Phosphotransacétylases du BCG et de Mycobacterium phlei

BIOCHIMIE, 1976, 58, 879-880.

Phosphotransacdtylases du BCG et de

Mycobacterium phlei.

A. ANDI1EJEXV ~>, M . - T . ORFANELLI e t J. DESBORDES.

Ecole Pratique des Hautes Eludes et C.N.R.S., Laboratoire de Physiopathologie Microbienne, 5 ter, rue d'Al~sia, 7501~ Paris. (3-2-1976).

L ' a c t i v a t i o n de l ' a c d t a t e a 6t6 tr~s p e u 6tudide c h e z les m y c o b a c t d r i e s (qui s o n t p o u r t a n t tr6s r i c h e s e n c o m p o s 6 s l i p i d i q u e s d o n t c e r t a i n s j o u e n t u n r61e t r 6 s i m p o r t a n t darts la p a t h o l o g i c de la t u b e r c u l o s e ) . N o u s a v o n s r 6 s u m d p r 6 c 6 d e m m e n t les o b s e r v a t i o n s c o n c e r n a n t l ' a c 6 t o k i n a s e d u BCG, q u c n o u s a v o n s purifide e n v i r o n 950 l o i s et d o n t n o u s a v o n s d d t e ~ m i n 5 cert a i n e s p r o p r i 6 t 6 s m o l 6 c u l a i r e s et c a t a l y t i q u e s . N o u s a v o n s c o m p a r ~ ces p r o p r i 6 t d s h celles de l ' a c 6 t o k i n a s e de M. phlei et a v o n s s i g n a l 6 les d i f f e r e n c e s o b s e r v d e s [1]. R a p p c l o n s q u e les p h o s p h o t r a n s a c ~ t y l a s e s d e s m y c o b a c t d r i e s n ' o n t p a s 6td 6tudi~es j u s q u ' h p r d s e n t . L e s p r 6 c i s i o n s c o n c e r n a n t les s o n c h c s , le m i l i e u de c u l t u r e et la t e c h n i q u e de p r 6 p a r a t i o n d e s e x t r a i t s b a e t d r i e n s , o u t dr6 d o n n ~ e s p r d c d d e m m e n t [l, 2]. L e s c u l t u r e s "~gdes de 8 (BCG) et 5 (ill. phlei) j o u r s s o n t b r o y d e s et l e u r s s n r n a g e a n t s s o n t p u r i f i 6 s d ' a p r b s lc s c h 6 m a s u i v a n t : c o n t a c t de 2 h a v e c MnCl_. 50 raM, c e n t r i f u g a t i o n , d i a l y s e d u s u r n a g e a n t c o n t r e le t a m p o n Tris-HC1 50 m M p H 7,4 a d d i t i o n n 6 de 2 - m e r c a p t o ~ t h a n o l 5 raM, f r a c t i o n n e m e n t a v e c (NH~).~SO~. L e s f r a c t i o n s a c t i v e s o b t e n u e s s o n t filtr~es h d e u x r e p r i s e s s u e u n e colonrre (2,5 × 100 c m ) de S e p h a d e x G-200, ~ q u i l i b ~ e et 61n~e a v e c le t a m p o n Tris-HC1 50 rnM p H 7,4, a d d i t i o r m d de (NH~)2SO~ 200 raM, de KC1 100 m M et de 2 - m e r c a p t o ~ t h a n o l 5 ruM. L ' 6 1 u t i o n e s t a s c e n d a n t e et s ' e f f e c t u e ~t 3 °. D~bit : 5 m l / 1 5 m n e n v i ron. Exceptionnellement : chromatographic sur DEAEc e l l u l o s e d a n s les c o n d i t i o n s p r f i c ~ d e m m e n t d ~ c r i t e s [1]. L ' a c t i v i t 4 de l a p h o s p h o t r a n s a c d t y l a s e (AedtylCoA : o r t h o p h o s p h a t e a c ~ t y l t r a n s f 4 r a s e , EC 2.3.1.8) e s t 6valu~e, s o i t e n m e s u r a n t d i r e e t e m e n t a n s p e e t r o p h o t o m 6 t r e l ' a e c r o i s s e m e n t de l a d e n s i t ~ o p t i q u e d u e h l a f o r m a t i o n d e l ' a e ~ t y l - C o A [3], 1

