Méthodes photométriques de dosage du cholestérol dans le sérum

CLINICA

MPTHODES

CHIMICA

389

ACTA

PHOTOMl?TRIQUES DE DOSAGE DANS LE Sl?RUM*

DU CHOLESTGROL

G. VANZETTI

Laboratoire de Biochiwzie Ospedale

Maggiore

(Rep

di Milano

le II juillet,

(Italie)

1963)

SUMMARY

PHOTOMETRIC

METHODS

OF CHOLESTEROL

DETERMKNATION

IN SERUM

Recent developments concerning the methods for the determination of serum cholesterol arc reviewed, and a classification cf the principal photometric methcds is given. Methods in which the digitonide cf cholesterol is isolated, and methods based on the saponification cf serum lipids followed by extraction of cholesterol are mostly reliable: several of them may be recommended as standard or reference methods for total serum cholesterol. Methods in which the colour reagent is added directly to serum, or to an unsaponified serum extract, are subject to the interference of bilirubin and of other aspecific chromogens, and may be influenced by the difference in the chromogenic activity of cholesterol and of its esters. In order to assist the analyst in his choice, an evaluation of the principal methods for serum cholesterol is attempted. Methods for the determination of cholesterol fractions are also briefly reviewed, and the usefulness of heparin as a reagent for the separation of cc- a.nd &lipoproteins and for the determination of GZ-and ~-lipoprotein cholesterol is confirmed.

Au tours des dernieres an&es le probleme du dosage du cholesterol et de ses fractions a Pti: I’objet de plusieurs revues d’ensemblel-‘, dans lesquelles on a essay& de comparer et d’evaluer les methodes les plus importantes et leurs modifications. 11 s’agit cependant d’un probleme qui n’est pas encore resclu sur le plan pratique. Au tours d’une recente enquete, nous avons constate que dans 130 laboratoires italiens d’analyses cliniques on n’employ~t pas moins de 27 methodes diffkrentes pour la determination de la cholesterolernie. On est done t&s loin d’une standardisation des methodes, et cependant une standardisation serait bien souhaitable. Dans le present rapport, on n’a pas essay6 de donner une analyse complete des methodes de dosage du cholesterol et de ses fractions. Ce but ne serait pas facile a atteindre: deja en 1935 les travaux methodologiques sur le dosage du cholestGol8 * Confkence tenue B la 6&me AssemblBe G&&ale de la Sock%6 Suisse de Chimie Clinique (Gen&ve, rz-~3 mai 1962). Le texte a BtB cornpI& en tenant compte des contributions les plus rkentes. Clirc. Chim. Acta,

IO

(1964)38g-405

G. VANZETTI

390

avaient d&pas& le nombre de 150, et aujourd’hui leur nombre est de plusieurs centaines. Notre but principal est de faciliter aux analystes le choix des mkthodes les plus simples et les plus sp&ifiques, en tenant compte des travaux ¢s et des exigences pratiques du laboratoire. Certains aspects des mkthodes de dosage, tels que l’extraction et la saponification des lipides du &rum ont CtC discut6s a fond dans les revues pr&dentes et ne seront pas consid&& ici. Le probEme du dosage du cholest&ol total sera envisa@ en dktail; le dosage des fractions les plus importantes du cholest&ol sera trait& plus br&vement. Seules les mCthodes photomCtriques ont Cti: consid&+es. Une Cvaluation critique des mCthodes est souvent difficile, car les travaux qui permettent de comparer les diff& rentes mkthodes ne sont pas nombreuxs-12. RfiACTIONS

COLORtiES DU CHOLESTl?ROL

Dans le Tableau I on trouve une liste des &actions les, plus importantes qui ont Ct6 employ6es jusqu’ici pour le dosage photomCtrique du cholest6r0113-21: une liste plus cornpEte des r&actions colorCes du cholestQo1 a &ti: compilCe par KRITCHEVSKY 5. TABLEAU PRINCIPALES

RtiACTIONS

COLORtiES

POUR

LE

DOSAGE

DU

CHOLkSTEROL

Re’actifs

Auteurs Anhydride

I. LIEBERMANN~~.

et acide et

acCtique

Chloroforme

et BuRcHARD'~

2. PEARSON

I

EMPLOYtiES

~011.~~

Acide

melange

d’anhydride

Verte

acCtique

sulfurique

et acide

Chlorure

en

solution

Verte

acC-

sulfurique

d’acCtyle

et

sels

de

zinc

en

solution Rouge

acCtique Chlorure

4. TRINDER”

de’ueloppe’e

sulfurique

paratolu&esulfonique

tique

3. TSCHUGAEFF’~

+

Couleur

et acide

d’acCtyle,

dichloro6thane

et

Rouge

acide

sulfurique 5. ZLATKIS,

ZAK

ET BOYLE~~

Chlorure

ferrique,

acide

acCtique

et

acide

Rouge

sul-

furique 6. CARPENTER

et ~011.~~

TrichloroCthane,

anhydride

acktiquc

et

acide

Verte

aclde

Rouge

sulfu-

Rouge

sulfurique

7. BROWNIE

Chlorure

d’acCtyle,

dichloroithane

et

perchlorique 8. SEARCY

ET BERGQUIST~~

Sulfate

ferreux,

acide

acCtique

et

acide

rique

La &action de PEARSON de la r&action de LIEBERMANN

et ~011,

mention&e

ET BURCHARD,

de SEARCY ET BERGQUIST est une variante

dans notrc tableau

tandis

que la r&action

de la rkaction

de ZLATKIS

est une variante au sulfate

ferreux

au chlorure du sulfate ferreux et toll.

ferrique, car selon toute vraisemblance, le pouvcir chromoghne est 1iC & la prCsence d’une certaine quantitC d’ions ferriquesa2. On peut aussi rappeler que les ions Fe +++ de la r&action de ZLATKIS et cdl. peuvent &tre substituCs par d’autres ions mktalliques, par exemple par les ions Co--’ (TORRES~~)

et par les ions Cu++ et Hg+

La r&action cependant

de CARPENTER

elle donne une couleur

(ZAK ET EPSTEIN

et ~011.~~ a

verte

&A propos6e

qui est semblable

s4).

