n-pentanol, le n-hutanol/n-pentanol et le n - b u t a n o l / f t h e r isopropylique, La, Lz, La, L~ : Phases organiques contenant les lipldes extraits respeetivement par le n-butanol, le n-pentanol, le n-butanol/n-pentanol, le n-butanol/~ther isopropylique. Chaque essai (1 ml) eontient un volume de phase aqueuse et deux volumes de l'extrait lipidique eorrespondant ultrasonn~ ; il est ineub6 15 mn h 37°C h pH 6,5 en pr~senee de 5.09 nmoles de pc[14C] ou 5 mn h 37°C h pH 6,5 en pr6se.nce, de 500 nmoles de LPC[14C]. n : nombre d'exp~riences.
r e s p e ~ t i v e m e n t ) . P a r coWt,re, 1,a p h a s e o r g a n i q u e q u i n,e c o n t i e n t p a s de prot,6in, e~s, r e n f e r m e 72 p. c e n t des l i p i d e s to,tanx
Cepen.d:an~, 'aprbs a x o i r h i s s 6 un 6chantil,l~n sous agi.tation pen~larrt 72 h, l'activit,6 p h o s p h o . l i F a s i q u e est inchan~g6e.
Les activit.6s ph~spholip,asiq,ues ne sont d6ce1,6es ni clans l'inCerface ni dan,s la frac.tion but'a-
La f r a c t i o n aq~a.euse pr6sen, te d o n c ~ l'6tat latent l ' a c t i v i t 6 phospho,litrasique q u i n ' e s l c e p e n d a n t
BIOCHIMIE, 1978, 60, n ° 5.
P h o s p h o l i p a s e s et lipides de la m u q u e u s e i n t e s l i n a l e .
523
raise .en 6 v i d e n c e qaae p a r l"addl[tion des lipitles p r d s e n t s d~ans l'h, omo.~daa,al in,t.eslinal,
pasiq.ne A r m a t s son e x t r a i t Iipi,diffu.e ne r e s t a u r e pas l'actiVil6 phosph~l,ip,asique B.
TABLEJrU H.
B - - N~ATURE DES LI'PIDES IMPLIQU]~S DANS LES ACTIVIT~S PHOSPHOLIPASIQUES.
Influence des fractions lipidiques de l'extrait butanolique sur la restauration de l'aetioit~ phospholipasique de type B. Fraction lipidique
0 Glycdrides - AGL MG-DG AGL Cholestdrol PE-PS PC LPC
Activitd phospholipasique B n moles/mn/mg
0,25 2,1 1,0 1,1 0,15 0,41 0,35 0,28
~ 0,05 ~___0,3 -I- 0,2 ~___0,2 ~__ 0,03 ~ 0,08 ~___0,07 ~___0,06
Chaque essai (I ml) contient un volume de phase aqueuse et deux volumes de fraction lipidique ultrasonnds ; il est ineubd 15 nan h 37°C en prdsenee de 500 nmoles de PC[~4C], dmulsionndes dans 1 ml de tampon aeide eitrique/phosphate disodique 0,2 M, pH 6,5. ~(~ : monoglyedrides ; DG : diglyedrides ; TG : triglyedrides ; ~GL : aeides gras libres ; PE : phosphatidydthanolamines ; PS : phosphatidylsdrines • PC : phosphatidyleholines • LI~C : lysophosphatidvleholines. ' " Nombre de mesures = 2.
