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Clinica Chimico Acta, 67 (1976) 21-27 0 Elsevier Scientific Publishing Company,
Amsterdam
- Printed
in The Netherlands
CCA 7511
METHODISCHE UND ERSTE KLINISCHE UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE MIT EINEM NEUEN INDIREKTEN PANKREASFUNKTIONSTEST
W. BORNSCHEIN
a, F.L. GOLDMANN
a und M. OTTE b
a II. Medizinische
Klinik des Klinikums r.d. Isar der Technischen Universitci’t Miinchen, 8 Miinchen 80, Ismaningerstrasse 22 und b II. Medizinische Klinik dir Uniuersitiit Miinchen, 8 Miinchen 2, Ziemenstrasse (G. F. R.)
(Eingegangen
den 20. August
1975)
Summary The synthetic peptide N-benzoyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoic acid was tested in vitro and in vivo for its chymotrypsin specificity. Comparative kinetic tests with bovine chymotrypsin and human pancreatic juice, as well as clearance tests with p-aminobenzoic acid (PABA), made this peptide seem suitable for an indirect pancreatic-function test. A testing scheme was set up for clinical use which has yielded promising preliminary results. While in 31 out of 32 healthy subjects there were normal PABA excretion rates in the urine collected over six hours, the test correlated well in 15 out of 16 cases of definite pancreatic disorder. The percentage dose excretion of PABA in the urine collected over six hours gave good correlations with the one-hour amount of chymotrypsin in the pancreozymin-secretin-test and with the concentration of chymotrypsin in the feces. These preliminary results make this test appear an appropriate screening method for pancreatopathy.
Einfiihrung Es fehlt bislang in der Pankreasfunktionsdiagnostik, abgesehen von der fakalen Chymotrypsinbestimmung [ 1,121, an einer such in der Praxis leicht durchfiihrbaren Screening-Methode zur Priifung der Pankreasfunktion. Von Kaffarnik und Meyer-Berthenrath wurde 1970 ein indirekter Pankreasfunktionstest zur Priifung der Lipasesekretion angegeben [ 91. Die verwendeten Fluoreszeindiester wurden zwar im Duodenalsaft gespalten und das Fluoreszein konnte im Urin nachgewiesen werden, die Substrate erwiesen sich jedoch als nicht spezifisch fur die Pankreaslipase [6]. Zur lipolytischen Spaltung ist zudem Galle erforderlich, so dass die isolierte Priifung der Pankreasfunktion such aus diesem Grund nicht mijglich war. 1971 und 1972 wurde von Imondi und de Benne-
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ville erstmals ein indircktcr Pankreasfunktionstest zur Priifung der Proteasen angegeben I4,7]. Das synthetische Peptid N-Benzoyl-I_,-‘l’yrosyl-P-Aminobenzoesaure (N-BT-PABA) erwies sich im Tierversuch und in vitro als chymotrypsinspezifisch. Im Tierversuch konnte zwischen normaler Pankreasfunktion und experimentell erzeugter Pankreasi~suffizienz durch Unt~rbindung des Pankreasganges f 6 1 und nach Pro~inmang~ldi~t unte~~hieden werden ] 51. Wir haben versucht, methodische Fragen fiir den klinischen Versuch zu klaren und eine klinische Testanordnung zu entwickeln, die es such beim Patienten gestattet, zwischen normaler und eingeschrankter Pankreasfunktion zu unterscheiden. 1, Methodik
und Patientengut
