Mise en place d’un secteur de pathologie moléculaire en oncologie au sein d’un laboratoire d’anatomie pathologique (LPCE, CHU de Nice)

Annales de pathologie (2013) 33, 24—37

Disponible en ligne sur

www.sciencedirect.com

ARTICLE ORIGINAL

Mise en place d’un secteur de pathologie moléculaire en oncologie au sein d’un laboratoire d’anatomie pathologique (LPCE, CHU de Nice) Setting up a department of molecular pathology in oncology in a pathology laboratory (LPCE, CHU de Nice) Elodie Long a,1, Véronique Hofman a,b,1, Marius Ilie a, Virgine Lespinet a, Christelle Bonnetaud b, Olivier Bordone b, Virginie Gavric-Tanga b, Kevin Washetine a, Marie-Clotilde Gaziello a,b, Virginie Mauro b, Sandra Lassalle a, Eric Selva b, Katia Zahaf a, José Santini c, Laurent Castillo c, Jean-Philippe Lacour d, Nicolas Vénissac e, Jérôme Mouroux e, Josiane Otto f, Michel Poudenx g, Charles-Hugo Marquette g, Jean-Christophe Sabourin h, Paul Hofman a,∗,b,1 a

Laboratoire de pathologie clinique et expérimentale (LPCE), hôpital Pasteur, centre hospitalo-universitaire, BP 69, 06002 Nice, France b Tumorothèque-centre de ressources biologiques, hôpital Pasteur, centre hospitalo-universitaire, BP 69, 06002 Nice, France c Institut universitaire de la face et du cou, avenue de Valombrose, 06100 Nice, France d Service de dermatologie, hôpital de l’Archet, 06200 Nice, France e Service de chirurgie thoracique, hôpital Pasteur, centre hospitalo-universitaire, BP 69, 06002 Nice, France f Unité de pneumologie, CLCC Antoine-Lacassagne, 06189 Nice, France g Service de pneumologie, hôpital Pasteur, centre hospitalo-universitaire, BP 69, 06002 Nice, France h Laboratoire de pathologie, CHU de Rouen, 1, rue de Germont, 76031 Rouen cedex, France Accepté pour publication le 16 d´ ecembre 2012 Disponible sur Internet le 30 janvier 2013

∗ 1

Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (P. Hofman). Ces auteurs ont contribué de fac ¸on identique à ce travail.

0242-6498/$ — see front matter © 2013 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. http://dx.doi.org/10.1016/j.annpat.2012.12.003

Création d’un secteur de pathologie moléculaire

MOTS CLÉS Biologie moléculaire ; Pathologie moléculaire ; Assurance qualité ; Accréditation ; NF ISO 15189:2007 ; Thérapie ciblée

KEYWORDS Molecular biology; Molecular pathology; Quality assurance; Accreditation; ISO 15189; Targeted therapy

25

Résumé L’avènement des thérapies ciblées et de la médecine personnalisée en oncologie a provoqué en France la mise en place et la structuration du réseau des plateformes hospitalières de génétique moléculaire sous l’impulsion de l’Institut national du cancer (INCa). Ces plateformes sont, selon les sites concernés, intégrées ou non au sein des services d’anatomie pathologique. Le développement des techniques de biologie moléculaire, le choix des procédures, l’établissement du circuit des échantillons, le contrôle de la qualité et la sélection des altérations génomiques à détecter sur chaque plateforme, ont été laissés à l’appréciation des différents laboratoires. En fonction des appels à projet formulés par l’INCa, les plateformes hospitalières de génétique moléculaire ont pu adapter leur activité selon l’enveloppe budgétaire attribuée. Alors que la présence de certaines altérations génomiques (comme les mutations du gène KRAS dans les adénocarcinomes coliques métastatiques ou les mutations du gène de l’EGFR dans les adénocarcinomes bronchopulmonaires), peuvent avoir comme conséquence l’administration de thérapies ciblées associée à une autorisation de mise sur le marché (AMM) de différentes molécules, d’autres sont associées à des essais thérapeutiques. Dans ce contexte, il est apparu nécessaire d’adapter rapidement le fonctionnement des laboratoires hospitaliers d’anatomie pathologique réalisant des actes de biologie moléculaire afin de répondre à la demande croissante des oncologues dans le domaine des thérapies ciblées. Cet article a pour but de décrire les différentes étapes de la mise en place d’un secteur de pathologie moléculaire au sein d’un laboratoire hospitalier d’anatomie pathologique (LPCE, CHU de Nice) et de montrer l’expérience dans ce domaine de ce laboratoire plus particulièrement orienté sur la prise en charge du diagnostic morphologique et moléculaire des cancers du poumon, de la thyroïde et du mélanome malin. © 2013 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Summary The advent of targeted therapies and personalized medicine in oncology has led in France to the settlement and organisation of a network of hospital molecular genetic platforms under the impetus of the National Cancer Institute (INCa). These platforms are, according to the concerned sites, integrated or not in pathology laboratories. The development of molecular biology methods, the choice of the procedures, the establishment of sample workflow, the quality control and the selection of the genomic alterations to be detected on each platform, have been left to the discretion of the different laboratories. Based on calls for project made by the INCa, hospital molecular genetic platforms were able to adapt their activity according to the assigned budgets. While the presence of some genomic alterations (i.e. KRAS gene mutations in metastatic colon adenocarcinoma or EGFR gene mutations in lung adenocarcinomas), may lead to administration of targeted therapies under the Marketing Authorization Application (MAA), others are associated with therapeutic clinical trials. However, increasing number of MAA for new molecules targeting genomic alterations is likely in the near future. In this context, it is necessary to quickly adapt the organisation of work of the hospital pathology laboratories performing molecular biology tests in order to meet the growing demand of oncologists in the field of targeted therapies. The purpose of this article is to describe the different steps of the settlement of a molecular genetic platform in an academic pathology laboratory (LPCE, CHU de Nice) and to show the experience of this laboratory specifically oriented on the support of the morphological and molecular diagnosis of lung cancer, thyroid cancer and malignant melanoma. © 2013 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

Le concept de médecine personnalisée et « l’explosion » des thérapies ciblées en oncologie ont eu pour conséquence la mise en place en 2006 des plateformes hospitalières de génétique moléculaire par l’Institut national du cancer (INCa) afin de rendre accessibles les tests de détection d’altérations génomiques à tous les patients sur l’ensemble du territoire franc ¸ais. Selon les villes, ces plateformes se sont organisées en plateforme centralisée sur un seul laboratoire ou réparties sur plusieurs laboratoires au sein d’une même institution ou d’une même ville. Les laboratoires développant une activité de biologie moléculaire à partir de tissus ou de cellules tumorales (ou activité de « pathologie moléculaire ») peuvent être des structures « autonomes » dirigées par des biologistes, des pharmaciens ou des histologistes, ou bien des structures intégrées dans des laboratoires d’anatomie pathologique. C’est dans ce dernier cadre que les pathologistes ont dû rapidement s’adapter à une

nouvelle activité et à de nouvelles obligations [1]. Ainsi, l’association d’une activité de « morphologiste » et de biologiste moléculaire (ou de « pathologiste moléculaire ») a demandé au pathologiste une formation nouvelle et l’acquisition rapide de connaissances à la fois théoriques et pratiques. Le nombre croissant des publications consacrées à l’intégration de la biologie moléculaire en anatomie pathologique dans les revues anglo-saxonnes de pathologie témoigne de la nécessité de développer ce secteur d’activité au sein de nos laboratoires [2—11]. L’obligation de devoir accréditer (selon la norme ISO 15189) à court terme l’activité de biologie moléculaire, a entraîné une autre obligation pour le pathologiste développant ce secteur au sein de son laboratoire, celle d’appréhender le système de management de la qualité dans ce domaine et de maîtriser toutes les exigences liées à cette activité [12].

