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La chimie combinatoire
NOUVELLESMiTHODES
r
combinatoire Parce qu’elle permet en une seule opkration de syntbktiser des milkers de cornposh diff&ents, la chimie combinatoire a investi les paillasses des laboratoires de recherche pharmaceutique. Excursion dans cet univers complexe.
l &rep. Campus de I’lnstitut Pasteur de Lille, 1, rue du ProfesseurCalmette, 59000 Lille.
E
n I’espace de quelques an&es les kultats des propremiers grammes de Gquencage et les progk du genie ginCtique ont profondkment transform6 les pro&d& de dkouverte des midicaments. Le champ d’investigation du pharmacologue couvre aujourd’hui des milliers de cibles potentielles (enzymes, rkcepteurs, Pknents de rkgulation gknique) qui, pouvant Ctre exprimies dans des organismes gCn&iquement modifiis, sont disponibles en grande quantitk. De plus, le dkveloppement de la robotique et des mkthodes analytiques a considkablemerit accru la capacitk des tests pharmacologiques in vitro. Ainsi, c’est souvent du nombre et de la diversit
structurale des mokules testkes que dipend la dkouverte d’un ligand qui, prkentant une haute affinitk pour un rtcepteur donnt!, pourrait &re i I’origine du dkveloppement d’un mkdicament. Cependant, la qua&t& de molicules synthPtisables par les chimistes est longtemps restCe trk en dessous du dPbit, en continue1 accroissement, de ces tests pharmacologiques. Une premike rCponse i cette insuffisance a consist6 j cribler les pharmacothGques, des collections de produits et d’intermbdiaires de synthtse, accumuICes au tours des annPes par les groupes pharmaceutiques. N&anmoins, si ces pharmacothkques demeurent encore i I’heure actuelle une
ISYNTHIQ~Ecmssnxml A
+
B
b
Ai
+
Bi
4
A-B
(n x n’ compw&) FIG 1 - Principe
26 BIOFUTUR 168
l
Juin 1997
de la synthkse
combinatoire.
source non tkgligeable de composis, elles prisentent deux inconvknients majeurs : d’une part, leur diversit structurale est limitke, d’autre part, elles sent d’une courte duke de vie et de rkapprovisionnement problCmatique. Dans ce contexte, une approche rationnelle et systtmatique de I’alimentation des tests de criblage par des compost% soigneusement sklectionrk s’est rapidement imposke et cela grlce i la chimie combinatoire. > Obtenir simultanement une infinite de combinaisons La dkmarche classique suivie par le chimiste organicien est extrCmement stCrCotypCe. Elle est fondCe sur la mise en prksence de rkactifs (A) et (B) afin d’obtenir un produit (AB) dont la purification et 1’Ptude structurale constituent des operations g&kalement plus longues et cokeuses que la synthtse elle-m&me. Ce type de astreignante dkmarche s’impose quand il est ntcessaire d’kaluer de faGon pricise les propriitCs du produit. En revanche, il est envisageable de la simplifier si le but de la synth& se est uniquement de dkcouvrir un produit actif par un criblage systCmatique du plus grand nombre possible de composks. Dans ce contexte sent apparues les premikes approches combinatoires. Leur principe fondamental est simple : la rPaction en milange de plusieurs monom&-es de diffkentes espkes (acides aminks, nucliotides, acides, amines...) conduit i I’obtention simultanke de mutes les combinaisons possibles de ces monomkres (voir figure 1). Ce milange est alors directement soumis au test biolo-
gique et ce n’est que si un resultat positif est obtenu que l’on cherche a identifier la combinaison active. Le fractionnement du melange, en tours de synthese, est evite en ayant recours a differentes methodes de sous-division des composes (voir plus loin). Ce principe de synthese et d’evaluation en melange se montre bien adapt6 21la preparation de peptides et d’oligonucleotides (a partir d’acides
aminis
et
de
nuclCotides).
Ces categories de molecules constituent d’ailleurs les premiers produits obtenus, d&s le debut des an&es quatre-vingt, par synthese combinatoire. > Une synthkse
en paralltile
En effet. les methodes recurrentes (procidant par la repetition d’une meme reaction) de synthese sur support solide autorisent, a partir d’un nombre limit& de monomeres bivalents (c’est-a-dire possedant deux sites reactifs) par exemple acides amines ou nucleotides, la multiplication des itapes combinatoires et l’obtention de composes en nombre quasi illimite (I). Les melanges d’oligonucliotides et plus particulierement de peptides, issus de ces methodes de synthese, se sont rtveles particulierement efficaces pour I’analyse de phenomenes de reconnaissance immunologique (determination d’epitopes reconnus par des anticorps monoclonaux, etude des regles d’association aux molecules du complexe majeur d’histocompatibilite). Cependant, leur utilisation s’est aussi soldie par des echecs lies a une absence d’activite ou a I’impossibilite d’identifier un compose unique responsable de I’activitt initialement dttectee. Paradoxalement, ces deux types d’ichecs proviennent d’une cause unique : le manque de diversite. Dans le premier cas, I’espace structural (un ensemble de parametre caractirisant la structure des molCcules) explore par le melange n’est pas suffisamment vaste pour inclure un compose actif. Dans le second cas, cet espace structural recouvre le domaine d’activitt mais, itant de faible diversite, les molecules le constituant sont t&s proches les unes des autres. Des lors, c’est du cumul de leurs activites individuelles que resulte l’activite initialement detectee, ce qui rend problematique l’identification d’un compose actif unique. Ces difficult&, auxquelles s’ajoutent les limites traditionnellement associees a I’utilisation thtra-
Facilit6
de synthese
Facilit6
d’utilisation
Diversit
structurale
Pertinence
pour
d’interactions T&es
de skies
Oligomhes
Petites
biologiques
organiques
molCoules
++ en melange
ktude
+
+++
+++
+
+
+++
biologiques int&essantes
