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Le virus de la vaccine: un nouveau vecteur
~OC~i~J-~.~
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FEVR~ER1984, 68, ~o2
Le virus de la v a c c i n e : un n o u v e a u v e c t e u r Le virus de ta vaccine (poxvirus) a conadtu# clans los ann#as 60 un mad#to utile pout /'expression des genes m~is son etude a #to #el(os~e par la suite par I'effort mis sur los virus oncog&nes. R#cemment, l'emploi des techniques du genie g#n#tique a tacit# de non?breux groupes # #tudier ee virus. En effet, los r#sultats de certaines etudes fondamentates, par example cellos concemant le systeme de transcrip* t/on [cytopiesm.;que), sent directement applicables a / c raise au point d'un nouveau type de vaccins ~as#s sur la construction de recombinents vaccine exprimant dne sequence exog#ne et capab;es de d#ciencher une synth#se d'anticorps apr#s inoculation # r h o m m e ou I'anJmaL Cede revue porte sur ta structure du g#nome et certains aspects de son expression en relation avec la raise au point du virus vacci,~a/ comma vecteur de genes. Los lect~"rs [nt#ress#s par fe virus d e / a vaccine peuvent consulter deux autres revues r#cent6s sur le DNA [I] et l'expression des genes [2] ainsi qua des zevues plus g#n#rales [3 t~] , dent une en frangais [5}. Le virus vaccine/eppartient a t a fami/te des poxviridae [6], qui sent des gro~ vi~u,s /environ O,3pm) # D N A pr#sentant une expression des genes dens le 3ytop/asme. La tai/le du D,&/A est surf/santa pour coder 100 a 200 prate:haS. Le virus de ta vaccine (peu pathoge ~ sur l'homme) pass#de des ant/genes :,w,~Fnuns avec celui de la vadole, ce qui exp/ique qu'i/ ait #t# employ# commP veccin vivant pour #:~Jiquer la variole, a la suite d'une eam<:-,~ne de I'O.M.S. [7]. Au niveau des recherches fo:~damentafes, le virus vaccinal consHtue un ben modete pour l~tude de/'expression des gen~s euea,~yotes. II se mull/pile dens ,'a plupart das i/griPes ceflutalres ave& cependent, que!ques restrictions [8, 9], et des infections ~nchreoea peuvent #tre faci/ement thai/sees. L'exp'ession des genes e t l a replication du DNA se produisent dens /e cytoptesme, ce qui distingue los
poxvirus des autres virus animaux ,~ DNA, qui uti/isent essentieflament los sysr#mes de transcription et de replication nucl#aires, b,en qu "une fonetion nucleaire inconnue sort requise pour obtenlr du virus vaccinal infeciVeux. Par cons#quent, te virus de la vaccine pr#sente /'int#r#t de contenir de nombreux genes eoccernent /a biosynth&se des acides nuct#iques; de plus, une dizaine d'enzymes correspondantes sent des constituents du virus vaccinal [5]. Los mRNA du ~¥pe pr#coce sent directement transcrits par/as pa~icules virales {cores) inject#as dens ie cytoptasme apr#s l'adsotption. // s'adit de e,R,~4A monocistroniques qui portent, comma lea mRIVA du type tardi~ lee modifications posttranecriptionnelles aux extr#r,nit#S 5' (cap) et 3" (poly{A)). Par centre, lea mRNA tardifs sent tranecrits au niveau du DNA viral reptiqu# dane los viresomes du cy~toplasme, ffs pr#sentent ta particular/t# d'etre tr&a hat#rag#haS car une re#me s#queoce codante pout #tre transcrite en une fami/le de mRNA de /enEueur variable, ,,,robeblement a/z' suite d'une termin~ison de ta t;anscription extrbmement ,rnpr#,,.dse. L "assernb/,-~ge et t'excr#tion du ~'im's fon~ inte:venir le cytosqueletze et set ttr#s camp/axes.
$~:ue'ture du GNA Le DNA de viru~ v~ecins! eat consdtu# par une ,"hal#cute linear: a deux #tins d'environ t90 i, bp mais qui presente des lie:sons co,'arden t~s aux exit#mites [10) . Los exit#mites du DNA vaccine ez du virus RP ant et~ s#quenoees [11, 12], ce qu/ a permis de montrer q!.:~: te fiai~on cove/elto aux extr#mit~s est eonsti~uee en fail oar la contim:ation des liaisons phos* p,hodiester [!I]. Cheque bou~!e term/hale ~xiste seus deux ,'~rmea et lea cent dormers nuclear/tier contier, nent urn ::(zaff?e de bases non appari#ea [1I]. Le DiVA g#nomique pr#sem~ aux extrernites une repetition ter~m,ina/e invers#e d'environ lOkbp [I3, t4}, /¢ resin de la maid'cute etant apparemn?ent consdtu#e par une sequence unique (F~. 1). Curieusement, /e
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ou w~us v ~ c c ~
FIG. t.
