Metabolisme des composes phenoliques chez le petunia v. utilisation de la phenylalanine par des chloroplastes isoles

Plant Science Letters, 10 (1977) 225--234

225

© Elsevier/North-Holland Scientific Publishers Ltd.

METABOLISME DES COMPOSES P H E N O L I Q U E S CHEZ LE P E T U N I A V. U T I L I S A T I O N DE LA P H E N Y L A L A N I N E PAR DES C H L O R O P L A S T E S ISOLES

RAOUL

RANJEVA, GILBERT ALIBERT et ALAIN M. B O U D E T

Centre de Physiologie Vdgdtale, Laboratoire Associ~ au C.N.R.S. No. 241, 118 route de Narbonne, 31077 Toulouse C~dex (France)

(Requ le 30 mars 1977) (Accept~ le 24 juin 1977)

SUMMARY

Metabolism of phenolic compounds in Petunia. V. Ability of isolated chloroplasts to synthetise phenolic compounds from phenylalanine The involvement of plastids in phenolic metabolism has been studied in Petunia after an isolation m e t h o d of pure and physiologically intact chloroplasts has been adapted. Feeding experiments with [ ~4C]phenylalanine demonstrated in these isolated organelles: the synthesis of cinnamate and benzoate derivatives which, with the exception of the first term of each serie, are o-hydroxylated (o-coumaric acid, coumarin and salicylic and gentisic acids); the lack of formation of labelled p - h y d r o x y l a t e d derivatives and flavonoids. The results are in agreement with the characterization, in the plastids of specific enzymes (PAL, cinnamate-2-hydroxylase) and the absence of cinnamate-4-hydroxylase. All these data suggest that the formation of p-hydroxylated derivatives, esters and flavonoids often characterized in chloroplasts may involve a cooperation between different organelles.

INTRODUCTION Les composds phdnoliques, de rdpartition gdndrale chez les plantes, sont localisds de faqon hdthrogdne ~ tousles niveaux de l'organisation vdgdtale [1--4]. A u sein de la cellule la vacuole et la paroi lignifide, compartiments relativement inertes sur le plan mdtabolique, constituent les sites d'accumulation principaux des polyphdnols. Cependant, on a pu identifier dans les chloroplastes d'un grand nombre de vdgdtaux des flavohoides [5--7] et divers esters d'acides cinnamiques [8,9]. A la suite de cette localisation il s'agit de savoir si le chloroplaste possdde la capacitd de synthdtiser ces substances ou si ces

226

dernieres proviennent en tout, ou pattie, d'autres compartiments ceUulalres. Dans cette optique nous avons, chez Petunia hybrida Vilmour cv. Rose du Ciel, tentd de ddterminer l'aptitude de chloroplastes isolds ~ former des composds phdnoliques ~ partir de phdnylalanine.

MATERIEL ET M E T H O D E S

Materiel u~g~tal Les plants de Pdtunia ont dtd obtenus selon un mode de culture prdcddemment ddcrit [10].

Produits Les produits commerciaux utilisdsprdsentent gdndralement le degrd de puretd le plus dlevd, lls proviennent de la firme Merck exceptd le polydthyldne glycol (PEG 6000, Touzart & Matignon) et la sdrumalbumine bovine (fraction V fatty acid poor, Miles). Les moldcules radioactives: phdnylalanine U-14C (436 mCi/mmol), acide cinnamique 3-~4C (58 mCi/mmol) et bicarbonate de sodium (48 mCi/mmol) sont d'origine C E A (France). Obtention des chloroplastes Toutes les opdrations d'extraction et de purification sont rdalisdes en lumidre verte (ou ~ l'obscuritd) ~ des tempdratures comprises entre 0 et 4°C. Les feuillesddbarrassdes de la nervure centrale, sont ddcoupdes aux ciseaux dans le milieu d'extraction (60 g de feuilles/120 ml de milieu) comprenant: Tris--HCl 0.1 M de p H 7.8; saccharose 0.4 M; sdrumalbumine bovine I g/l; cystdine--HCl 3 • 10 -3 M; E D T A 15 • 50 -3 M e t P E G 5 gfl (ce milieu est dit de "lavage" quand il ne contient ni P E G ni cystdine). Les organes sont ensuite broyds par fractions de 30 g dans un mortier prdalablement tapissd de 3 couches de toile ~tblutter dont une de 100 ~ m et deux de 200 ~ m de vide de maille, le pilon dtant dgalement entourd de deux dpaisseurs de cette m ~ m e toile [11J. Le broyat est filtrdsur huit dpaiMeurs de gaze mddicale reposant sur une couche de toile ~ blutter de 35 ~ m de vide de maille et le filtratcentrifugal 10 rain ~ 340 g (Beckman, J21 B). Le surnageant obtenu est ddposd, par fractions de 20 ml, sur un gradient de densitd discontinu constitud ~kpartir du milieu de lavage enrichi en saccharose de concentrations finales: 2 M (5 ml); 1.5 M (5 ml), 1 M (10 ml). Aprds centrifugation ~ 1000 g pendant 15 rain (MSE Major) les chloroplastes intacts, qui viennent se placer ~ l'interface 1--1.5 M, sont aspirds sous vide partiel ~ l'aide d'un capillaire. La fraction recueillie est concentrde par une nouvelle centrifugation 1500 g pendant 15 rain et le culot ddlicatement remis en suspension clans le milieu de lavage. Les chloroplastes sont lards ~tdeux reprises par centrifugation dans des conditions identiques.