26

E. Long et al.

Le but de cet article est de décrire la mise en place d’un secteur de « pathologie moléculaire » au sein d’un laboratoire d’anatomie pathologique (le laboratoire de pathologie clinique et expérimentale [LPCE] du CHU de Nice) avec les différentes contraintes et obligations liées à ce développement. Nous détaillons plus particulièrement les étapes préanalytique, analytique et postanalytique nécessaires à la réalisation de ce secteur. Nous décrivons également le périmètre choisi pour l’engagement du laboratoire dans la démarche d’accréditation selon la norme ISO 15189 de ce secteur de pathologie moléculaire et l’activité de ce secteur entre janvier 2010 et avril 2012.

muqueux, ou acrolentigineux). En 2011, les mutations du gène KIT (exons 9, 11, 13, 17, 18) (mélanomes muqueux et acro-lengitineux), du gène BRAF (V600, K, D, G, M, A, G464E, G466 V, G469A) (mélanomes, ADCBP, adénocarcinome colique métastatique), du gène P13KCA (exons 9 et 20) (ADCBP), du gène HER2 (ADCBP) et le réarrangement de EML4-ALK (ADCBP) ont été également recherchées. Seule cependant, la recherche des mutations des gènes de l’EGFR, de BRAF et de KRAS a été inclue dans le périmètre initial de la démarche d’accréditation. L’ensemble des altérations génomiques recherchées et des pathologies concernées est résumé dans le Tableau 1.

Matériel et méthodes

Les étapes préanalytique, analytique et postanalytique

Périmètre défini dans le cadre de la démarche d’accréditation (selon la norme ISO 15189) du secteur de pathologie moléculaire du LPCE

La phase préanalytique

Cette étude porte sur la période comprise entre le premier janvier 2010 et le 30 avril 2012.

Pathologies concernées Le LPCE du CHU de Nice a orienté une activité de pathologie moléculaire sur la prise en charge des cancers du poumon non à petites cellules (essentiellement les adénocarcinomes, et plus exceptionnellement les carcinomes épidermoïdes et les carcinomes à grandes cellules), des adénocarcinomes colorectaux métastatiques, des cancers papillaires de la thyroïde (CPT) et des mélanomes malins. Entre janvier 2010 et décembre 2010, cette activité n’a pas fait l’objet de compte rendu systématiquement transmis aux cliniciens. Nous avons considéré qu’il s’agissait d’une phase de mise en place et « d’apprentissage ». Cette période a nécessité de nombreux contrôles intra- et interlaboratoires. À partir du mois de janvier 2011, les comptes rendus concernant tous les résultats de pathologie moléculaire ont été transmis aux cliniciens et/ou aux pathologistes prescripteurs. Les prélèvements analysés ont concerné des fragments tissulaires issus des pièces opératoires, des biopsies réalisées sous vidéo-médiastinoscopie, des biopsies bronchiques, des biopsies cutanées et de sites tissulaires métastatiques et des culots cellulaires. Les tissus étaient, soit fixés dans du formaldéhyde et inclus en paraffine, soit congelés dans l’azote liquide, puis conservés à —80 ◦ C dans la biobanque du CHU de Nice (http://www.biobank06.com). Les prélèvements provenaient de patients hospitalisés au sein du CHU de Nice ou bien de patients pris en charge dans le secteur libéral. Si les échantillons des patients provenant du secteur libéral ont bénéficié de la même prise en charge au sein du secteur de pathologie moléculaire, nous avons décidé de restreindre dans une première phase le périmètre de la démarche d’accréditation aux échantillons prélevés sur les patients hospitalisés au CHU de Nice et techniqués dans le secteur de pathologie clinique du LPCE.

Altérations génomiques recherchées Lors de l’année 2010, ont été recherchées les mutations présentes sur les exons 18, 19, 20 et 21 du gène de l’EGFR (adénocarcinomes primitifs broncho-pulmonaires [ADCBP]), sur les codons 12, 13, et 61 du gène KRAS (ADCBP et adénocarcinome colique métastatique) et la mutation V600E du gène BRAF (CPT et mélanome malin métastatique,

La phase préanalytique est certainement la phase la plus difficile à maîtriser et aussi la plus concernée par les nonconformités. Il est donc crucial d’en assurer la bonne gestion par la rédaction d’un manuel et d’un guide de prélèvements. Des réunions d’information organisées tous les trois mois avec les chirurgiens et les cliniciens ont été mises en place. Le but de ces réunions a été de donner des conseils sur la gestion des échantillons tissulaires dès le prélèvement. Le contrôle de la phase préanalytique au sein du LPCE se conc ¸oit de fac ¸on différente selon le système de transport de l’échantillon. Le LPCE est lié par deux pneumatiques à deux blocs opératoires distants de plusieurs centaines de mètres (un pneumatique liant le bloc de chirurgie thoracique et d’endoscopie pulmonaire au laboratoire et un pneumatique liant le bloc de chirurgie de la face et du cou au laboratoire). La grande majorité des échantillons tissulaires sont transmis non fixés grâce à ces pneumatiques, dès que les prélèvements sont réalisés. Certains prélèvements peuvent occasionnellement transiter par un coursier (en particulier les pièces opératoires volumineuses). Les critères d’acceptation des échantillons doivent être définis par écrit et validés par les services de soins (identification du patient et du préleveur ; heure et date du prélèvement ; conditions de transport et délai d’acheminement). Le périmètre de la phase préanalytique tel que définit dans notre démarche d’accréditation du secteur de pathologie moléculaire inclut la gestion de l’échantillon dès son prélèvement, la fixation formolée ou bien la congélation des fragments tissulaires. Ce périmètre englobe aussi l’inclusion des échantillons en paraffine, la coupe tissulaire, la coloration standard par l’hématoxyline éosine et la sélection par les pathologistes du LPCE des territoires tumoraux à partir desquels sera réalisée l’extraction de l’ADN. Il convient d’ajouter dans cette phase préanalytique, la maîtrise du diagnostic histologique faite par un pathologiste du LPCE (étape qui entre ici en théorie dans la phase analytique d’un secteur de pathologie). Il nous paraît très important que le continuum entre le diagnostic morphologique et l’indication d’un examen de pathologie moléculaire puisse se réaliser de fac ¸on idéale au sein du même laboratoire et par une même équipe de pathologistes, ces derniers pouvant avoir ainsi la « double compétence » de pathologiste « morphologiste » et « moléculaire ». Ce mode de fonctionnement permet de parfaitement gérer les indications et de mieux intégrer dans la réflexion les limites des examens réalisés en aval du diagnostic histologique (extraction, amplification, et contrôle de qualité de l’ADN) [13]. C’est à ce niveau que le pourcentage de cellules tumorales, la présence d’une intense réaction inflammatoire et/ou de

Création d’un secteur de pathologie moléculaire

27

Tableau 1 Principales altérations génomiques recherchées au sein du laboratoire de pathologie clinique et expérimentale et pathologies d’organe concernées par ces analyses. Main genomic alterations determined at the LPCE and corresponding tumour pathology.