peutique des peptides et des oligonucleotides - stabilite limitee en milieu biologique et mauvaise biodisponibiliti -, se sont traduites par ia recherche de methodes combinatoires plus adaptees h la preparation de petites molecules organiques. Or, la reactivite des monomeres organiques n’est pas, contrairement a celle des acides amines ou des acides nucleiques, suffisamment homogene pour permettre la construction de toutes ou presque toutes les combinaisons possibles. Face a ce probkme, les chimistes ont developpe une approche, applicable aux syntheses en solution ou en phase solide, fondee sur les techniques robotisees des pharmacologues. Cette methode, denommee synthese parallele, contourne les difficult& inherentes aux syntheses en melange, par une preparation individuelle des molecules dans les micropuits de plaque de titration, impliquant a chaque Ptape un seul monomere. Avantage considerable, toutes les manipulations individuelles, pesee, Ptiquetage, rapidement fastidieuses, voire impossibles quand elles concernent un t&s grand nombre d’echantillons differents, sont evities. En effet, les robots realisant les syntheses utilisent des plaques de meme format (96 puits) que les automates de criblage. Comme on le voit dans le tubEeau, la chimie combinatoire des oligomtres biologiques (peptides et oligonucleotides), y differe radicalement de celle des petites molecules organiques tant au niveau de sa mise en ceuvre que de ses objectifs. Si le caractere recurrent des syntheses combinatoires de peptides ou d’oligonucliotides rend inevitable I’utilisation de la chimie en phase solide, il n’en est pas de meme pour la preparation de petites molecules organiques, tout particulierement en synthese parallele. En fait, c’est la
nature des molecules a synthetiser qui conditionne le recours i des protocoles de svnthese en solution ou en phase solide. Ces deux chimies possedant chacune, comme on le verra par la suite, ses propres avantages et inconvenients. > 11% microbilles
rentrent
en jeu
Les methodes de synthese sur support solide impliquent la fixation covalente (eventuellement au moyen d’un bras de liaison) d’un des monomeres a une microparticule, une bille de quelques dizaines de micrometres de diametre constituee d’un polymere insoluble. L’autre monomere, qui peut ttre muni d’un groupe protecteur destine a masquer certains sites reactifs, est ajouti en solution. Le produit de reaction AB Ctant done lie au polymere, une filtration suffit i le &parer d’un eventuel exces de B. Prealablement h l’evaluation de son activite biologique, la mokule peut Ctre IibCrCe du support par le clivage de la liaison la reliant au polymere. Simple et facilement automatisable, la synthese en phase solide permet de s’affranchir de la variabiliti structurale de AB, ce qui n’est pas le cas pour d’autres methodes utilisees en chimie organique classique (extractions, precipitations), qui doivent itre adapt&es aux caractiristiques physicochimiques de chaque compose AB. Au tours des dernieres an&es, le nombre de reactions de chimie organique adaptees a la synthese en phase solide a CtC fortement multiplie. Parallelement ont eti developpees des methodes analytiques puissantes permettant de caracdriser les molecules obtenues encore likes a leur support de synthtse (techniques de resonance magnitique nucleaire a l’angle magique empruntees aux specialistes de la physicochimie des solides). Enfin, sont apparus de nouveaux BlOFUTUR168
(1) Cinq &apes cambinatoires avec les 20 acides amink naturels fournlssent 205 = 32 000 000 pentapeptides.
l
Juin 1997 27
~
NOUVELLES MiTHODES 1 METHODE DCR ]
[Une bilte : Un peptide] FIG 2 - MBthode
divide
couple
recombine.
polymkes aux propri&ks de gonflement mieux adaptkes i I’kentail des solvants utilisPs ainsi que de nouveaux bras de liaison, au clivage modulable, plus stables vis-h-vis de certains rPactifs organiques. > Une
(2) On compte 3 10s belles de 90 p par gramme de r&e
dans lesquels les monomkres les plus reactifs sont sous-reprkentis et la kalisation du couplage en deux &apes. Dans ce dernier cas. la premike Ptape est realiske avec une quantitt stcechiomkrique du mglange, un exct-s n’itant utilisi que pour la seconde phase. En fait, seule la mkthode divide couple recombine (DCR, division, couplage, remilange) offre. au prix d’une manipulation plus complexe. une solution g&&-ale au probkme. Elle implique prkalablement 1 toute &ape combinatoire, la rkpartition du support solide dans autant de rkacteurs qu’il y aura de monomkres diffkents i incorporer. Chaque monomke est alors coupli individuellement, ce qui autorise I’emploi de gros excks de rtactifs. En fin de couplage, les excis sont PliminCs aprPs lavage, et les microparticules provenant de chacun des riacteurs sont remGlangPes. Si cette mkthode pkente un avantage macroscopique, puisque la reprksen-
un compos6
bille,
L’un des avantages de la synthkse sur support solide est d’autoriser I’emploi de gros exck de rkactifs ce qui permet d’amener beaucoup plus facilement les rkactions i leur terme. Cependant, si au cows d’une &ape combinatoire un melange de plureactifs B diffCrents sieurs est employ6 en excks, ceux d’entre eux qui bkkficient des cinkiques de couplage les plus favorables seront incorpork prkfkrentiellement, introduisant un biais dans la reprisentation des diffkents compoks au sein du mClange combinatoire. Des solutions ont CtP propokes pour compenser ce ph6nomtne : I’utilisation de milanges
S
at-6 pour
monom&es stade
autant
combinatoire
differents
robotique
offre
pos6s
diffbrents
dans
un automate
manence
fichier
et d’une
individuelle.
Juin 1997
solide,
barres. complet pesees,
cerep
de la synth&se sont
composk
comportant,
en plus
de son des
I’hygromktrie,
au
de com-
est realis6e
identifies
synthbtis6
que I’identification
les tempbratures,
de 4 000
dkveloppkes
plus de 10 millions
et microplaques
telles
de plus
d’assemblage
de preparer
Chaque
a fait, de la chimie
L’utilisation
L’ensemble
reactifs
d’informations des
de chimies
theorique
de codes
en jeu, I’enregistrement
l
dizaine
la possibilite
informatique
en phase
I’une de ses spkialit6s.