comme

&action

fluorescente,

B celle donnCe par la r&action

391

CHOLESTfiROL DANS LE S&RUM-PHOTOMtiTRIE

LIEBERMANN ET BTJRCHARD: la lecture au ~uorim~tre est plus sensible que la lecture au photometre. On peut partager les reactions color&s du Tableau I en deux groupes: celles qui provoquent la formation d’un corps “vert” et celles qui provoquent la formation d’un corps “rouge”. Les reactions caracterisees par une couleur rouge ont en gkkral une sensibiliti! plus ClevCe et donnent une extinction optique 5-8 fois plus intense que les reactions caractbisees par une couleur verte. D’aprits les recherches de LANGE et ses ~011.25, de DULOU et ses coKz6, de BRIESKORN ET CAPUANO w et d’autres auteurs encore, le mtkanisme probable de la reaction de LIEBERMANN ET BURCHARD (secaracterisant par la formation d’un corps “vert”) *, et de la reaction de SALKOWSKI (secaracterisant par la formation d’un corps “rouge”) est le suivant : deshydratation du cholest&roI avec formation dun cholestadiene avec doubles liaisons conjuguees, dim~risation h bis-cholestadi~ne, sulfonation avec formation d’un acide monosulfonique ou disulfonique et formation des corps “halochromiques” respectifs; la coloration “verte” serait due a l’acide bis-cholestadienylmonosulfonique; la coloration “rouge” serait due a l’acide bis-cholestadi~nyldisulfonique (voir le schema de la Fig. I).

de

Cholest&ol (z mol.)

4

Bis-cholestadi&ne

Acide his-cho~estadi~u~ldisulfonique ComposB halochromique (&action “rouge”)

Acide bis-cholestadi~ny~monosulfonique Compo& halochromique (r&ction “verte”) Fig.

I.

Probable

mtcanisme des &actions “verte”) et de SALKOWSXI

de (a

LIEBER~~~N-~URCHA~D droite, r&action “rouge“).

(& gauche,

reaction

I1 est possible que les mecanismes mentionnes dans la Fig. I soient valables aussi pour les autres reactions du Tableau I. Malheureusement, les reactions chimiques indiquees dans la Fig. I ne peuvent pas en general &tre consider&es comme “quantitatives”: elIes ne s’arretent pas a la formation des corps halochromiques, mais elles evoluent en donnant lieu B la formation d’autres corps; les couleurs obtenues sont souvent peu stables. On doit aussi souligner que les reactions utilisees pour le dosage du cholesterol ne sont pas specifiques: il s’agit de reactions “de groupe” qui peuvent Ctre Cgalement donnees par d’autres sterols de structure analogue et par d’autres substances. Enfin, la reactivite et le pouvoir chromogene des esters du cholesterol different souvent de ceux du cholesterol non ester-if% __--

_

* Dans la rkaction de LIEBERMANN ET BXJRCHARD, par des colorations rouges et violettes transitoires.

la

coloration

“v&e”

finale est pr6c8d&!

(‘/in. (‘kiwi. Acta, IO (1964) 389-405

G. VANZETTI

392 Pour un dosage fication

exact

du cholesterol

des esters et de l’elimination

ple de la bilirubine.

total,

Ces buts peuvent

(a) par la saponification

bien l’utilite

qui peuvent

de la saponi-

interferer,

par exem-

Ctre atteints:

des lipides

(b) par la precipitation

on comprend

des substances

et l’extraction

du cholesterol

avec

du residu

la digitonine

ncn saponifiable;

et l’isolement

du digi-

tonide. PURETE DES REACTIFS 11 s’agit neglige.

d’un

problbme

Je me bornerai

ploy6 comme

qui a une importance

a rappeler

deux

points:

standard,

et celui de la purification

que

la plupart

fondamentale,

et qui est souvent

celui de la purete de l’acide

du cholesterol

acetique

em-

dans les methodes

au FeCl,. On sait contamine

dans

par le cholestanol

et par des traces

de 7-dehydrocholesterol

qui est un produit RADIN

d’oxydation

ET GRAMZA~~ ont Ctabli

du cholesterol.

dans

des capillaires

evacues

tions

les plus pures

est d’environ

moleculaire

Ces criteres

du cholesterol

de CARR ET DREKTER)

commerciales,

le cholesterol

par le lathosterol

est

ou cholestenol

(BLADON “) et aussi par le 7-ketocholesterol,

du cholesterol.

tions

THAL

des preparations

ou dihydrocholesterol,

des criteres

comprennent

(apres

pour

recrystallisation,

le pcint

149.5”-151.8”),

avec la reaction

la purete

du chlorure

de l’absorption

de fusion

de fusion

des prepara-

de l’absorptivite

ET BURCHARD

ferrique

optique

des prepara-

du pcint

la determination

de LIEBERMANN

et avec la reaction

et COZL.~~), et la determination

&valuer

la determination

(technique

(technique

de ROSEN-

a 235 rnp pour l’evaluation

du 7-ketocholesterol. En employant parations

ces critkes,

commerciales

par differentes produits

methodes.

recrystallises

la methode

a l’acide

recrystallids)

n’etait

Le probleme aujourd’hui

sterols.

L’importance

pondant

La purete

anhydride merciales

les resultats

au dibromure

(BLADON~).

La

les differentes

les plus satisfaisants (methode

pureti:

pre-

apres recrystallisation avec

recommandee)

des produits

les

et par

originaux

(non

pas suffisante. par

les

du cholesterol techniques bien

employ6

modernes

de la disponibilite

de l’acide au chlorure

acetique ferrique.

MOORE ET BoYLE~~.

moindres

traces

d’impuretes;

chromique30 de l’acide

bles d’impuretes, cipale

acetique

obtenus

comme de

commerciale

definies

la d’un

est Cvidente,

standard

pourrait

gas-chromatographie produit

standard

et on doit

etre des

pur re-

souhaiter

qu’il

surtout

pour

realise.

les methodes et par

11s ont obtenu

a des caracteristiques

soit bientot

ET GRAMZA ont compare et les produits

par la methode

de la pureti:

aborde

RADIN

du cholestercl

est l’acide

Les

acetique

glyoxylique,

methodes

l’acide

ou apres

qui peuvent

est aussi d’une Ce sujet

pour

analyse

donner

Le Tableau

doit

avec

importance, ferrique

sensibles

apres

refluxe

Les preparations

toujours

aux sur com-

variaprindu s&urn.

des quantites

tres remarquables:

avec le tryptophane

ET RALSTON~~

sont

&tre redistill6

K,Cr,O,“l.