227

Preparation des extraitsenzymatiques Les activitds enzymatiques considdrdes sont estimdes fi partir: soit de la fraction chloroplastique broyde au mortier dans le tampon phosphate monobipotassique 0.1 M de p H 7.5; soit fipartir du surnageant (extrait global E) obtenu aprds broyage des feuillesdans le milieu d'extraction des chloroplastes (traitd par le charbon actif [12 ] et une rdsine dchangeuse d'anions [13 ] ). Estimation des activitds enzymatiques Les activitds phdnylalanine ammonia-lyase (E.C.'4.3.1.5.) et cinnamate-4hydroxylase sont mesurdes selon des mdthodes radiochimiques ddcrites par ailleurs [14]. Darts le cas de la cinnamate-2-hydroxylase le protocole ddfini par Gestetner et Conn [15] a dt~ retenu. Le produit de la rdaction l'acide o-coumarique est pm'ifid par chromatogmphie bidimensionnelle sur couche mince (voir ciaessous, solvants A et B).

Mdthodes analytiques Les produits, dventueUement formds aprds mdtabolisation de la phdnylalanine par les chloroplastes, sont isolds selon le mode opdratoire su.ivant: apres un temps de rdaction de 120 et de 240 rain on prdldve 1 ml du milieu puis on ajoute 5 ml de mdthanol et on porte le mdlange ~ 100°C pendant 2 rain pour arr~ter les rdactions. O n ffltresur papier, on rince par 10 rnl de solvant puis on dvapore ~isec. Le rdsidu est repris par une solution aqueuse contenant 2 0 % d'dthanol, 2 0 % d'acide mdta-phosphorique et 4 0 % de sulfate d'ammonium [16] permettant l'extraction totale des composd phdnoliques par l'acdtate d'dthyle. Le contenu de la phase organique, aprds dlirnination du solvant, est soumis aux traitements reportds sur le diagramme opdrationnel suivant:

Hydrolyse, NaOH 4 N, 4 h sous azote (en prdsence de surcharges ac. phdnols, coumarines) pH ajustd a 2 Extraction par l'dther dthylique (2 × 15 ml)

l Phase aqueuse

$ Phase dthdrde: PI

Hydrolyse HCI 2 N 1 h ~i100°C p H amend ~ 2

$

Extraction par l'dther dthylique (2 X 15 ml)