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Structure du genome du virus vacclnaL
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virus vat/clique ne poss~de pas de r~p~tidon termieale inversee [15], a en juger par /'absence d'hybridetion croisee entre fragments terminaux. La repetit.~on term/hale inversee vaccine a et~ clonee [18], puis sequene~Je en part& sur 3 kbp. Cheque r~gion repet&e est cens~ituee par un ensemble de 3 r~,gions un,,ques contenant deux s~ries de sequences de 70 bp rep&t~es une qu[nzaine de fois en tandem (Fig. l) [11,17]. Cos repetitions sent sans doute responsebles de i'heterog&neite term/hale, a / a suite de recombinaisons fr~quentes [18,19]. La premiere carte des sites d~ deux enzymes de restriction a et# publiee en 1977 [20t. Actue/lement, on dispose des cartes (pour diffbrentes souches d'orthopoxvirus) pour tes enzymes suivantes {nombre [ndicatif de sites) : Sma I [1], Sac 11 [4], Bg II [3], Hind I11 [14], Ave ! [18], Sa II [221 et rn~me EcoR t [44] [20-27]. La carte Hind Ill est repr~sentee figure 2. D'une fa#on gen~rale, la &~gion centrale (environ 140 kbp) est re&tivement bien censervee parmi los differents erthopoxvirus [2i].
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FIG. 2
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Carte de ,-estr~ction Hind Hi du DNA du virus
vaccinaL
R~plication du DNA Des experiences de marquage court du DNA genomique suggerent que ia r~plication est initi~e dens .~a region des e;,tremites et pro gresse ensuite de fa¢on bid/ten tionnelle [28]. La formation de concat#m#res au cours de le replication cytoptasmique du DNA du virus RP a #te observ#e, ce qu~
sugg~re un mod~le possible pour la r~piication du DNA [29]. D'autres modeles rendant compte de ta structure terminale (flip-flop) ont ~t~ ~galem~n~ proposes [11]. Par ailleurs, '~ne r~plication nucl&aire du DN.4 du virus vaccinal a &t& confirmee recemment [30], mais son rS/e physiologique cinsi que cetui d'uee transcription nucl~ai:e du DNA vaccine [31] reste inconnu. Une DNA polymerase r&sistante I'acide phosphonoacetique (PAA) a ~t& isoi&e, ee qui a permis de demontrer sen origine virale [32] et certains mutants thermosensibles (et PAA ~) seront sans doute tres utiles pour etudier c.ette enzyme [33] . Le g~ne codant pour cett¢ DNA polymerase (un polypeptide de 110 K) est s/rue a'~ns le fragment E/Hind ill e t a ~t~ cartographie r~cemment [3~ 35]. Transcription La cartegraphie d'une centaine de Fo/ypepddes precoces et t~rdifs reve/e que los g~nes tardifs sent ptut&t lene/is~s eu centre du gencme, dans la region bien conservee I36J. La region term/hale contenant los sequences r&p~tees en tandem n'est pas transcrite mais 4 mRNA pr~coces sent/ocaiises dens/a r~p~tidon term/hale inversee. Deux d'entre eux son ~. transcrits vers /a droite a/ors que los 2 autres ainsi que 7 mRNA precoces Iocalis&s dens tes 20kbp gauche sent tous trenscrits vers la gauche [37, 41]. Quatre autres mRNA pr~coces ont ~te tocalis~s dens le fragmept J/Hind Iif, dent celui codant pour ia thyroid/no k/ease [42J. L'extr~me h&terogeneit~ des mRNA tardifs n'a pas permis de los cartographier jusqu'& present. En accord avec /'expression cytoplasmique de cos genes, aucune modification des RNA par epissage n'a et~ raise en ~,idence. L'identification des g&nes dent le foncden est connue comprend seulement le g~ne codant ~our la thyroid/no kinase vaccine (TK/VV) [42, 43] et celui de le DN,4 polym~rase deja mentionnee [34,35]. Le g&ne T K / W est ectuellement bien connu. L "enzyme est ur~ teZTam~re d'um petypeptide 19 K [42, 44] . Le mRNA TK/Vv" peut ~tre treduit en lysat de reticutocytes [45,46]. Le gene TK est situe l'extremite gauche du ~,agment J/Hind I!t [44, 48-48] . Des informations plus precises ont &te obtenues par sequen;age Di'dA et identificai/on du mRNA. La sequence codante comprend 531 nucleotides, correspondent a une proteine d'environ 21,000 ne presentant pas d'homologie a v e c l a sequence TK du virus herp=Etique
X~[I [&3,49]. Le transcdt cnrrespondant cent!ant environ 370 nucl#otides, avec le sequence poly(A) et seutemant 6 nuclear!des precedent I'AUG ,'~itiateur de fa traduction [49]. Trois mutants spontan#s TK ant #t# egatement sequences, ce qui e permis de rnontrer que la mutation se produit par r#iteration d'un nucleat!de qui provoque un changement de la phase de lectur~ et une terminaison pr#metur#e
[42, 49].