contiennent

des erreurs

qui reagit

METHODES PHOTOMETRIQUES

au chlorure

acetique

traitement

grande

a CtC CtudiC par MCINTYRE

l’impurete

des proteines

DE DOSAGE DU CHOLESTEROL TOTAL

II donne une classification

schematique

des methodes

photometriques

C&n. Chim. Acta, IO (1964) 389-405

CHOLESTfiROL

DANS LE SfiRUM -- PHOTOMIkRIE TABLEAU

CLASSEMENT

Phases principales de l’analyse

393

II

SCHhMATIQUE DES MkTHODES POUR LE DOSAGE PHOTOMkTRIQUE DU CHOLESTI?ROL DANS LE &RUM

Me’thodes

Souvces

Remarques

d’erreurs

--

___-

A. Extraction Saponification

I. SCH~NHEIMER

Techniques rieuses

B. Saponification Extraction

I. TRINDER" 2. _&BELL et COll.s6 3. ANDERSON ET KEYS~’ 4. MANNER

InstabilitC de couleur finale (B 2 et B 3)

la

MBthodes standard pour le dosage du cholestdrol total

I. BLOOR~~ 2. SACKETT~O 3. CARR ET DRKKTER~~ 4. I,EFFLER~~

DiffCrences entre le pouvoir chromog&ne du cholesterol et celui de ses esters. PrCsence de chromog6nes aspecifiques? (C 1 et c 2)

La mkthode C3 donne des rbsultats correspondants aux mkthodes standard. Les autres methodes donnent des rkultats 61evBs (C I et C 2) ou demandent d’ult6rieurs contrbles

I. ZLATKIS et ~011.~~ 2. PEARSON et ~011.'~ 3. WATSON~~ 4. HUANG et ~011.~~

M&mes sources d’erreurs (cf. C)

Les mkthodes au chlorure ferrique (D I) donnent des valeurs ClevCes. Les autres mkthodes (D 2 - D 3 - D 4) demandent d’ulterieurs contrBles _~_ ____

ET SPERRY~~ Isolation du digi- ~.SPERRYETWEBB~~ tonide ~.COLMAN ETMCPHEE~~ RCaction colorke 4. BROWNIE

RCaction color& C. Extraction R6action

color&e

D. RBaction color& (mithodes “directes" sur le &rum)

labo-

MBthodes de rCfCrence pour le dosage du cholest&-ol total et du cholestkrol non estCrifi6 (A I et A 2)

de dcsage du cholestkrol 32--44.En se basant sur les principaux on peut distinguer 4 groupes principaux de mkthodes. Groupe I. M&odes

“temps”

des analyses,

caracttkisbes par l’isolement dzt digitonide

Les mkthodes de ce groupe (mkthodes “A 4 temps”) demandent l’isolement du digitonide aprks l’extraction et la saponification des lipides; la rkaction colorke est le dernier stade du dosage. Ces mkthodes sont considkrtes comme spkcifiques du cholest&o1 et jouent un rBle fondamental comme mkthodes de rkfkrence, mais elles sont relativement laborieuses (elles demandent en gCnCra1 plusieurs centrifugations) et ne conviennent pas comme mkthodes de routine. Presque toutes les mkthodes k 4 temps se basent sur la rkaction de LIEBERMANN ET BURCHARD. La mkthode classique est celle de SCH~NHEIMER ET SPERRY~~, qui a CtC simplifiCe et perfectionnke par SPERRY ET WEBB 33. Dans les dernihes an&es on a dCcrit

plusieurs

COLMAN

ET MCPHEE~~

ET J.~MEs~~ du

digitonide

mt3hodes

et la m&hode est obtenu

modifikes;

et de FERRO de par

je

rappellerai

ET HAM

BROWNIE. filtration

parmi

46, le dcuxi6me

Dans et non

cette pas,

derni&re

comme

elles

les

pro&d6

mkthodes

mhthode,

d’habitude,

de

de BILLIMORIA l’isolement par

centrifu-

gation. Le digitonide le composant

On a employ6 ou par

peut

glycidique

la tomatine

aussi

&tre aussi

dCtermini:

de la digitonide la pr&ipitation

(SCHULZ

ET SANDER,

par

une m&hode

?I l’anthrone,

en dosant

47--49. par

le sulfate

51 KABARA~~).

de pyridinium La

tomatine

(SOBEL

et c~ll.~~)

est un

alcaloi’de

des tomates qui forme avec le cholesttkol un complexe encore moins soluble que le digitonide; elle serait douke d’une spCcificitC remarquable. Une mkthode de determination du cholesterol total et du cholestkrol non estCrifiC baske sur l’isolement du Clin. Chim. Acta, IO (1964) 389-405

394

G. VANZETTI

tomatinide a et& d&rite par KABARA ‘. Si l’experience confirmera la validite et les avantages des methodes recentes, elles pourront peut-Ctre remplacer les methodes classiques comme methodes de reference. Groupe II. M&hodes baskes SW la saponification insaponi$able

des lipides et SW l’extraction du rt%idzc

Les methodes de ce groupe se basent sur la saponification du serum suivie par l’extraction du cholesterol avec l’ether de petrole ou avec un autre solvent convenable; on evapore une partie de l’extrait et on execute la reaction coloree sur l’extrait sec. M&me sans l’isolement du digitonide, ces methodes peuvent &tre considerees comme specifiques pour le cholesterol puisque la saponification suivie par l’extraction du residu insaponifiable permet de realiser une purification poussee. En effet ABELL et ~011.~~ont montri: par la methcde de la distribution a contre courant qu’au moins 99% du residu insaponifiable extrait avec l’ether de p&role est constitue par le cholesterol. Les contrbles effectues par de nombreux auteurs ont montre que la methcde d’ABELL et c011.~~,ainsi que la variante d’ANDERSoN ET KEYS~’ donnent des valeurs concordantes avec celles fournies par les methodes de reference & la digitonine (SCH~NHEIMER ET SPERRY et SPERRY ET WEBB). Les methodes d’ABELL et ses ~011. et ~‘ANDERSON ET KEYS sent assez simples, leur mise au point est facile et elles se pretent t&s bien a l’usage courant. Cependant il y a une difficult&, qui concerne la stabilite insuffisante de la couleur obtenue par la reaction finale selon LIEBERMANN ET BURCHrZRD.D’apres ABELL et ses ~011.la coloration finale atteint son maximum et reste stable entre la so&me et la 35erne minute; ceci n’est pas toujours vrai, puisque le maximum d’intensite de la couleur est atteint dans des delais differents selon les serums. Pour eviter cette source d’erreur, ANDERSON ET KEYS conseillent de lire l’extinction optique au bout de 20 min et de r&peter la lecture a des intervalles de 5 min, en retenant le maximum de l’extinction atteinte. La reaction de LIEBERMANN ET BURCHARD peut Ctre remplacee par d’autres reactions qui donnent des couleurs plus stables. TRINDER” a utilise dans ce but la reaction au chlorure d’acetyle et au dichloroethane, MANNERla reaction au chlorure ferrique, ROSE et ses ~011.~”et HANEL ET DAMONdes reactifs du type TSCHUGAEFF, JURAND ET ALBERT-RECHT~~ ont fait reagir un melange d’acide acetique et d’acide sulfurique sur l’extrait redissous dans l’ethanol. Appliquees aux extraits obtenus apres saponification des lipides, ces reactions peuvent donner des result&s satisfaisants. D’apres notre experience, la reaction de ZLATKIS et ~011.au chlorure ferrique est d’une execution assez delicate. Elle est accompagnee d’une forte augmentation de la temperature, indispensable pour le developpement de la couleur; de faibles modifications de techniques suffisent pour modifier la vitesse de la reaction et la temperature atteinte, et si la technique n’est pas trb rigoureuse, les valeurs de l’extinction optique ne sont pas parfaitement reproductibles. Des observations semblables ont itte faites par FURST ET LANGE~~. La reaction de TRINDER et celle de TSCHUGAEFF ont d’autres inconvenients: la premiere a cause de la volatilite et de l’instabilite du chlorure d’acetyle et de la toxicite du dichloroethane, la deuxieme a cause de l’extreme sensibilite a toute trace d’eau et de la haute viscosite de la solution de chlorure de zinc. Cl%. Chinz.Acta, IO (1964)389-405