A e ~ t y l - P -4- HS-CoA ~ - ~ " Ae~tyl-S-CoA d- p h o s p h a t e , 2

s o i t e n e o u p l a n t cette r 6 a e t i o n a v e e l ' a e ~ t y l a t i o n de l ' a r s 6 n i a t e [4] ; e e t t e d e r n i 6 r e m ~ t h o d e ~ t a n t p r i n e i p a l e m e n t emp.loy~e a u e o u r s d e s e s s a i s de p u r i f i c a t i o n des p h o s p h o t r a n s a e ~ t y l a s e s . R a p p e l o n s q u e l ' a e ~ t y l CoA p o s s 6 d e u n c o e f f i c i e n t d ' e x t i n e t i o n p l u s ~lev6 q u e celui d u CoA : Ae = 4,44.106 c m 2 / m o l e [3]. L e s f r a c t i o n s p o u r v u e s de l ' a c t i v i t 6 sp~cifique la p l u s 61evde p r ~ c i p i t e n t a v e e (NH,)._,SO~ 1,2 h 1,4 M (BCG), o u 1,4 ~t 1,6 M (M. phlei). P o u r n n e colon.ue (2,5 X 25 cm) de D E A E - e e l l u l o s e , l ' d l u t i o n de l ' a c ~ t o k i u a s e et de l a p h o s p h o t r a n s a c 6 t y l a s e d u BCG s'effectue, darts les m ~ m e s c o n d i t i o n s [1], a v e c le p h o s p h a t e 36 m M et 176 raM, r e s p e e t i v e m e n t ; le g r a d i e n t ~ t a n t l i n 6 a i r e . A q u i r o u t e c o r r e s p o n d a n c e d o l t ~tre a d r e s s d e .

A p r 6 s d e u x p a s s a g e s s u c c e s s i f s s u r S e p h a d e x G-200, les p h o s p h o t r a n s a c 6 t y l a s e s d u BCG et de M. phlei s o n t p u r i f i ~ e s e n v i r o n 80 l o i s , a v e e u n r e n d e m e n t r e s p e c t i t de 10 et de 30 p. cent. Les f r a c t i o n s a c t i v e s a i n s i obtenues ne torment pas d'ac6tyl-CoA en prdsenee d ' a c 6 t a t e , de A T P et de CoA [he p o s s ~ d e n t a u e u n e a c t i v i t 6 d ' a c 6 t a t e : C o A l i g a s e (AMP), EC 6.2.1.1], e l l e s n ' h y d r o l y s e n t p a s l ' a c ~ t y l - P et s o n t t o t a l e m e n t d6pourvues d'ac6tokinase (ATP:ac6tate phosphotransf& r a s e , EC 2.7.2.1). Le PM (6valu6 p a r f i l t r a t i o n s u e gel de S e p h a d c x ) e s t de l ' o r d r e de 160 000 (BCG et M. phlei) ; le g r a p h i q u e de r 6 f 6 r e n c e ( K ~ e n f o n c t i o n d u log de la m a s s e m o l 6 c u l a i r e ) 6 t a u t t r a c 6 d ' a p r ~ s les i n d i c a t i o n s d o n n 6 e s p r 6 c 6 d e m m e n t [2]. L ' e n z y m e purifi~e d u BCG e s t n e t t e m e n t m o i n s s e n s i b l e q u e eelle de M. phlei a u x v a r i a t i o n s d u p H ( e n t r e 6 et 7,5). L e p H o p t i m a l ( c a e o d y l a t e et Tris-HC1) e s t de 6,6 h 7,2 (BCG) et de 7,4 (ill. phlei). TABLEAU I.

Influence des ions. Concentration

(haM)

T6moin NH4CI (NH:,)eSO~, KCI NaCI

10 20 50 10 10 10

MgCI~ CaC12

10 10

CoCI~

10

1

1 1

P. cent d'activit6 BCG

M. phlei

100 212 179 176 233 183 67 81 82 37 59 25 59

100 320 366 351 291 251 83 108 91 108 115 83 108

Les p o u r c e n t a g e s d ' a e t i v a t i o n o b t e n u s a v e c les i o n s N H , + o u K + s o n t n e t t e m e n t p l u s 61eves d a n s le c a s de l ' e n z y m e de M. phlei q u e darts c e l u i d u BEG. L ' e f f e t i n h i b i t e u r des i o n s N a +, Ca ++ et Co ++ est, e a r e v a n c h e , p l u s p r o n o n c 6 d a n s le c a s d u BCG ( t a b l e a u I). L ' e f f e t s t a b i l i s a t e u r d e s i o n s N H F e s t n e t darts t o u s l e s cas. L e s p h o s p h o t r a n s a c ~ t y l a s e s d u BCG et de M. phlei s o n t f o r t e m e n t i n h i b ~ e s p a r I ' A T P et, h u n degr~ m o i n d r e , p a r I ' A D P ; l % n z y m e de M. phlei ~ t a n t n e t t e m e n t p l u s s e n s i b l e h l ' ~ g a r d de ces a d 6 n o s i n e - n u 6O