Gène

Adénocarcinome pulmonaire

Mélanome malin

Carcinome papillaire de la thyroïde

Adénocarcinome colique métastatique

EGFR

Exon 18 (p.G719A ; p.G719S, p.G719 C) Exon 19 (Del19) Exon 20 (p.S768I ; p.T790 M) Exon 21 (p.L858R ; p.L861Q ou R)

Non recherché

Non recherché

Non recherché

KRAS

Exon 2 (p.G12D ; pG12V ; p.G12 C ; p.G12S ; p.G12A ; p.G12R ; p.G13D) Exon 3 (p.Q61L ; p.Q61E ; p.Q61H ; p.Q61R)

Non recherché

Non recherché

Exon 2 (p.G12D ; pG12V ; p.G12 C ; p.G12S ; p.G12A ; p.G12R ; p.G13D) Exon 3 (p.Q61L ; p.Q61E ; p.Q61H ; p.Q61R)

BRAF

Exon 15 (V600E ; V600G ; V600 M ; V600 K ; V600A) Exon 11 (G464E ; G466V ; G469A)

Exon 15 (V600E ; V600G ; V600 M ; V600 K ; V600A)

Exon 15 (V600E ; V600G ; V600 M ; V600 K ; V600A)

Exon 15 (V600E ; V600G ; V600 M ; V600 K ; V600A)

KIT

Non recherché

Exon 9 (p.K509I ; p.Y503 F504insAY ; p.F508 K509insFAF) Exon 11 (p.K550* ; p.Y553* ; p.W557* ; p.V559* ; p.N566* ; p.V569* ; p.L576*) Exon 13 (p.R634* ; p.K642E ; p.N655 K) Exon 17 (p.D816* ; p.A829P) Exon 18 (p.I841V)

Non recherché

Non recherché

PI3KCA

Exon 9 (p.E542 ; p.E545 ; p.Q546) Exon 20 (p.M1043 ; p.H1047 ; p.G1049)

Non recherché

Non recherché

Non recherché

ALK

Réarrangement ALK

Non recherché

Non recherché

Non recherché

HER2

Insertions exon 20

Non recherché

Non recherché

Non recherché

zones étendues de nécrose (éléments impactant sur la qualité des résultats), sont pris en considération lors de la validation finale des résultats de pathologie moléculaire. Les différentes étapes concernant l’extraction, la quantification, et le contrôle de qualité de l’ADN ont été réalisées comme précédemment décrites [6].

La phase analytique Nous avons décidé de mettre en place des méthodes automatisées et nous avons utilisé des kits commercialisés avec des lots ayant des dates de péremption (« kits » développant des tests « CE-IVD » correspondant à des tests de diagnostic in vitro agréés par le conseil de l’Europe). Ce choix nous autorise à « adopter » les « pratiques » et « à vérifier » au sein du laboratoire les différentes performances affichées par les fournisseurs, selon les « exigences » du chapitre 5 de la norme ISO15189. L’ « adoption », terme employé dans cette norme, consiste pour un laboratoire à utiliser de fac ¸on scrupuleuse l’ensemble des procédures (ou des « pratiques »)

développées sur son site par le fournisseur pour utiliser un kit commercialisé ou un équipement. Ainsi cette approche autorise une simple « vérification » au sein du laboratoire, c’est-à-dire que la mise en application des procédures conduit à des résultats reproductibles (ce qui constitue l’une des « exigences » de la norme). L’évaluation de différents paramètres (fidélité, reproductibilité, répétabilité, robustesse, contamination inter-échantillons, justesse) a été conduite pour les différentes techniques automatisées. En 2010, les recherches de mutation ont été réalisées par pyroséquenc ¸age et par séquenc ¸age direct de fac ¸on systématique pour chaque examen. En 2011, seule la technique de pyroséquenc ¸age a été utilisée, hormis pour la recherche des mutations des gènes KIT, PI3KA et HER2 qui a été réalisée par séquenc ¸age direct (compte tenue de l’absence de « kits CE-IVD » disponibles actuellement pour la recherche des mutations par pyroséquenc ¸age sur ces trois gènes). L’analyse ciblée des mutations sur les gènes : • EGFR (codons 719, 768, 790, et 858—861, et les délétions dans l’exon 19) ;

28 • KRAS (codons 12, 13 et 61) ; • BRAF (codons 600 et 464—469), a été réalisée par pyroséquenc ¸age selon une méthode décrite précédemment (Matériel complémentaire) [14]. L’analyse globale des mutations sur les gènes : • PIK3CA (exons 9 et 20) ; • HER2 (exon 20) ; • KIT (exons 9, 11, 13, 17 et 18) a été réalisée par séquenc ¸age direct (Matériel complémentaire). L’analyse du réarrangement du gène ALK a été réalisée par une technique d’hybridation in situ fluorescente FISH (Vysis ALK Break Apart FFPE FISH Probe Kit, Abbott Molecular) (Matériel complémentaire). L’ensemble des mutations recherchées au sein du LPCE selon la pathologie d’organe est indiqué dans le Tableau 1.

La phase postanalytique Nous avons inclut dans l’étape postanalytique la réalisation et la validation du compte rendu de pathologie moléculaire et la convention de preuves (vérification de la réception des résultats par les prescripteurs et mise à disposition rapide et sécurisée de ces résultats sur un serveur hospitalier ou par l’envoi de courriels cryptés). L’interprétation et la validation des résultats sont une composante majeure du compte rendu. La validation initiale du compte rendu écrit se fait par trois personnes, un ingénieur biologiste responsable du secteur technique des analyses, un pathologiste moléculaire et le responsable de l’unité fonctionnelle de pathologie moléculaire. La validation se fait ensuite en lien avec le pathologiste ayant fait le diagnostic morphologique (Fig. 1). Les comptes rendus de pathologie moléculaire réalisés au LPCE ont fait l’objet d’une standardisation afin que les pathologistes moléculaires utilisent la même formulation. Un exemple de compte rendu est donné sur la Fig. 2. Ces compte rendus sont transmis systématiquement aux pathologistes ayant adressé le prélèvement et aux cliniciens lorsque ceux-ci ont été identifiés avec la transmission de l’échantillon au secteur de biologie moléculaire.