CHOLESTdROL DANS LE STRUM-PHOTOM~TRIE

395

A notre avis, c’est la reaction de LIEBERMANN ET BURCHARD qui merite encore d’etre preferee. Dans notre laboratoire, nous avons adopteb7 une variante de la methode d’ARELr. et ~011.Nous employons pour la reaction finale un reactif du type LIEBERMANN-BURCHARD stabilid par le sulfate de sodium44, qui donne une couleur stable et des r&&tats t&s bien reproductibles. ~~o~p~ III.

~~t~od~s bas&

sw ~‘~xtr~~t~o~ des ~~p~~es(sm.9 s~p~~~~~~~t~o~~

Les methodes de ce groupe se basent sur l’extraction des lipides du serum, aussitot suivie par la reaction coloree finale. Les reactions le plus souvent employees pour le developpement de la couleur sont la reaction de LIEBERMANN ET BURCHARD et la reaction au chlorure ferrique. On doit considerer deux importantes sources d’erreur: (a) Le pouvoir chromogene des esters du cholesterol contenus dans l’extrait lipidique differe souvent de celui du cholesterol non esterifie5*. (b) Les estraits lipidiques non saponities du serum contiennent des chromogenes autres que le cholesterol, capables de reagir avec les reactifs habituellement utilises, ou bien des substances capables d’intensifier ou peut-Ctre aussi de diminuer le developpement de la couleur. L’importance de ces sources d’erreur est demontree par les recherches de BROWN et de COHEN et ses ~011.BROWNS a fait reagir des reactifs differents (un reactif au chlorure ferrique, un reactif du type TSCHUGAEFF et un reactif B l’acide perchlorique et au chlorure d’acetyle) sur les extraits lipidiques non saponifies du serum: ii a obtenu pour la cholest~rol~mie des valeurs nettement plus Clevees que celles obtenues avec la methode de reference. En faisant reagir les memes reactifs sur des extraits obtenus apres saponification des lipides il a obtenu par contre des resultats concordants avec ceux donnes par la methode de reference. COHEN et ses ~011.~~ont s&pare par la chromatographie sur oxyde d’aluminium les esters du cholesterol et le cholesterol libre contenus dans l’extrait lipidique du serum; en omettant la saponification, ils ont obtenu des valeurs nettement en exces pour le cholesterol total, et des valeurs nettement reduites (jusqu’B 507; en moins) pour les esters du cholesterol. On sait que dans plusieurs methodes couramment employees pour la determination du cholesterol (BLooR~~, SACKETT~~, IRELAND~O, HOBSON et COU.~‘,etc.) la reaction de LIEBERMANN ET BuRCH.~RDest faite sur l’extrait chloroformique non saponitie du serum. Avec cette reaction les esters du cholesterol donnent une couleur plus intense (jusqu’a 30% en plus) de la couleur don&e par le cholesterol en concentration equivalente. Avec les methodes citCes on obtient pour la cholest~rol~mie totale des valeurs en exces de IO a 20% par rapport aux methodes de reference, comme il a et& montre par de nombreuses recherches de cantrole. Avec d’autres reactions, comme la reaction de LIEBERMANN ET BURCHARD en milieu acetique, la r&action de ZLATKIS et ses ~011.au chlorure acetique, la reaction de SEARCY ET BERGQUIST au sulfate ferreux et les reactions du type PEARSON et ses toll., le cholesterol et ses esters en concentrations equivalentes donnent, d’apres la plupart des auteurs, une m&me extinction optique. Cependant KURZWEG ET ~ASSMANN 68,en contr~lant ces reactions (m~thodes originales, ou methodes modifiees *3+@29 68) ont trouve des differences marquees entre le CJin. Chim.

Ada,

IO (1964)

$39.405

396

G. VANZETTI

pouvoir chromogbne du cholestercl et celui de ses esters, surtout de l’oleate de cholesteryle qui a don& des chiffres d’extinction reduites. Parmi les methodes de ce groupe il y en a une qui donne des resultats en accord avec les methodes de reference: il s’agit de la methode de CARR ET DREKTER’~, qui se base sur la reaction de LIEBERMANN ET BURCHARD en milieu acetique. Avec cette methode le pouvoir chromogene des esters du cholesterol est equivalent a celui du cholesterol non esterifie, et les resultats obtenus pour le cholesterol total s’accordent bien avec ceux fournis par la methode de SCH~NHEIMER ET SPERRY; la validite des resultats a CtC confirm&e par HOLLINGER et ses ~011.~~. D’apres notre experience aussi, la methode de CARR ET DREKTER donne des resultats satisfaisants; mais puisque son execution est assez delicate et puisqu’elle demande la preparation d’un “blanc” sur le serum, elle ne presente pas, a notre avis, des avantages substantiels sur la methcde d’AnELr. et ~011. 11 y a d’autres methodes dans lesquelles la reaction color&e se fait directement sur l’extrait lipidique total du serum: par exemple la methode de SOLS~~,qui extrait le serum a chaud avec l’acide acetique, la methode de LEFFLER~~ qui emploie comme solvant l’alcocl isopropylique, la methode de BOWMAN ET WOLFER dans laquelle le solvant est l’alcool etylique et les methodes de KLUNGSOYR et ~011.~~et de BABSON et ~011.~~qui emploient un melange I : I d’ethanol et d’acetate d’ethyle. Dans les methodes de LEFFLER et de BOWMAN ET WOLF, l’interference de la bilirubine est fortement reduite, puisqu’elle est precipitee en grande partie avec les proteines; dans la methode de BABSON et toll., la bilirubine est Climinee par absorption sur hydroxide d’alumine. BABSON et ~011.ont trouve, avec leur methode au chlorure ferrique, des valeurs de la cholesterolernie qui ittaient assez proches des valeurs obtenues par la methode d’ABELL et toll. (+ 1.3% en moyenne). Des controles ulterieurs pourront confirmer la valeur de cette methode, qui se prete bien a la determination fraction&e du cholesterol esterifie et non esterifie a c6tC du cholesterol total du serum. Groupe IV. Mtfthodes de ditermination