; monomkres,
un ensemble
28 BIOFUTUR168
la synthese
de man&e
au moyen
gn6 d’un Wale,
nbgliger en solution
en per-
est accompaidentitb monom&es etc.
strucmis
tation des monomPres ne depend plus de leurs rkactivitk relatives mais de la faqon dont I’ensemble des microparticules, appelk egalement rPsine, a et6 divise, elk a Pgalement une cons& quence inattendue au niveau microscopique. Lors de la division de la rtsine, chaque microparticule se trouve dans un rkacteur (voir figure 2) et un seul, oti elle refoit un monomke unique (le vert ou le jaune). Aprk un remPlange et une nouvelle division, les billes jaunes comme les billes vertes sont j nouveau riparties entre deux riacteurs oti elles reqoivent un monomkre unique (bleu ou rouge). On constate qu’i I’issue d’une strie d’ktapes de DCR chaque bille adopte un chemin unique lui &ant propre. En consiquence, chaque bille est porteuse 1 la surface d’une espke combinatoire unique, c’est le principe du one bead-one peptide ou one beadone compound. Si i I’issue de la synthese, les composis dPharrass& de leurs groupes protecteurs ne sont pas dkacht% de leur support, il est possible d’entreprendre un criblage direct, puisqu’i chaque bille correspond une entitk mokulaire unique. De nombreuses mkthodes d’identification issues de ce principe seront dCtaillPes plus loin. La seule limit, de la mkthode DCR tient au nomhre de composis qu’elle permet de priparer. A un raisonnement simpliste qui veut que le nombre de composks ne puisse dtpasser le nombre de billes (2), il est prtfk-able de substituer une approche statistique permettant de calculer le
nombre de billes necessaires pour qu’un pourcentage don& de tous les composes possibles soit present dans le produit final. Un gramme de resine constituie de billes de 90 pm de diametre permet la synthese de moins d’un million de composes differents, en acceptant qu’une faible proportion de tous les composes attendus soit absente. Cette limitation restera en vigueur meme si l’on &pare les produits de leur support. Si I’on veut respecter la representation homogene des differents composes dans la solution, il sera necessaire d’utiliser un nombre superieur de billes. Lorsque les syntheses sont realisees en solution, il n’est plus possible
L
a methode
(a) ne s’applique
purement
peptidique.
gradation
recurrente
non peptidiques ~1exotiques Cette de
d’Edman,
(acides
assemblant
et
de reconnaissance
(b).
imposes
par
diversite
structurale
est constituee
la
de la synthese
plus
d’acides un
a la surface I’on
assigne
a repondre
aux
ce qui grande.
amines
monomere
permet
structure
autre
autorise
naturels
la lecture
de
ralement
la
marqueurs
en
alors,
a chacun
apparues.
different.
masse,
de sa sequen-
faisant aleatoi-
evite
la plupart
dues
sequentiel
au des
precedentes, Son
gazeuse,
on
ses
identifies
par
lecture
la la
nucleaire
permet,
synthese.
d’analyse
citera
magnetique
positive,
puis leur
de
methodes
un lien gene-
est
Plus
sur bille sont
spectrometrie
de
et le marquage
n
~ETIQUETTE Lactue
directs
SCquewage de peptide
NonPeptidique
Lectws indirect8 SCqueqage de peptide
Nnn P*ntiWotr 1.1.1. rp...mye
Lecture indirecte (GC) Etinllatte lb-m I ---A------peptidiquq non I oCquen?able
approches iLA.VAL4.W
consiste
a
etapes
synthese
en
faisant
marqueurs
celles-ci
la resonance
PeptidiQJe
des
des
a des
photolyse
marmono-
de la synthese).
bille
I’historique
caractere
I’ensemble la
phase
de nouvelles Parmi
par
de
meme
radioelectrique.
ALA-VAL.LEU
a ete introduite principe
en
qu’un
etapes
Lorsqu’une
d’apprehender
recemment,
indiquer
maret sur
il a ete incorpo-
differentes
est lie a la bille par
detaches
de
du monomere
de laquelle
a differentes
marqueurs
photoclivable. sont
combinaison
combinaisons pour
incorpore
chromatographie
une
au tours deux
employees des
Chaque sur la nature
COMPOSE A TESTER 1
beau-
rapide
qui
a ete
barres. a la fois
que
seront
L’ensemble
sa
a un marquage
erreurs
ainsi
en
criteres
La seconde,
organique
mere
codes
de
de
methode
plus
des
re (c’est
de liaison.
coup
appel
I’etape
cc-amines
les fonctions
a qui
d’Edman,
bille est positive,
ce d’identification deduire
n’a pas
associe
lorsqu’une
elles
beaucoup
est
de
renseigne
c’est-a-dire
sequences
d’entre
la degradation
revanche,
sequence
en dissociant
deux
L’une
desquels
coder
queurs
d’elements
acides
d’identification,
simultanement
fonction
(c).
I’emploi
ou m&me
a ete contournee
bille
re,
man&e
par de-
queurs
chaque
appel
elle interdit
B-amines,
Les methodes de d&convolution, appliquies au criblage en solution, sont d’un principe totalement different. Elles sont fondies sur la repartition, en tours de synthese, des composes en series de sous-ensembles. Ces derniers, testes separement, vont permettre d’identifier l’espece active sans qu’il wit necessaire de recourir a sa purification et a son andlyse structurale. On retiendra ici trois grandes methodes : la d&convolution iterative, le balayage positionnel et la mithode dite de partitions orthogonales (ou des bibliotheques orthogonales). La molecule svnthetisee est consideree comme un ensemble ordonne de monomeres occupant des positions precises. La d&convolution iterative,
de nature
se faisant
I>).
limitation
Une
qu’a des composes
L’identification
reconnaissance
Ainsi,
mieux la diversiti qu’offre chaque famille de monomeres dans des riactions d’assemblage simples avant un large domaine d’application. Une fois la synthese realisie, criblage et identification (ou deconvolution) constituent l’etape cli qui permet la decouverte de molecules a application therapeutique potentielle. Quand les couplages s’effectuent avec plusieurs monomeres simultanement, les melanges sont testes directement. L’identification de l’esptce responsable de I’activite est effect& par plusieurs methodes dont les principes different selon que le criblage aura iti effect& sur des composes encore lies a leur polymere de synthise OLI sur des composes &pares de ce support et
combinaisons fonctionnant
cl
--AQ-ii
I I I
de a la
d’utiliser l’exces de l’un des monomeres ni d’eliminer les reactifs. Une mise au point beaucoup plus soigneuse du protocole se revele alors necessaire. En revanche, l’absence de liaison d’un des monomeres a un support augmente considerablement la diversiti et tvite I’etape de clivage laquelle peut entrainer la destruction de composes possedant des groupements fragiles. L’emploi des reactions en solution permet d’utiliser au
done testes en solution. A l’issue d’une synthise en phase solide. selon la methode DCR, le criblage peut-Ptre effect& directement. L’ensemble des billes est alors incube avec le recepteur soluble dont on souhaite identifier un ligand. La liaison de ce rtcepteur aux billes est visualisee par un marquage direct ou indirect du rtcepteur. Quand une bille se revele positive on procede a l’identification du compose qu’elle Porte (voiv encudt4.