Contrôles intralaboratoires et interlaboratoires Contrôles intralaboratoires Pour l’année 2010, deux échantillons par tumeur ont été systématiquement analysés (lorsque cela était rendu possible par la taille des prélèvements). L’ensemble du processus a alors été comparé (extraction et qualité de l’ADN, et résultats des mutations). Un contrôle intertechnicien (deux techniciens travaillant « à l’aveugle ») a été effectué pour 34 tumeurs. À partir du mois de janvier 2011, et pour chaque pathologie (ADCBP, métastase d’adénocarcinome colique, CPT et mélanome malin), deux échantillons d’un même patient ont été analysés chaque mois (si la taille du prélèvement le permettait) (contrôle interne de qualité « échantillon »), et un même prélèvement a été contrôlé de fac ¸on indépendante par deux techniciens une fois par mois (contrôle interne de qualité « technicien »). Les résultats obtenus sur le pyroséquenceur pour le gène de l’EGFR ont été systématiquement contrôlés par séquenc ¸age direct lors du deuxième trimestre 2011, puis un résultat positif et un résultat négatif de mutation sur le gène de l’EGFR ont été ensuite contrôlés une fois par mois (contrôle interne de qualité « méthode »).

E. Long et al.

Contrôles interlaboratoires Pour l’année 2010, le nombre de contrôles interlaboratoires pour les mutations des gènes de l’EGFR, de KRAS et de BRAF a été important compte tenu de la mise en place du secteur de pathologie moléculaire. Ces contrôles interlaboratoires ont été réalisés, soit en utilisant la même technique de détection de la mutation (à partir de d’ADN déjà extrait, ou à partir de l’échantillon primaire et après une nouvelle extraction sur le laboratoire contrôlant les résultats), soit en utilisant une ou plusieurs techniques différentes de détection de la mutation. Ainsi, pour la recherche de mutation sur l’un des quatre exons du gène EGFR, les laboratoires externes ont utilisés la technique de séquenc ¸age direct. Pour la recherche des mutations du gène KRAS, les méthodes de détection réalisées dans les laboratoires externes étaient soient identiques à celles effectués dans le laboratoire (séquenc ¸age direct et pyroséquenc ¸age) soient différentes (SNaPshot® , Taqman® ). Les laboratoires externes ayant participé à ces contrôles interlaboratoires ont été : • le laboratoire de génétique des tumeurs solides (Dr Florence Pedeutour, CHU de Nice); • l’International Agency for Research Cancer (Dr Pierre Hainaut, Lyon), le laboratoire de pathologie du CHU de Rouen (Dr A Lamy et Pr JC Sabourin), le laboratoire de pathologie de l’hôpital Erasme à Bruxelles (Dr Isabelle Salmon), et le Laboratoire de Transfert de l’Institut Gustave Roussy (Dr Ludovic Lacroix). Pour la recherche des mutations du gène KRAS, le LPCE a participé au test d’assurance qualité européen (« EQA scheme ») en 2010 et en 2011. Pour l’année 2011, une tumeur mutée et une tumeur non mutée, pour chaque pathologie et pour chaque gène (KRAS, EGFR, BRAF), ont été adressées tous les mois en contrôle à un laboratoire externe. Les principaux contrôles sont résumés dans le Tableau 2.

Analyse des concordances Cette analyse a été réalisée pour les résultats des contrôles intralaboratoires et interlaboratoires.

Prescription des examens de pathologie moléculaire, stratégie, arbre décisionnel et délai de rendu des résultats La prescription des examens de pathologie moléculaire est faite par un pathologiste ayant fait le diagnostic histologique et/ou par le clinicien responsable du patient. La demande d’examen de pathologie moléculaire est transmise au secteur de biologie moléculaire avec un certain nombre d’informations associées concernant le patient, la date du prélèvement et le (s) type (s) de mutation (s) à rechercher (Fig. 3). En ce qui concerne les altérations génomiques à rechercher dans les cancers du poumon non à petites cellules, nous avons adopté l’arbre décisionnel suivant en accord avec les prescripteurs (Fig. 4) : les recherches de mutations ont été effectuées uniquement lorsque le diagnostic d’ADCBP était posé sauf demande expresse et justifiée par les prescripteurs pour un autre sous-type histologique ou un contexte clinique particulier (âge jeune, patient non tabagique). La recherche des mutations des gènes de l’EGFR, de KRAS et de PI3KA a été réalisée systématiquement de fac ¸on synchrone. En l’absence de mutation, la recherche d’un réarrangement de EML4-ALK a été réalisée par une technique d’hybridation in situ en fluorescence FISH. Une

Création d’un secteur de pathologie moléculaire

29

Figure 1. Circuit d’analyse et de validation d’un examen de pathologie moléculaire. Analysis and validation workflow of a molecular pathology test.

analyse immuno-histochimique avec un anticorps anti-ALK a été réalisée systématiquement d’emblée en cas de diagnostic d’ADCBP suivi d’une analyse par FISH sans attendre les résultats des mutations sur les gènes de l’EGFR et de KRAS. La recherche des mutations de BRAF est ensuite réalisée en cas d’absence de mutations et de réarrangement détectés précédemment. Une recherche de mutation du gène HER2 est ensuite réalisée en l’absence de mutation détectée. Un certain nombre d’informations présentes sur la fiche de prescription et sur le compte rendu de pathologie moléculaire permet d’apprécier les délais de transmission des résultats et les délais pouvant exister entre différentes étapes : • délai entre le prélèvement et la prescription par le pathologiste et/ou le clinicien ; • délai entre la prescription et la transmission de l’échantillon au secteur de pathologie moléculaire ; • délai entre la réception de l’échantillon dans le secteur de pathologie moléculaire et la signature du compte rendu et sa mise à disposition. ¸on comparative pour Ces délais ont été analysés de fac des échantillons provenant du secteur libéral et du secteur hospitalier.

Résultats Tumeurs analysées En 2010, 80 ADCBP ont été analysés, correspondant à 75 pièces opératoires (dont 70 tumeurs congelées) et cinq biopsies bronchiques (toutes fixées) ; 45 CPT ont été analysés (tumeurs congelées). Du premier janvier 2011 au 30 avril 2012, 364 ADCBP ont été adressés au LPCE pour une analyse moléculaire. 39/364 (10 %) cas ont été réfutés pour

cette analyse compte tenu d’un pourcentage de cellules tumorales trop faible (< 5 %), d’un matériel entièrement nécrotique ou plus exceptionnellement d’un diagnostic histologique non adapté à la demande de la mutation (erreur d’identification du bloc de paraffine adressé). L’analyse a concerné 155 pièces opératoires (75 tissus congelés), 198 biopsies bronchiques (dont 16 biopsies congelées) et 11 culots cellulaires (réalisés à partir d’aspiration bronchique). Dans la même période, 58 CPT (dont 39 tumeurs congelées) ont été analysés ainsi que 110 mélanomes malins (dont 45 tumeurs congelées).