“diirecte” dzt cholestkrol dans le s&rum

Les methodes de ce groupe sont techniquement simples, mais elles sont exposees aux sources d’erreur deja indiquees pour les methodes du groupe precedent. On peut subdiviser ce groupe selon la reaction finale adoptee. I. Le premier groupe de “methodes directes” utilise comme reactif chromogene un reactif au chlorure ferrique (methode de ZLATKIS, ZAK ET BoYLE’~). 11 s’agit d’une methode tres simple, qui est cependant sujette a plusieurs sources d’erreur. La plupart des auteurs qui l’ont comparee avec une methode de reference a obtenu des resultats trop eleves, allant parfois jusqu’a + 60% (voir BROWNO). HOLLINGER dit que le reactif au chlorure ferrique de ZLATKIS “reacts with so many agents in blood serum as to preclude specificity for cholesterol”. ZAK lui-m&me a publie en collaboration avec EPSTEIN~~ une modification de la methode dans laquelle le cholesterol est prealablement extrait par un solvant organique. Cependant la methode directe au chlorure ferrique jouit encore aujourd’hui d’une popularite remarquable chez les analystes, et il y a des auteurs qui ont obtenu par elle des valeurs tout a fait comparables aux valeurs obtenues par la methode de ABELL et ~011. Une source d’erreur trits importante est constituee par les impuretes des reactifs employ& et surtout de l’acide acetique (voir page 392). M&me si l’on emploie de l’acide Clilz.Chinz.Acta, IO (1964)389-405

CHOLESTI?ROLDANS LE StiRUM - PHOTOM~TRIR acetique redistill& sur anhydride chromique ou sur K,Cr,O,,

397

la methode dire&e de

ZLATKIS et COG.est exposee ZIl’interference de l’hemoglobine, des bromures, du lathosterol et du desmosterol, et bien qu’en mesure moindre que la methode de LIEBERMANN ET BURCHARD, aussi de la bilirubine: l’activite chromogene de I rng% de bilirubine Bquivaut B celle de I.4 rng% de cholesterol. Encore, ii s’agit d’une methode delicate, puisque de moindres imperfections de technique peuvent conduire ?i des resuftats &eves et ma1 reproductibles. D’apres notre experience, la methcde dire&e au chlorure ferrique est souvent difhcile a contrbler et ne peut pas &tre recommandee comme methode standard pour la determination du cholesterol dam Ie serum. On peut obtenir des resultats meilleurs si les proteines sont precipitees prealablement par une solution acetique de chlorure ferrique (ZAK~~, HENLY~~). Cependant, d’apres notre experience, mPme dans ce cas il est souvent difficile d’obtenir une reproductibilite satisfaisante. 2. Dans un deuxieme

groupe de “m&hades

directes”,

on emploie des acides

arylsulfoniques dissous dans l’acide acetique (methcde a l’acide toluenesuffonique de PEARSON et c01l.r~~methcde B I’acide dimethylbenzenesulfonique de WATSONEJ, methode a l’acide sulfosalicylique de RAPPAPORT ET EICHHORN~~~‘l. La methode de PEARSON et ~011.est la plus connue : elle a Cti! adapt&e par Bov~~ 5.1'Autoanalyzer. Les reactifs employ&s dans ces methodes sont plus stables que les reactifs COUrants du type LIEBERMANN ET BURCHARD; l’acide sulfurique est ajoutk j part et son adjonction est ac~ornpa~~e d’un intense degagement de chaleur. D’apres la plupart des auteurs, on doit preparer un “blanc” pour chaque serum examink. PEARSON et coZi.15,de m&me que RAPPAPORT ET EICHWORN~~~~~ p&parent le “blanc” en diluant le serum avec la solution acetique d’acide toluenesulfonique ou, respectivement, d’acide sulfosalicylique, sans ajouter l’acide sulfurique. Avec les serums icteriques, WATSON a obtenu par le procede de PRARSON et cold des resultats errones: pour compenser I’erreur due & la bilirubine, WATSON la transforme en biliverdine en traitant le “blanc” avec une solution d’eau oxygenee, sans ajouter l’acide sulfurique. D’aprbs WATSON, le “blanc” serait necessaire seulement pour les serums fortement pigment& (hyperbilirubin~miques ou hemolytiques). La methode de PEARSON et co& a cite control&e par plusieurs auteurs (BEST et WRIGHT et cc~lZ,~*) qui ont obtenu colLg, JOSEPHSON ET GYELLENSWAND 73,~%OKRIS~~, avec elle des valeurs plus hautes qu’avec les methodes de reference. Vis-B-vis de celles-ci, l’exces atteindrait 5 & 2096. MANNER aurait trouve, par contre, des valeurs &ales ou inferieures & celles de la m&bode d’ARELt, mais avec des oscillations asset larges. La &son de cette divergence n’est pas Claire. 3. Dans un troisieme groupe de m&hades “directes”,

on utilise des reactifs du

type LIEBERMANN ET BURCHARU. Les methodes “dire&es” proposees par FERRO ET HAM 46et par C1.4MPI74appartiennent a ce groupe. FERRO ET HAM ont constate euxmemes que leur methode “directe” fournit des chiffres d&passant de 15 8. 20% ceux obtenus aprbs saponification des lipides et isolement du digitonide. Une methode recente de ce groupe est la methode “directe” proposee par HUANG & c01i.~~en 1961: elle se fonde sur l’adjonction de 0.1 ml de serum a 5 ml d’un reactif du type LIE~ER~~~N~ ET BURCHAR~ stab%& avec sulfate de sodium. Cette methode a deux m&rites principaux: elle est trbs simple et elle donne tine C&n.Chim.Ada, 10 (1964) $39~405

