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Les inclusions protéiques de l'oocyte de Parascaris equorum
Experimental
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Cell Research, 7, 153-168 (1954)
LES INCLUSIONS PROThQUES PARASCARIS E. FAURe-FREMIET, Laboratoire
d’Embryogt%ie
DE L’OOCYTE DE
EQUORUM J. P. EBEL
CornpaGe, Rep
et J. COLAS
Colk?ge de France,
le 2 Fkier,
Paris,
France
1954
L900tx-m
jeune de l’dscaris megalocephala, de son vrai nom Parascaris equorum (Goerze 1782) est char@ de granules ribonuclCiques (9, 10, 11, 12, 13). En tours de croissance ces granules ribonuclkiques diminuent progressivement, tandis que deux sortes de corps figurCs, d6crits par van Be‘neden (1) sous les no& de (( cristallo?des N et de ctsph&res hyalines)), et une importante quantitC de glycogke B Y&at diffus s’accumulent dans son cytoplasme (3). Apr6s la fkcondation l’ceuf s’entoure de deux membranes concentriques; l’externe, dite chitineuse, se forme aux dCpens d’une partie du glycogke l’interne, constitke par une tire (alcool ascarylique de cytoplasmique; Flury (3)), se forme aux dCpens des cccristallo’ides)) de van Beneden (3). Entre temps, les (( sph&res hyalines )) se rassemblent & la pCriphCrie de l’ceuf oti elles semblent se fusionner avant de disparaitre. L’ensemble de ces transformations se traduit par une forte diminution de la masse de l’aeuf finalement isolC sous une faible couche de liquide pbrivitellin g l’inthrieur de la membrane cireuse; l’ceuf apparait alors comme une sphhre, protoplasmique ne contenant plus, en sus du chondriome et des pronuclei, que quelques globules graisseux et du glycogitne diffus. La membrane cireuse est impermbable B l’eau et aux solutions aqueuses, mais elle permet les Cchanges gazeux; on sait, depuis les recherches de Hallez, 1885, Samassa, 1898, Bataillon, 1910, etc.,l que la segmentation de l’aeuf ne peut s’effectuer qu’en presence d’oxyghne; mais le dCveloppement, jusqu’au stade de larve vermiforme mobile, s’effectue sans aucun apport de matkriaux nutritifs, et l’embryon ne peut done utiliser que ce qui reste inclus sous les membranes, principalement le glycogke ovulaire et la protkine constituant le (( c8ne rkfringent)) du spermatozo’ide. Panijel (9-l 1) et 1 On trouvera la bibliograpbie des travaux constitution chimique de l’oeuf des Nematodes
anciens et rkcents relatifs A la physiologie et & la dans Fauri-Fremiet (3), Panijel (10) et V. Brand
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E. Faur&Fremiet,
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J. P. ,Ebel et J. Colas
Pasteels (12, 13), ont demontre l’apparition d’acide ribonucleique dans la zone oti le cone refringent disparait dans le cytoplasme ovulaire. Le role et la signification des (( spheres hyalines 1) restent indetermines au tours des transformations qui accompagnent la fecondation et la segmentation. Leur nature m&me reste incertaine; l’un de nous (FaurC-Fremiet (3)) se fondant sur diverses reactions cytochimiques et chimiques’ a conclu que les spheres hyalines sont des vacuoles aqueuses contenant un phosphate de calcium associe a des traces de proteines, et enveloppees par une couche limitante lipidique. Mais Wottge (15) ne retrouve pas au niveau de ces inclusions les reactions cytochimiques du Ca; Panijel (10) indique ces m&mes reactions comme incertaines, tandis que celle du phosphore selon Serra et Queiroz Lopes (14) lui apparait positive, et que l’analyse chimique des spheres hyalines isolees en milieu alcalin lui montre une quantitd importante de phosphore. 11 conclut a (tune reserve inorganique constituee par du P et du Ca, maintenue avec une structure d’element figure grace a une pellicule limitante de nature lipidoproteique D. Certains caracteres de ces inclusions nous ayant paru peu compatibles avec une nature essentiellement minerale, nous avons repris l’etude des ((spheres hyalines)) de l’oocyte (4). Nous avons d’abord precise leurs caractkres de solubilite; la connaissance de ces derniers nous a permis de mettre au point des moyens de conservation corrects rendant possibles d’une part l’etude de l’evolution de ces inclusions et de l’autre celle de leur constitution par des techniques cytochimiques modernes; enhn nous avons mis au point les procedes d’isolement et de purification permettant d’aborder leur etude chimique. Nous examinerons ici les resultats obtenus au point de vue cytologique et cytochimique; l’etude chimique fera l’objet d’un autre travail. Aspect des sphbres hyalines
dans l’oocyte
des cellules sexuelles de Parascaris tout au long du tube ovarien, depuis la zone germinative, ou les oogonies sont en voie de multiplication, jusqu’a l’oviducte, ou les oocytes mures sont fecondes et forment leurs membranes, avant de passer dans l’uterus et dans le vagin. Les differents
stades de l’evolution
equorum se succedent regulierement
1 Aspect h&?rog&ne montr6 par des colorants vitaux; insolubilitk de la masse principale dans certaines solutions alcalines; reactions du P selon Macallum positive au nivead de la fraction insoluble; caractCrisation chimique du P et du Ca dans cette m&me fraction isol6e par centrifugation, mais non purifibe. Experimental
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Les jeunes oocytes apparaissent comme des elements piriformes disposes radiairement autour d’un cordon protoplasmique central ou rachis (Figs. 3 et 4); leur longueur s’accrott progressivement jusqu’a environ 200 p, tandis que leur cytoplasme se charge d’inclusions deutoplasmiques ou vitellines (Fig. 5); au terme de leur croissance, ils se detachent du rachis sous forme de grosses cellules approximativement spheriques (Fig. 6). L’examen des oocytes a l’etat frais doit &tre fait dans le liquide coelomique, ou mieux dans une solution isotonique de saccharose. A cet effet, les tubes ovariques d’une femelle hien vivante sont rapidement extraits et laves dans la solution de saccharose; de courts segments sont isoles a differents niveaux, et une leg&e pression exercee sur leur paroi en fait sortir un boudin d’oocytes que l’on dissocie rapidement dans une goutte de la solution sucree pure ou addition&e d’un colorant vital. Les globules hyalins apparaissent comme des inclusions spheriques, claires, faiblement refringentes, &par&es par un contour net du cytoplasme environnant qui est charge de cristalloIdes t&s refringents. Une leg&e pression exercee sur l’oocyte permet d’isoler ces spheres dans le liquide environnant, oti elles conservent d’abord leur aspect caracteristique; mais dans ces conditions ces elements paraissent relativement instables et se detruisent plus ou moins rapidement. Le rouge neutre ne colore pas les spheres hyalines dans l’oocyte vivant; le bleu de mCthyl&ne et plus specialement les bleus de Nil et de cresyl brillant les colorent au contraire d’une maniere elective, avec une ICgbre metachromasie; le vert Janus se fixe, lui aussi, sur ces elements. Sous I’effet de ces divers colorants vitaux les spheres prennent rapidement un aspect h&&ogene se traduisant par une vacuolisation et la separation d’une masse cortitale dessinant comme une calotte t&s fortement teintee en bleu ou en vert. La question se pose de savoir si les spheres hyalines sont reellement h&&ogenes ou si les colorants vitaux produisent un effet de demixion de leurs constituants. Apres action d’un reactif fixateur assurant la conservation des spheres (voir plus loin), celles-ci sont klectivement et intensement colorables par le bleu d’aniline utilise suivant la technique de Mallory. Elles fixent d’autres colorants, tels que le picro-carmin (l), l’hematoxyline (6), etc., mais d’une maniere beaucoup moins elective. C’est pourquoi nous avons utilise systematiquement la triple coloration de Mallory pour nous assurer de la persistance ou de la disparition des spheres hyalines au tours des divers essais effectues pour determiner leurs caractbres de solubilite.