A part lea 3kbp des extr#mit#s terminales
[11, 17], environ 4kbp de sequence DN4 vaccine (avec identification precise des mRNA) oo* at# pub/in& qui comprennent tes extremit#s tie ie pret#ine Z5 K [r~], los prate!has 19 K et 42 K [51] et /e gone TK [43, 49] , situ#s respec#vement ~ environ #, 8 et 80 kbp de l'extremite gauche du DNA. Quatre sequences precedent le debut de ia transcription pr#coce ant #t# compar#es, ce qM a permis de d#duire le presence de 2 s~quences consensus TA TAA T~A et AAT AATAT A # - 43 et -- 18bp, dens une region tr#s fiche en A nu T [4~]. Des travau~, sent activement poureMvis dans diffe~ents !,~boratoires pour mieux d#finir los sequences contr6lant la transcription des genes pr#coces et tardifs. La mise au point d'un systeme fid,Jle de transcription in vitro adapt# au systeme vaecinal devrait aider ce'~, recherches [52]. M u t a n t s n o n d ~ f e c t i f e de d d l d t i o n
Des deletions de 5 a 30 kbp souvent aseoci#es ~ des ~ranspositions aveient ere raises en evidence dans certains mutants du virus RP [53,54], du cowpox [2~], du monkeypoxvirus [55] et de le vaccine o(1 la deletion est s~,/n~trique [58]. P/us r#ce,'nmen~ trois groupes ant !sol# des deletions {virus non d#fectif/~ de 10 # 20 kbp clans/e v#us vaccineL Deux d'entre olios son~ tres shr.itaires et ta deletion de fO kbp s~tend de 10 a 20kbp da f'extr#mit# gauche [25, 57, 58]. Carte sequence d#l#t#e code pour au mains 10 polypeptides [57}, dent 2 prot#ines de structure [58]; ces mutants spontan#s se repliquent normatement en culture de eel!uies HeLa, BSC ou de rein de coehon, a/ors qua certains mutants de d#l#ticn du virus RP presanta!ant une restriction dW~te [53]. Le deu~ieme type de d~l#tion d#crite pour /a vaccine, de 17kbp et couvrant ?a deletion prec#demm¢.nt d~crite, est associ# a une transposition dens I'e;.tr@mit# droite [5~] ; (S. G;/lerd et R. Dr!l/ion. communication personnefte!. Ce muZant pr#sente une restriction d'hOte c::r ~
plupart des 8 I~n#es cel/ula:res d'oH2ine hemaine #tudiees ne sent pas permissives efots qua le randament an virus ~'est qua peu r~du!'... apr#s infection de ceBules d'autres asp#cos [59] .; cos etudes sent importantes pou: le r#e#sation de vecteurs vaccine utiliseb/es sur l'homme (voir plus bas). Par aitteurs, plus!ours groupes ant !sol# des c~JZeet,ons de mutants te du virus vaccine,~, qui ~e r#pectissent en 17 a 32 groupes de compl~m#ntation [27,~-53]. Los aut~,urs obtiennant un ben alignement entre ce~e g#n#tiqua et carte physique et toue cos mutants te sent ,~it,,#s d~,ns la region centre/e du g#nome, ce qs'i cen~,rma Fid#e qua ,~esgenes situ#s aux extr#,,,,'t#s ~.,~;sent pas essentials pour/a replication du virus en culture de cefiules. Construction de vec~:euTs v@ccine par tree?afaction de DffdA La recombinaison gen#tique #teit connue depu~s longtemps chez /a virus RP, ,mais !as techniques de trensfeedon de DNA n'ont #t6 utitis#es qua r#cemrnent. En ef~t, le DNA vaccine n'est pas infectieux {~ cause de sen d~Jveloppement cktopiasmique}. Cependanz: te seuvetage du g#nome du virus ~P a#t# obtenu apr#s transfection de DNA (isole du virus R,#/ dens des eellules infect#as par le ~;;rus de I'#l@ctrom#lie, /e virus RP n#osynt#etis# provenent sans doute du DNA transfectent [24]. R~u's o#n#relement des fragments de D&~A genera!qua du type sauvage pe~mettant apr#,~ trensfaction de cei!u!es infect#as par un mutant ts, de r#cup#ret des virus se muir!pliant ~ ~emp#reture normale [24]. Le sauvetege du ma,rqueur TK [44, 46-48] et te recuperation de DNA d#l#t# dens le region non essentiel!e [6~] ant ~'t# #gelamenZ o6tenus par transfection de DNA g#nomique ou de fragme,?ts vaccine convenables e/ones dens E. coli. On pouva/t alors pr#voir !a pass!hi/it# d?ns#rer a des endroits precis dans le g#nome vira~ #as segments de DNA exog#na si celu#ci est pree/eblement ins#re par r=,combineison in vitro darts un fragment vaccine, !as deux sequences vaccine situ~es a/ors de pa~ et d'eutre pr#sentant !'homo/ogi@ requise pout lee recombh?eisons se produisant d s s des earle/as pr#aMb/amant infect#as. Avec du DNA clan# /e longueur de te sequence homo/ague n#cessaire pour obtenir le maxi,hum de recombinants ne d#pesse pas 2 kbp per #vehement de recombineison, pour sauver !e merquaur TE [47]. De plus, l'existence de
X[V