applicable aux syntheses recurrentes, procede par identifications successives du monomire le plus actif en chacune des positions, au moyen de melanges de complexiti decroissante. Son principe est illustre par la figure 3 dans le cas d’un exemple simple : une synthese comportant trois &apes combinatoires au tours desquelles est utilise un melange de deux monomeres, A et B. Le resultat est done un ensemble BIOFUTUR 168
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de huit molecules. L’identification du compose responsable de I’activiti est effectue de la man&e suivante : on synthetise deux lots differents, le premier contient tomes les molecules qui comportent A en premiere position (A-X-X : X correspond a A ou B), le second lot rassemble toutes les molecules comportant B (B-X-X) fix.5 en premiere position. L’etude de l’activite biologique de chacun de ces lots permet de determiner qui de A ou de B est, pour la premiere position, responsable de I’activite biologique. Supposons que B soit identifie, on synthttise alors deux lots comportant B en premiere position, A ou B en deuxieme position (B-A-X ou B-B-X). De la mCme man&e que precedemment, l’itude de l’activite biologique de chacun des lots permettra de determiner qui de A ou de B doit itre present en deuxieme position. L’opiration est alors repetee pour la troisieme position. Cette methode presente I’inconvenient de necessiter une nouvelle sirie de syntheses pour chaque position, et ceci chaque fois qu’une nouvelle activite est dicelee. En revanche, la concentration en espece active s’accroissant (en theorie) a chaque &ape, une augmentation sensible de I’activite biologique lors du processus d’identification constitue un excellent contrble. Le balayage positionnel est decrit sur la figwe 4 pour le mime ensemble de huit composes que precedemment. Ceux-ci sont, des la synthese, repartis en six sous-ensembles se recouvrant partiellement. Chaque sousensemble comporte un monomere fixe en une position, les deux autres
FIG 3 - Principe de la dkonvolution itkrative appliqube C?Iune bibliotheque de huit compos8s.
positions portent X. Les six lots sont testes simultanement ce qui permet de determiner dans chaque position la nature du monomere qui confere la plus grande activite. On remarque, par opposition au cas precedent que la total% des sow-ensembles est priparee et testee en une seule &ape, sans qu’il soit necessaire de recourir 1 une nouvelle synthese. En revanche, aucune amelioration d’activite, pouvant renseigner sur la qualit6 de la methode d’identification, n’est attendue. De plus, pour que le balayage positionnel soit valide, il est necessaire d’admettre le principe de connectivite (c’est-a-dire l’interaction entre les differents monomeres et le recepteur comme des elements associes) entre chacun des monomeres ccles plus actifs )), ce qui n’est pas toujours le cas.
> Les sowbibliothttques i la rescousse La methode dite de partition orthogonale repose, comme la precidente, sur la repartition de la bibliotheque, dis sa synthese, en series de sousbibliotheques prealablement definies. Deux series de sous-bibliotheques sont preparees, correspondant chacune i deux repartitions differentes de I’ensemble des composes de la mCme bibliotheque. Une proprieti importante de ces sous-bibliotheques est que le nombre de composes par sous-bibliotheque est igal au nombre de sous-bibliotheques dans chaque serie. La synthese est organisic de telle sorte que les composes presents en melange dans une mime sous-bibliotheque de la premiere serie se voient ripartis a raison d’un compose et un seul dans chacune des
.~~-~~
Bibliothkwe
FIG 4 - Principe 30 BlOFLJTUR168
l
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du balayage
positionnel
divisb
applique
.,
en 6 lots de 4 compos&
A une bibliothkque
de huit composk.
/-Am
Bibliotheque de 9 composes Serie 1 : 3 sous-bibliotheques de 3 composes
FIG 5 - Partition
orthogonale
dune
sous-bibliotheques de la seconde serie. 11 n’y a, ainsi, qu’un seul compose en commun, permettant l’identification directe d’un produit actif (uoir figure 5). Lorsqu’une strategic comhinatoire fait appel a. la synthese parallele, chaque compose est obtenu et testi individuellement. I1 est alors essentiel de s’assurer que l’ensemble des molecules couvre un espace structural de la plus grande diversite possible. L’evaluation et l’optimisation de cette diversiti constituent, en effet, un element cl& dans le succes d’une stratigie de criblage.
> haluer la diversit Toute methode d’evaluation de la diversiti est fondee sur I’elahoration d’un 1~descripteur )) integrant deux categories de donnees. D’une part, des elements qui sont, par exemple, la connectivite des atomes (nature des liaisons entre les atomes), I’identification de groupes fonctionnels, des proprietes physicochimiques glohales (la masse moleculaire, l’hydrophobie, etc). D’autre part, des informations qui, relatives a la structure tridimensionnelle des molecules, sont particulierement significatives dans le domaine des interactions biologiques. La strategic d’ivaluation de la diversiti developpee a Cerep fait t&s largement appel i des descripteurs fond& sur les structures tridimensionnelles. Chaque monomere est soumis a une etude informatique
bibliotheque
de neuf
chacune
composes.
de dynamique moleculaire, permettant d’engendrer l’ensemble des comformations representatives. A partir de ces conformations est calculee une c( signature )), qui prend la forme d’une matrice de 63 elements, denommee empreinte du pharmacophore. Chacun des elements correspond aux distances minimale, maximale et moyenne entre les principaux groupements susceptihles d’etablir des interactions intermoleculaires (accepteurs ou donneurs de liaisons hydrogenes, charges, noyaux aromatiques...). La comparaison de deux molecules revient alors a comparer chacun des 63 elements de leur (( empreinte du pharmacophore )). La ponderation a accorder a chacun de cc‘s 63 elements a fait l’objet d’une
parametrisation au moyen d’un algorithme specifique et de groupes de molecules <j. La premiere application de cette methode est de permettre une selection rapide parmi de grandes familles de monomeres de man&e a maximiser la diversite au sein de bihliotheques de criblage primaire ou, au contraire, de selectionner les monomeres les plus proches structuralement (conception de pharmacotheques biaisees destinies a l’optimisation d’une tite de serie). Un autre avantage de cette mithode est de se preter, par couplage virtue1 des monomeres, a la generation de tres grandes collections de composes (jusqu’h 10 millions) de man&-e i en evaluer la diversite ou a y rechercher des eICments de pharmacophore prealablement difinis. La chimie comhinatoire constitue aujourd’hui une discipline au potentie1 important et dont les exigences de qualite sont i l’origine de dive1oppements analytiques originaux en spectrometrie de masse et RMN en particulier. Encore jeune, la conception rationnelle des pharmacotheques devra prohahlement integrer de nouveaux parametres intervenant dans le dtveloppement des medicaments. Pour cela, il sera nicessaire de creer et d’exploiter des banques de donnees permettant d’evaluer hiodisponihilite, pharmacocinetique et metaholisme. I1 est Pgalement previsihle que l’etahlissement systtmatique de profils pharmacologiques sur un grand nomhre de recepteurs differents (73 ricepteurs en profiling rapide a Cerep) permettra de degager des consensus structuraux pour chaque grande famille de recepteurs et de concevoir des pharmacotheques qui en seront specifiques.