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E. Faur&Fremiet, J. P. Ebel et J. Colas Caracths
de sol&lit6
des
sphhes
hyalines
Les oocytes au stade piriforme, isoles dans une solution de saccharose isotonique, ont CtC trait& dans une Iwemiere operation pendant 12 heures par divers solvants et diverses solutions salines. 11s ont ensuite CtC examines directement entre lame et lamelle, afin de contr8ler la presence ou l’absence des spheres. Dans le cas on celles-ci Ctaient conservees, les oocytes ont et6 &al& en frottis et color& selon la technique de Mallory. Dans un certain nombre de cas, cette seconde operation entrainait leur disparition. 11 apparait done que les reactifs utilises dans la premiere operation pouvaient produire soit une precipitation irreversible de la substance constituant les spheres hyalines, soit une precipitation reversible, ren$ant possible leur dissolution ulterieure lors de la coloration. De ce fait on est conduit a distinguer 1) les reactifs qui insolubilisent d&initivement les spheres hyalines, 2) eeux qui les conservent, mais sans les insolubiliser, et 3) ceux qui Ies dissolvent. 1) RCacfifs insolubilisants. Rentrent clans cettc categoric: le bichlorure de mercure (HgCl,) en solution saturce, qui donne de loin les meilleurs rksultats, et l’acide phosphomolybdique en solution a 15 %. 2) Rkactifs conservant les sph&es hyalines, mais saris les insolubiliser. Les rcactifs fixateurs de cette categoric sont caractcrids par les deux tests suivants: a) Action du reactif pendant 12 heures, Ctalement en frottis puis coloration selon la technique de Mallory: on constate la disparition des spheres hyalines. b) Action de ces reactifs pendant 12 heures, Btalement en frottis, traitement par HgCl, sat& puis coloration selon la technique de Mallory: les spheres sont conservces. Le bichlorure de Hg a prccipite de manicre irreversible la substance des spheres hyalines, conserve’e, mais non insolubilisCe par le reactif essay&. Font partie de ce groupe de rcactifs: l’eau bouillante; l’alcool a 96” et l’acetone; les acides picrique a saturation et trichloracctique a 5 %; les solutions aqueuses des composes suivants: acetate de plomb a 10 %, sulfate d’ammonium a saturation et a demi-saturation, chlorure de sodium a 10 %, sulfocyanure de potassium a concentration superieure a 2 M; form01 a 10 %. 3) Rtactifs dissolvants. La dissolution de la substance constitutive des spheres hyalines apres traitement pendant 12 heures par ces reactifs a temperature ordinaire est prouvce par l’absence de coloration selon la technique de Mallory, mame aprbs l’action du bichlorure de mercure a saturation. Rentrent dans cette categoric: l’eau distillee a froid; l’alcool a 50” et a 60”; les acides chlorhydrique, sulfurique, acetique, oxalique, mctaphosphorique et sulfosalicylique, utilisces a toute concentration; les bases telles que soude, potasse, ammoniaque aux concentrations infcrieuExperimental
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res a la normalite. (Au dessus de la concentration N, la soude et la potasse, tout en detruisant le cytoplasme, semblent laisser intactes les spheres hyalines. L’action insolubilisante de la potasse signalee par l’un de nous (3) et confirmee par Panijel(l0) ne s’exerce done qu’a partir d’une concentration determinCe (KOH N)); diverses solutions. salines: chlorure de sodium entre 0.9 et 5 7,; sulfate de cuivre a 10 ‘T$, iodure de potassium 3 M, sulfocyanure de potassium M; uree a 35 % Au point de vue technique nous retiendrons parmi tous ces caractcres de solubilite des spheres hyalines: a) l’action insolubilisante irreversible de HgCl,; b) la solubilite dans I’eau distillhe; c) la solubilite dans l’alcool a 60”. (A des degres alcooliques plus &eves, la dissolution devient de plus en plus difficile: les spheres hyalines sont insolubles dans l’alcool ti 96’); d) la solubilite dans NaCl isotonique et a 5 % et l’insolubilite dans NaCl a 10 %; e) l’action du sulfocyanure de potassium: SCNK M dissout les spheres hyalines, mais a partir de la concentration 2 M, SCNK tout en dispersant totalement le cytoplasme, les laisse subsister isolees, un peu gonflees, souvent vacuolisees. Ces caracteres nous ont guide d’une part dans le choix d’un fixateur permettant la conservation des spheres hyalines en vue de leur etude cytologique, d’autre part dans la mise au point d’une methode d’isolement en vue de l’analyse biochimique de leur substance constitutive.
.i%ude cytochimique des spheres hyalines 1) Choix du fixateur convenable. Les caractbres de solubilite precedents expliquent les resultats obtenus par divers fixateurs. Les fixateurs de Carnoy et d’Allen ne conservent pas les spheres, en raison de la presence dans ces melanges de substances solubilisantes. 11 en est de mCme du sublime acetique, en raison de la presence de l’acide. Les alcools a 80” et B 96” sont egalement B rejeter, puisqu’ils n’insolubilisent pas definitivement les spheres hyalines. Le liquide de Bouin donne des resultats incertains: il conserve les spheres, sans doute g&e au formol, mais en les gonflant. Souvent on constate un d&placement de la substance constitutive g l’interieur de la coupe. On obtient par contre d’excellents resultats en remplacant dans le liquide de Bouin, ainsi que le suggere Lams (6), l’acide acetique par l’acide trichloracetique (Bouin trichloradtique). La composition du melange de HelIy: bichromate, sublime, formol, explique egalement les bons resultats obtenus avec ce fixateur. Entin de magnifiques images sont obtenues en utilisant comme fixateur une solution aqueuse ou alcoolique saturke de sublime. Le sublime alcoExperimental
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E. FaurbFremiet, J. P. Ebel et J. Colas olique donne des r6sultats particulierement interessants dans la fixation des mufs pourvus de leur membrane cireuse. L’emploi des derniers tixateurs (Bouin trichloracetique, Helly, solution aqueuse ou alcoolique saturee de sublime) nous a permis d’aborder l’etude cytologique des spheres hyalines. 2) Micro-incindration. Avant d’indiquer les resultats des reactions cytologiques proprement dites, signalons ceux obtenus en soumettant des oocytes a la micro-incineration. Utilisant le four de Policard, nous avons incinere soit des oocytes isoles dans le saccharose isotonique, soit des oocytes fixes par le Bouin trichloracetique. Dans le cas des oocytes isok dans le saccharose isotonique, la quantite de cendres observee a la place occupee par les spheres hyalines est plus importante que celle don&e par les travees cytoplasmiques qui les entourent. Observees en fond noir, ces cendres se presentent comme un prCcipit6 tres fin, amorphe, d’aspect homogene, diffusant une lumiere bleuatre (Fig. 1). On doit apporter une grande attention a la duree d’action du saccharose isotonique sur les oocytes. On constate en effet au tours du temps la disparition progressive du constituant mineral, mis en evidence par la micro-incineration, alors que le constituant organique, mis en evidence par les techniques cytologiques, persiste. La disparition du constituant mineral est encore plus marquee apres action d’un tixateur acide comme le Bouin trichloracetique. Dans ce cas, la micro-incineration laisse la place des spheres hyalines absolument vide, alors que la coloration par la technique de Mallory montre la persistance du constituant organique (Fig. 2). Nous avons essay6 quelques reactions de caracterisation de ces cendres. Elles sont insolubles dans l’eau et difficilement solubles dans l’acide chlordu calcium par depot d’une microhydrique dilue. La caracterisation goutte d’acide sulfurique dilud en solution alcoolique (formation de cristaux de gypse) a don& des resultats negatifs ou tres incertains. La micro-incineration montre done la presence simultanee, au niveau des spheres hyalines, de constituants organiques et mineraux. Les reactions cytologiques effect&es sur des oocytes totaux ou sur des coupes d’oocytes ne nous ont au contraire permis de caracteriser avec certitude que le constituant organique. 3) RtTactions du phosphore. Les travaux anterieurs sur la constitution des spheres hyalines ayant fait admettre la presence de phosphore. nous nous sommes particulierement attaches a la recherche cytologique de cet Clement. Nous avons d’abord recherche la presence de phosphates mineraux par la reaction au nitrate de plomb, suivie d’un traitement par le sulfure d’amExperimental Cell Research 7
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monium (reaction de Gomori sans incubation enzymatique). Cette reaction, quoique non specifique, aurait en effet don& une indication interessante, si elle avait Cte positive. Or elle nous a don& un resultat negatif. Nous avons ensuite applique deux methodes de detection du P organique: la methode d’Angeli et celle de Serra et Queiroz Lopes (14). Toutes deux ont et6 systematiquement negatives. Rappelons que l’un de nous (FaurC-Fremiet (3)) avait trouve la reaction du P selon Macallum positive (action du molybdate suivi de phenylhydrazine). Or on sait aujourd’hui que cette technique est defectueuse (7), la coloration verdttre obtenue Ctant souvent causee par une absorption du molybdate sur diverses structures (en particulier proteiques), et la phenylhydrazine Ctant capable de reduire en bleu les molybdates tout comme les phosphomolybdates. Le resultat positif obtenu sur les spheres hyalines n’avait done pas de valeur. Le resultat positif obtenu recemment par Panijel (10) avec la technique de Serra et Queiroz Lopes nous semble par contre beaucoup plus surprenant. Nous n’avons pu le reproduire et cette divergence nous parait inexplicable. 4) Rkactions du calcium. Les reactions cytochimiques du calcium nous ont don& des resultats contradictoires. Alors que la reaction argentique de von Kossa est negative, la reaction a l’alizarine de Cretin nous est apparue faiblement positive au niveau des spheres hyalines; Wottge (15) avait obtenu avec cette derniitre des resultats negatifs et Panijel (10) des resultats incertains. 5) R&actions des Zipides. Les reactions des lipides (Soudan III, bleu BZL) ont CtC n6gatives.l La reaction de Hotchkiss, particuliere6) Redactions des polysaccharides. merit intense dans le cytoplasme environnant par suite de la presence de glycogene, est negative au niveau des spheres hyalines. 7) R&actions des prote’ines. Diverses &actions des proteines sont positives: reaction xanthoproteique, reaction de Millon-Bensley, reaction de Thomas (ces deux dernieres faiblement). Le caractere proteique du constituant des spheres hyalines est confirm6 par le resultat positif obtenu avec la recente methode de Mazia, Brewer et Alfert (8) au bleu de bromophenol mercurique, reaction qui semble specitique des proteines. 8) Conclusions de l’e’tude cytochimique. Les reactions precedentes conduisent a admettre une nature proteique de la substance constituant les spheres 1 La couche superficielle observable lors des colorations vitales a BtB considkrke par l’un de nous (FaurB-Fremiet (3)) et par Panijel (10) comme de nature lipidique ou IipoprotCique. Cette hypothhse, fond&e sur des caract&res peu significatifs, ne nous paralt pas devoir iXre retenue. Experimental
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hyalines. Ce resultat s’accorde d’ailleurs avec la disparition par la pepsine et la trypsine signal&e par Panijel (10). 11 ne s’agit pas d’une nucleoproteine (reaction de Unna et de Feulgen negatives), ni d’une proteine soufree (reaction au plombite de sodium et reaction des groupements SH de Chbvremont negatives). Les resultats de la micro-incineration montrent cependant que cette proteine n’est pas l’unique constituant des spheres hyalines. Elles renferment Cgalement des elements mineraux. 11 ne semble pas que ces derniers soient solidement lies a la proteine, puisque l’action de la solution de Bouin trichloracetique ou mCme l’action un peu prolong&e du saccharose isotonique Climine facilement les elements mineraux, laissant au contraire la proteine en place. Nous ne pouvons nous prononcer sur la nature de ces substances minerales, les diverses reactions essayees (en particulier celles du phosphore et du calcium) &ant negatives ou incertaines. On peut penser que la proteine constituant les spheres hyalines se trouve dissoute ou dispersee dans une solution de sels mineraux.