d#l#tions importantes dens certains mutants non d#fectifs sugg#rait qu'une tailte pr#cise du DNA n'est pas r'~quise pour I'assembtagc du virus race!hal. Pour obtenir un virus non d~ ectif l~. insertions de la e#quence codante TK du virus herp#tique (TI(/HSV), dent I'expression peut #tie essez facifement caract#ris#e, ont #t# realis#es dane la r#gion non essentiel/e g~uche [65, 65]. L'inse~ien de DNA exogene d:~ns le g#ne TK de la vaccine offre I'avsntage de pouvoir selectionner tes recombinan;c TK [66] Un autre moyen de r#,cup#rer et de clener les recombinants est d'utifiser fhybridation in situ au niveau de~ ;/ages de virus, apr#s la prise d'une empre;nte, au moyen d'une sonde ra dieacEve specifique du DNA exog#ne [ 6 5 ] . Les promoteurs reconnus par la polym#ras~ f i n e semblent pas constituer des signaux recennus par le syst#me de transcription vaccinaL En effet, if apparait n#cessaire de placer une :~#quence vaccine convenable (promoteur) en emont du g#ne TK/HSV pour obtenir un recombinant vaccine qui exprime la TK/HSV [65, 66], (r#sultats non publies de notre laborato!re). Jusqu'# pr#sent les deux groupes ayer, t mis au point un vecteur vaccine, avec la sequence TK/HSV comme s#quence exog#ne, ont utifise comma promoteurs soit un fragment d'environ 270 bp situ# en amont du g#ne codant pour la proteine pr#coce 7.5K [ 6 8 ] , soit un promoteur endog#ne situ# ~ proximit# du site B~mH i du fragment F/Hind H!, ta s#quence exog#ne #tent ins#r#e pr#cis#ment ~ ce si~e [ 6 5 ] . Ces deux signaux ont permis d'exprimer des s#quences codantes d'inter#t pratique et qui comprennent les genes cedant pour/'antigene de surface du virus de l'h#patite B humaine [67] et I'h#magglutinine du virus grippal
[68, 69]. Ces travaux iflus,.'ren~ !'inter~t du virus vaccihal comma vecteur de gBnes. La seule Imitation de ce vecteur est sans doute de ne pas perme#re I'expression d'un g#ne comprenant un intron, mais if est alors so,,vent possible de recourir a le copie DNA du mRNA correspondan*,. Le virus recombinant n'est pes d#fectif et la capacit# d'insertion va jusqu'a 25 kbp [70] . La prepri#t# la plus originale est qu'il constitue un vaccin vivant (peu co£tteux b produire et tres stable b conserver) qui pourrait #tre employ# assez facifement dens le dome!he vet#rin,~ire et dens certains cas (r#)employe sur I'homme. En effet, I'inoculation au lapin du virus recombinant vaccine-h#patite d#clenche un titre #lev# d'anticorps anti-HBSAg [67]; if e n e s t de m#me pour
les reconvb;nants vaccine exprimant l'h#magglut!nine du virus grippal [68, 69] qui prot#gent les hamsters centre une h~fection ult#rieure per !e ~irus gri~'pal [ 8 9 ] . On peJt doric conclurc qua I'avenir des poxvirus est assure comme vaccin vivant dens le domaine v#t#rinaire et peut-#tre re#me chez I'homme, aussi bien qua c o m m a mod#le pour des recherches fondamentales sur t'expression des g#nes eucaryotes. G. B e a u d I n s t i t u t J. MONO/.T o u r 43 2 p l a c e Jussieu 75251 Paris C e d e x 05
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29 39. 3i. 32. 33. 34. 35.
Societ~ de Chimie Bio~ogique : Groupe th#matiqu8 {< Macrophages >~ La 3 ~ reunion du groupe th~matique ~{ Macrophages ~ aura fieu /e 19 juin I984 au b#time~t 338 des cofloaues # !a Facult# des Sciences c~'Orsay. Pro~yamme Corferenciers
: A. Ryter et P, Ga!anaud.
7able :onde generate sur fe theme t~ R#cep~.=~uts e t ~Brqueurs de surface des phagocytes Trois groupes de discussion se d~rouleront ensuite simultanement sur des themes ehoisis dens ta !iste non iimitative ci-dessous : - - / n t e r a c b o n s macrophages-autres types ce!lu/aires par/'in[erm#diah'e d%~terleukines, - - M # d i a t e u r s flpidiques {production par fes macrophages; offers sur los macrophages}. - - M a c r o p h a g e s et complement (production par /as macrophages de facteurs du compigment, action de cos facteurs sur !as macrophages), --PhagocFtose [fusion phagosomes -- !ysosomes, enzymes tysosomiaux, cons~Jquences de i~ phadc,cytos& en particu/ier cte I'mgestion de particuies inertes), - - Acdvatiun des macrophages in v i t r o (par des !ymphokines et des immuno-rnedu/ateurs exogbnes). -- Derives activ#s de l'oxyg#.ne #n#thedes de mesure, contrSle de la production r#le) II feud.eit qua tous ceux qui d#sirent intervemr a /a TaMe rondo g#nera!e ou # Fur des groupes do discussion r#d~;en~ /,~::s r#sutt~ts qu~Ts pr~senteron~, en une page, 5 ad~'esser avant le 25 ma/ 1984 : Dccteur J £ Pedt tnstitui de Biech/mie B g t~-n..~ n t -#~32 Unive~/tb de P~ns-Sud 91405 Orsay Codex