L e ,trait,ement de 1,a malqu,euse inles,ti.n,ale p a r le but, anoI enlrain:e ~m,e f o r t e ttimin,ulion de l ' a c t i v i t 6 lysoph, o s p h o l , i p a s i q u e A~ (60' ~ 8'0 p. cent) el l ' a d d i t i o n d;e l'exlra'it l i p i d i q u e e n t ~ a i n e son i n ' h i b i t i o n totare. 2) Traitement par d'autres solvants. La s o l u b i l i s a t i o n d e s p r o t 6 i n e s p a r le penl,an~)l et p a r le bulano~l-peniano,1 e s l id~entique h eerie du bu,tano~l (410, p. c e n I d a,ns la p h a s e a q u e u s e .el 6,0 p. c e n t d a n s l ' i n t e r f a c e ) ; le m d l a n g e b u t a n o l - t i t h e r i s o p r o p y l i q u e s v l u b i H s e 50, p. cen,t ddes p r o l ~ i n e s . Les t r o i s t y p e s de solvants, e x t r a i e n t de 69 h 73 p. c e n l des 1,~p~.d~est o t a u x . L'ad,dition d e Fettle.all llp.idique obt~e.n~ apr6s d 6 1 i p i d a t i o n p a r le n - p e n t a n o l (II d- 2.L2) r e s l a u r e 25 p. c e n l de l'a,ct~vit6 p h o s p h o l i p a s ~ q u e B e t inh, ibe l'ac,tivit6 lyso,phosph'ol4pasique A 1 f f a b l e a u I). D ' a u t r e p a r t l'exi.rait Hpi,dique ~bt~ep~u p a r le m61'ange bulono,l-pentan,o¢ (.'1,13) resi,a:ure l'ac~ivit6 p h o s p h o l f p a s i q u e B m a t s h u n taut( m o i n s 6J.ev6 que Pex.trail b~atanoliqu,e. Le mbl'ange b u l a n o l 6 t h e r i~opropyl~ique f,a~l app,avaitre ffans la ph,ase a q u e u s e (IV) 60 p. c e n t de l ' a c t i v i t d l y s o p h o s p h o l i -
BIOCHIMIE, 1978, 60, n ° 5,
E p s i e i n et co,H. [24] .et Subba4ah et c crl,L [5] o n l monlrr~6 q u e r e x . t r a c t i o n des act, des gras libres' supp r i m a i t t o t a l e m e n t r a c t i v i t 6 i n t e s t i n a l e de t y p e B. H sembl,erait d o n c q u e l ' o n p u i s s e l e u r a t t r i b u e r la r e s i a , u r a t i o n de F a~t'ivitd p h o s p l m l i p a s i q u e B, ta.ndis q u e 1,es ,aci~d,es. p,trospha,tidiques, les p h o s phati, dyl-in.os,itot, ,1,es p h o s p h a t . i d y l - s e r i n e s et le d o d ~ c y l - s u t f a t e de sod~,um n ' o n l a'ucun effet a e t i v a l e u r [5]. L ' e x t r a ' i t butanallique 61arrt le pl~us actif, n a u s a e o n s sdpar6 les fra, etion~ .l.ipidiques d.e eel exCrait p o u r e n v i s a g e r sysl~m~atiquemeni 1,cur a,ction i n d i vid~aelle. Les rr6sultats s o n l r a p p o r t ~ s d'ans le tabl, eau II. L'addi, l,ion de lip'ides n e u l r e s rest'aure 50 p. c e n t d e l ' a c f i v i t 6 ph.ospholi~pasique B a~Lors q u e ~es a c i d e s gras lib~es n e res~auren, t q u e 27 p. c e n t de l'ac¢ivit6 initia,le. L e s p h o s p h ' o l i p i d e s et le c h o l e s t,6rod ne s o n t p,as a c t i v a t e u r s . E n c~ncl'usion, Paclivi,t6 phos, p h o l i p , a s i q u e B glob a l e de la m u q u e u s e ~in,test~in.al:e de rat est f o r t e m e n l inh.ib6e .apr6s ddl,i,pid~ali~n ; pl.us de 95 p. c e n t d,e ,l'activit.6 dis.parail. L'ad~diti'on des glyc6r i d e s el des acid,es g r a s ~res,tauve p.lus de 50 p. c e n t de oette ~c.tivit,6 a l o r s q u e l ' a c t i v i t d l y s , o p h o s p h o l i p a s i q u e f f e s t pas rest.atw6e. Ce r~std~,at 1,~moigne de l~a lipido-d;6pendan, c e d,u sys~,6me e n z y l n a t i q u e de la m u q u e u s e in.teslinale l i b 6 r a n l les d e u x a c i d e s g r a s des p h o s p h a t i d y t c h o l i n e s .
Remerciements. Nous remercions Vdronique Roques pour sa prdcieuse collaboration technique. BIBLI'OGRAPHI,E. 1. Bonnefis, M. J., Rey, G., Thouvenot, J. P. & DousteBlazy, L. (197,7) Biochimie, 59, 355-361. 2. Nishijima, M,. & Nojima~ S. (1977) J. Biochem., 81, 5313-537. 3. Schmidt, G., Bessinlan, M. J. & Thannhauser, S. J. (1957) Biochim. Biophys. Acta, 23, 127-128. 4. Epstein, B. & Shapiro, B. (195.7) Nature, 180, 387. 5. Subbaiah, P. V. & Ganguly, J. (19'70) Biochem. J., 118, 233-2.39. 6. Drainas, D., Moores, G. R. & Lawrence, A. J. (1978) FEBS Letters, 8~, 1 4%52. 7. O'Doherty, P. J. A., Smith, N. B. & Kuksis, A. 0977) Arch. Biochem. Biophys., 180, 10-18. 8. Lokesh, B. R., Rao, A.'M. & Murthy, S. K. (1977) Biochim. Bioph!ls. Acta, 486, 341~350. 9. Hiilsmann, W. C. & Kurpershoek-Davidov, R. (1976) Biochim. Biophys. Aeta, 450, 2188-30'0.
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