Altérations génomiques observées L’ensemble des résultats obtenus et le détail des mutations par pathologie d’organe sont indiqués dans le Tableau 3. En 2010, 11 % des ADCBP présentaient une mutation du gène de l’EGFR, correspondant dans 8 % des cas à une mutation sur l’exon 19 et dans 3 % des cas à une mutation sur l’exon 21. Trente-cinq pour cent des ADCBP présentaient une mutation sur le gène KRAS, avec une majorité des mutations sur le codon 12. Ces mutations étaient toujours exclusives. De 2011 à 2012, 17,2 % des ADCBP présentaient une mutation du gène de l’EGFR (10,5 % des cas sur l’exon 19 et 5,7 % des cas sur l’exon 21). Parmi les ADCBP, 33,1 % montraient une mutation exclusive sur le gène KRAS. Quatorze tumeurs non mutées pour l’EGFR, KRAS et PI3KA montraient une mutation du gène BRAF (V600E [six cas] ; G469 [sept cas] ; G466 [un cas]). Le réarrangement du gène ALK était présent chez 13,7 % des patients sélectionnés non mutés sur les gènes EGFR, KRAS et PI3KA. 22/41 (54,4 %) des CPT étaient mutés sur le gène BRAF (100 % des cas sur V600E). Quarante-deux pour cent des mélanomes étaient mutés sur le gène BRAF (41 V600E ; 1 V600 K). Une seule mutation sur le gène KIT (exon 13) a été observée. De 2011 à 2012, 3,5 % des patients présentaient une mutation du gène P13KA et 1, 5 % du gène HER2.

30

E. Long et al.

Figure 2. Exemple de compte rendu de résultat d’un test de mutation somatique au sein du laboratoire de pathologie clinique et expérimentale. Example of a somatic mutation test report from the LPCE.

Absence de résultats Pour l’ensemble des analyses demandées en 2011/2012 aucun résultat n’a pu être obtenu pour 42/887 (5 %) des tumeurs prises en charge sur la plateforme de pathologie moléculaire du LPCE. Cela correspondait à :

• l’absence ou à quantité trop faible d’ADN avec l’impossibilité de réaliser une amplification par PCR (15 cas [1,7 %]) ; • l’impossibilité d’une analyse correcte des séquences (examen non interprétable) (15 cas [1,7 %]) ; • une mauvaise qualité de l’ADN (hyperfixation, fixateur non formolé) (12 cas [1,3 %]).

Création d’un secteur de pathologie moléculaire Tableau 2

31

Différents contrôles intra et interlaboratoires et analyse des concordances.

Laboratory controls and analyse of concordances.

A. Contrôles intralaboratoire concernant les échantillons (année 2010) Gène

Nombre de tests réalisés

Nombre de tests concordants

% concordance

EGFR KRAS BRAF

5 5 2

5 5 2

100 100 100

B. Contrôles intralaboratoire concernant les techniciens (année 2010) Gène EGFR KRAS BRAF

Nombre de tests réalisés

Nombre de tests concordants

13 12 9

13 12 9

% concordance 100 100 100

C. Contrôles intralaboratoire concernant les méthodes d’analyse sur le gène de l’EGFR (année 2010) Séquenc ¸age versus pyroséquenc ¸age gène EGFR n = 39 patients Résultats concordants Résultats impossibles en séquenc ¸age directa Discordanceb Concordance (par exon)

Exon 18 33 6 0 85 %

Total

86 %

Exon 19 34 5 0 87 %

Exon 20 37 1 1 95 %

Exon 21 30 9 0 77 %

D. Contrôles interlaboratoires (année 2010) Gène

Technique utilisée au LPCE

Nombre de tests

Technique du laboratoire externe

Résultats concordants

EGFR (Exons 18, 19, 20 et 21) KRAS (Codons 12—13 et 61)

Séquenc ¸age Séquenc ¸age Séquenc ¸age Séquenc ¸age

30 22 19 16

Séquenc ¸age direct Snapshot Séquenc ¸age direct TaqMan

30 22 19 15

BRAF (Exon 15)

direct direct direct direct

% concordance 100 100 97

CIQ : contrôle interne de qualité. a Résultats non interprétables par séquenc ¸age direct mais analysables par pyroséquenc ¸age. b Mutation rare (insertion c.2301ins9 ; p.A767 S768insAASVD) non analysée par la technique de pyroséquenc ¸age.

L’absence ou la quantité trop faible d’ADN était liée dans les 15 cas observés à une cellularité en cellules tumorales insuffisante par rapport à l’ensemble des cellules observées sur le prélèvement (généralement inférieur à 5 %) ou à un très faible nombre de cellules tumorales.

l’analyse du test KRAS (codons 12, 13 et 61) dans le cadre des l’EQA 2010, 2011 et 2012 nous avons obtenu 100 % de concordance. Les principaux résultats sont résumés dans le Tableau 2.

Délai de rendu des résultats Analyse des concordances Dans le cadre des contrôles intralaboratoires et pour l’année 2010, le contrôle effectué de fac ¸on systématique sur deux échantillons d’un même patient et en utilisant la même technique montre 100 % de concordance. Les résultats obtenus par deux techniques différentes (séquenc ¸age direct et pyroséquenc ¸age) montrent 100 % de concordance pour les recherches de mutations sur le gène KRAS, 100 % de concordance pour les recherches de mutations sur le gène BRAF, et 86 % de concordance pour la recherche de mutation sur le gène EGFR. Dans le cadre des contrôles interlaboratoires : la concordance a été de 100 % pour le gène de l’EGFR, de 100 % pour le gène KRAS et de 97 % pour le gène BRAF (écart lié aux différences intertechniques : méthode globale versus méthode ciblée de détection des mutations). Pour

Pour les prélèvements provenant du secteur libéral, le délai entre la prescription et la transmission des résultats aux prescripteurs a été en moyenne de 17 jours (écart : 6—35 jours) pour les gènes EGFR et KRAS respectivement. Pour les prélèvements provenant du secteur hospitalier (CHU de Nice) le délai entre la prescription et la transmission des résultats aux prescripteurs a été de 11 jours (écart : 3—26) pour EGFR et KRAS (Fig. 5). La différence dans ces délais s’explique par un délai d’acheminement (déstockage de l’échantillon et transfert au laboratoire central) plus long pour les prélèvements du secteur libéral. Ainsi, le délai moyen entre la prescription et l’enregistrement au laboratoire était de neuf jours pour le secteur libéral et de deux jours pour le secteur hospitalier. L’ensemble des délais de transmission des résultats selon la mutation recherchée est indiqué sur la Fig. 5.

32

E. Long et al.

Figure 3. Fiche de prescription pour une demande de pathologie moléculaire formulée au laboratoire de pathologie clinique et expérimentale. Prescription form for a molecular biology analysis requested to the LPCE.