Groupe th~matiqtJe {,~ ~ a g n ~ t i s m e
N u c i e ~ i r e e t Bio~ogie >~
R,P~.N. in vivo e n bio~ogie e t m ~ d e c i n e Autrans
-- 8 - £ - t0 octobre
'~984
Lc~ Z reunion du Greupe Themarique ~ Ma~ oetisme Nucl#aire et Biologie ~ (Responsable :
~
FEVR~ER1984, 68, ~o2
Le virus de la v a c c i n e : un n o u v e a u v e c t e u r Le virus de ta vaccine (poxvirus) a conadtu# clans los ann#as 60 un mad#to utile pout /'expression des genes m~is son etude a #to #el(os~e par la suite par I'effort mis sur los virus oncog&nes. R#cemment, l'emploi des techniques du genie g#n#tique a tacit# de non?breux groupes # #tudier ee virus. En effet, los r#sultats de certaines etudes fondamentates, par example cellos concemant le systeme de transcrip* t/on [cytopiesm.;que), sent directement applicables a / c raise au point d'un nouveau type de vaccins ~as#s sur la construction de recombinents vaccine exprimant dne sequence exog#ne et capab;es de d#ciencher une synth#se d'anticorps apr#s inoculation # r h o m m e ou I'anJmaL Cede revue porte sur ta structure du g#nome et certains aspects de son expression en relation avec la raise au point du virus vacci,~a/ comma vecteur de genes. Los lect~"rs [nt#ress#s par fe virus d e / a vaccine peuvent consulter deux autres revues r#cent6s sur le DNA [I] et l'expression des genes [2] ainsi qua des zevues plus g#n#rales [3 t~] , dent une en frangais [5}. Le virus vaccine/eppartient a t a fami/te des poxviridae [6], qui sent des gro~ vi~u,s /environ O,3pm) # D N A pr#sentant une expression des genes dens le 3ytop/asme. La tai/le du D,&/A est surf/santa pour coder 100 a 200 prate:haS. Le virus de ta vaccine (peu pathoge ~ sur l'homme) pass#de des ant/genes :,w,~Fnuns avec celui de la vadole, ce qui exp/ique qu'i/ ait #t# employ# commP veccin vivant pour #:~Jiquer la variole, a la suite d'une eam<:-,~ne de I'O.M.S. [7]. Au niveau des recherches fo:~damentafes, le virus vaccinal consHtue un ben modete pour l~tude de/'expression des gen~s euea,~yotes. II se mull/pile dens ,'a plupart das i/griPes ceflutalres ave& cependent, que!ques restrictions [8, 9], et des infections ~nchreoea peuvent #tre faci/ement thai/sees. L'exp'ession des genes e t l a replication du DNA se produisent dens /e cytoptesme, ce qui distingue los
poxvirus des autres virus animaux ,~ DNA, qui uti/isent essentieflament los sysr#mes de transcription et de replication nucl#aires, b,en qu "une fonetion nucleaire inconnue sort requise pour obtenlr du virus vaccinal infeciVeux. Par cons#quent, te virus de la vaccine pr#sente /'int#r#t de contenir de nombreux genes eoccernent /a biosynth&se des acides nuct#iques; de plus, une dizaine d'enzymes correspondantes sent des constituents du virus vaccinal [5]. Los mRNA du ~¥pe pr#coce sent directement transcrits par/as pa~icules virales {cores) inject#as dens ie cytoptasme apr#s l'adsotption. // s'adit de e,R,~4A monocistroniques qui portent, comma lea mRIVA du type tardi~ lee modifications posttranecriptionnelles aux extr#r,nit#S 5' (cap) et 3" (poly{A)). Par centre, lea mRNA tardifs sent tranecrits au niveau du DNA viral reptiqu# dane los viresomes du cy~toplasme, ffs pr#sentent ta particular/t# d'etre tr&a hat#rag#haS car une re#me s#queoce codante pout #tre transcrite en une fami/le de mRNA de /enEueur variable, ,,,robeblement a/z' suite d'une termin~ison de ta t;anscription extrbmement ,rnpr#,,.dse. L "assernb/,-~ge et t'excr#tion du ~'im's fon~ inte:venir le cytosqueletze et set ttr#s camp/axes.
$~:ue'ture du GNA Le DNA de viru~ v~ecins! eat consdtu# par une ,"hal#cute linear: a deux #tins d'environ t90 i, bp mais qui presente des lie:sons co,'arden t~s aux exit#mites [10) . Los exit#mites du DNA vaccine ez du virus RP ant et~ s#quenoees [11, 12], ce qu/ a permis de montrer q!.:~: te fiai~on cove/elto aux extr#mit~s est eonsti~uee en fail oar la contim:ation des liaisons phos* p,hodiester [!I]. Cheque bou~!e term/hale ~xiste seus deux ,'~rmea et lea cent dormers nuclear/tier contier, nent urn ::(zaff?e de bases non appari#ea [1I]. Le DiVA g#nomique pr#sem~ aux extrernites une repetition ter~m,ina/e invers#e d'environ lOkbp [I3, t4}, /¢ resin de la maid'cute etant apparemn?ent consdtu#e par une sequence unique (F~. 1). Curieusement, /e
XH
jr G~o~
ou w~us v ~ c c ~
FIG. t.