1

Phase aqueuse

i Phase dthdrde: P2

228

Les fractions P, et P2 sont rassembldes, dvapordes ~ sec, reprises par du mdthanol et ddposdes en bande sur papier Macherey Nagel MN 827 ff. L'dlution des acides phdnols est rdAli~de en chambre froide pendant 12 h par l'acide acdtique ~ 1% [17]. Les flavonoides, peu solubles dans ce solvant, sont enfin dluds du papier par le mdlange mdthanol--acdtate d'dthyle (1 : 1, v/v) dans les m~me conditions. A ]a suite de cette chromatographie prdparative, la fraction acides phdnols concentrde est chromatographide sur couche mince de cellulose (Merck sans indicateur de fluorescence) dans les systdmes solvants: A: chloroforme--acide acdtique--eau (2 : 1 : 1, v/v) pour la premidre dimension; B: acide acdtique ~ 1% pour la seconde dimension. Dans ces conditions on isole les acides p-coumarique, cafdique, p-hydroxybenzoique et gentisique. Les composds non sdpards lots de cette premidre opdration (localisds dans le front du solvant A) sont dluds par le mdthanol puis purifies par chromatographies sur couche mince successives dans le solvant E de Reio [18] (acide salicylique et coumarine) puis l'acide acdtique ~ 1% (acides cinnamique et benzoique). Ce mode opdratoire permet une sdparation totale des diffdrents composds dtudids, ndcessaire pour l'apprdciation de ]eur radioactivite individueUe.

Dosage des chlorophylles Les chlorophyiles sont estimdes selon la mdthode spectrophotomdtrique de Arnon [19] les calculs dtant effectuds selon Bruinsma [20]. Mesure de la radioactivit~ La radioactivitd des composds rdcupdrds aprds "grattage" des plaques est ddterminee en prdsence de 15 ml du mdlange scintillant de Bray et de 750 mg de Cab-O-sil au spectromdtre Packard (moddle 22-11). L'efficacitd de l'instaUation de comptage est estimde par la mdthode du rapport des canaux. RESULTATS

Caractdristiques des chloroplastes isol~s Afin de rdduire les risques d'artdfacts d'origine multiple, l'dtude des capacitds mdtaboliques d'organites isolds ndcessite leur obtention a l'dtat put. Les fractions doivent dgalement prdsenter le degrd d'intdgritd morphologique et physiologique le plus dlevd possible. Ces deux impdratifs, difficilement conciliables, ont dtd considdrds dans la raise au point du protocole expdrimental adoptd dans le cas des chloroplastes du Pdtunia. Comme le montre la Fig. 1, on peut sdparer diffdrentes fractions par centrifugation d'un extrait de feuflles sttr gradient discontinu de saccharose. A c e stade de purification toutefois, la bande correspondant aux chloroplutes intacts (bande No. 2) s'avdre encore contaminde par d'autres ozganites (Tableau

229

ilI 0,4 M i!

1M

iI

3

1,5M

2M

Fig. 1. Distribution des diffdrentes fractions cellulaires isoldes d'un extrait de feuilles de P6tunia aprds centrifugation sur barridre de dermitd de saccharose: bande 1, chloroplMt~ agrdgds (interface 1.5--2 M); bande 2, chloroplastes intacts (interface 1--1.5 M); bande 3, chloroplastes dclatds (interface 0.4--1 M).

I). Deux lavages successifs conduisent a l'dlimination totale de ces contaminants et les plastes obtenus conservent alors l'aptitude ~ fixer le C02 d la lumidre avec cependant une efficacitd moindre par rapport aux chloroplastes non lavds. Le contrSle effectual en microscopie en contraste de phases fait apparaltre la birefringence due ~ la conservation de la double m e m b r a n e de ces organites. Ces caractdristiques biochimiques et structurales indiquent donc que le degrd d'intdgritd et de puretd des chloroplastes isolds est sati~aisant. II faut toutefois noter le faible taux de rdcupdration ~tl'issuedes opdrations d'isolement: environ 1 % sur la base de la teneur en chlorophylle.

230 TABLEAU I CARACTERISTIQUES BIOCHIMIQUES DE LA FRACTION CHLOROPLASTIQUE ISOLEE Etapes de purification

Catalase a (A DO/min/mg chlorophylle)

Fumarase a ( ~ DO/rain/rag chlorophylle)

COx b fixd (~mol/h/mg chlorophylle)

Interface 1--1.5 M Aprds 2 lavages

0.60

0.02

4

0

0

0.5

a La catalase, enzyme caract~ristique des "microbodies" et la fumarase caract~ristique des mitochondries, sont estimdes selon Cooper et Beevers [21 ]. b L'activit~ photosynthdtique des chloroplastes isolds est estimde selon le protocole de Rathnam et Edwards [22 J.