Die Chymotrypsinbestimmung im Stuhl erfolgte nach Imondi et al f8]. Die Normwerte wurden nach Amann festgelegt ]I]. Die quantitative Fettbestimmung im Stuhl wurde nach der Methode von Tomaszewsky ausgefiihrt [15]. Der Pankreozymin-Sekretin-Test wurde nach Otte et al. durchgefiihrt [lo]. Chymotrypsin im Duodenalsaft wurde nach [ 21 bestimmt. Das Prinzip des indirekten Pankreasfunktionstestes besteht im Nachweis der PABA im Urin. Der Nachweis erfolgt im 6-Std. Urin, nach der beziiglich der Hydrolyse modifizierten Bratton-~larshall Reaktion (BM Reaction) f 31. Nach Tabor wird die PABA neben ~-Amino-Hippurs~ure (PAH) und NGlukuroniden such zu N-Acetyl-Derivaten metabolisiert [ 141. Wahrend PAH ebenso wie PABA in der Bratton-Marshall-Reaktion ohne Hydrolyse zu dem Azofarbstoff koppelt und die Glukuronide bereits nach milder Hydrolyse die Farbreaktion auf primare Arylamine ergeben, ist fiir den Nachweis von NAcetyl-PABA und N-Acetyl-PAH eine Hydrolyse unter Zusatz von 13 N HCI i,iber 1 Std. bei 100°C erforderlich. Unter diesen Hydrolyse-Bedingungen kommt es jedoch zu falsch-positiver Mitreaktion physiologischer Arylamine. Zudem kommt es im konzentrierten Urin such zu falsch-negativen Reaktionen in der BM-Reaktion in Folge von Diazotierungsblockade oder Konkurrenzreaktion bei der Farbstoffkopplung durch Urinbestandteile. Es ist deshalb eine Verdes diinnung des Urins auf 1 : 10 mit destilliertem Wasser sowie Zentrifugieren Urins zum Entfernen der korpuskularen Urinbestandteile erforderlich. Die PABA-Urineichkurven als Regressionsgeraden (X = mMo1 PABA; y = Extinktion bei 546 nm) entsprechen under diesen ~edin~ngen rechnerisch bis auf geringgradiges Y-Intercept den PABA-Wassereichkurven. Aus Resorptions- und Exkretionsstudien bei 6 Gesunden geht hervor, dass die Metaboliten der Substanz nach oraler Gabe von 50 mg PABA zu durchschnittlich 65% im 6-Std.-Sammelurin ausgeschieden werden. Die PABA-Gesamt-Exkretion im 24-Std.-Urin betragt ca 75% der gegebenen Dosis. Die 6Std.-Exkretionsquote erscheint reprasentativ fiir das Mass der Substratspaltung durch Chymotrypsin im Duodenum. Das von der Fa. Fluka (Buchs, SG Schweiz) synthetisierte Peptid N-BT-PABA besitzt ein Molekulargewicht von 435. Molmassenbestimmungen sowie Gehaltsbestimmungen stimmen gut mit den theoretischen Werten iiberein. Zur Charakterisierung der Substanz wurde die Michaeliskonstante von Rinderchymotrypsin (Merck) bestimmt. Aus den Messwerten wurde mit einem BASIC-Rechenprogramm nach Lineweaver-Burk-Formel KM =
1.14 mM errechnet. Bei langeren Reaktionszeiten (15 Min und langer) findet (IV-BT-PABA) von eine inkompetitive Hemmung, bei Substratkonzentrationen mehr als 1.5 mM such eine kompetitive Hemmung statt. Zur naheren Untersuchung dieser Effekte sind weitere Versuche geplant. Aus Vorversuchen ergab sich fir den praktischen Versuch eine optimale Peptidkonzentration im Duodenalsaft von 1.5 X 10-j Mel/l, entsprechend 150 mg Peptid in 250 ml Wasser gel&t. Hierbei findet bei der von uns ermittelten Chymotrypsinkonzentration im Duodenalsaft (bei 20 Patienten ohne und mit Stimulation durch CCK (Pankreozymin) und Sekretin eine je nach Chymotrypsinkonzentration unterschiedlich starke Hydrolyse des Peptides statt. Das Peptid erwies sich in vitro als chymotrypsinspezifisch. Physiologische Konzentrationen von Salzsiure, Pepsin, Carboxypeptidase-B und Trypsin fiihrten zu keiner Hydrolyse. Magensaft hydrolysierte das Peptid nur mit Beimischungen von Duodenalsaft. Unter Beriicksichtigung der Ergebnisse dieser Vorversuche wurde folgendes Testschema bei Patienten und Pankreasgesunden im klinischen Versuch verwendet. Nach Abgabe des Morgenurins als Leerurin wird dem Probanden 150 mg Peptid in einer Oblatenkapsel mit 250 ml Wasser (Modifikation A) oder unter Stimulationsbedingungen mit 250 ml Lundh-Probe-Mahl (Modifikation B) verabreicht. Nach 2 Std. muss der Proband 500 ml Fliissigkeit, nach der 3., 4. und 5. Std. nochmals je 250 ml nachtrinken. Die Urinsammlung erfolgt als 6Std.