i i
Structure du genome du virus vacclnaL
--
virus vat/clique ne poss~de pas de r~p~tidon termieale inversee [15], a en juger par /'absence d'hybridetion croisee entre fragments terminaux. La repetit.~on term/hale inversee vaccine a et~ clonee [18], puis sequene~Je en part& sur 3 kbp. Cheque r~gion repet&e est cens~ituee par un ensemble de 3 r~,gions un,,ques contenant deux s~ries de sequences de 70 bp rep&t~es une qu[nzaine de fois en tandem (Fig. l) [11,17]. Cos repetitions sent sans doute responsebles de i'heterog&neite term/hale, a / a suite de recombinaisons fr~quentes [18,19]. La premiere carte des sites d~ deux enzymes de restriction a et# publiee en 1977 [20t. Actue/lement, on dispose des cartes (pour diffbrentes souches d'orthopoxvirus) pour tes enzymes suivantes {nombre [ndicatif de sites) : Sma I [1], Sac 11 [4], Bg II [3], Hind I11 [14], Ave ! [18], Sa II [221 et rn~me EcoR t [44] [20-27]. La carte Hind Ill est repr~sentee figure 2. D'une fa#on gen~rale, la &~gion centrale (environ 140 kbp) est re&tivement bien censervee parmi los differents erthopoxvirus [2i].
i
FIG. 2
--
Carte de ,-estr~ction Hind Hi du DNA du virus
vaccinaL
R~plication du DNA Des experiences de marquage court du DNA genomique suggerent que ia r~plication est initi~e dens .~a region des e;,tremites et pro gresse ensuite de fa¢on bid/ten tionnelle [28]. La formation de concat#m#res au cours de le replication cytoptasmique du DNA du virus RP a #te observ#e, ce qu~
sugg~re un mod~le possible pour la r~piication du DNA [29]. D'autres modeles rendant compte de ta structure terminale (flip-flop) ont ~t~ ~galem~n~ proposes [11]. Par ailleurs, '~ne r~plication nucl&aire du DN.4 du virus vaccinal a &t& confirmee recemment [30], mais son rS/e physiologique cinsi que cetui d'uee transcription nucl~ai:e du DNA vaccine [31] reste inconnu. Une DNA polymerase r&sistante I'acide phosphonoacetique (PAA) a ~t& isoi&e, ee qui a permis de demontrer sen origine virale [32] et certains mutants thermosensibles (et PAA ~) seront sans doute tres utiles pour etudier c.ette enzyme [33] . Le g~ne codant pour cett¢ DNA polymerase (un polypeptide de 110 K) est s/rue a'~ns le fragment E/Hind ill e t a ~t~ cartographie r~cemment [3~ 35]. Transcription La cartegraphie d'une centaine de Fo/ypepddes precoces et t~rdifs reve/e que los g~nes tardifs sent ptut&t lene/is~s eu centre du gencme, dans la region bien conservee I36J. La region term/hale contenant los sequences r&p~tees en tandem n'est pas transcrite mais 4 mRNA pr~coces sent/ocaiises dens/a r~p~tidon term/hale inversee. Deux d'entre eux son ~. transcrits vers /a droite a/ors que los 2 autres ainsi que 7 mRNA precoces Iocalis&s dens tes 20kbp gauche sent tous trenscrits vers la gauche [37, 41]. Quatre autres mRNA pr~coces ont ~te tocalis~s dens le fragmept J/Hind Iif, dent celui codant pour ia thyroid/no k/ease [42J. L'extr~me h&terogeneit~ des mRNA tardifs n'a pas permis de los cartographier jusqu'& present. En accord avec /'expression cytoplasmique de cos genes, aucune modification des RNA par epissage n'a et~ raise en ~,idence. L'identification des g&nes dent le foncden est connue comprend seulement le g~ne codant ~our la thyroid/no kinase vaccine (TK/VV) [42, 43] et celui de le DN,4 polym~rase deja mentionnee [34,35]. Le g&ne T K / W est ectuellement bien connu. L "enzyme est ur~ teZTam~re d'um petypeptide 19 K [42, 44] . Le mRNA TK/Vv" peut ~tre treduit en lysat de reticutocytes [45,46]. Le gene TK est situe l'extremite gauche du ~,agment J/Hind I!t [44, 48-48] . Des informations plus precises ont &te obtenues par sequen;age Di'dA et identificai/on du mRNA. La sequence codante comprend 531 nucleotides, correspondent a une proteine d'environ 21,000 ne presentant pas d'homologie a v e c l a sequence TK du virus herp=Etique
X~[I [&3,49]. Le transcdt cnrrespondant cent!ant environ 370 nucl#otides, avec le sequence poly(A) et seutemant 6 nuclear!des precedent I'AUG ,'~itiateur de fa traduction [49]. Trois mutants spontan#s TK ant #t# egatement sequences, ce qui e permis de rnontrer que la mutation se produit par r#iteration d'un nucleat!de qui provoque un changement de la phase de lectur~ et une terminaison pr#metur#e
[42, 49].