Commentaires Afin de répondre aux différents appels à projet de l’INCa orientés sur les tests de détection des altérations moléculaires en oncologie et pour faire face aux demandes croissantes des oncologues de la région nic ¸oise, nous avons développé à partir de 2010 une activité de diagnostic moléculaire au sein de notre laboratoire d’anatomie pathologique. Nous avons alors orienté notre activité de biologie moléculaire (ou pathologie moléculaire) sur les pathologies tumorales gérées sur le plan du diagnostic morphologique au sein du LPCE. En effet, ces différentes pathologies peuvent bénéficier de thérapies ciblées avec des molécules ayant obtenu une AMM ou bien utilisées dans le cadre d’essais cliniques [15—24]. Nous avons procédé selon deux schémas directeurs successifs, avec une première année (2010) au cours de laquelle nous avons réalisé de nombreux contrôles de qualité intralaboratoire (intertechniciens

et intertechniques) et interlaboratoires. Cette procédure contraignante a permis de faire ensuite des analyses de concordance, et compte tenu des résultats obtenus, nous avons dans un deuxième temps « allégé » notre mode de fonctionnement à partir de janvier 2011. Nous avons observé une augmentation constante de l’activité entre le mois janvier 2010 et le mois de mars 2012 (en particulier pour la recherche des altérations génomiques des cancers pulmonaires). Cette augmentation de l’activité a été le reflet de : • transmission plus importante des prélèvements en provenance du secteur libéral ; • l’augmentation du nombre des biomarqueurs moléculaires à analyser suite au deuxième appel à projet 2010 de l’INCa portant sur les biomarqeurs émergeants. Pour répondre à l’établissement et au maintien des critères de qualité, nous avons limité le nombre d’altérations génomiques à rechercher dans trois pathologies d’organe

Création d’un secteur de pathologie moléculaire

33

Figure 4. Arbre décisionnel pour la recherche d’une altération génomique au sein du laboratoire de pathologie clinique et expérimentale. Diagnostic flow chart for the detection of genomic alterations at the LPCE.

(cancer du poumon, cancer de la thyroïde et mélanome malin). Hormis la recherche des mutations par pyroséquenc ¸age, nous avons inclus au sein du secteur de pathologie moléculaire, la technique FISH, bien que cette technique puisse être considérée par certains praticiens être « hors champ » d’un secteur de pathologie moléculaire. L’ensemble des résultats obtenus au sein de notre laboratoire est sensiblement comparable à celui décrit dans la plupart des publications réalisées sur ce sujet en ce qui concerne les types de mutations détectés selon la pathologie d’organe [2,4,8,9,11,13,18,19,23,24]. Toutefois, si le pourcentage de mutations détectées dans les mélanomes malins et les CPT sont similaires à ceux rapportés dans la littérature, le pourcentage des différentes altérations génomiques trouvées dans les ADCBP est globalement plus élevé, en particulier pour EML4-ALK et pour BRAF. Ceci peut s’expliquer par le fait que tous les échantillons rec ¸us sur la plateforme n’ont pas été analysés et qu’un certain nombre de prélèvements a été écarté compte tenu d’une mauvaise qualité. La

deuxième explication tient à l’enrichissement de la population analysée pour le réarrangement de EML4-ALK et pour la mutation de BRAF, puisque seuls les patients non mutés pour EGFR (sur les quatre exons 18, 19, 20 et 21) et KRAS (sur les codons 12, 13 et 61) ont été analysés. L’activité de pathologie moléculaire nécessite une gestion optimale des processus et impose de s’intégrer rapidement dans une démarche d’accréditation. Nous avons choisi pour le secteur de « pathologie moléculaire », une accréditation selon une norme ISO 15189. Cette norme est utilisée pour l’accréditation des actes de « biologie médicale » dans le cadre des activités de soin. Il n’existe pas en fait de norme ISO parfaitement adaptée à l’activité de « pathologie moléculaire », et certaines étapes devant conduire à l’obtention de cette accréditation sont difficiles à franchir. Ainsi dans certains pays (États-Unis, Grande Bretagne), l’accréditation de la pathologie moléculaire n’utilise pas cette norme et ce sont les organismes nationaux qui délivrent les autorisations de réaliser les tests

34 Tableau 3

E. Long et al. Altérations génomiques détectées selon la pathologie d’organe (janvier 2010—avril 2012).

Genomic alterations assessed according to tumor type (January 2010—April 2012).

Gène

Total

WT n (%)

EGFR

325

260 (80)

KRAS

324

BRAFa Pi3KCA

Non interprétable n (%)

Distribution des mutations n (%)

54 (17)

11 (3)

210 (65)

104 (32)

10 (3)

148

133 (90)

14 (9)

1 (1)

90

82 (91)

3 (3)

5 (6)

ALKb HER2

110 98

88 (80) 88 (90)

14 (13) 1 (1)

8 (7) 9 (9)

Exon 18 : 3 (6) Exon 19 : 33 (61) Exon 21 : 18 (33) Exon 2 (Codon 12) : 93 (89) Exon 2 (Codon 13) : 6 (6) Exon 3 (Codon 61) : 5 (5) Exon 11 : 8 (57) Exon 15 : 6 (43) Exon 9 : 3 (100) Exon 20 : 0 (0) NA Exon 20 : 1 (100)

Carcinome papillaire de la thyroïde

BRAF

58

26 (45)

31 (53)

1 (2)

Exon 15 : 31 (100)

Mélanome malin

BRAF

104

58 (56)

42 (40)

4 (4)

33

30 (91)

1 (3)

2 (6)

Exon 11 : 1 (2) Exon 15 : 41 (98) Exon 13 : 1 (100)

Adénocarcinome pulmonaire

KIT

Muté n (%)

a

Ces résultats sont obtenus à partir d’une population tumorale sélectionnée EGFR, KRAS, PI3KA, non mutés. Ces résultats (translocation ou non de ALK) sont obtenus à partir d’une population tumorale sélectionnée EGFR, KRAS, PI3KA, BRAF non mutés.

b

Figure 5. Délais de rendu des résultats de biologie moléculaire au sein du laboratoire de pathologie clinique et expérimentale selon l’origine de la prescription (secteur libéral versus secteur hospitalier). The turn around time for molecular biology results at the LPCE according to the source of prescription (private sector versus university healthcare institution).

Création d’un secteur de pathologie moléculaire moléculaires. La difficulté d’une démarche d’accréditation en « pathologie moléculaire » est liée d’une part à sa spécificité technique combinant souvent des techniques manuelles et automatisées et d’autre part au manque d’informations précises sur la mise en œuvre organisationnelle, technique et méthodologique accessible dans la littérature scientifique concernant cette activité. Lors de la mise en place de notre démarche d’accréditation nous avons défini une politique qualité orientée sur trois grandes directions : • amélioration de l’organisation et de la communication ; • satisfaction des clients ; • qualité de l’instrumentation et des réactifs. Nous avons ainsi ciblé des objectifs mesurables avec des indicateurs de performance. La maîtrise de la phase préanalytique est un élément déterminant pour l’obtention de l’accréditation selon la norme ISO 15189. Si cette phase préanalytique peut être bien contrôlée pour les analyses biologiques, la maîtrise de cette phase dans l’environnement d’un laboratoire de pathologie est plus difficile, car elle fait intervenir de nombreux paramètres dont certains sont extérieurs à l’enceinte du laboratoire (bloc opératoire ou d’endoscopie, service clinique, acheminement des prélèvements jusqu’au laboratoire) [6,25]. D’autres éléments de cette phase préanalytique doivent être gérés au sein du laboratoire d’anatomie pathologique et ont été précédemment détaillés [6]. Nous avons créé un fonctionnement associant les départements cliniques et chirurgicaux reliés par des pneumatiques au laboratoire d’anatomie pathologique [26]. La grande majorité des prélèvements (pièces opératoires, biopsies chirurgicales, biopsies bronchiques) arrive par les pneumatiques au laboratoire permettant ainsi leur gestion immédiate (fixation ou congélation) par les pathologistes en association avec l’équipe technique. L’organisation mise en place conduit à une prise en charge multidisciplinaire associant la pathologie clinique, la biobanque et la pathologie moléculaire. Ce fonctionnement conduit à transmettre les résultats de pathologie moléculaire dans un délai optimal aboutissant ainsi à une meilleure prise en charge thérapeutique. Dans la démarche d’accréditation, il est primordial d’effectuer des contrôles de qualité intra- et interlaboratoires. Ces contrôles doivent concerner chaque gène et chaque mutation d’intérêt recherchée, en les adaptant à la pathologie d’organe. Les contrôles interlaboratoires peuvent être réalisés ou non en utilisant les mêmes techniques d’analyse, ce qui peut permettre de comparer les sensibilités des méthodes, notamment en fonction du pourcentage de cellules tumorales présent dans l’échantillon à analyser. Les contrôles de qualité doivent se faire sur toutes les étapes (préanalytique, analytique et postanalytique) du processus, mais en particulier depuis la prise en charge initiale du tissu jusqu’à la détermination des altérations génomiques. Les contrôles externes de qualité bénéficient de la mise en place de tests nationaux et européens qui permettent au laboratoire qui y participe d’obtenir une certification et une reconnaissance objective [27]. L’évolution constante des nouvelles thérapies ciblées dans le domaine de l’oncologie, leur éventuelle combinaison adaptée à la présence de plusieurs mutations simultanément présentes dans la même tumeur, laissent envisager le transfert à court dans le secteur de l’offre de soin de nouvelles technologies d’extraction des acides nucléiques et aussi de l’analyse des altérations génomiques. La complexité