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combinatoire Parce qu’elle permet en une seule opkration de syntbktiser des milkers de cornposh diff&ents, la chimie combinatoire a investi les paillasses des laboratoires de recherche pharmaceutique. Excursion dans cet univers complexe.
l &rep. Campus de I’lnstitut Pasteur de Lille, 1, rue du ProfesseurCalmette, 59000 Lille.
E
n I’espace de quelques an&es les kultats des propremiers grammes de Gquencage et les progk du genie ginCtique ont profondkment transform6 les pro&d& de dkouverte des midicaments. Le champ d’investigation du pharmacologue couvre aujourd’hui des milliers de cibles potentielles (enzymes, rkcepteurs, Pknents de rkgulation gknique) qui, pouvant Ctre exprimies dans des organismes gCn&iquement modifiis, sont disponibles en grande quantitk. De plus, le dkveloppement de la robotique et des mkthodes analytiques a considkablemerit accru la capacitk des tests pharmacologiques in vitro. Ainsi, c’est souvent du nombre et de la diversit
structurale des mokules testkes que dipend la dkouverte d’un ligand qui, prkentant une haute affinitk pour un rtcepteur donnt!, pourrait &re i I’origine du dkveloppement d’un mkdicament. Cependant, la qua&t& de molicules synthPtisables par les chimistes est longtemps restCe trk en dessous du dPbit, en continue1 accroissement, de ces tests pharmacologiques. Une premike rCponse i cette insuffisance a consist6 j cribler les pharmacothGques, des collections de produits et d’intermbdiaires de synthtse, accumuICes au tours des annPes par les groupes pharmaceutiques. N&anmoins, si ces pharmacothkques demeurent encore i I’heure actuelle une
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de la synthkse
combinatoire.
source non tkgligeable de composis, elles prisentent deux inconvknients majeurs : d’une part, leur diversit structurale est limitke, d’autre part, elles sent d’une courte duke de vie et de rkapprovisionnement problCmatique. Dans ce contexte, une approche rationnelle et systtmatique de I’alimentation des tests de criblage par des compost% soigneusement sklectionrk s’est rapidement imposke et cela grlce i la chimie combinatoire. > Obtenir simultanement une infinite de combinaisons La dkmarche classique suivie par le chimiste organicien est extrCmement stCrCotypCe. Elle est fondCe sur la mise en prksence de rkactifs (A) et (B) afin d’obtenir un produit (AB) dont la purification et 1’Ptude structurale constituent des operations g&kalement plus longues et cokeuses que la synthtse elle-m&me. Ce type de astreignante dkmarche s’impose quand il est ntcessaire d’kaluer de faGon pricise les propriitCs du produit. En revanche, il est envisageable de la simplifier si le but de la synth& se est uniquement de dkcouvrir un produit actif par un criblage systCmatique du plus grand nombre possible de composks. Dans ce contexte sent apparues les premikes approches combinatoires. Leur principe fondamental est simple : la rPaction en milange de plusieurs monom&-es de diffkentes espkes (acides aminks, nucliotides, acides, amines...) conduit i I’obtention simultanke de mutes les combinaisons possibles de ces monomkres (voir figure 1). Ce milange est alors directement soumis au test biolo-
gique et ce n’est que si un resultat positif est obtenu que l’on cherche a identifier la combinaison active. Le fractionnement du melange, en tours de synthese, est evite en ayant recours a differentes methodes de sous-division des composes (voir plus loin). Ce principe de synthese et d’evaluation en melange se montre bien adapt6 21la preparation de peptides et d’oligonucleotides (a partir d’acides
aminis
et
de
nuclCotides).
Ces categories de molecules constituent d’ailleurs les premiers produits obtenus, d&s le debut des an&es quatre-vingt, par synthese combinatoire. > Une synthkse
en paralltile
En effet. les methodes recurrentes (procidant par la repetition d’une meme reaction) de synthese sur support solide autorisent, a partir d’un nombre limit& de monomeres bivalents (c’est-a-dire possedant deux sites reactifs) par exemple acides amines ou nucleotides, la multiplication des itapes combinatoires et l’obtention de composes en nombre quasi illimite (I). Les melanges d’oligonucliotides et plus particulierement de peptides, issus de ces methodes de synthese, se sont rtveles particulierement efficaces pour I’analyse de phenomenes de reconnaissance immunologique (determination d’epitopes reconnus par des anticorps monoclonaux, etude des regles d’association aux molecules du complexe majeur d’histocompatibilite). Cependant, leur utilisation s’est aussi soldie par des echecs lies a une absence d’activite ou a I’impossibilite d’identifier un compose unique responsable de I’activitt initialement dttectee. Paradoxalement, ces deux types d’ichecs proviennent d’une cause unique : le manque de diversite. Dans le premier cas, I’espace structural (un ensemble de parametre caractirisant la structure des molCcules) explore par le melange n’est pas suffisamment vaste pour inclure un compose actif. Dans le second cas, cet espace structural recouvre le domaine d’activitt mais, itant de faible diversite, les molecules le constituant sont t&s proches les unes des autres. Des lors, c’est du cumul de leurs activites individuelles que resulte l’activite initialement detectee, ce qui rend problematique l’identification d’un compose actif unique. Ces difficult&, auxquelles s’ajoutent les limites traditionnellement associees a I’utilisation thtra-
Facilit6
de synthese
Facilit6
d’utilisation
Diversit
structurale
Pertinence
pour
d’interactions T&es
de skies
Oligomhes
Petites
biologiques
organiques
molCoules
++ en melange
ktude
+
+++
+++
+
+
+++
biologiques int&essantes