&de
biochimique
L’etude biochimique devant faire l’objet d’un autre travail, nous indiquerons seulement ici les principaux resultats obtenus a cet Cgard. Une technique permettant l’isolement et la purification de la substance des spheres hyalines a et6 mise au point en tenant compte de sa solubilite dans NaCl isotonique et dans l’alcool a 60” et de son insolubilite dans NaCl a 10 y0 et dans SCNK 3 M. Apres dialyse, l’analyse de la substance obtenue a donne une teneur en azote de 16,2 % et n’a rCvCld que des traces de phosphore (0,2 “/o). Le produit donne les reactions des proteines (reactions xanthoproteique, du biuret, de Millon positives). Les reactions des nucleoproteines sont negatives. La reaction au plombite de sodium et les reactions des glucides (reaction de Molisch, reaction de Dische a l’a-naphtol et a la diphenylamine) sont negatives.
Fig. 1. Spodogramme d’oocytes piriformes isoles dans une solution de saccharose isotonique; microphotographie en fond noir; les spheres hyalines apparaissent comme des masses blanchatres. Fig. 2. Spodogramme d’oocytes piriformes fixes par la solution de Boufn trichloracetique; microphotographie en fond noir; les spheres hyalines sont marquees par des espaces vides. Fig. 3. Jeunes oocytes piriformes montrant l’apparition des premieres spheres hyalines dans la zone apicale au-dessous du noyau (Bouin trichloradtique, coloration de*Mallory). N, noyau, S, spheres hyalines. Fig. 4. Oocytes piriformes plus avances, montrant l’augmentation du nombre des spheres hyalines, fortement colorees, encore localisees dans la region apicale (Boufn trichloracbtique, coloration de Mallory). Experimental
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L’analyse par chromatographie sur papier aprbs hydrolyse a mis en Cvidence un certain nomhre d’acides amink, parmi lesquels une proportion relativement importante de proline. L’klectrophorkse A pH 8,6 et A pH 3,5 montre une mobilit assez faible et la prCsence d’au moins deux pits dans le diagramme, t6moins de I’hCtCrogCn&tk de la protCine. L’Ctude chimique confirme done les rksultats de 1’Ctude cytochimique: la substance des sphkes hyalines est constituke par une prot&ine Clectrophorktiquement non homogke, dont il convient, d$s maintenant, de signaler les propriCtCs inusuelles de solubilitk et la composition particulibre.
l%olution
des spht?res hyalines au cows de l’accroissement de l’oocyte et de la maturation de l’ceuf j&onde’
La coloration de Mallory apr&s fixation au liquide de Bouin trichloracktique ou au sublimb alcoolique a permis de suivre, sur les coupes pratiquCes A diffbrents niveaux de l’ovaire et de I’utCrus, les stades successifs de l’kvolution des sph&res hyalinek depuis leur apparition dans l’oocyte jeune jusqu’a leur disparition dans l’awf fkondC. C’est dans les jeunes oocytes piriformes mesurant environ 60 B 70 p de long que les sph&res hyalines commencent A apparaitre sous forme d’inclusions peu nombreuses, irrCguli&res, intensement colorCes par le bleu d’aniline et mesurant jusqu’8 5 B 6 p environ (Fig. 3). D’abord IocalisCes ,dans la rCgion moyenne de I’oocyte, au-dessous du noyau, ces inclusions deviennent ensuite de plus en plus nombreuses (Fig. 4); chez les grands oocytes mesurant 200 B 300 p, elles envahissent toute la masse cytoplasmique, sous forme de sphkules atteignant jusqu’g 10 A 15 p de diamhtre, les plus petites &ant particulikrement nombreuses dans la rCgion pCrinuclCaire (Fig. 5). Lorsque, arriv6e au terme de leur croissance, les oocytes se dCtachent du rachis et prennent une forme sphCrique, les inclusions sont distribudes
Fig. 5. Oocytes piriformes au terme de leur croissance (Bouin trichlora&ique, coloration de Mallory). Fig. 6. Oocytes mars, libres, ayant pris la forme sphkrique (Bouin trichloracktique, coloration de Mallory). Fig. 7. (Eufs f&cond&s, montrant la margination des sphkres hyalines (Bouin trichlorac&ique, coloration de Mallory). Fig. 8. Formation de la membrane chitineuse et debut de coalescence des spheres hyalines (Bouin trichloradtique, coloration de Mallory). Fig. 9. Coalescence et debut de disparition des sphhes hyalines (Bouin trichloracCtique, coloration de Mallory). 11 - 643702
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au hasard dans leur cytoplasme (Fig. 6); c’est a ce stade qu’a lieu la fecondation. Apres la pCnCtration du spermatozoPde, les spheres hyalines sont repoussees a la peripherie de l’euf (Fig. 7), tandis que les cristalloides se rassemblent dans la partie centrale; cette (( margination)) bien connue des anciens auteurs a fait penser (5, 6) que les inclusions hyalines participent a la formation de la premiere membrane; nous ne retiendrons pas cette hypothese, car les transformations ulterieures des spheres proteiques semblent tout a fait independantes de l’epaississement rapide de la membrane chitineuse. Lorsque la premiere membrane a atteint son Cpaisseur maxima, les spheres hyalines deviennent coalescentes (Fig. 8) et semblent confluer en plages marginales irregulieres pour dessiner hnalement un lisere plus ou moins continu autour de l’muf (Fig. 9). C’est a ce moment que les cristalloides disparaissent et que la membrane cireuse se forme entre la membrane chitineuse externe et la masse protoplasmique, notablement reduite, de l’oeuf. A partir de ce stade, le liquide de Bouin trichloracetique ne penetre plus et une fixation correcte de la substance proteique des spheres hyalines ne peut Ctre obtenue que par le sublime alcoolique; il apparait alors que la couche superticielle formee par la substance proteique se disloque, prend un aspect rCticulC, puis disparait dans l’etroit espace perivitellin compris entre la masse protoplasmique de l’ceuf et les deux membranes qui l’enveloppent. Cette dernibre transformation est probablement de courte duree, si l’on en juge d’apres la zone t&s Ctroitement limitee de l’oviducte ou l’on peut en observer les aspects caracteristiques. La margination des spheres hyalines, suivie de leur confluence, de leur extension, et enfin de la disparition apparente de leur substance, parait indiquer une modification de leur constituant proteique, dont un autre aspect est donne par la variation progressive de leur indice de refraction. Examinant les oocytes 5 l’etat frais en utilisant soit la methode des franges de Becke en lumiere polarisee, soit le contraste de phase et plus specialement le dispositif (t varicolor N de Locquin, on constate que, avant la fecondation, l’indice de refraction des spheres hyalines est nettement superieur B celui du cytoplasme qui les entoure, tandis qu’a partir du moment oti elles commencent h confluer, leur indice diminue, jusqu’a &tre sensiblement egal a celui du cytoplasme, puis devient notablement plus faible que celui-ci.l 1 Comme il s’agit ici dun indice relatif, il serait interessant de savoir si l’indice de refraction du cytoplasme varie lui aussi et dans quel sens; il ne semble pas que cet indice augmente et la disparition dune quantite importante de son contenu en glycogene, au tours de la formation de la premiere membrane, laisse plutot supposer qu’il doit diminuer lui-m&me; s’il en est bien ainsi, la diminution de l’indice relatif des spheres hyalines garde toute sa signification. Experimental
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La fonte des spheres hyalines, comme le changement des propriCtCs physiques qui la precede, suggere l’idee d’une degradation de leur constituant proteique aboutissant a la dissolution de polypeptides, ou peut btre d’acides amines, dans le liquide perivitellin au sein duquel l’embryon se developpe ulterieurement. DISCUSSION