-Sammelurin. Da die Nachweisreaktion auf aromatische Amine sehr unspezifisch ist, ist es erforderlich jegliche Medikamente, Vitamintabletten, Konserven und selbstverstandlich such Pankreasfermente mindestens 2 Tage vor Beginn des Tests wegzulassen. Der Urin ist unverdiinnt in tiefgefrorenem Zustand (-10°C) ca. 8 Tage ohne Anderung der Ergebnisse haltbar. Der Test wurde bisher an 66 Probanden ausgewertet. Bei insgesamt 34 Untersuchten (22 Pankreasgesunde, 12 Patienten mit Pankreasinsuffizienz) wurde der Test zusatzlich unter Stimulationsbedingungen mit Lundh-Probe-Mahl (Modifikation B) durchgefiihrt, insbesondere dann, wenn im Peptid-Test (Modifikation A) grenzwertige oder leicht pathologische PABA-Exkretionsquoten im 6Std.Urin gefunden wurden. Der Test wurde als pathologisch gewertet, wenn die prozentuale PABA-Exkretionsquote im 6Std.-Urin unter 45% * 2 S.D. (Mod. A) oder 50% + 2 S.D. (Mod. B) der verabreichten Doses ergab. Bei allen Testpersonen waren vorher ein Malabsorptions-Syndrom (durch PABA-Gabe im Leerversuch oder durch D-Xylose-Test) und eine Niereninsuffizienz ausgeschlossen worden. 34 Personen waren sicher pankreasgesund. 16 Patienten hatten eine gesicherte Pankreasinsuffizienz. Der Nachweis wurde durch Pankreozymin-SekretinTest (n = 8) sowie durch pathologische Stuhlchymotrypsinwerte in Verbindung mit Steatorrhoe (mehr als 7 g Fett/24 Std.) bei gleichzeitig sicheren morphologischen Veranderungen des Pankreasgangsystems in der endoskopischen retrograden Pankreatikographie gefiihrt (n = 8). Bei 2 zusatzlichen Patienten lag ein Zustand nach subtotaler Pankreasresektion vor. Eine Untersuchung der Pankreasfunktion war hier nicht vorgenommen worden.
2. Statistische
Auswertung
Priifung auf Signifikanz zwischen dem Kollektiv “Gesunde” und “Pankreasinsuffiziente” mit dem Wilcoxon-Test nicht verbundener Stichproben. Priifung der Korrelation zwischen der Chymotrypsinmenge/Std. im Duodenalsaft nach Stimulation bzw. der Chymotrypsinkonzentration im Stuhl und der prozentualen PABA-Exkretion im 6-Std.-Urin mit einem BASIC-Rechenprogramm; polynomiale Regression. Logarithmische Werte der Enzymwerte auf Grund von logarithmischer Verteilung [ 1.121. Bei den PABA-Exkretionswerten liegt Normalverteilung vor. Die Regression wurde ersten Grades gewahlt. 3. Ergebnisse . Zur Toxlzrtat: In wiederholten Selbstversuchen, sowie spater in Untersuchungen an inzwischen 100 Freiwilligen fand sich kein Hinweis auf akute oder chronische Toxizitat (Beobachtungszeit 12 Wochen). Transaminasen, Harnstoffwerte sowie Blutgase waren stets normal. Bei 15 der 16 Patienten mit gesicherter Pankreasinsuffizienz verlief der Peptid-Test pathologisch, ebenso bei den 2 Patienten mit Pankreasresektion. Bei den 34 Pankreasgesunden fand sich nach Ausschluss eines Malabsorptions-Syndromes (wie beschrieben) und nach Ausschluss einer Niereninsuffizienz bei einem Patienten ein falschpositiver Peptid-Test. Das Kollektiv der Patienten mit Pankreasinsuffizienz unterschied sich signifikant vom Kollektiv der Pankreasgesunden (Abb. 1). Nach Lundh-Mahl trat im Durchschnitt keine starkere Stimulation des Pankreas gegeniiber der reinen Peptid-Gabe auf. Die Standardabweichung war jedoch beim Kollektiv der Pankreasinsuffizienten grosser. Die Korrelation der prozentualen PABA-Exkretion im 6-Std.-Urin mit ChymotrypsinOutput/Std. im Duodenalsaft nach Stimulation mit CCK (Pankreozymin) und Sekretin war signifikant (siehe Abb. 2). Ebenso korrelierte die PABA-Exkretion im 6-Std.-Urin gut mit Chymotrypsinkonzentrationen im Stuhl (s. Abb. 3).
%PABA-100 Exkretion t
-go - 80 * 70 - 60
.
50
- 40
.
30
- 20 . -
10 0 Pankreasinsuffiriente
Abb. und
1.