398

6. VANZETTI

coloration assez stable. Nous avons obtenu avec elle pour les serums normaux des resultats peu differents (en moyenne legerement superieurs) de ceux de la methode d’ABRII., et co& Now avons trouve cependant que la methode de HUANC est sensible B la bilirubine (qui est transformee en biliverdine) et, tres vraisemblablement, & d’autres substances qui entrainent une augmentation de l’extinction67: cette augmentation est balande par une rPduction de l’extinction like a la presence d’eau dans le serum. En cas d’hyperbilirubinemie, la methode de HUANG et cell. fournit des Valeurs en exces (la preparation d’un “blanc” n’est pas prevue) : I mg de bilirubine Cquivaut en effet, comme pouvoir chromogene

B 5.5 rng% de cholesterol (lecture a

6x0 mp). En conclusion, a notre avis les methodes “directes” au chlorure ferrique doivent &tre abandonnees, tandis qu’il est difficile de donner un jugement definitif sur les methodes directes des deux autres groupes D’apres les resultats obtenus jusqu’ici il est probable que ces methodes ne soient pas tout a fait specifiques, cependant on pourra peut-etre leur reserver une place dans les laboratoires comme “methodes rapides” approximk. DOSAGE DIJ CWoLEST3?ROLESTERIFIk ET NON ESTERIFId Pour &parer le cholesterol esthifii: du cholesterol non esterifie (cholesterol dit “libre”) du serum on doit partir de l’extrait lipidique total et on peut employer deux methodes: la precipitation du cholesterol non estCrifiC avec la digitonine, ou bien la separation chromatographique du cholesterol et de ses esters. Comme “m&rode de reference” B la digitonine on peut accepter la methode de SPERRY ET WEBB, qui permet de doser le cholesterol non ester% Q c&d du cholesterol total. Dans cette methode on precipite le cholesterol non esterifiC avec une solution de digitonine, on isole le digitonide, on le fait reagir avec un reactif chromogene et on le dose au photometre: le cholesterol esterifiit est calcule par difference. Le m&me principe est utilise dans les methodes plus recentes de COLMAN ET McPHEE~*, de FERRY ET HAM*~ et de BILLIMORIA ET JAMES*~. Une methode simple a 6tC proposee r~cemment par BABSON et ses colLB7, qui ajoutent une petite quantiti: de digitonine (environ 7 mg) B l’extrait lipidique du serum (2s emploient comme solvant un melange I:I d’ethanol et d’adtate d’ethyle) et apres avoir eloigne le digitonide par centrifugation, dosent le cholesterol esterifie contenu dans le liquide surnageant. On peut aussi rappeler la methode de WEBSTER?~ qui extrait les lipides par l’ethano1 et l’ether de p&role; il precipite le di~tonide du cholesterol libre dans une fraction d’extrait, sCchCe et reprise par l’ethanol. Apres centrifugation du digitonide il dose, lui aussi, le cholesterol esterif% dans le surnageant. Les methodes chromatographiques de separation du cholesterol “libre” et esterifiC du serum ont 6th inaugurees par TRAPPE 78:plus recemment elles ant et& Ctudiees etadopteespar KERRETBAULD~~, ~~~WYCOFF~TP~RSONS~*,~~~K~~INETJA~SSEN '@et par d’autres auteurs; KERR ET BAULD ont employ6 la chromatographie sur alumine, les autres auteurs la chromatographie sur acide silicique. Par ces methodes on peut faire Ie dosage &pare et simultane du cholesterol esterifii: et non esterif& avec des r&&tats tout a fait satisfaisants,

CHOLESTkROL DANS LE StiRrIM - PHOTOMtiTRIE

399

DOSAGE Du CHOLESTEROL a- ET ~-LIP~PR~T~IQUE Les methodes et l’etude

les plus importantes

des lipoproteines

precipitation

ethanolique

les heparinoides

que I’on peut employer

l’electrophorese,

la

avec l’heparine

ou

a froid selon COHN, et le fractionnement

d’apres

BURSTEIN. III

TABLEAU CORRESPONDANCE

pour le fractionnement

du serum sont l’ultracentrifugation,

ENTRE

LES

FRACTIONS

OBTENUES

PAR

LfPOPROT~IQuES

DIFFtRENTES

PRINCIPALES

DU

&RUM

MkTHODES

Electrophortke sw @pier Lipoproteines & haut poids specifique (D > 1063) Fractions IV -)- V -+ VI

UltracentrifugationBO

~ra~tionnement dthanolique par la methode de COHN~‘,*~ Fractionnement p&s BURSTEIN SAMAILLE~~,

Lipoproteines B bas poids sptkifique (1006 < D < 1043) Fraction I + II I

Fraction pr&ipitabIe avec he’parine et MnCl,

Fraction non precipitable avec heparine et MnCl,

d’aET

84

Fraction non precipitable Fractionnement d’aavec heparine et phenol presSCANU et CO11.~5~~~

Dans fe Tableau equivalentes indiquees La serum

III on trouve des donnees relatives aux fractions

obtenues

par les differents

dans le tableau

des methodes

seulement

doit etre accept&e avec reserve,

au moyen

des solutions

fractions lipoproteiques. actuellement,

mais

de l’ultracentrifugation

salines

concentrees,

qui permet

un “rapport

fixk par les deux

au photodensitometre).

Cette methode

entre les lipides

differents

lipides pour le colorant

est sujette n’est

accessibles

seriques a et& executee des lipides contenus

cette methode fractions

” en fonction

lipoproteiques

a de nombreuses

le cholesterol

au lipidogramme

l’affinitedes des bandes

electrophoretique

la signification

contenu

dans les fractions

par l’electrophorese

les methodes

sources d’erreur;

au tours du lavage

d’une

des lipides (VERSCHURE 87). Pour obtenir des resultats

rees par l’ultracentrifugation,

de la

(lecture

lie aux lipides, etc.

on ne peut pas lui attribuer

bles, on peut determiner

a

dans

on obtient un “lipi-

pas stoechiometrique;

n’est pas la m&me;

Pour ces raisons, si I’on peut reconnajtre

seulement

du des

dont nous disposons qui sont

/?: TVlipoproteique

principales

et fes colorants

on peut avoir des pertes du colorant

va discuter

la predilution la “flottation”

coiiteuses,

sur les lipoproteines

On sait bien qu’avec

de calculer

la liaison

valeur orientative,

demande permettre

sur papier suivie par la coloration

les bandes electrophoretiques. du colorant

pour

des installations

Une grande partie des recherches

quantitative

des fractions

specialids.