Les rCsultats que nous venons d’exposer intirment totalement les conclusions avancees quarante ans plus t6t par I’un de nous (FaurC-Fremiet (3)) et encore admises plus recemment (Panijel (lo)), a savoir que les inclusions protoplasmiques de l’oocyte de Parascaris equorum d&rites sous le nom de ((spheres hyalines)) sont de nature minerale et principalement constituees par un phosphate de calcium. Nos nouvelles recherches montrent en effet que ces inclusions sont essentiellement constituees par une proteine, dont les caracteres t&s particuliers de solubilite permettent la caracterisation cytochimique in situ, ainsi que la separation, la purification et l’etude chimique in vitro. Devant ces faits nouveaux nous devons examiner deux questions relatives I’une a la constitution physicochimique de ces inclusions, llautre a leur role physiologique. L’examen des oocytes a Petat frais dans un liquide physiologique en presence d’un colorant vital tel que le bleu de Nil montre le plus souvent les spheres hyalines entourees d’une pellicule plus fortement colorable, apparemment visqueuse, et pouvant se condenser lateralement en formant une ou deux calottes plus refringentes que la partie centrale de la sphere; apres fixation, on observe t&s frequemment soit, le m&me aspect, soit une vacuolisation plus ou moins accentuee des spheres hyalines. Ces observations ont conduit a considerer les spheres hyalines de van Beneden comme des systemes complexes, structures, entoures par une pellicule de nature lipidique (FaurC-Fremiet (3)) ou lipoproteique (Panijel (lo)), d’aprbs l’action des detergents et des ferments proteolytiques). S’il en Ctait bien ainsi, la proteine que nous avons isolee ne representerait que l’un des constituants des spheres hyalines; mais il semble qu’une autre interpretation soit valable. Si, utilisant une Ctuve a microscope, on examine des oocytes frafchement isoles dans une solution de saccharose isotonique addition&e de bleu de Nil et maintenue A la temperature de 37 a 38”C, on constate que les spheres hyalines restent parfaitement homogenes, au contraire de ce que l’on observe a la temperature du laboratoire. Considerant d’autre part les aspects Experimental
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plus ou moins fortement vacuolises montres par les spheres isoldes dans une solution saline et tout specialement dans les solutions concentrees de sulfocyanure de potassium, il est permis d’expliquer 1”apparente hett?rogknCite de ces inclusions cellulaires par un effet de demixion, lie a un gonflement traduisant un debut de dissolution de leur contenu pr0tCique.l L’homogdnCitC optique, a l’etat normal (temperature de 37”(Z), des spheres hyalines permet d’admettre que les pro&d& d’extraction utilises interessent la totalite de leurs constituants organiques; cette conclusion ne contredit pas, bien entendu, la coexistence probable de plusieurs constituants proteiques de proprietes tres voisines indiquee par les premiers resultats de l’electrophorese, ni la presence d’elements mineraux, mise en evidence par la micro-incineration, dans le liquide de dispersion de ces proteines. La nature proteique des spheres hyalines motive, en tant que fait nouveau, En effet, la composition essentiellement minerale quelques commentaires. qui leur Ctait assignee par les travaux precedemment cites conferait a l’oocyte de Parascaris un caractere assez exceptionne12 qui disparait aujourd’hui. De m&me la demonstration de leur constitution proteique fait tomber l’interessante opposition tracee par Panijel ((lo), p. 100) entre l’ovogenbse de Rana fusca qui ((met en jeu un metabolisme de synthese et d’accumulation, et en particulier de synthese et d’accumulation proteique)), et l’ovogenese du Parascaris equorcrm montrant surtout ((un metabolisme de transformation et, en particulier, un metabolisme non proteique)). En fait, dans l’un comme dans l’autre cas, la croissance de l’oocyte s’accompagne de l’elaboration dun materiel proteique mis en reserve sous de globules vitellins en un mot. Et la forme d’inclusions cytoplasmiques, diminution du taux des ribonucleoproteines cytoplasmiques, bien mise en evidence par Panijel au debut de l’apparition des spheres hyalines, ne fail plus exception a la regle puisqu’elle correspond, ici comme dans tant d’autres cas, a la synthbe de composes proteiques. On remarquera encore que ces constatations restreignent la signification accordee par quelques auteurs A l’apport, au tours de la fecondation de l’muf chez Paroscar& d’inclusions proteiques spermatiques (ascaridine du cone refringent); ces inclusions ont CtC comparees par Hertwig, par Scheben, par Marcus3 a un vitellus, et par Panijel ((lo), p. 264), d’une man&e plus 1 Une figure publide par l’un de nous (E. Faurt-Fremiet (3) pl. XII, Fig. 4) et reproduite par Panijel ((10) Fig. IO, p. 33) represente certainement un stade initial de la dissolution de deux spheres hyalines isolees dans le serum physiologlque. a Panljel (1) ecrit (p. 33): clun tel cas de sreserve minerale, est a notre connaissance le seul rencontre jusqu’a present dans les diverses ovogdneses Btudiees B. * Voir pour la bibliograpbie de ces anciens travaux E. Faure-Fremiet (3). Experimental
Cell Research ?
Les inclusions profe’iquesde l’oocyfe de Parascaris equorum
167
suggestive, a un ~vitellus exogene)), capable de suppleer a l’incapacite proteinogene de l’oocyte. Cette remarque ne touche d’ailleurs en rien l’intCr6t tout particulier que presente la ((recharge)) en ribonucleoproteines de l’ceuf de Parascaris dtkouverte par Panijel et Pasteels (g-13), recharge qui semble like aux transformations subies par la proteine spermatique. On n’oubliera pas, cependant, le fait bien particulier que le vitellus proteique de l’oeuf de Parascaris est expulse du cytoplasme peu apres l’insemination et qu’il disparait dans le liquide periovulaire; il resterait done ?I verifier la presence dans ce liquide de produits de degradation solubles et a savoir si, au tours de la segmentation et de I’embryogCnbe, ces produits sont utilises par les blastomeres et les cellules en voie de division.
RhUMfi
L’etude cytochimique des inclusions contenues dans l’oocyte de Parascaris equorum et connues sous le nom de ((spheres hyalines)) de van Beneden montre qu’elles ne sont pas de nature essentiellement minCrale, comme l’affirmaient les travaux anterieurs, mais qu’elles sont principalement constit&es par une proteine possedant certains caracteres particuliers: solubiliti: dans l’alcool A 60”, l’eau, le serum physiologique et les acides; insolubilite dans le chlorure de sodium a 10 %, dans le sulfocyanure 2 M et dans les solu.tions alcalines concentrees. L’analyse chimique de cette proteine fait apparaitre un taux de proline assez Cleve. L’etude de l’evolution de ces spheres au tours de la croissance de l’oocyte et de la maturation de l’ceuf feconde montre que, d’abord reparties au hasard dans le cytoplasme de l’oocyte, elles passent a la peripherie de l’aeuf apres fecondation, deviennent coalescentes et disparaissent dans l’espace periovulaire compris entre la masse protoplasmique et les membranes. L’evolution de ce vitellus proteique et son apparente disparition apres la fecondation suggerent sa transformation en produits de degradation utilisables au tours du developpement embryonnaire. BIBLIOGBAPHIE 1. VAN BENEDEN, E., Arch. Biol., 4, 265 (1883). 2. VON BRAND, T., Chemical Physiology of Endoparasitic Animals. Academic Press, Inc., New York, p. 184, 1952. 3. FAUR~FREMIET, E., Arch. Anaf. Microscop., 15, 437 (1913). 4. FAURB-FREMIET, E., EBEL, J. P., et COLAS, J., Compt. rend. Acad. Sci., 237, 629 (1953). 5. FLURY, F., Arch. expfl. Pathol. Pharmakol., 67, 275 (1912). 6. LAMS, H., Acla Anat., 14, 141 (1952). Experimental
Cell Research 7
168
E. FaurbFremief, J. P. Ebel ef J. Colas
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Experimental Cell Research ?