PABA-Exkretion
Pankreasinsuffizienten.
im
&Stunden-Urin
0. L..
ohm
in Prozent
Lundh-Probe-Mahl;
der
Dais
m. L..
t Standardabweichung mit
Lundh-Probe-Mahl.
bei
Gesunden
25 %PABA-‘100 Exkretion
t -75
y=22,3636x-
16.6560
Rxy= 0,7502 p c 0,001 2 Ol
3
--log,,,[CT”
h.jj?
Abb. 2. Abszisse: Log 10 der pro Stunde in das Duodenum ausgeschiedenen Chymotrypsineinheiten Ordinate: PABA-Exkretion im 6-Stunden-Urin in Prozent der Dosis. Polynomiale Regression ersten Grades. (CTIJ).
4. Diskussion Ebenso wie im Tierversuch zeigen such unsere klinischen Untersuchungen die Chymotrypsinspezifitat des Peptides N-BT-PABA. Mit der Bratton-Marshall-Reaktion mit schwacher Hydrolyse, so wie sie im Tiewersuch zum Nachweis der PABA-Metaboliten offenbar mijglich ist [ 13,141, konnten wir im klinischen Versuch nicht zwisehen Pankreasgesunden und Patienten mit Pankreasinsuffizienz unterseheiden. Aus Eichkurvenvergleichen in Form von Regressionsgeraden zeigte sich, dass die beim Menschen in relativ grossen Mengen vorkommenden N-Acetyl-Derivate der PABA und PAH [ 141 im Gegensatz zu N-Glukuroniden und PAH eine Hydrolyse unter Zusetzen von 13 N HCl mit 1 Std. Kochen benijtigen. Die hierbei entstehende Erhijhung des
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Abb. 3. Abszisse: Log 10 der in einem Gramm Stuhl enthdtenen Chymotrypsinmenge (CT) in Mikrogramm. Ordinate: PABA-Exkretion im 6-Stunden-Urn in Prozent der Do&,. Polynomiale Regression ersten Grades.
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background der physiologischen Arylamine kann durch ilrinverdiinnung behoben werden. Die Substrataffinittit von N-BT-P,4BA ist verglitrhen mit anderen synthetischen Chymotrypsinsubstraten relativ hoch 12 I. Als Ursachc fiir die in vitro nach langeren Reaktionszeiten und hiiheren Peptidkonzentrationen auftretenden inkompetitiven bzw. irreversiblen und kompetitiven Hemmungen des Enzymes kijnnte ein ~urchbre~he~l der Pufferk;~pazit~t durch das enzymatis~ll freigesetzte PABA eine Rolle spielen. Nach unseren Untersuchungen mit dem von Haverback angegebenen 0.005 M Trispuffer sind die I-lemmreaktionrn bcsonders ausgeprggt wghrend Imondi mit 0.1 M Trispuffer iiber keine Substrathemmung im Chymotrypsin-Assay berichtet 16 I. Im Duodenalsaft mit unterschiedlichem Chymotrypsingehalt kommt es bui der unter klinischen Versuchsbedingungen verwendeten Peptidkonzentration zu einer dem ChymotrypsingehaIt proportionale Hydrolysc und unsere ktinisohe Ergebnisse sprechen fiir den tats~~hli~~l miiglichen indirekten Nachweis der Chymotrypsinproduktion der Bauchspeicheldriise. Das Peptid bewirkt im Duodenum auf bisher noch nicbt geklarte Art und Weise eine Stimulation des Pankreas. Nach G&e von Lundh-Mahl kommt es im Durchschnitt zu keinem hijheren Chymotrypsin-Output (ausgedriickt in Prozenten PABA-Exkretion im 6-Std.-Urin (siehe Abb. 1). Wghrend bei den durch Proteinabbau entstehenden Peptiden spstestens in der D~nndarmzeIle die Peptid-Aufspaltung zu Aminos~uren erfolgt / 111, ist die vollstgndige Aufspaltung dieses synth~tischen Peptides bishcr nicht nachgewiesen. Mijglicherwise wird N-BT-PABA zu einem geringen Prozentsatz durch Diinndarmhydrolasen gespalten oder ungespalten resorbiert, wie er der Nachweis von 10% PABA-Exkretionsquote bei einem Patienten mit im Pankreozymin-Sekretin-Test nachgewiesenem viilligen Chymotrypsinverlust nahelegt. Eine geringe chymotrypsinunspezifische PABA-Exkretionsrate beeinflusst den Wert des Tests als Screening-Test in keiner