l’aide de l’electrophorese

quantite

lipoprot~iques

en raison de la diversite

Elle est sans doute la meilleure methode

elle demande

aux instituts

dogramme”

procedes W--B~. L’equivalence

de fractionnement.

separation avec

Fractionprecipitableavec heparine et phenol

une

determination

quantitatifs

vala-

lipoproteiques

sepa-

ou par des agents

bashes sur les deux dernieres

chimiques.

mkthodes

On

de frac-

tionnement. Clin. Cl&n. Acta, 10 (1964) 389-405

G. VANZETTI

400

On a dkcrit plusieurs mkthodes de dosage du cholestkrol u- et @ipoprot&que sur les fractions skparkes par l’klectrophor&se. On peut rappeler les mkthodes moins rCcentes de NIKKIL;~~~et de BoYD~@, et celles plus rkentes de NWRV ET SMITHSO,de CRAWFORD~', ct de SEARCV et ~011.~~. Par un pro&d6 dCcrit par SEARCY et ~011.B3il est possible d’identifier les fractions lipoprotkiques en plongeant les bandes ~lectrophor~tiques dans une solution diluCe ~h~matoporphyxine et en les observant 2~la lumi&e ultraviolette. Les a- et les,&lipoprotkines apparaissent comme des bandes fluorescentes; on peut dkouper les bandes, extraire les Iipides par un solvant convenable, dessircher l’extrait de chaque bande et doser le cholestkrol par une rkaction colorke. Fractionnement

avec l’kthautol d basse tempkztwe

(mkthode de COHN et cell.)

Cette mkthode a &C largement employ&e surtout par Russ, EDER ET BARR~~; elleprksente ~inconv~nient de demander I’usage d’un bain rkfrig(tr& Une mkthode simplifike a &ir d&rite par ANDERSON ET E(EPs~'. Fractionlzement

avec l’h&arine

et les ht$%wilzofdes de synthtkse

Des mkthodes fond&es sur ce principe ont t?tk d&rites par BURSTEIN ET SAMAILLE et par SCANU et c011.~~-~~ : elles permettent d’Cloigner les @-lipoprotkines par prkipita-

tion avec le sulfate de dextrane et le chlorure de calciuma3, ou bien avec l’hilparine et le chlorure de manganPse 84ou avec l’hkparine et le phknolS5-8s. If s’agit de mPthodes extr~mement simples. Puisqu’il n’est pas facile de disposer d’un sulfate de dextrane avec des caract&istiques thimiques (degrtlt de sulfatation) et physico-chimiques (poids mokulaire moyen) vraiment constantes, les mkthodes B l’hkparine mkritent la prkfkrence. BURSTEIN ET SAMAILLE ont trouvC que le fractionnement B l’hkparine correspond trbs bien & celui obtenu avec l’Clectrophor&w. Nous-mCmes nous avons trouvC qu’il y a en &n&al un bon accord entre les rksultats de la mCthode Q l’hkparine et ceux obtenus apr&s skparation des lipoprot&nes j l’ultracentrifugeuse (VANZETTI ET GATTI~~). BURSTEIN et c~fl.~~~~~ ont combink la mCthode Q i'hkparineavec la mCthode de dosage du cholest&ol dans le s&rum d'apres PEARSON et coll.‘b Nous avons combin la mkthode B I’hCparine avec la mkthode d'ABEr.L et colt. en modifiant le pro&d&

d’extraction et la reaction colorke finale, de mani&re B obtenir pour le cholestkrol des cx-lipoprotkines une coloration stable et suffisamment intense. Nous avons obtenu par cette mkthode des rksultats fiddles ct tr6s bien reproductibles (VANZETTI ET GATTI~').

CONCLUSIONS

CTneCvaluation objective des mkthodes de dosage du cholestkol est difficile: on risque d’Ctre influence considkrablement par l’expkrience personnelle. A notre avis on peut cependant tir$r les conclusions suivantes. (I) Les mkthodes de dosage du cholestBro1 total basCes sur l’isolement du digitonide aprhs extraction et saponification des lipides sont encore B considirer comme les “mkthodes de rkfkrence” les plus fidPles: on peut donner la pr(lftirrenceB la mkthodc flitt. Chim.A&, IO (1964) 389-405

CHoIXSTfiROL DANS LE

&RUM

-

P~OTOM~~R~~

4or

d&ormais dassique de SPERRY ET WERB %3.on peut recommander la m&me m&hode pour le dosage de la fraction non est&ifi&e et de la fraction est&rif%e du cholesterol; dans le m&me but on’peut employer le fra~tiouneme~t

de f’extrait lipidique dn s&urn

par chromatographie. (2) Les m&thodes basPes sur Ia saponification

des lipides suivie par I’extraction

du cholestCro117~36-38sont simples et peuvent &tre rec~mmand~es ~omme methodes standard pour le cholesterol total. Les m&odes ~‘ABELX. et COEI.~~ et d’ANDERSoN ET KEYS 37, qui out &tC employees an COWS d’importantes enqu~tes inte~ationales, peuvent &re adopt&es comme “methodes de ref&ence” pour le cholest&roI total. Dans ces mCthodes on peut ameliorer la stabilite de la couleur finale en employant un r&&if chromogene stabilise par le sulfate de sodium. (3) Parmi les m&odes de dosage du cholesterol dans les extraits lipidiques non saponi~~s du sCrum, seulement la methode de CARR ET DREXTER 41donne avec certitude des r&&-tats s’accordant bien aux mkthodes de rCfCrence. D’autres mkthodes, y comprise la mkthode de BLOOR et ses variantes, donnent des r&uItats trop ClevPs; d’autres methodes encore demandent des contr6fes ultCrieurs. (4) Les methodes de dosage “directe”