peutique des peptides et des oligonucleotides - stabilite limitee en milieu biologique et mauvaise biodisponibiliti -, se sont traduites par ia recherche de methodes combinatoires plus adaptees h la preparation de petites molecules organiques. Or, la reactivite des monomeres organiques n’est pas, contrairement a celle des acides amines ou des acides nucleiques, suffisamment homogene pour permettre la construction de toutes ou presque toutes les combinaisons possibles. Face a ce probkme, les chimistes ont developpe une approche, applicable aux syntheses en solution ou en phase solide, fondee sur les techniques robotisees des pharmacologues. Cette methode, denommee synthese parallele, contourne les difficult& inherentes aux syntheses en melange, par une preparation individuelle des molecules dans les micropuits de plaque de titration, impliquant a chaque Ptape un seul monomere. Avantage considerable, toutes les manipulations individuelles, pesee, Ptiquetage, rapidement fastidieuses, voire impossibles quand elles concernent un t&s grand nombre d’echantillons differents, sont evities. En effet, les robots realisant les syntheses utilisent des plaques de meme format (96 puits) que les automates de criblage. Comme on le voit dans le tubEeau, la chimie combinatoire des oligomtres biologiques (peptides et oligonucleotides), y differe radicalement de celle des petites molecules organiques tant au niveau de sa mise en ceuvre que de ses objectifs. Si le caractere recurrent des syntheses combinatoires de peptides ou d’oligonucliotides rend inevitable I’utilisation de la chimie en phase solide, il n’en est pas de meme pour la preparation de petites molecules organiques, tout particulierement en synthese parallele. En fait, c’est la
nature des molecules a synthetiser qui conditionne le recours i des protocoles de svnthese en solution ou en phase solide. Ces deux chimies possedant chacune, comme on le verra par la suite, ses propres avantages et inconvenients. > 11% microbilles
rentrent
en jeu
Les methodes de synthese sur support solide impliquent la fixation covalente (eventuellement au moyen d’un bras de liaison) d’un des monomeres a une microparticule, une bille de quelques dizaines de micrometres de diametre constituee d’un polymere insoluble. L’autre monomere, qui peut ttre muni d’un groupe protecteur destine a masquer certains sites reactifs, est ajouti en solution. Le produit de reaction AB Ctant done lie au polymere, une filtration suffit i le &parer d’un eventuel exces de B. Prealablement h l’evaluation de son activite biologique, la mokule peut Ctre IibCrCe du support par le clivage de la liaison la reliant au polymere. Simple et facilement automatisable, la synthese en phase solide permet de s’affranchir de la variabiliti structurale de AB, ce qui n’est pas le cas pour d’autres methodes utilisees en chimie organique classique (extractions, precipitations), qui doivent itre adapt&es aux caractiristiques physicochimiques de chaque compose AB. Au tours des dernieres an&es, le nombre de reactions de chimie organique adaptees a la synthese en phase solide a CtC fortement multiplie. Parallelement ont eti developpees des methodes analytiques puissantes permettant de caracdriser les molecules obtenues encore likes a leur support de synthtse (techniques de resonance magnitique nucleaire a l’angle magique empruntees aux specialistes de la physicochimie des solides). Enfin, sont apparus de nouveaux BlOFUTUR168
(1) Cinq &apes cambinatoires avec les 20 acides amink naturels fournlssent 205 = 32 000 000 pentapeptides.
l
Juin 1997 27
~
NOUVELLES MiTHODES 1 METHODE DCR ]
[Une bilte : Un peptide] FIG 2 - MBthode
divide
couple
recombine.
polymkes aux propri&ks de gonflement mieux adaptkes i I’kentail des solvants utilisPs ainsi que de nouveaux bras de liaison, au clivage modulable, plus stables vis-h-vis de certains rPactifs organiques. > Une
(2) On compte 3 10s belles de 90 p par gramme de r&e
dans lesquels les monomkres les plus reactifs sont sous-reprkentis et la kalisation du couplage en deux &apes. Dans ce dernier cas. la premike Ptape est realiske avec une quantitt stcechiomkrique du mglange, un exct-s n’itant utilisi que pour la seconde phase. En fait, seule la mkthode divide couple recombine (DCR, division, couplage, remilange) offre. au prix d’une manipulation plus complexe. une solution g&&-ale au probkme. Elle implique prkalablement 1 toute &ape combinatoire, la rkpartition du support solide dans autant de rkacteurs qu’il y aura de monomkres diffkents i incorporer. Chaque monomke est alors coupli individuellement, ce qui autorise I’emploi de gros excks de rtactifs. En fin de couplage, les excis sont PliminCs aprPs lavage, et les microparticules provenant de chacun des riacteurs sont remGlangPes. Si cette mkthode pkente un avantage macroscopique, puisque la reprksen-
un compos6
bille,
L’un des avantages de la synthkse sur support solide est d’autoriser I’emploi de gros exck de rkactifs ce qui permet d’amener beaucoup plus facilement les rkactions i leur terme. Cependant, si au cows d’une &ape combinatoire un melange de plureactifs B diffCrents sieurs est employ6 en excks, ceux d’entre eux qui bkkficient des cinkiques de couplage les plus favorables seront incorpork prkfkrentiellement, introduisant un biais dans la reprisentation des diffkents compoks au sein du mClange combinatoire. Des solutions ont CtP propokes pour compenser ce ph6nomtne : I’utilisation de milanges
S
at-6 pour
monom&es stade
autant
combinatoire
differents
robotique
offre
pos6s
diffbrents
dans
un automate
manence
fichier
et d’une
individuelle.
Juin 1997
solide,
barres. complet pesees,
cerep
de la synth&se sont
composk
comportant,
en plus
de son des
I’hygromktrie,
au
de com-
est realis6e
identifies
synthbtis6
que I’identification
les tempbratures,
de 4 000
dkveloppkes
plus de 10 millions
et microplaques
telles
de plus
d’assemblage
de preparer
Chaque
a fait, de la chimie
L’utilisation
L’ensemble
reactifs
d’informations des
de chimies
theorique
de codes
en jeu, I’enregistrement
l
dizaine
la possibilite
informatique
en phase
I’une de ses spkialit6s.