TABLEAU II COMPOSES PHENOLIQUES FORMES A PARTIR DE LA PHENYLALANINE PAR LES CHLOROPLASTES INTACTS ISOLES DU PETUNIAa Compos~s

Quantit~ forrn~e en nmole par nag de chlorophylle (calcul~e sur la base de la radioactivit~b ) 120 rain

240 rain

C6---C3 Acide cinnamique Acide p-coumarique Acide caf~ique

3 0 0

Acide o-coumarique Coumarine

2.5 8

C6--C i Acide benzoique Acide salicylique Acide gentisique

3 0.9 1.08

7 2.1 2.25

Acide p-hydroxybenzoique

0

0

0

0

8 0 0 6 14

Cl$ Flavonoides

a Milieu rdactionnel: 1 ~mol ph~nylalanine (100 ~Ci); 30 ~mol glucose-6-P; 300 #mol tampon phosphate de potemium pH 8; chloroplutes dquivalent i 100 #g de chlorophylle~ Volume final, 3 ml. Tempdrature, 30°C; dclairement, 7500 lux. b Radioactivit~ de chaque compos~ = valeur relev~e au temps t -- valeur au temps 0 (immddiatement a p r ~ addition de la phdnylalanine 14C).

231

M~tabolisme des composds phdnoliques dans les chloroplastes de P~tunia Les chloroplastes isolds sont capables de transformer la phdnylalanine en diffdrents composds phdnoliques. La ddtermination de la radioactivitd retrouvde dans les diffdrentes familles phdnoliques (Tableau II) indique que seuls les acides phdnols s'avdrent marquds aprds apport de phenylalanine 14C, aucune radioactivitd n'dtant ddcelde au niveau de la fraction flavonoide. Dans les conditions expdrimentales retenues il se forme a la fois des structures du type cinnamique et benzoique. Dans les deux cas, mis ~ part le premier terrne de chaque sdrie, on observe la prddominance de composes o-hydroxylds (acide o-coumarique et coumarine d'une part, acides salicylique et gentisique d'autre part) et l'absence des ddrivds p-hydroxyles. Cette situation pouvant rdsulter de l'absence de cofacteurs addquats nous avons compard les potentialitds enzymatiques des chloroplastes (aprds dclatement des organites) et d'un extrait protdique de feuilles,en prdsence de tousles cofacteurs ndcessaires aux diverses rdactions. Les rdsultats (reprdsentant la moyenne d'au moins trois expdriences sdpardes) sont ramends a 1 m g de chlorophylle composd caracteristique des plastes (Tableau III). Les donndes obtenues au niveau des enzymes s'accordent avec les renseignements fournis par l'experience de mdtabolisation de la phdnylalanine: La P A L prdsente une activitd relative plus dlevde dans le broyat et dolt donc, c o m m e cela a dte ddj~i montre ~idiverses reprises [23--25], se localiserdans diffdrents sites cellulaires. Elle se retrouve dans les chloroplastes du Pdtunia avec des activites comparables a ceUes indiqudes pour d'autres vdgdtaux [26--28]. La cmnamate-2-hydroxylase paraTt se confiner au seul compartiment plastidial c o m m e dans le cas du Trdfle [14] et de l'Hortensia [29]. TABLEAU III DISTRIBUTION DES ACTIVITES ENZYMATIQUES DANS L ' E X T R A I T (E) ET LES CHLOROPLASTES ECLATES (P) Source d'enzyme

Enzymes

Substrats

nmol produit formal/ragde chlorophylle/h

Rapport P/E

E P

PAL PAL

Phdnylalanine

1300 350

0.27

E P

C=H C2H

Acide cinnamique Acide cinnamique

285 290

E P

C4H C4H

Acide cinnamique Acide cinnamique

200 0

Phdnylalanine

0

PAL, phdnylalanine ammonia4yase; C=H, cinnamate-2-hydroxylase ; C4H , cinnamate-4hydroxylase.