A part lea 3kbp des extr#mit#s terminales
[11, 17], environ 4kbp de sequence DN4 vaccine (avec identification precise des mRNA) oo* at# pub/in& qui comprennent tes extremit#s tie ie pret#ine Z5 K [r~], los prate!has 19 K et 42 K [51] et /e gone TK [43, 49] , situ#s respec#vement ~ environ #, 8 et 80 kbp de l'extremite gauche du DNA. Quatre sequences precedent le debut de ia transcription pr#coce ant #t# compar#es, ce qM a permis de d#duire le presence de 2 s~quences consensus TA TAA T~A et AAT AATAT A # - 43 et -- 18bp, dens une region tr#s fiche en A nu T [4~]. Des travau~, sent activement poureMvis dans diffe~ents !,~boratoires pour mieux d#finir los sequences contr6lant la transcription des genes pr#coces et tardifs. La mise au point d'un systeme fid,Jle de transcription in vitro adapt# au systeme vaecinal devrait aider ce'~, recherches [52]. M u t a n t s n o n d ~ f e c t i f e de d d l d t i o n
Des deletions de 5 a 30 kbp souvent aseoci#es ~ des ~ranspositions aveient ere raises en evidence dans certains mutants du virus RP [53,54], du cowpox [2~], du monkeypoxvirus [55] et de le vaccine o(1 la deletion est s~,/n~trique [58]. P/us r#ce,'nmen~ trois groupes ant !sol# des deletions {virus non d#fectif/~ de 10 # 20 kbp clans/e v#us vaccineL Deux d'entre olios son~ tres shr.itaires et ta deletion de fO kbp s~tend de 10 a 20kbp da f'extr#mit# gauche [25, 57, 58]. Carte sequence d#l#t#e code pour au mains 10 polypeptides [57}, dent 2 prot#ines de structure [58]; ces mutants spontan#s se repliquent normatement en culture de eel!uies HeLa, BSC ou de rein de coehon, a/ors qua certains mutants de d#l#ticn du virus RP presanta!ant une restriction dW~te [53]. Le deu~ieme type de d~l#tion d#crite pour /a vaccine, de 17kbp et couvrant ?a deletion prec#demm¢.nt d~crite, est associ# a une transposition dens I'e;.tr@mit# droite [5~] ; (S. G;/lerd et R. Dr!l/ion. communication personnefte!. Ce muZant pr#sente une restriction d'hOte c::r ~
plupart des 8 I~n#es cel/ula:res d'oH2ine hemaine #tudiees ne sent pas permissives efots qua le randament an virus ~'est qua peu r~du!'... apr#s infection de ceBules d'autres asp#cos [59] .; cos etudes sent importantes pou: le r#e#sation de vecteurs vaccine utiliseb/es sur l'homme (voir plus bas). Par aitteurs, plus!ours groupes ant !sol# des c~JZeet,ons de mutants te du virus vaccine,~, qui ~e r#pectissent en 17 a 32 groupes de compl~m#ntation [27,~-53]. Los aut~,urs obtiennant un ben alignement entre ce~e g#n#tiqua et carte physique et toue cos mutants te sent ,~it,,#s d~,ns la region centre/e du g#nome, ce qs'i cen~,rma Fid#e qua ,~esgenes situ#s aux extr#,,,,'t#s ~.,~;sent pas essentials pour/a replication du virus en culture de cefiules. Construction de vec~:euTs v@ccine par tree?afaction de DffdA La recombinaison gen#tique #teit connue depu~s longtemps chez /a virus RP, ,mais !as techniques de trensfeedon de DNA n'ont #t6 utitis#es qua r#cemrnent. En ef~t, le DNA vaccine n'est pas infectieux {~ cause de sen d~Jveloppement cktopiasmique}. Cependanz: te seuvetage du g#nome du virus ~P a#t# obtenu apr#s transfection de DNA (isole du virus R,#/ dens des eellules infect#as par le ~;;rus de I'#l@ctrom#lie, /e virus RP n#osynt#etis# provenent sans doute du DNA transfectent [24]. R~u's o#n#relement des fragments de D&~A genera!qua du type sauvage pe~mettant apr#,~ trensfaction de cei!u!es infect#as par un mutant ts, de r#cup#ret des virus se muir!pliant ~ ~emp#reture normale [24]. Le sauvetege du ma,rqueur TK [44, 46-48] et te recuperation de DNA d#l#t# dens le region non essentiel!e [6~] ant ~'t# #gelamenZ o6tenus par transfection de DNA g#nomique ou de fragme,?ts vaccine convenables e/ones dens E. coli. On pouva/t alors pr#voir !a pass!hi/it# d?ns#rer a des endroits precis dans le g#nome vira~ #as segments de DNA exog#na si celu#ci est pree/eblement ins#re par r=,combineison in vitro darts un fragment vaccine, !as deux sequences vaccine situ~es a/ors de pa~ et d'eutre pr#sentant !'homo/ogi@ requise pout lee recombh?eisons se produisant d s s des earle/as pr#aMb/amant infect#as. Avec du DNA clan# /e longueur de te sequence homo/ague n#cessaire pour obtenir le maxi,hum de recombinants ne d#pesse pas 2 kbp per #vehement de recombineison, pour sauver !e merquaur TE [47]. De plus, l'existence de
X[V