; monomkres,
un ensemble
28 BIOFUTUR168
la synthese
de man&e
au moyen
gn6 d’un Wale,
nbgliger en solution
en per-
est accompaidentitb monom&es etc.
strucmis
tation des monomPres ne depend plus de leurs rkactivitk relatives mais de la faqon dont I’ensemble des microparticules, appelk egalement rPsine, a et6 divise, elk a Pgalement une cons& quence inattendue au niveau microscopique. Lors de la division de la rtsine, chaque microparticule se trouve dans un rkacteur (voir figure 2) et un seul, oti elle refoit un monomke unique (le vert ou le jaune). Aprk un remPlange et une nouvelle division, les billes jaunes comme les billes vertes sont j nouveau riparties entre deux riacteurs oti elles reqoivent un monomkre unique (bleu ou rouge). On constate qu’i I’issue d’une strie d’ktapes de DCR chaque bille adopte un chemin unique lui &ant propre. En consiquence, chaque bille est porteuse 1 la surface d’une espke combinatoire unique, c’est le principe du one bead-one peptide ou one beadone compound. Si i I’issue de la synthese, les composis dPharrass& de leurs groupes protecteurs ne sont pas dkacht% de leur support, il est possible d’entreprendre un criblage direct, puisqu’i chaque bille correspond une entitk mokulaire unique. De nombreuses mkthodes d’identification issues de ce principe seront dCtaillPes plus loin. La seule limit, de la mkthode DCR tient au nomhre de composis qu’elle permet de priparer. A un raisonnement simpliste qui veut que le nombre de composks ne puisse dtpasser le nombre de billes (2), il est prtfk-able de substituer une approche statistique permettant de calculer le
nombre de billes necessaires pour qu’un pourcentage don& de tous les composes possibles soit present dans le produit final. Un gramme de resine constituie de billes de 90 pm de diametre permet la synthese de moins d’un million de composes differents, en acceptant qu’une faible proportion de tous les composes attendus soit absente. Cette limitation restera en vigueur meme si l’on &pare les produits de leur support. Si I’on veut respecter la representation homogene des differents composes dans la solution, il sera necessaire d’utiliser un nombre superieur de billes. Lorsque les syntheses sont realisees en solution, il n’est plus possible
L
a methode
(a) ne s’applique
purement
peptidique.
gradation
recurrente
non peptidiques ~1exotiques Cette de
d’Edman,
(acides
assemblant
et
de reconnaissance
(b).
imposes
par
diversite
structurale
est constituee
la
de la synthese
plus
d’acides un
a la surface I’on
assigne
a repondre
aux
ce qui grande.
amines
monomere
permet
structure
autre
autorise
naturels
la lecture
de
ralement
la
marqueurs
en
alors,
a chacun
apparues.
different.
masse,
de sa sequen-
faisant aleatoi-
evite
la plupart
dues
sequentiel
au des
precedentes, Son
gazeuse,
on
ses
identifies
par
lecture
la la
nucleaire
permet,
synthese.
d’analyse
citera
magnetique
positive,
puis leur
de
methodes
un lien gene-
est
Plus
sur bille sont
spectrometrie
de
et le marquage
n
~ETIQUETTE Lactue
directs
SCquewage de peptide
NonPeptidique
Lectws indirect8 SCqueqage de peptide
Nnn P*ntiWotr 1.1.1. rp...mye
Lecture indirecte (GC) Etinllatte lb-m I ---A------peptidiquq non I oCquen?able
approches iLA.VAL4.W
consiste
a
etapes
synthese
en
faisant
marqueurs
celles-ci
la resonance
PeptidiQJe
des
des
a des
photolyse
marmono-
de la synthese).
bille
I’historique
caractere
I’ensemble la
phase
de nouvelles Parmi
par
de
meme
radioelectrique.
ALA-VAL.LEU
a ete introduite principe
en
qu’un
etapes
Lorsqu’une
d’apprehender
recemment,
indiquer
maret sur
il a ete incorpo-
differentes
est lie a la bille par
detaches
de
du monomere
de laquelle
a differentes
marqueurs
photoclivable. sont
combinaison
combinaisons pour
incorpore
chromatographie
une
au tours deux
employees des
Chaque sur la nature
COMPOSE A TESTER 1
beau-
rapide
qui
a ete
barres. a la fois
que
seront
L’ensemble
sa
a un marquage
erreurs
ainsi
en
criteres
La seconde,
organique
mere
codes
de
de
methode
plus
des
re (c’est
de liaison.
coup
appel
I’etape
cc-amines
les fonctions
a qui
d’Edman,
bille est positive,
ce d’identification deduire
n’a pas
associe
lorsqu’une
elles
beaucoup
est
de
renseigne
c’est-a-dire
sequences
d’entre
la degradation
revanche,
sequence
en dissociant
deux
L’une
desquels
coder
queurs
d’elements
acides
d’identification,
simultanement
fonction
(c).
I’emploi
ou m&me
a ete contournee
bille
re,
man&e
par de-
queurs
chaque
appel
elle interdit
B-amines,
Les methodes de d&convolution, appliquies au criblage en solution, sont d’un principe totalement different. Elles sont fondies sur la repartition, en tours de synthese, des composes en series de sous-ensembles. Ces derniers, testes separement, vont permettre d’identifier l’espece active sans qu’il wit necessaire de recourir a sa purification et a son andlyse structurale. On retiendra ici trois grandes methodes : la d&convolution iterative, le balayage positionnel et la mithode dite de partitions orthogonales (ou des bibliotheques orthogonales). La molecule svnthetisee est consideree comme un ensemble ordonne de monomeres occupant des positions precises. La d&convolution iterative,
de nature
se faisant
I>).
limitation
Une
qu’a des composes
L’identification
reconnaissance
Ainsi,
mieux la diversiti qu’offre chaque famille de monomeres dans des riactions d’assemblage simples avant un large domaine d’application. Une fois la synthese realisie, criblage et identification (ou deconvolution) constituent l’etape cli qui permet la decouverte de molecules a application therapeutique potentielle. Quand les couplages s’effectuent avec plusieurs monomeres simultanement, les melanges sont testes directement. L’identification de l’esptce responsable de I’activite est effect& par plusieurs methodes dont les principes different selon que le criblage aura iti effect& sur des composes encore lies a leur polymere de synthise OLI sur des composes &pares de ce support et
combinaisons fonctionnant
cl
--AQ-ii
I I I
de a la
d’utiliser l’exces de l’un des monomeres ni d’eliminer les reactifs. Une mise au point beaucoup plus soigneuse du protocole se revele alors necessaire. En revanche, l’absence de liaison d’un des monomeres a un support augmente considerablement la diversiti et tvite I’etape de clivage laquelle peut entrainer la destruction de composes possedant des groupements fragiles. L’emploi des reactions en solution permet d’utiliser au
done testes en solution. A l’issue d’une synthise en phase solide. selon la methode DCR, le criblage peut-Ptre effect& directement. L’ensemble des billes est alors incube avec le recepteur soluble dont on souhaite identifier un ligand. La liaison de ce rtcepteur aux billes est visualisee par un marquage direct ou indirect du rtcepteur. Quand une bille se revele positive on procede a l’identification du compose qu’elle Porte (voiv encudt4.