Weise. Auf Grund der in-vitro-untersuchungen und erster klinischer Erfahrungen mit diesem indirekten Pankreasfunktionstest seheint sich der Test als Screening-Methode zu eignen. Ein Malabsorptions-Syndrom, ein portaler Hypertonus und eine Niereninsuffizienz miissen wie bei jedem Resorptions-Test zuerst ausgeschlossen werden. Ob beim Ausschluss eines Malabsorptions-Syndromes mit den iiblichen Kriterien auf die Untersuchung der PABA-Resorption verzichtet werden kann, ist noch nicht geklgrt, MGglicherweise hand& es sich bei dem beschriebenen falschpositiven PeptidTest urn eine isolierte PABA-Malabsorption. Zum Ausschluss einer Malabsorption sollte deshalb vor dem eigentlichen Peptid-Test ein Leerversuch mit der spgter im Versuch verwendeten aquivalenten Dosis PABA vorausgehen. Zusammenfassung Das synthetische Peptid N-Benzoyl-L-Tyrosyl-p_Aminobenzoestiure wurde in vitro und im klinischen Versuch auf seine Chymotrypsinsp~zifit~t untersucht. Stoffwechseluntersuchungen mit ~-Aminobenzoes~ure sowie enzymkinetische Untersuchungen mit Rinderchymotrypsin und humanem Pankreassaft liessen die Substanz fiir einen indirekten Pankreasfunktionstest geeignet erscheinen. Mit einer fi.ir den klinischen Gebrauch entwickelten Testanordnung konnten erste Untersuchungsergebnisse gewonnen werden. Wghrend der Test bei 31 von 32
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Pankreasgesunden normal ausfiel, konnte in 15 von 16 gesicherten Fallen mit Pankreasinsuffizienz die Diagnose bestatigt werden. Die prozentuale Ausscheidung der p-Amino-Benzoesaure pro Dosis im 6-Std.-Sammelurin ergab eine gute Korrelation mit l-Std. Chymotrypsinmengen im Pankreozymin-Sekretin-Test und mit der Chymotrypsinkonzentration im Stuhl. Nach ersten Untersuchungsergebnissen scheint sich der Test als Such-Test bei Pankreasinsuffizienz zu eignen. Danksagung Frl. B. Ihrig gilt unser Dank fur hervorragende technische Assistenz. Bei Herrn Dr. H.D. Weis, Rijntgeninstitut im Klinikum r.d. Isar der T.U. Miinchen (Direktor Prof. Dr. H. Anacker) mijchten wir uns fiir die Uberlassung der Befunde der endoskopischen retrograden Pankreatikografie bedanken. Literatur Fortschritte in der Pankreasfunktionsdiagnostik, Springer-Verlag. Berlin, Heidel1 Amann, R. (1967) berg, New York H.U. (1970) Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim/Bergstrasse 2 Bergmeyer, 3 Bratton, A.C. und Marshall. E.K. (1939) J. Biol. Chem. 128, 537 4 De Benneville. P.. Godfrey, W.J. und Sims, H.J. (1972) J. Med. Chem. 15. 1098-1100 5 Gyr, K., Wolf. R.H., Imondi. A.R. und Felsenfeld, 0. (1975) Gastroenterology 68. 488494 6 Imondi, A.R., Stradley, R.P. und Wohlgemuth, R. (1972) Gut 13, 726-731 7 Imondi, A.R.. Stradley. R.P., Wohlgemuth, R. und Braun. Jr., T.G. (1971) Pharmacologist 13, 290 8 Imondi, A.R.. Stradley. R.P. und Butler, E.R. (1973) Anal. Biochem. 54. 199-204 9 Kaffamik, H. und Meyer-Berthenrath, J.G. (1970) Arzneim. Forsch. 20.754-756 10 Otte. M., Stahlheber, H.. Zoelch. M., ForelI. M., Thurmayr, G.R. und Thurmayr. R. (1973) KIin. Wochenschr. 51,915-920 11 Mathews, D.M. (1975) in Intestinal Absorption and Malabsorption (Csaky. T.Z. Hrsg.) Raven Press, New York 12 Schneider, R.. DUrr, H.K. und Bode, J. Ch. (1974) Dtsch. Med. Wochenschr. 99.1449-1454 13 Strauss, E.F.. Lowell, C. und Finland. N. (1941) Clin. Invest. 20. 189 14 Tabor. C.W., Freemann, N. und BaiIy. J.. Smith. P.K. (1951) J. Pharmacol. Exp. Therap. 102.98-102 15 Tomaszewsky. L. (1975) Clin. Chim. Acta 61. 113-120