d#l#tions importantes dens certains mutants non d#fectifs sugg#rait qu'une tailte pr#cise du DNA n'est pas r'~quise pour I'assembtagc du virus race!hal. Pour obtenir un virus non d~ ectif l~. insertions de la e#quence codante TK du virus herp#tique (TI(/HSV), dent I'expression peut #tie essez facifement caract#ris#e, ont #t# realis#es dane la r#gion non essentiel/e g~uche [65, 65]. L'inse~ien de DNA exogene d:~ns le g#ne TK de la vaccine offre I'avsntage de pouvoir selectionner tes recombinan;c TK [66] Un autre moyen de r#,cup#rer et de clener les recombinants est d'utifiser fhybridation in situ au niveau de~ ;/ages de virus, apr#s la prise d'une empre;nte, au moyen d'une sonde ra dieacEve specifique du DNA exog#ne [ 6 5 ] . Les promoteurs reconnus par la polym#ras~ f i n e semblent pas constituer des signaux recennus par le syst#me de transcription vaccinaL En effet, if apparait n#cessaire de placer une :~#quence vaccine convenable (promoteur) en emont du g#ne TK/HSV pour obtenir un recombinant vaccine qui exprime la TK/HSV [65, 66], (r#sultats non publies de notre laborato!re). Jusqu'# pr#sent les deux groupes ayer, t mis au point un vecteur vaccine, avec la sequence TK/HSV comme s#quence exog#ne, ont utifise comma promoteurs soit un fragment d'environ 270 bp situ# en amont du g#ne codant pour la proteine pr#coce 7.5K [ 6 8 ] , soit un promoteur endog#ne situ# ~ proximit# du site B~mH i du fragment F/Hind H!, ta s#quence exog#ne #tent ins#r#e pr#cis#ment ~ ce si~e [ 6 5 ] . Ces deux signaux ont permis d'exprimer des s#quences codantes d'inter#t pratique et qui comprennent les genes cedant pour/'antigene de surface du virus de l'h#patite B humaine [67] et I'h#magglutinine du virus grippal
[68, 69]. Ces travaux iflus,.'ren~ !'inter~t du virus vaccihal comma vecteur de gBnes. La seule Imitation de ce vecteur est sans doute de ne pas perme#re I'expression d'un g#ne comprenant un intron, mais if est alors so,,vent possible de recourir a le copie DNA du mRNA correspondan*,. Le virus recombinant n'est pes d#fectif et la capacit# d'insertion va jusqu'a 25 kbp [70] . La prepri#t# la plus originale est qu'il constitue un vaccin vivant (peu co£tteux b produire et tres stable b conserver) qui pourrait #tre employ# assez facifement dens le dome!he vet#rin,~ire et dens certains cas (r#)employe sur I'homme. En effet, I'inoculation au lapin du virus recombinant vaccine-h#patite d#clenche un titre #lev# d'anticorps anti-HBSAg [67]; if e n e s t de m#me pour
les reconvb;nants vaccine exprimant l'h#magglut!nine du virus grippal [68, 69] qui prot#gent les hamsters centre une h~fection ult#rieure per !e ~irus gri~'pal [ 8 9 ] . On peJt doric conclurc qua I'avenir des poxvirus est assure comme vaccin vivant dens le domaine v#t#rinaire et peut-#tre re#me chez I'homme, aussi bien qua c o m m a mod#le pour des recherches fondamentales sur t'expression des g#nes eucaryotes. G. B e a u d I n s t i t u t J. MONO/.T o u r 43 2 p l a c e Jussieu 75251 Paris C e d e x 05
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29 39. 3i. 32. 33. 34. 35.
Societ~ de Chimie Bio~ogique : Groupe th#matiqu8 {< Macrophages >~ La 3 ~ reunion du groupe th~matique ~{ Macrophages ~ aura fieu /e 19 juin I984 au b#time~t 338 des cofloaues # !a Facult# des Sciences c~'Orsay. Pro~yamme Corferenciers
: A. Ryter et P, Ga!anaud.
7able :onde generate sur fe theme t~ R#cep~.=~uts e t ~Brqueurs de surface des phagocytes Trois groupes de discussion se d~rouleront ensuite simultanement sur des themes ehoisis dens ta !iste non iimitative ci-dessous : - - / n t e r a c b o n s macrophages-autres types ce!lu/aires par/'in[erm#diah'e d%~terleukines, - - M # d i a t e u r s flpidiques {production par fes macrophages; offers sur los macrophages}. - - M a c r o p h a g e s et complement (production par /as macrophages de facteurs du compigment, action de cos facteurs sur !as macrophages), --PhagocFtose [fusion phagosomes -- !ysosomes, enzymes tysosomiaux, cons~Jquences de i~ phadc,cytos& en particu/ier cte I'mgestion de particuies inertes), - - Acdvatiun des macrophages in v i t r o (par des !ymphokines et des immuno-rnedu/ateurs exogbnes). -- Derives activ#s de l'oxyg#.ne #n#thedes de mesure, contrSle de la production r#le) II feud.eit qua tous ceux qui d#sirent intervemr a /a TaMe rondo g#nera!e ou # Fur des groupes do discussion r#d~;en~ /,~::s r#sutt~ts qu~Ts pr~senteron~, en une page, 5 ad~'esser avant le 25 ma/ 1984 : Dccteur J £ Pedt tnstitui de Biech/mie B g t~-n..~ n t -#~32 Unive~/tb de P~ns-Sud 91405 Orsay Codex
Groupe th~matiqtJe {,~ ~ a g n ~ t i s m e
N u c i e ~ i r e e t Bio~ogie >~
R,P~.N. in vivo e n bio~ogie e t m ~ d e c i n e Autrans
-- 8 - £ - t0 octobre
'~984
Lc~ Z reunion du Greupe Themarique ~ Ma~ oetisme Nucl#aire et Biologie ~ (Responsable :