Herrmann,
153
Cell Research, 7, 153-168 (1954)
LES INCLUSIONS PROThQUES PARASCARIS E. FAURe-FREMIET, Laboratoire
d’Embryogt%ie
DE L’OOCYTE DE
EQUORUM J. P. EBEL
CornpaGe, Rep
et J. COLAS
Colk?ge de France,
le 2 Fkier,
Paris,
France
1954
L900tx-m
jeune de l’dscaris megalocephala, de son vrai nom Parascaris equorum (Goerze 1782) est char@ de granules ribonuclCiques (9, 10, 11, 12, 13). En tours de croissance ces granules ribonuclkiques diminuent progressivement, tandis que deux sortes de corps figurCs, d6crits par van Be‘neden (1) sous les no& de (( cristallo?des N et de ctsph&res hyalines)), et une importante quantitC de glycogke B Y&at diffus s’accumulent dans son cytoplasme (3). Apr6s la fkcondation l’ceuf s’entoure de deux membranes concentriques; l’externe, dite chitineuse, se forme aux dCpens d’une partie du glycogke l’interne, constitke par une tire (alcool ascarylique de cytoplasmique; Flury (3)), se forme aux dCpens des cccristallo’ides)) de van Beneden (3). Entre temps, les (( sph&res hyalines )) se rassemblent & la pCriphCrie de l’ceuf oti elles semblent se fusionner avant de disparaitre. L’ensemble de ces transformations se traduit par une forte diminution de la masse de l’aeuf finalement isolC sous une faible couche de liquide pbrivitellin g l’inthrieur de la membrane cireuse; l’ceuf apparait alors comme une sphhre, protoplasmique ne contenant plus, en sus du chondriome et des pronuclei, que quelques globules graisseux et du glycogitne diffus. La membrane cireuse est impermbable B l’eau et aux solutions aqueuses, mais elle permet les Cchanges gazeux; on sait, depuis les recherches de Hallez, 1885, Samassa, 1898, Bataillon, 1910, etc.,l que la segmentation de l’aeuf ne peut s’effectuer qu’en presence d’oxyghne; mais le dCveloppement, jusqu’au stade de larve vermiforme mobile, s’effectue sans aucun apport de matkriaux nutritifs, et l’embryon ne peut done utiliser que ce qui reste inclus sous les membranes, principalement le glycogke ovulaire et la protkine constituant le (( c8ne rkfringent)) du spermatozo’ide. Panijel (9-l 1) et 1 On trouvera la bibliograpbie des travaux constitution chimique de l’oeuf des Nematodes
anciens et rkcents relatifs A la physiologie et & la dans Fauri-Fremiet (3), Panijel (10) et V. Brand
w Experimental
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E. Faur&Fremiet,
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J. P. ,Ebel et J. Colas
Pasteels (12, 13), ont demontre l’apparition d’acide ribonucleique dans la zone oti le cone refringent disparait dans le cytoplasme ovulaire. Le role et la signification des (( spheres hyalines 1) restent indetermines au tours des transformations qui accompagnent la fecondation et la segmentation. Leur nature m&me reste incertaine; l’un de nous (FaurC-Fremiet (3)) se fondant sur diverses reactions cytochimiques et chimiques’ a conclu que les spheres hyalines sont des vacuoles aqueuses contenant un phosphate de calcium associe a des traces de proteines, et enveloppees par une couche limitante lipidique. Mais Wottge (15) ne retrouve pas au niveau de ces inclusions les reactions cytochimiques du Ca; Panijel (10) indique ces m&mes reactions comme incertaines, tandis que celle du phosphore selon Serra et Queiroz Lopes (14) lui apparait positive, et que l’analyse chimique des spheres hyalines isolees en milieu alcalin lui montre une quantitd importante de phosphore. 11 conclut a (tune reserve inorganique constituee par du P et du Ca, maintenue avec une structure d’element figure grace a une pellicule limitante de nature lipidoproteique D. Certains caracteres de ces inclusions nous ayant paru peu compatibles avec une nature essentiellement minerale, nous avons repris l’etude des ((spheres hyalines)) de l’oocyte (4). Nous avons d’abord precise leurs caractkres de solubilite; la connaissance de ces derniers nous a permis de mettre au point des moyens de conservation corrects rendant possibles d’une part l’etude de l’evolution de ces inclusions et de l’autre celle de leur constitution par des techniques cytochimiques modernes; enhn nous avons mis au point les procedes d’isolement et de purification permettant d’aborder leur etude chimique. Nous examinerons ici les resultats obtenus au point de vue cytologique et cytochimique; l’etude chimique fera l’objet d’un autre travail. Aspect des sphbres hyalines
dans l’oocyte
des cellules sexuelles de Parascaris tout au long du tube ovarien, depuis la zone germinative, ou les oogonies sont en voie de multiplication, jusqu’a l’oviducte, ou les oocytes mures sont fecondes et forment leurs membranes, avant de passer dans l’uterus et dans le vagin. Les differents
stades de l’evolution
equorum se succedent regulierement
1 Aspect h&?rog&ne montr6 par des colorants vitaux; insolubilitk de la masse principale dans certaines solutions alcalines; reactions du P selon Macallum positive au nivead de la fraction insoluble; caractCrisation chimique du P et du Ca dans cette m&me fraction isol6e par centrifugation, mais non purifibe. Experimental
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Les inclusions protdiques de l’oocyte de Parascaris equorum
155
Les jeunes oocytes apparaissent comme des elements piriformes disposes radiairement autour d’un cordon protoplasmique central ou rachis (Figs. 3 et 4); leur longueur s’accrott progressivement jusqu’a environ 200 p, tandis que leur cytoplasme se charge d’inclusions deutoplasmiques ou vitellines (Fig. 5); au terme de leur croissance, ils se detachent du rachis sous forme de grosses cellules approximativement spheriques (Fig. 6). L’examen des oocytes a l’etat frais doit &tre fait dans le liquide coelomique, ou mieux dans une solution isotonique de saccharose. A cet effet, les tubes ovariques d’une femelle hien vivante sont rapidement extraits et laves dans la solution de saccharose; de courts segments sont isoles a differents niveaux, et une leg&e pression exercee sur leur paroi en fait sortir un boudin d’oocytes que l’on dissocie rapidement dans une goutte de la solution sucree pure ou addition&e d’un colorant vital. Les globules hyalins apparaissent comme des inclusions spheriques, claires, faiblement refringentes, &par&es par un contour net du cytoplasme environnant qui est charge de cristalloIdes t&s refringents. Une leg&e pression exercee sur l’oocyte permet d’isoler ces spheres dans le liquide environnant, oti elles conservent d’abord leur aspect caracteristique; mais dans ces conditions ces elements paraissent relativement instables et se detruisent plus ou moins rapidement. Le rouge neutre ne colore pas les spheres hyalines dans l’oocyte vivant; le bleu de mCthyl&ne et plus specialement les bleus de Nil et de cresyl brillant les colorent au contraire d’une maniere elective, avec une ICgbre metachromasie; le vert Janus se fixe, lui aussi, sur ces elements. Sous I’effet de ces divers colorants vitaux les spheres prennent rapidement un aspect h&&ogene se traduisant par une vacuolisation et la separation d’une masse cortitale dessinant comme une calotte t&s fortement teintee en bleu ou en vert. La question se pose de savoir si les spheres hyalines sont reellement h&&ogenes ou si les colorants vitaux produisent un effet de demixion de leurs constituants. Apres action d’un reactif fixateur assurant la conservation des spheres (voir plus loin), celles-ci sont klectivement et intensement colorables par le bleu d’aniline utilise suivant la technique de Mallory. Elles fixent d’autres colorants, tels que le picro-carmin (l), l’hematoxyline (6), etc., mais d’une maniere beaucoup moins elective. C’est pourquoi nous avons utilise systematiquement la triple coloration de Mallory pour nous assurer de la persistance ou de la disparition des spheres hyalines au tours des divers essais effectues pour determiner leurs caractbres de solubilite.