35 des réseaux moléculaires à identifier au sein d’une tumeur combinée à des échantillons tumoraux de taille de plus en plus réduite (compte tenu de gestes de moins en moins invasifs) sur lesquels un diagnostic morphologique optimal peut devenir plus difficile [28], vont imposer une optimisation des méthodes de détection des altérations génomiques. Ainsi les nouvelles techniques de séquenc ¸age (next generation sequencing ou NGS) devraient permettre des détections mutationnelles multiples à partir de l’ADN de plusieurs patients dans un même temps et à partir d’échantillons de petite taille [29,30]. Ces techniques doivent aussi autoriser une diminution du temps d’analyse afin d’obtenir les résultats plus rapidement. Un des écueils possibles de ces analyses à haut ou moyen débit risque d’être la qualité de l’ADN après fixation formolée et inclusion en paraffine. Cependant certaines études récentes montrent toutefois de très bons résultats avec ces méthodes sur de l’ADN extrait de tissus fixés [31]. Un des éléments le plus contraignant sera de pouvoir analyser une quantité suffisante d’ADN extrait à partir du matériel biologique, le seuil étant le plus souvent fixé à 10 ng d’ADN. Il faudra certainement réaliser des contrôles de qualité de l’ADN avant toute analyse par NGS et faire aussi des tests comparatifs initiaux avec les résultats obtenus sur de l’ADN extrait de matériel tissulaire congelé. À cette complexité méthodologique (qui nécessitera l’émergence rapide de nouvelles compétences dans les laboratoires hospitaliers, comme l’expertise bioinformatique), s’ajoute aussi la complexité tumorale avec une grande hétérogénéité des mutations selon la cartographie réalisée dans une même tumeur [32]. Ainsi, le concept de médecine personnalisée doit aussi intégrer les difficultés actuelles pour cerner avec certitude le profil mutationnel de l’ensemble d’une tumeur [32]. L’avenir d’un secteur de pathologie moléculaire dans un laboratoire d’anatomie pathologique devra aussi tenir compte des nouveaux développements dans le domaine de l’immuno-histochimie avec l’arrivée d’anticorps pouvant mettre en évidence les mutations et les réarrangements génomiques (par exemple avec les anticorps anti-ALK, antiEGFR [pouvant reconnaître les formes mutées du gène de l’EGFR] ou anti-BRAF) [33—37]. C’est dans ce contexte que la confrontation précise des signaux obtenus sur une analyse histologique avec les résultats de biologie moléculaire « classique » s’avère incontournable [33—37]. La présence de pathologistes ayant une compétence en biologie moléculaire sera l’une des garanties de l’utilisation optimale de ces anticorps et d’une bonne interprétation des résultats. Au-delà de l’apport dans le cadre de l’offre de soin aux patients, on ne peut ignorer le fait que l’intégration d’un secteur de pathologie moléculaire dans les laboratoires d’anatomie pathologique doit permettre à la nouvelle génération de pathologistes, l’acquisition d’une nouvelle culture en biologie et de nouvelles connaissances dans la physiopathologie du cancer au bénéfice des futurs patients [38—43]. Enfin, la possibilité d’établir un lien étroit avec une biobanque, idéalement au sein d’un même laboratoire, doit permettre également de renforcer l’optimisation d’un secteur de pathologie moléculaire et de faire naître le concept de « pathologie intégrative » dans les hôpitaux [39,44,45]. Ce concept de « pathologie intégrative » ou de biopathologie pourra associer les données moléculaires, la morphologie en pathologie clinique et la gestion des différentes collections biologiques.

36

Déclaration d’intérêts Paul Hofman est consultant pour Qiagen (Hilden, Allemagne). Les autres auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article.

Remerciements Les auteurs remercient l’Institut national du cancer pour l’aide financière à la mise en place des tests de biologie moléculaire au sein du LPCE. Nous remercions les personnes ayant accepté de participer aux contrôles interlaboratoires : Dr Florence Pedeutour (laboratoire de génétique des tumeurs solides, faculte de médecine de Nice), Dr Pierre Hainaut (département de pathologie moléculaire, IARC, Lyon), Dr Ludovic Lacroix (laboratoire de transfert, institut Gustave Roussy, Villejuif), Dr Aude Lamy (laboratoire de pathologie, CHU de Rouen), Dr Isabelle Salmon (laboratoire de pathologie, hôpital Erasme, Bruxelles).

Appendix A. Matériel complémentaire Le matériel complémentaire accompagnant la version en ligne de cet article est disponible sur http://www. sciencedirect.com et http://dx.doi.org/10.1016/j.annpat. 2012.12.003.

Références [1] Scott MG, Smith BR, Young IS, WU A, Plebani M, Chiu R. How well are we training the next generation of clinical pathologists and clinical laboratory directors? A global perspective. Clin Chem 2012;58:91—5. [2] Cheng L, Alexander RE, Maclennan GT, et al. Molecular pathology of lung cancer: key to personalized medicine. Mod Pathol 2012;25:347—69. [3] Diaz-Cano SJ. General morphological and biological features of neoplasms: integration of molecular findings. Histopathology 2008;53:1—19. [4] Dietel M, Sers C. Personalized medicine and development of targeted therapies: the upcoming challenge for diagnostic molecular pathology. a review. Virchows Arch 2006;448:744—55. [5] Dry S, Grody WW, Papagni P. Stuck between a scalpel and a rock, or molecular pathology and legal-ethical issues in use of tissues for clinical care and research: what must a pathologist know? Am J Clin Pathol 2012;137:346—55. [6] Hofman V, Ilie M, Gavric-Tanga V, et al. Rôle du laboratoire d’anatomie-pathologique dans l’approche pré-analytique des examens de biologie moléculaire réalisés en pathologie tumorale. Ann Pathol 2010;30:85—93. [7] Jones D, Fletcher CD. How shall we apply the new biology to diagnostics in surgical pathology? J Pathol 1999;187: 147—54. [8] Kulesza P, Ramchandran K, Patel JD. Emerging concepts in the pathology and molecular biology of advanced non-small cell lung cancer. Am J Clin Pathol 2011;136:228—38. [9] Ladanyi M, Hogendoorn PC. Cancer biology and genomics: translating discoveries, transforming pathology. J Pathol 2011;223:99—101. [10] Moch H, Blank PR, Dietel M, et al. Personalized cancer medicine and the future of pathology. Virchows Arch 2012;460: 3—8. [11] Tomlinson IP, Ilyas M. Molecular pathology of solid tumours: some practical suggestions for translating research into clinical practice. Mol Pathol 2001;54:203—5.