232 La cinnamate-4-hydroxylase n'est pas ddcelable dans les chloroplastes dans les conditions permettant son fonctionnement au niveau du broyat de feuilles ou de la fraction microsomale du Pdtunia [30]. DISCUSSION L'ensemble des rdsultats ddcrits dens ce travail confmme l'aptitude des chloroplastes isolds ~ utiliserla phdnylalenine dens le mdtabolisme phdnolique. La ddsamination de cet acide arnind semble s'effectuer pour une part, dens ces organites et le devenir de l'acide t-cinnamique formd in situ paraTt limitd ~tdeux voies mdtaboliques: (A) La premidre concerne l'hydroxylation en position 2 de l'unitd C6--C3, etape spdcifique de la biogdndse des coumarines simples [31]. La formation de l'acide o~oumarique et de la coumarine* par les chloroplastes de Pdtunia, jointe aux rdsultats r~cents de Dhillon et Brown [32] relatifs ~ la synthdse des furanocoumarines par ces m~mes organites chez Ruta, suggdrent l'intervention probable des chloroplastes darts l'dlaboration de coumarines plus ou moins complexes. (B) La deuxidme voie d'utilisation de l'acide cinnamique par les chloroplsstes isolds conduit, par perte de deux atomes de carbone de la c h a ~ e lat~rale, aux acides de la s~rie benzoique. Selon Loffelhardt et Kindl [33] les plastes pourraient constituer le site de biosynthdse de ces compos~s dans les organes verts tandis qu'ils se formeraient plut6t dens les orgenites du type "microbodies" dans les tissus ddpourvus de chlorophyUes [34,35]. Dens le cas du Petunia on ne peut dire pour l'instant si tous les C6--CI ddrivent de leurs homologues cinnamiques ou si certains d'entre eux sont issus de l'acide benzoique aprds hydroxylations successives. Ce probldme ainsi que le mdcanisme impllqud dans les diverses rdactions sont actuellement ~ l'dtude. Contrairement ~ Czichi et Kindl [36] nous n'avons pu caractdriser la cinnamate-4-hydroxylase dans les chloroplastes. L'hypothdse d'une perte de la protdine enzymatique au cours des purifications ne semble pas ~ retenir car cette enzyme est toujours fortement lide aux membranes [37,38]. Par ailleurs, les rdsultats ndgatifs obtenus, ~ la fois lots d'incorporation de phdnytalanine et lots des essais de mise en dvidence de la cinnamate-4-hydroxylase, dliminent l'dventualit~ d'une non caractdrisation de l'enzyme (en prdsence de substrat cinnamate) due ~ l'existence d'un complexe PAL--C4H [36]. L'absence de ce maillon intermddiaire laisse supposer l'incapacitd des chloroplastes du Pdtunia ~ synthdtiser les polyphdnols issus de l'acide 4-hydroxycinnamique ~ partir de la phdnylalanine (on n'observe d'ailleurs aucun marquage au niveau de racide cafdique et de la fraction flavonoide). Ce rdsultat pose alors le probldme de l'origine biosynthdtique des esters cinnamiques et des substances Czs souvent rencontrds darm ces organites. Ces * Dans les c o n d i t i o n s e x p ~ r i m e n t a l e s retenues une l a c t o n i s a t i o n n o n e n z y m a t i q u e de l'acide o ~ : o u m a r i q u e ne p e u t c e p e n d a n t Stre e x c l u e .

233

polyphdnols pourraient avoir soit une origine entidrement extra-plastidiale, soit ~tre forrnds ~ partird'intermddiaires fournis par d'autres compartiments [39]. La localisation intraceUulaire des biocatalyseurs plus directement irnpliquds dans la biosynthdse de ces substances devrait permettre de prdciser le rSle exact des chloroplastes dans leur dlaboration chez le Pdtunia [40]. RESUME

Le rSle des chloroplastes dans le mdtabolisme phdnolique a dtd dtudid chez le Pdtunia ~ la suite de l'adaptation d'une mdthode permettant l'obtention de ces organites, physiologiquernent fonctionnels, dans un bon dtat de puretd. L'incorporation de phdnylalanine 14C dans les chloroplastes isolds fait apparaTtre: leur aptitude ~ synthdtiser des unitds phdnoliques simples des sdries cinnamique et benzoique qui, ~ l'exception du premier terrne,sont hydroxyldes en position 2 (acide o-coumarique, coumarine, acides salicyliqueet gentisique); leur incapacitd ~ former, zipartirde ce prdcurseur, des composds p-hydroxylds et des flavonoides. Ces rdsultats sont confirmds par la caractdrisation dans les plastes de certaines enzymes: PAL, cinnamate-2-hydroxylase et par l'absence de la cinnamate-4-hydroxylase. Cet ensemble de donndes suggdre la coopdration de diffdrents organites dans l'dlaboration de polyphdnols souvent identifidsdans le chloroplaste (esterset flavonoides) qui ddrivent pour la plupart de l'acidep-coumarique. REFERENCES 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