Experimental
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E. Faur&Fremiet, J. P. Ebel et J. Colas Caracths
de sol&lit6
des
sphhes
hyalines
Les oocytes au stade piriforme, isoles dans une solution de saccharose isotonique, ont CtC trait& dans une Iwemiere operation pendant 12 heures par divers solvants et diverses solutions salines. 11s ont ensuite CtC examines directement entre lame et lamelle, afin de contr8ler la presence ou l’absence des spheres. Dans le cas on celles-ci Ctaient conservees, les oocytes ont et6 &al& en frottis et color& selon la technique de Mallory. Dans un certain nombre de cas, cette seconde operation entrainait leur disparition. 11 apparait done que les reactifs utilises dans la premiere operation pouvaient produire soit une precipitation irreversible de la substance constituant les spheres hyalines, soit une precipitation reversible, ren$ant possible leur dissolution ulterieure lors de la coloration. De ce fait on est conduit a distinguer 1) les reactifs qui insolubilisent d&initivement les spheres hyalines, 2) eeux qui les conservent, mais sans les insolubiliser, et 3) ceux qui Ies dissolvent. 1) RCacfifs insolubilisants. Rentrent clans cettc categoric: le bichlorure de mercure (HgCl,) en solution saturce, qui donne de loin les meilleurs rksultats, et l’acide phosphomolybdique en solution a 15 %. 2) Rkactifs conservant les sph&es hyalines, mais saris les insolubiliser. Les rcactifs fixateurs de cette categoric sont caractcrids par les deux tests suivants: a) Action du reactif pendant 12 heures, Ctalement en frottis puis coloration selon la technique de Mallory: on constate la disparition des spheres hyalines. b) Action de ces reactifs pendant 12 heures, Btalement en frottis, traitement par HgCl, sat& puis coloration selon la technique de Mallory: les spheres sont conservces. Le bichlorure de Hg a prccipite de manicre irreversible la substance des spheres hyalines, conserve’e, mais non insolubilisCe par le reactif essay&. Font partie de ce groupe de rcactifs: l’eau bouillante; l’alcool a 96” et l’acetone; les acides picrique a saturation et trichloracctique a 5 %; les solutions aqueuses des composes suivants: acetate de plomb a 10 %, sulfate d’ammonium a saturation et a demi-saturation, chlorure de sodium a 10 %, sulfocyanure de potassium a concentration superieure a 2 M; form01 a 10 %. 3) Rtactifs dissolvants. La dissolution de la substance constitutive des spheres hyalines apres traitement pendant 12 heures par ces reactifs a temperature ordinaire est prouvce par l’absence de coloration selon la technique de Mallory, mame aprbs l’action du bichlorure de mercure a saturation. Rentrent dans cette categoric: l’eau distillee a froid; l’alcool a 50” et a 60”; les acides chlorhydrique, sulfurique, acetique, oxalique, mctaphosphorique et sulfosalicylique, utilisces a toute concentration; les bases telles que soude, potasse, ammoniaque aux concentrations infcrieuExperimental
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Les inclusions prote’iques de l’oocyte de Ptirascaris equorum
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res a la normalite. (Au dessus de la concentration N, la soude et la potasse, tout en detruisant le cytoplasme, semblent laisser intactes les spheres hyalines. L’action insolubilisante de la potasse signalee par l’un de nous (3) et confirmee par Panijel(l0) ne s’exerce done qu’a partir d’une concentration determinCe (KOH N)); diverses solutions. salines: chlorure de sodium entre 0.9 et 5 7,; sulfate de cuivre a 10 ‘T$, iodure de potassium 3 M, sulfocyanure de potassium M; uree a 35 % Au point de vue technique nous retiendrons parmi tous ces caractcres de solubilite des spheres hyalines: a) l’action insolubilisante irreversible de HgCl,; b) la solubilite dans I’eau distillhe; c) la solubilite dans l’alcool a 60”. (A des degres alcooliques plus &eves, la dissolution devient de plus en plus difficile: les spheres hyalines sont insolubles dans l’alcool ti 96’); d) la solubilite dans NaCl isotonique et a 5 % et l’insolubilite dans NaCl a 10 %; e) l’action du sulfocyanure de potassium: SCNK M dissout les spheres hyalines, mais a partir de la concentration 2 M, SCNK tout en dispersant totalement le cytoplasme, les laisse subsister isolees, un peu gonflees, souvent vacuolisees. Ces caracteres nous ont guide d’une part dans le choix d’un fixateur permettant la conservation des spheres hyalines en vue de leur etude cytologique, d’autre part dans la mise au point d’une methode d’isolement en vue de l’analyse biochimique de leur substance constitutive.
.i%ude cytochimique des spheres hyalines 1) Choix du fixateur convenable. Les caractbres de solubilite precedents expliquent les resultats obtenus par divers fixateurs. Les fixateurs de Carnoy et d’Allen ne conservent pas les spheres, en raison de la presence dans ces melanges de substances solubilisantes. 11 en est de mCme du sublime acetique, en raison de la presence de l’acide. Les alcools a 80” et B 96” sont egalement B rejeter, puisqu’ils n’insolubilisent pas definitivement les spheres hyalines. Le liquide de Bouin donne des resultats incertains: il conserve les spheres, sans doute g&e au formol, mais en les gonflant. Souvent on constate un d&placement de la substance constitutive g l’interieur de la coupe. On obtient par contre d’excellents resultats en remplacant dans le liquide de Bouin, ainsi que le suggere Lams (6), l’acide acetique par l’acide trichloracetique (Bouin trichloradtique). La composition du melange de HelIy: bichromate, sublime, formol, explique egalement les bons resultats obtenus avec ce fixateur. Entin de magnifiques images sont obtenues en utilisant comme fixateur une solution aqueuse ou alcoolique saturke de sublime. Le sublime alcoExperimental
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E. FaurbFremiet, J. P. Ebel et J. Colas olique donne des r6sultats particulierement interessants dans la fixation des mufs pourvus de leur membrane cireuse. L’emploi des derniers tixateurs (Bouin trichloracetique, Helly, solution aqueuse ou alcoolique saturee de sublime) nous a permis d’aborder l’etude cytologique des spheres hyalines. 2) Micro-incindration. Avant d’indiquer les resultats des reactions cytologiques proprement dites, signalons ceux obtenus en soumettant des oocytes a la micro-incineration. Utilisant le four de Policard, nous avons incinere soit des oocytes isoles dans le saccharose isotonique, soit des oocytes fixes par le Bouin trichloracetique. Dans le cas des oocytes isok dans le saccharose isotonique, la quantite de cendres observee a la place occupee par les spheres hyalines est plus importante que celle don&e par les travees cytoplasmiques qui les entourent. Observees en fond noir, ces cendres se presentent comme un prCcipit6 tres fin, amorphe, d’aspect homogene, diffusant une lumiere bleuatre (Fig. 1). On doit apporter une grande attention a la duree d’action du saccharose isotonique sur les oocytes. On constate en effet au tours du temps la disparition progressive du constituant mineral, mis en evidence par la micro-incineration, alors que le constituant organique, mis en evidence par les techniques cytologiques, persiste. La disparition du constituant mineral est encore plus marquee apres action d’un tixateur acide comme le Bouin trichloracetique. Dans ce cas, la micro-incineration laisse la place des spheres hyalines absolument vide, alors que la coloration par la technique de Mallory montre la persistance du constituant organique (Fig. 2). Nous avons essay6 quelques reactions de caracterisation de ces cendres. Elles sont insolubles dans l’eau et difficilement solubles dans l’acide chlordu calcium par depot d’une microhydrique dilue. La caracterisation goutte d’acide sulfurique dilud en solution alcoolique (formation de cristaux de gypse) a don& des resultats negatifs ou tres incertains. La micro-incineration montre done la presence simultanee, au niveau des spheres hyalines, de constituants organiques et mineraux. Les reactions cytologiques effect&es sur des oocytes totaux ou sur des coupes d’oocytes ne nous ont au contraire permis de caracteriser avec certitude que le constituant organique. 3) RtTactions du phosphore. Les travaux anterieurs sur la constitution des spheres hyalines ayant fait admettre la presence de phosphore. nous nous sommes particulierement attaches a la recherche cytologique de cet Clement. Nous avons d’abord recherche la presence de phosphates mineraux par la reaction au nitrate de plomb, suivie d’un traitement par le sulfure d’amExperimental Cell Research 7
Les inclusions prottiques de I’oocgte de Parascaris equorum
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monium (reaction de Gomori sans incubation enzymatique). Cette reaction, quoique non specifique, aurait en effet don& une indication interessante, si elle avait Cte positive. Or elle nous a don& un resultat negatif. Nous avons ensuite applique deux methodes de detection du P organique: la methode d’Angeli et celle de Serra et Queiroz Lopes (14). Toutes deux ont et6 systematiquement negatives. Rappelons que l’un de nous (FaurC-Fremiet (3)) avait trouve la reaction du P selon Macallum positive (action du molybdate suivi de phenylhydrazine). Or on sait aujourd’hui que cette technique est defectueuse (7), la coloration verdttre obtenue Ctant souvent causee par une absorption du molybdate sur diverses structures (en particulier proteiques), et la phenylhydrazine Ctant capable de reduire en bleu les molybdates tout comme les phosphomolybdates. Le resultat positif obtenu sur les spheres hyalines n’avait done pas de valeur. Le resultat positif obtenu recemment par Panijel (10) avec la technique de Serra et Queiroz Lopes nous semble par contre beaucoup plus surprenant. Nous n’avons pu le reproduire et cette divergence nous parait inexplicable. 4) Rkactions du calcium. Les reactions cytochimiques du calcium nous ont don& des resultats contradictoires. Alors que la reaction argentique de von Kossa est negative, la reaction a l’alizarine de Cretin nous est apparue faiblement positive au niveau des spheres hyalines; Wottge (15) avait obtenu avec cette derniitre des resultats negatifs et Panijel (10) des resultats incertains. 5) R&actions des Zipides. Les reactions des lipides (Soudan III, bleu BZL) ont CtC n6gatives.l La reaction de Hotchkiss, particuliere6) Redactions des polysaccharides. merit intense dans le cytoplasme environnant par suite de la presence de glycogene, est negative au niveau des spheres hyalines. 7) R&actions des prote’ines. Diverses &actions des proteines sont positives: reaction xanthoproteique, reaction de Millon-Bensley, reaction de Thomas (ces deux dernieres faiblement). Le caractere proteique du constituant des spheres hyalines est confirm6 par le resultat positif obtenu avec la recente methode de Mazia, Brewer et Alfert (8) au bleu de bromophenol mercurique, reaction qui semble specitique des proteines. 8) Conclusions de l’e’tude cytochimique. Les reactions precedentes conduisent a admettre une nature proteique de la substance constituant les spheres 1 La couche superficielle observable lors des colorations vitales a BtB considkrke par l’un de nous (FaurB-Fremiet (3)) et par Panijel (10) comme de nature lipidique ou IipoprotCique. Cette hypothhse, fond&e sur des caract&res peu significatifs, ne nous paralt pas devoir iXre retenue. Experimental
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E. FaurC-Fremiet, J. P. Ebel et J. Colas
hyalines. Ce resultat s’accorde d’ailleurs avec la disparition par la pepsine et la trypsine signal&e par Panijel (10). 11 ne s’agit pas d’une nucleoproteine (reaction de Unna et de Feulgen negatives), ni d’une proteine soufree (reaction au plombite de sodium et reaction des groupements SH de Chbvremont negatives). Les resultats de la micro-incineration montrent cependant que cette proteine n’est pas l’unique constituant des spheres hyalines. Elles renferment Cgalement des elements mineraux. 11 ne semble pas que ces derniers soient solidement lies a la proteine, puisque l’action de la solution de Bouin trichloracetique ou mCme l’action un peu prolong&e du saccharose isotonique Climine facilement les elements mineraux, laissant au contraire la proteine en place. Nous ne pouvons nous prononcer sur la nature de ces substances minerales, les diverses reactions essayees (en particulier celles du phosphore et du calcium) &ant negatives ou incertaines. On peut penser que la proteine constituant les spheres hyalines se trouve dissoute ou dispersee dans une solution de sels mineraux.