applicable aux syntheses recurrentes, procede par identifications successives du monomire le plus actif en chacune des positions, au moyen de melanges de complexiti decroissante. Son principe est illustre par la figure 3 dans le cas d’un exemple simple : une synthese comportant trois &apes combinatoires au tours desquelles est utilise un melange de deux monomeres, A et B. Le resultat est done un ensemble BIOFUTUR 168
l
Juin 1997 29
de huit molecules. L’identification du compose responsable de I’activiti est effectue de la man&e suivante : on synthetise deux lots differents, le premier contient tomes les molecules qui comportent A en premiere position (A-X-X : X correspond a A ou B), le second lot rassemble toutes les molecules comportant B (B-X-X) fix.5 en premiere position. L’etude de l’activite biologique de chacun de ces lots permet de determiner qui de A ou de B est, pour la premiere position, responsable de I’activite biologique. Supposons que B soit identifie, on synthttise alors deux lots comportant B en premiere position, A ou B en deuxieme position (B-A-X ou B-B-X). De la mCme man&e que precedemment, l’itude de l’activite biologique de chacun des lots permettra de determiner qui de A ou de B doit itre present en deuxieme position. L’opiration est alors repetee pour la troisieme position. Cette methode presente I’inconvenient de necessiter une nouvelle sirie de syntheses pour chaque position, et ceci chaque fois qu’une nouvelle activite est dicelee. En revanche, la concentration en espece active s’accroissant (en theorie) a chaque &ape, une augmentation sensible de I’activite biologique lors du processus d’identification constitue un excellent contrble. Le balayage positionnel est decrit sur la figwe 4 pour le mime ensemble de huit composes que precedemment. Ceux-ci sont, des la synthese, repartis en six sous-ensembles se recouvrant partiellement. Chaque sousensemble comporte un monomere fixe en une position, les deux autres
FIG 3 - Principe de la dkonvolution itkrative appliqube C?Iune bibliotheque de huit compos8s.
positions portent X. Les six lots sont testes simultanement ce qui permet de determiner dans chaque position la nature du monomere qui confere la plus grande activite. On remarque, par opposition au cas precedent que la total% des sow-ensembles est priparee et testee en une seule &ape, sans qu’il soit necessaire de recourir 1 une nouvelle synthese. En revanche, aucune amelioration d’activite, pouvant renseigner sur la qualit6 de la methode d’identification, n’est attendue. De plus, pour que le balayage positionnel soit valide, il est necessaire d’admettre le principe de connectivite (c’est-a-dire l’interaction entre les differents monomeres et le recepteur comme des elements associes) entre chacun des monomeres ccles plus actifs )), ce qui n’est pas toujours le cas.
> Les sowbibliothttques i la rescousse La methode dite de partition orthogonale repose, comme la precidente, sur la repartition de la bibliotheque, dis sa synthese, en series de sousbibliotheques prealablement definies. Deux series de sous-bibliotheques sont preparees, correspondant chacune i deux repartitions differentes de I’ensemble des composes de la mCme bibliotheque. Une proprieti importante de ces sous-bibliotheques est que le nombre de composes par sous-bibliotheque est igal au nombre de sous-bibliotheques dans chaque serie. La synthese est organisic de telle sorte que les composes presents en melange dans une mime sous-bibliotheque de la premiere serie se voient ripartis a raison d’un compose et un seul dans chacune des
.~~-~~
Bibliothkwe
FIG 4 - Principe 30 BlOFLJTUR168
l
Juin1997
du balayage
positionnel
divisb
applique
.,
en 6 lots de 4 compos&
A une bibliothkque
de huit composk.
/-Am
Bibliotheque de 9 composes Serie 1 : 3 sous-bibliotheques de 3 composes
FIG 5 - Partition
orthogonale
dune
sous-bibliotheques de la seconde serie. 11 n’y a, ainsi, qu’un seul compose en commun, permettant l’identification directe d’un produit actif (uoir figure 5). Lorsqu’une strategic comhinatoire fait appel a. la synthese parallele, chaque compose est obtenu et testi individuellement. I1 est alors essentiel de s’assurer que l’ensemble des molecules couvre un espace structural de la plus grande diversite possible. L’evaluation et l’optimisation de cette diversiti constituent, en effet, un element cl& dans le succes d’une stratigie de criblage.
> haluer la diversit Toute methode d’evaluation de la diversiti est fondee sur I’elahoration d’un 1~descripteur )) integrant deux categories de donnees. D’une part, des elements qui sont, par exemple, la connectivite des atomes (nature des liaisons entre les atomes), I’identification de groupes fonctionnels, des proprietes physicochimiques glohales (la masse moleculaire, l’hydrophobie, etc). D’autre part, des informations qui, relatives a la structure tridimensionnelle des molecules, sont particulierement significatives dans le domaine des interactions biologiques. La strategic d’ivaluation de la diversiti developpee a Cerep fait t&s largement appel i des descripteurs fond& sur les structures tridimensionnelles. Chaque monomere est soumis a une etude informatique
bibliotheque
de neuf
chacune
composes.
de dynamique moleculaire, permettant d’engendrer l’ensemble des comformations representatives. A partir de ces conformations est calculee une c( signature )), qui prend la forme d’une matrice de 63 elements, denommee empreinte du pharmacophore. Chacun des elements correspond aux distances minimale, maximale et moyenne entre les principaux groupements susceptihles d’etablir des interactions intermoleculaires (accepteurs ou donneurs de liaisons hydrogenes, charges, noyaux aromatiques...). La comparaison de deux molecules revient alors a comparer chacun des 63 elements de leur (( empreinte du pharmacophore )). La ponderation a accorder a chacun de cc‘s 63 elements a fait l’objet d’une
parametrisation au moyen d’un algorithme specifique et de groupes de molecules <
” Training
immune
cells to work ” &p-a j&%$4,<.; i;,$.--;
e op V.OI conr P,jli.$ erz l!)w,ij;l:~
.--.-l.-._ IDM Tel.
,.
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BlOFUTUR168
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kin1997
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