dans le serum, bakes SW la reaction de

I,~~BE~M~NN ET BURCFIARD sont trb simples mais leur specificite n’a pas encore Ctk &montrke d’une facon convaincante. Les methodes “directes” fondles SIX la rkaction au chlorure ferrique ont don& & la plupart des auteurs des result&s trop &eves et ii ne semble pas possible de les recommander. (5) Pour le dosage fractionm? du cholest&oI 01-et ~-lipoprot~iq~e on peut recommander comme methode standard un pro&d& associant la precipitation hkparinique des @lipoprotCines selon BURSTEIN ET SAMAILLE et une variante de la methode ~‘ABELL eii cdl. (VANZETTI ET C?USFT~~~}. (6) On doit &re t&s exigeant dans La mise au point iniiiale des methodes. Une mCthode nouvelle doit &tre confront&e avec nne methode de rbftkence bien choisie: le contr8e doit comprendre un nombre su%sant de serums pathologiques (i&k-iques, hypercholest~rol~miques, hGmolytiques, etc.) & c&it des &rums normaux. L’interfkrence de la bilirubine pent etre CvaluCe Q I’aide d’une solution acqueuse, p&par&e en prCsence d’albumine BB. Dans les mkthodes qui se passe& de la Saponi~caiion des lipides on dcit toujcurs contralec si des solutions ~quimo~~culair~s du cholesterol et de ses dif%rents esters donnent un d~veloppement de couleur identique: le contr6le deit comprendre I’cl@atc de cholesteryle et, si possible, des esters d’acides gras poiyinsatur~s. On doit enfin &valuer statistiquement la pr@cision de la methode, Q l’aide de dosages rep&es, sur un nambre suf5sant de s&urns. En suivant ces regles, on pourra Ctre bien stir de la validite de la m&hode et des rCsultats.

402

G. VAIGETTI

On a passe en revue les methodes recentes de dosage du cholesterol et de ses fractions dans le serum, et on a don& une classification schematique des methodes photometriques les plus importantes. Les methodes qui se basent sur l’isolement du digitonide, et celles qui se basent sur la saponification des lipides suivie par l’extraction de l’insaponifiable, peuvent en g&&al &tre considerees specifiques, et peuvent &r-e employees comme “mirthodes de reference” ou comme methodes standard pour la determination du cholesterol total. Les methodes dans lesquelles le reactif chromogene est addition6 directement au&urn ou a l’extrait lipidique non saponifie du serum sont exposees & plusieurs sources d’erreurs (interference de la bilirubine et d’autres chromogenes aspecifiques, differente reactiVitC du cholesterol esterifie et non esterif%, etc.) et peuvent donner des Valeurs erronees. En se basant sur les don&es de la litterature et sur l’experience personnelle, on a essaye d’evaluer les methodes les plus importantes, dans le but de faciliter aux analystes le choix des methodes les plus simples et les plus specifiques. On a don& aussi un bref apercu des methodes de dosage des fractions du cholesterol et on a soul@6 l’utiliti: de I’heparine comme reactif pour la separation des alpha et des beta-lipoproteines et pour la determination du cholesterol alpha et betalipoproteique du serum. ADDENDUM (Rep le 16 septembre, 1964)

Parmi les nombreux travaux sur le dosage du cholesterol et de ses fractions qui ont paru apres la redaction de mon article, il y en a plusieurs que l’on doit rappeler brevement. I. CAWLEYet aLs7 ont d&it une methode gaz-chromatographique pour le dosage du cholesterol dans le serum, caracterisee par une deviation standard de 5% environ. 11s ont constate que la gaz-chromatographie permet de &parer le cholesterol des sterols de structure similaire (7-dehydrocholesterol et desmosterol). SCHMITET MATHER*~ont decrit r~cemment une methode gaz-chromatographique t&s exacte qui donne dans la quasi-totality des cas (sauf pour quelques serums hautement icteriques) des resultats quantitatifs qui coincident avec ceux obtenus par les methodes d’AnELI et cdl. et de SPERRY ET WEBB. 2. WEBSTER a decrit une nouvelle mitthode de fractionnement du cholesterol sur colonne d’aluminas9 et en outre il a constate loo-en contraste avec KURZWEG ET MASSMANN~~-que dans des conditions standard des quantites equivalentes d’esters de cholesterol et de cholesterol non esterifie ont un pouvoir chromogene Cgal vis-a-vis du chlorure ferrique. 3. GIRARD ET Assous ont observe que si la reaction au chlorure ferrique est obtenue par addition d’un melange d’acide acritique et d’acide sulfurique il n’y a pas de developpement de chaleur ; dans ces conditions le cholesterol non esterifie donne la reaction, tandis que les esters du cholesterol reagissent en mesure negligeable. En se basant sur cette observation, ces auteurs ont decrit une methode tres simple de dosage du cholesterol non esterifie, a c8tC du cholesterol total dans l’extrait lipidique du s¨o~ ou m@me directement dans le sCrumr% 103, sans skparation prealable des esters.

CROLESTEROL DANS LE SERUM - P~OTOM~TRIE 4. Le problbme et& l’objet

dune

du choix de m&odes

standard

Dans une resolution de reference”

conclusive

comme

“m&bodes

“methodes

de de TRAVERSE

de routine”

la mdthode

ET GIRARD~~~ et celle de ~~TsoN~~.

On sait que la methode methode

de de TRAVERSE el CO~Z.~~~, qui derive dune

classique de GRIGAUT~~*, est basee sur la reaction

CHARD pratiquee sur un extrait SERBME et coEl. comporte d’acetate ont

a recommande

dans le serum la methode

et ~011.107,et comme

a

de l’Ath~roscl~roselo4,

pour l’etude de l’Arterioscl&ose~O~.

la Societe Francaise

pour le dosage du cholesterol

et ~011.~06et celle de ~&&ME d’AssoUs

pour le dosage du cholesterol

Seance speciale tenue par la SociCti: Francaise

aussi bien que d’une Seance de la SociCte Italienne

403

d’ethyle,

saponifie des lipides du serum, tandis que la methode

l’extraction

des

suivie par la reaction

etC comparees

avec

revision de la

de LIEBERMA~N ET BUR-

la m&bode

lipides

avec

au chlorure

un

melange

ferrique,

d’ethanol

Ces deux

et

methodes

de SCHOENHEIMER ET SPERRY; I’accord

a 4th

.satisfaisantlo7s lo*. Au cows

de la reunion de la

on a souligne I’importance

SociCtCItalienne pour i’etude de 13Art~rioscl~rose,

d’une saponification

prealabie des lipides pour le dosage du

cholestCro1 total dans le serum. On a for-mule des recommandatio~s adopter,

sans pourtant

d’ailleurs

differentes

On ne saurait thodes

analytiques

serum,

dans

le but

arriver ;I un choix officiel. Les m&odes

des methodes

recommandees

fmir sans souhaiter pour la determination d’eviter

l’adoption

sur les methodes recommandees

a

sont

par la Societe Francaise.

une st~dardization du cholesterol de methodes

internationale et de ses fractions

standard

differentes

des medans le dans les

diff &rents pays. BlRI.IOGRAPHIE

1 F. CHEVALL-IER, AS%. N&Y. 2 B. ZAK ET N. RESSLER, Am.

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10 (X694)389-40s

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C. VANZETTI

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