&de
biochimique
L’etude biochimique devant faire l’objet d’un autre travail, nous indiquerons seulement ici les principaux resultats obtenus a cet Cgard. Une technique permettant l’isolement et la purification de la substance des spheres hyalines a et6 mise au point en tenant compte de sa solubilite dans NaCl isotonique et dans l’alcool a 60” et de son insolubilite dans NaCl a 10 y0 et dans SCNK 3 M. Apres dialyse, l’analyse de la substance obtenue a donne une teneur en azote de 16,2 % et n’a rCvCld que des traces de phosphore (0,2 “/o). Le produit donne les reactions des proteines (reactions xanthoproteique, du biuret, de Millon positives). Les reactions des nucleoproteines sont negatives. La reaction au plombite de sodium et les reactions des glucides (reaction de Molisch, reaction de Dische a l’a-naphtol et a la diphenylamine) sont negatives.
Fig. 1. Spodogramme d’oocytes piriformes isoles dans une solution de saccharose isotonique; microphotographie en fond noir; les spheres hyalines apparaissent comme des masses blanchatres. Fig. 2. Spodogramme d’oocytes piriformes fixes par la solution de Boufn trichloracetique; microphotographie en fond noir; les spheres hyalines sont marquees par des espaces vides. Fig. 3. Jeunes oocytes piriformes montrant l’apparition des premieres spheres hyalines dans la zone apicale au-dessous du noyau (Bouin trichloradtique, coloration de*Mallory). N, noyau, S, spheres hyalines. Fig. 4. Oocytes piriformes plus avances, montrant l’augmentation du nombre des spheres hyalines, fortement colorees, encore localisees dans la region apicale (Boufn trichloracbtique, coloration de Mallory). Experimental
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L’analyse par chromatographie sur papier aprbs hydrolyse a mis en Cvidence un certain nomhre d’acides amink, parmi lesquels une proportion relativement importante de proline. L’klectrophorkse A pH 8,6 et A pH 3,5 montre une mobilit assez faible et la prCsence d’au moins deux pits dans le diagramme, t6moins de I’hCtCrogCn&tk de la protCine. L’Ctude chimique confirme done les rksultats de 1’Ctude cytochimique: la substance des sphkes hyalines est constituke par une prot&ine Clectrophorktiquement non homogke, dont il convient, d$s maintenant, de signaler les propriCtCs inusuelles de solubilitk et la composition particulibre.
l%olution
des spht?res hyalines au cows de l’accroissement de l’oocyte et de la maturation de l’ceuf j&onde’
La coloration de Mallory apr&s fixation au liquide de Bouin trichloracktique ou au sublimb alcoolique a permis de suivre, sur les coupes pratiquCes A diffbrents niveaux de l’ovaire et de I’utCrus, les stades successifs de l’kvolution des sph&res hyalinek depuis leur apparition dans l’oocyte jeune jusqu’a leur disparition dans l’awf fkondC. C’est dans les jeunes oocytes piriformes mesurant environ 60 B 70 p de long que les sph&res hyalines commencent A apparaitre sous forme d’inclusions peu nombreuses, irrCguli&res, intensement colorCes par le bleu d’aniline et mesurant jusqu’8 5 B 6 p environ (Fig. 3). D’abord IocalisCes ,dans la rCgion moyenne de I’oocyte, au-dessous du noyau, ces inclusions deviennent ensuite de plus en plus nombreuses (Fig. 4); chez les grands oocytes mesurant 200 B 300 p, elles envahissent toute la masse cytoplasmique, sous forme de sphkules atteignant jusqu’g 10 A 15 p de diamhtre, les plus petites &ant particulikrement nombreuses dans la rCgion pCrinuclCaire (Fig. 5). Lorsque, arriv6e au terme de leur croissance, les oocytes se dCtachent du rachis et prennent une forme sphCrique, les inclusions sont distribudes
Fig. 5. Oocytes piriformes au terme de leur croissance (Bouin trichlora&ique, coloration de Mallory). Fig. 6. Oocytes mars, libres, ayant pris la forme sphkrique (Bouin trichloracktique, coloration de Mallory). Fig. 7. (Eufs f&cond&s, montrant la margination des sphkres hyalines (Bouin trichlorac&ique, coloration de Mallory). Fig. 8. Formation de la membrane chitineuse et debut de coalescence des spheres hyalines (Bouin trichloradtique, coloration de Mallory). Fig. 9. Coalescence et debut de disparition des sphhes hyalines (Bouin trichloracCtique, coloration de Mallory). 11 - 643702
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au hasard dans leur cytoplasme (Fig. 6); c’est a ce stade qu’a lieu la fecondation. Apres la pCnCtration du spermatozoPde, les spheres hyalines sont repoussees a la peripherie de l’euf (Fig. 7), tandis que les cristalloides se rassemblent dans la partie centrale; cette (( margination)) bien connue des anciens auteurs a fait penser (5, 6) que les inclusions hyalines participent a la formation de la premiere membrane; nous ne retiendrons pas cette hypothese, car les transformations ulterieures des spheres proteiques semblent tout a fait independantes de l’epaississement rapide de la membrane chitineuse. Lorsque la premiere membrane a atteint son Cpaisseur maxima, les spheres hyalines deviennent coalescentes (Fig. 8) et semblent confluer en plages marginales irregulieres pour dessiner hnalement un lisere plus ou moins continu autour de l’muf (Fig. 9). C’est a ce moment que les cristalloides disparaissent et que la membrane cireuse se forme entre la membrane chitineuse externe et la masse protoplasmique, notablement reduite, de l’oeuf. A partir de ce stade, le liquide de Bouin trichloracetique ne penetre plus et une fixation correcte de la substance proteique des spheres hyalines ne peut Ctre obtenue que par le sublime alcoolique; il apparait alors que la couche superticielle formee par la substance proteique se disloque, prend un aspect rCticulC, puis disparait dans l’etroit espace perivitellin compris entre la masse protoplasmique de l’ceuf et les deux membranes qui l’enveloppent. Cette dernibre transformation est probablement de courte duree, si l’on en juge d’apres la zone t&s Ctroitement limitee de l’oviducte ou l’on peut en observer les aspects caracteristiques. La margination des spheres hyalines, suivie de leur confluence, de leur extension, et enfin de la disparition apparente de leur substance, parait indiquer une modification de leur constituant proteique, dont un autre aspect est donne par la variation progressive de leur indice de refraction. Examinant les oocytes 5 l’etat frais en utilisant soit la methode des franges de Becke en lumiere polarisee, soit le contraste de phase et plus specialement le dispositif (t varicolor N de Locquin, on constate que, avant la fecondation, l’indice de refraction des spheres hyalines est nettement superieur B celui du cytoplasme qui les entoure, tandis qu’a partir du moment oti elles commencent h confluer, leur indice diminue, jusqu’a &tre sensiblement egal a celui du cytoplasme, puis devient notablement plus faible que celui-ci.l 1 Comme il s’agit ici dun indice relatif, il serait interessant de savoir si l’indice de refraction du cytoplasme varie lui aussi et dans quel sens; il ne semble pas que cet indice augmente et la disparition dune quantite importante de son contenu en glycogene, au tours de la formation de la premiere membrane, laisse plutot supposer qu’il doit diminuer lui-m&me; s’il en est bien ainsi, la diminution de l’indice relatif des spheres hyalines garde toute sa signification. Experimental
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La fonte des spheres hyalines, comme le changement des propriCtCs physiques qui la precede, suggere l’idee d’une degradation de leur constituant proteique aboutissant a la dissolution de polypeptides, ou peut btre d’acides amines, dans le liquide perivitellin au sein duquel l’embryon se developpe ulterieurement. DISCUSSION