E. Long et al. [12] Norme NF ISO 15189. Laboratoires d’analyses de biologie médicale. Exigences particulières concernant la qualité et la compétence 2007, AFNOR. [13] Ilie M, Hofman P. Pitfalls in lung cancer molecular pathology: how to limit them in routine practice? Curr Med Chem 2012;19:2638—51. [14] Ogino S, Kawasaki T, Brahmandam M, et al. Sensitive sequencing method for KRAS mutation detection by pyrosequencing. J Mol Diagn 2005;7:413—21. [15] De Mattos-Arruda L, Dienstmann R, Tabernero J. Development of molecular biomarkers in individualized treatment of colorectal cancer. Clin Colorect Cancer 2011;10:279—89. [16] Eberhard DA, Giaccone G, Johnson BE. Biomarkers of response to epidermal growth factor receptor inhibitors in Non-SmallCell Lung Cancer Working Group: standardization for use in the clinical trial setting. J Clin Oncol 2008;26:983—94. [17] Gately K, O’Flaherty J, Cappuzzo F, Pirker R, Kerr K, O’Byrne K. The role of the molecular footprint of EGFR in tailoring treatment decisions in NSCLC. J Clin Pathol 2012;65: 1—7. [18] Harris PJ, Bible KC. Emerging therapeutics for advanced thyroid malignancies: rationale and targeted approaches. Expert Opin Investig Drugs 2011;20:1357—75. [19] Li J, Chen F, Cona MM, Feng Y, Himmelreich U, Oyen R, et al. A review on various targeted anticancer therapies. Target Oncol 2012;7:69—85. [20] Mok TS. Personalized medicine in lung cancer: what we need to know. Nat Rev Clin Oncol 2011;8:661—8. [21] Nikiforov YE, Nikiforova MN. Molecular genetics and diagnosis of thyroid cancer. Nat Rev Endocrinol 2011;7:569—80. [22] Richman SD, Seymour MT, Chambers P, et al. KRAS and BRAF mutations in advanced colorectal cancer are associated with poor prognosis but do not preclude benefit from oxaliplatin or Irinotecan: results From the MRC FOCUS Trial. J Clin Oncol 2009;27:5931—7. [23] Shaw AT, Yeap BY, Mino-Kenudson M, Digumarthy SR, Costa DB, Heist RS, et al. Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer who harbor EML4-ALK. J Clin Oncol 2009;27:4247—53. [24] Woodman SE, Lazar AJ, Aldape KD, Davies MA. New strategies in melanoma: molecular testing in advanced disease. Clin Cancer Res 2012;18:1195—200. [25] Wood WG. The preanalytical phase — can the requirements of the DIN-EN-ISO 15189 be met practically for all laboratories? A view of the ‘‘German situation’’. Clin Lab 2005;51:665—71. [26] Lassalle S, Hofman V, Marius I, et al. Assessment of morphology, antigenicity, and nucleic acid integrity for diagnostic thyroid pathology using formalin substitute fixatives. Thyroid 2009;19:1239—48. [27] Bellon E, Ligtenberg MJ, Tejpar S, et al. External quality assessment for KRAS testing is needed: setup of a European program and report of the first joined regional quality assessment rounds. Oncologist 2011;16:467—78. [28] Brambilla E, Lantuejoul S. New classification of pulmonary cancer: application to small size biopsy sampling. Ann Pathol 2010;5:60—3. [29] Yauch RL, Settleman J. Recent advances in pathway-targeted cancer drug therapies emerging from cancer genome analysis. Curr Opin Genet Dev 2012;22:45—9. [30] Cronin M, Ross JS. Comprehensive next-generation cancer genome sequencing in the era of targeted therapy and personalized oncology. Biomark Med 2011;5:293—305. [31] Schweiger MR, Kerick M, Timmermann B, et al. Genome-wide massively parallel sequencing of formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues for copy-number- and mutation-analysis. PLoS One 2009;4:e5548. [32] Gerlinger M, Rowan AJ, Horswell S, et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med 2012;366:883—92. [33] Hofman P, Ilie M, Hofman V, et al. Immunohistochemistry to identify EGFR mutations or ALK rearrangements in patients with lung adenocarcinoma. Ann Oncol 2012;23:1738—43.

Création d’un secteur de pathologie moléculaire [34] Ilie MI, Hofman V, Bonnetaud C, et al. Usefulness of tissue microarrays for assessment of protein expression, gene copy number and mutational status of EGFR in lung adenocarcinoma. Virchows Arch 2010;457:483—95. [35] Simonetti S, Molina MA, Queralt C, et al. Detection of EGFR mutations with mutation-specific antibodies in stage IV nonsmall-cell lung cancer. J Transl Med 2010;8:135. [36] Yu J, Kane S, Wu J, et al. Mutation-specific antibodies for the detection of EGFR mutations in non-small-cell lung cancer. Clin Cancer Res 2009;15:3023—8. [37] Koperek O, Kornauth C, Capper D, et al. Immunohistochemical detection of the BRAF V600E-mutated protein in papillary thyroid carcinoma. Am J Surg Pathol 2012;36:844—50. [38] Bogenrieder T, Herlyn M. The molecular pathology of cutaneous melanoma. Cancer Biomark 2011;9:267—86. [39] Brousset P, Delsol G. Emergence d’une spéciliaté médicale nouvelle: la pathologie. Med Sci 2011;27:651—5.

37 [40] Dacic S. Molecular diagnostics of lung carcinomas. Arch Pathol Lab Med 2011;135:622—9. [41] Jiang Y, Wang M. Personalized medicine in oncology: tailoring the right drug to the right patient. Biomark Med 2010;4:523—33. [42] La Thangue NB, Kerr DJ. Predictive biomarkers: a paradigm shift towards personalized cancer medicine. Nat Rev Clin Oncol 2011;8:587—96. [43] Rodriguez-Canales J, Eberle FC, Jaffe ES, Emmert-Buck MR. Why is it crucial to reintegrate pathology into cancer research? Bioessays 2011;33:490—8. [44] Hewitt RE. Biobanking: the foundation of personalized medicine. Curr Opin Oncol 2011;23:112—9. [45] Fournet JC. Pathologie integrative, un important champ de développement de la pathologie clinique. Ann Pathol 2012;32:79—90.