J. Tronchet, Ann. Sci. Univ. Besancon Bot., 10 (1971) 23. M. Tissut, C.R. Acad. Sci. Paris, 268 (1969) 65. P. Delaveau et R.R. Paris, C.R. Acad. Sci. Paris, 269 (1969) 1074. B. Monties, Bull. Soc. Ft. Physiol. Veg., 15 (1969) 29. G. Weissenbock, Bet. Dtsch. Bot. Ges., 86 (1973) 351. J.A. Saunders et W. Mac Clure, Phytochemistry, 15 (1976) 809. G. Weissenbock et V. Schneider, Z. Pflanzenphysiol., 72 (1974) 23. W. Ottmeier et A. Heupel, Z. Naturforsch., 27 (1972) 177. W. Ottmeier et A. Heupel, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem., 353 (1972) 135. R. Ranjeva, R. Faggion et A.M. Boudet, Physiol. Veg., 13 (1975) 725. P.S. Nobel, Methods Enzymol., XXXI (1974) 600. F. Durst, Thdse Doct. Sci., Strasbourg (1974). G.G. Gross, R.L. Mansell et M.H. Zenk, Biochem. Physiol. Pflanz., 168 (1975) 41. G. Alibert et R. Ranjeva, FEBS Lett., 19 (1971) 11. B. Gestetner et E.E. Corm, Arch. Biochem. Biophys., 163 (1974) 617. J.J. Macheix, Thdse Doct. Sci. Paris(1974). G. Alibert, G. Marigo et A. Boudet, Physiol. Veg., 7 (1969) 57. L. Reio, J. Chromatogr., 4 (1960) 458. D.I. Arnon, Plant Physiol., 24 (1949) 1. J. Bruinsma, Biochim. Biophys. Acta, 52 (1961) 576. T.G. Cooper et H. Beevers, J. Biol. Chem., 241 (1969) 3507. G.K.M. Rathnam et G.E. Edwards, Plant Cell Physiol., 17 (1976) 172.

234 23 H.A. Stafford, Annu. Rev. Plant Physiol., 25 (1974) 459. 24 P.M. Boudet, G. Alibert et R. Ranjeva, XIIe Congr& Inter. Bot., IAningrad (1975). 25 G. Weissenbock, A. Plesser et K. Trinks, Ber. Dtsch. Bot. Ges., 89 (1976) 457. 26 J.A. Saunders et W. Mac Clure, Phytochemistry, 14 (1975) 1285. 27 W. LSffelhardt, B. Ludwig et H. Kindl, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem., 354 (1973) 1006. 28 B. Monties, Th~se Doct. Sci., Paris (1975). 29 H. Kindl, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem., 352 (1971) 78. 30 R. Ranjeva et R. Faggion, Physiol. Veg., 13 (1975) 735. 31 S.A. Brown, Biosynthesis of coumarins, in G. Billek (Ed.), Biosynthesis of Aromatic Compounds, Vol. 9, Pergamon Press, Oxford, 1966, p. 15. 32 D.S. Dhillon et S.A. Brown, Arch. Biochem. Biophys., 177 (1976) 74. 33 W. I ~ f f e l h a r d t et H. Kindl, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem., 356 (1975) 487. 34 H. Kindl et M. Ruis, Phytochemistry, 10 (1971) 2633. 35 G. Alibert, R. Ranjeva et A. Boudet, Biochim. Biophys. Acta, 279 (1972) 282. 36 U. Czichi et H. Kindl, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem., 356 (1975) 475. 37 D.W. Russel et E.E. Conn, Arch. Biochem. Biophys., 122 (1967) 256. 38 U. Czichi et H. Kindl, Planta, 125 (1975) 115. 39 G. Weissenbock, Nova Acta Leopold., 7 (Suppl.) (1976) 97. 40 R. Ranjeva, G. Alibert et A.M. Boudet, Plant Sci. Lett., 10 (1977) 235.