Les rCsultats que nous venons d’exposer intirment totalement les conclusions avancees quarante ans plus t6t par I’un de nous (FaurC-Fremiet (3)) et encore admises plus recemment (Panijel (lo)), a savoir que les inclusions protoplasmiques de l’oocyte de Parascaris equorum d&rites sous le nom de ((spheres hyalines)) sont de nature minerale et principalement constituees par un phosphate de calcium. Nos nouvelles recherches montrent en effet que ces inclusions sont essentiellement constituees par une proteine, dont les caracteres t&s particuliers de solubilite permettent la caracterisation cytochimique in situ, ainsi que la separation, la purification et l’etude chimique in vitro. Devant ces faits nouveaux nous devons examiner deux questions relatives I’une a la constitution physicochimique de ces inclusions, llautre a leur role physiologique. L’examen des oocytes a Petat frais dans un liquide physiologique en presence d’un colorant vital tel que le bleu de Nil montre le plus souvent les spheres hyalines entourees d’une pellicule plus fortement colorable, apparemment visqueuse, et pouvant se condenser lateralement en formant une ou deux calottes plus refringentes que la partie centrale de la sphere; apres fixation, on observe t&s frequemment soit, le m&me aspect, soit une vacuolisation plus ou moins accentuee des spheres hyalines. Ces observations ont conduit a considerer les spheres hyalines de van Beneden comme des systemes complexes, structures, entoures par une pellicule de nature lipidique (FaurC-Fremiet (3)) ou lipoproteique (Panijel (lo)), d’aprbs l’action des detergents et des ferments proteolytiques). S’il en Ctait bien ainsi, la proteine que nous avons isolee ne representerait que l’un des constituants des spheres hyalines; mais il semble qu’une autre interpretation soit valable. Si, utilisant une Ctuve a microscope, on examine des oocytes frafchement isoles dans une solution de saccharose isotonique addition&e de bleu de Nil et maintenue A la temperature de 37 a 38”C, on constate que les spheres hyalines restent parfaitement homogenes, au contraire de ce que l’on observe a la temperature du laboratoire. Considerant d’autre part les aspects Experimental
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plus ou moins fortement vacuolises montres par les spheres isoldes dans une solution saline et tout specialement dans les solutions concentrees de sulfocyanure de potassium, il est permis d’expliquer 1”apparente hett?rogknCite de ces inclusions cellulaires par un effet de demixion, lie a un gonflement traduisant un debut de dissolution de leur contenu pr0tCique.l L’homogdnCitC optique, a l’etat normal (temperature de 37”(Z), des spheres hyalines permet d’admettre que les pro&d& d’extraction utilises interessent la totalite de leurs constituants organiques; cette conclusion ne contredit pas, bien entendu, la coexistence probable de plusieurs constituants proteiques de proprietes tres voisines indiquee par les premiers resultats de l’electrophorese, ni la presence d’elements mineraux, mise en evidence par la micro-incineration, dans le liquide de dispersion de ces proteines. La nature proteique des spheres hyalines motive, en tant que fait nouveau, En effet, la composition essentiellement minerale quelques commentaires. qui leur Ctait assignee par les travaux precedemment cites conferait a l’oocyte de Parascaris un caractere assez exceptionne12 qui disparait aujourd’hui. De m&me la demonstration de leur constitution proteique fait tomber l’interessante opposition tracee par Panijel ((lo), p. 100) entre l’ovogenbse de Rana fusca qui ((met en jeu un metabolisme de synthese et d’accumulation, et en particulier de synthese et d’accumulation proteique)), et l’ovogenese du Parascaris equorcrm montrant surtout ((un metabolisme de transformation et, en particulier, un metabolisme non proteique)). En fait, dans l’un comme dans l’autre cas, la croissance de l’oocyte s’accompagne de l’elaboration dun materiel proteique mis en reserve sous de globules vitellins en un mot. Et la forme d’inclusions cytoplasmiques, diminution du taux des ribonucleoproteines cytoplasmiques, bien mise en evidence par Panijel au debut de l’apparition des spheres hyalines, ne fail plus exception a la regle puisqu’elle correspond, ici comme dans tant d’autres cas, a la synthbe de composes proteiques. On remarquera encore que ces constatations restreignent la signification accordee par quelques auteurs A l’apport, au tours de la fecondation de l’muf chez Paroscar& d’inclusions proteiques spermatiques (ascaridine du cone refringent); ces inclusions ont CtC comparees par Hertwig, par Scheben, par Marcus3 a un vitellus, et par Panijel ((lo), p. 264), d’une man&e plus 1 Une figure publide par l’un de nous (E. Faurt-Fremiet (3) pl. XII, Fig. 4) et reproduite par Panijel ((10) Fig. IO, p. 33) represente certainement un stade initial de la dissolution de deux spheres hyalines isolees dans le serum physiologlque. a Panljel (1) ecrit (p. 33): clun tel cas de sreserve minerale, est a notre connaissance le seul rencontre jusqu’a present dans les diverses ovogdneses Btudiees B. * Voir pour la bibliograpbie de ces anciens travaux E. Faure-Fremiet (3). Experimental
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Les inclusions profe’iquesde l’oocyfe de Parascaris equorum
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suggestive, a un ~vitellus exogene)), capable de suppleer a l’incapacite proteinogene de l’oocyte. Cette remarque ne touche d’ailleurs en rien l’intCr6t tout particulier que presente la ((recharge)) en ribonucleoproteines de l’ceuf de Parascaris dtkouverte par Panijel et Pasteels (g-13), recharge qui semble like aux transformations subies par la proteine spermatique. On n’oubliera pas, cependant, le fait bien particulier que le vitellus proteique de l’oeuf de Parascaris est expulse du cytoplasme peu apres l’insemination et qu’il disparait dans le liquide periovulaire; il resterait done ?I verifier la presence dans ce liquide de produits de degradation solubles et a savoir si, au tours de la segmentation et de I’embryogCnbe, ces produits sont utilises par les blastomeres et les cellules en voie de division.
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L’etude cytochimique des inclusions contenues dans l’oocyte de Parascaris equorum et connues sous le nom de ((spheres hyalines)) de van Beneden montre qu’elles ne sont pas de nature essentiellement minCrale, comme l’affirmaient les travaux anterieurs, mais qu’elles sont principalement constit&es par une proteine possedant certains caracteres particuliers: solubiliti: dans l’alcool A 60”, l’eau, le serum physiologique et les acides; insolubilite dans le chlorure de sodium a 10 %, dans le sulfocyanure 2 M et dans les solu.tions alcalines concentrees. L’analyse chimique de cette proteine fait apparaitre un taux de proline assez Cleve. L’etude de l’evolution de ces spheres au tours de la croissance de l’oocyte et de la maturation de l’ceuf feconde montre que, d’abord reparties au hasard dans le cytoplasme de l’oocyte, elles passent a la peripherie de l’aeuf apres fecondation, deviennent coalescentes et disparaissent dans l’espace periovulaire compris entre la masse protoplasmique et les membranes. L’evolution de ce vitellus proteique et son apparente disparition apres la fecondation suggerent sa transformation en produits de degradation utilisables au tours du developpement embryonnaire. BIBLIOGBAPHIE 1. VAN BENEDEN, E., Arch. Biol., 4, 265 (1883). 2. VON BRAND, T., Chemical Physiology of Endoparasitic Animals. Academic Press, Inc., New York, p. 184, 1952. 3. FAUR~FREMIET, E., Arch. Anaf. Microscop., 15, 437 (1913). 4. FAURB-FREMIET, E., EBEL, J. P., et COLAS, J., Compt. rend. Acad. Sci., 237, 629 (1953). 5. FLURY, F., Arch. expfl. Pathol. Pharmakol., 67, 275 (1912). 6. LAMS, H., Acla Anat., 14, 141 (1952). Experimental
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