A. Andrejeu,, M.-T. Orfanelli et J. Desbordes.

880

e l d o t i d e s ( t a b l e a u II). L ' a e t i v i t 6 n ' e s t p a s i n f l u e n c d e p a r le NAD + o u le NADH. S u r ee p o i n t les p h o s p h o t r a n s a c 6 t y l a s e s de CIostridium t y r o b u l y r i c u m [5] o u de Escherichia colt [6] r ~ a g i s s e n t de f a q o n diff6rente. L ' a e t i v i t 6 de l ' e n z y m e de C. t y r o b u t g r i c u m n ' e s t i n f l u e n c 6 e p a r a u e u n de ces n u c l 6 o t i d e s , l a n d i s q u e celle de E. colt e s t f o r t e m e n t i n h i b d e p a r le N A D H el,

L e s m e s u r e s de l a c i n 6 t i q u e d ' i n a c t i v a t i o n p a r la t e m p 6 r a t u r e s o n t f a i t e s d a n s le t a m p o n d ' 6 1 u t i o n c o n t e n a n t les i o n s NH~+ et p o r t e n t s u r d e s p r 6 p a r a t i o n s c o m p a r a b l e s des p h o s p h o t r a n s a c ~ t y l a s e s filtr~es s u r S e p h a d e x G-2~)0. L a p h o s p h o t r a n s a e 6 t y l a s e d u B E G e s t nettement plus sensible h l'inactivation thermique que

0,0

TABLEAU II.

,~ 6 0 °

I n f l u e n c e des nucldotides (0,5 raM).

"o.% 6 0 o

P. cent d'activit6

%

BCG

M. phlei

100 44 85 92 90

100 9 26 105 105

65 °

~S,5 2

T~moin . . . . . . . . . . . ATP ............. ADP ............. NAD + ............ NADH ...........

:8

"~,o u n degr6, r e s p e c t i v e m e n t , q u a t r e et v i n g t f o i s m o i n d r e p a r I ' A D P et I'ATP. I1 e s t d o n e p o s s i b l e q u e I ' A T P p u i s s e e x e r e e r ehez l e s m y e o b a c t 6 r i e s u n effet r 6 g u l a t e u r p a r t i e u l i b r e m e n t i m p o r t a n t s u r la f o r m a t i o n de l ' a e 6 t y l - C o A . P a r a i l l e u r s , le p y r u v a t e a c t i v e l ' e n z y m e de E. coli [~6] et n ' e x e r e e p a s d'effet s u r les p h o s p h o - t r a n s a e d t y l a s e s d u BCG et de M. phleL L ' e n z y m e de Bacillus subtilis [7] e s t 6 g a l e m e n t i n s e n s i b l e a u p y r u vate, m a i s s e n s i b l e h l'effet i n h i b i t e u r d e s a d 6 n o s i n e nuel4otides.

'oh

65 °

L e s v a l e u r s m o y e n n e s de la e o n s t a n t e d'@quilibre, o b t e n u e s h 29 °, d a n s le t a m p o n Tris-HC1 p H 7,2 (BCG) o u 7,4 (M. phlei),

Keq [ae6tyl-CoA] [Pi]

T e m p s de e h a u f f a g e (ran) = 206 (BCG) et 215 (M. phlei),

[ a c d t y l - P ] [CoAl i n d i q u e n t q u e la r d a c t i o n s ' e f f e c t u e f o r t e m e n t e n f a v e u r de l a f o r m a t i o n de 1'ac6tyl-CoA. Ces v a l e u r s s o n t 4 'h 6 f o i s p l u s 61ev6es q u e c e l l e s de C. t y r o b u t y r i c u m [5]. L a f o r m a t i o n de l ' a c 6 t y l - C o A se t r o u v e d o n e n e t t e m e n t p l u s f a v o r i s ~ e c h e z l e s m y c o b a e t 6 r i e s ; ee f a i t p o u v a n t ~tre e n r a p p o r t a v e c l e u r g r a n d e r i c h e s s e en compos~s lipidiques. E n p r 6 s e n c e de CoA 0,3 m M , n o u s o b t e n o n s p o u r l ' a c 6 t y l - P (29 °, T r i s ) d e s Km de 4,65.10-4 M (BCG) et de 2,4.10-4 M (3I. phlei) ; t a n d i s q u ' e n p r 6 s e n c e de l ' a c 6 t y l - P 2 m M , le ;K~ p o u r le CoA (29 °, T r i s ) e s t de 1,13.10-4 M (BCG) et de 1,06.10-4 M (M. phlei). E t a n t d o n n 6 q u e ees v a l e u r s ( s u b s t r a t : a c ~ t y l - P ) s o n t 10 o u 20 l o i s m o i n s 61ev@es q u e celles de E. colt [8] o u de C. t y r o b u t y r i c u m [5], il e s t p o s s i b l e q u e l ' a f f i n i t 4 de l ' e n z y m e p o u r ce s u b s t r a t s o i l p l u s g r a n d e d a n s re c a s des mycobact4ries. E n p r d s e n c e de l ' u n e (BCG) o u de l ' a u t r e (M. phlei) de ces p h o s p h o t r a n s a c 4 t y l a s e s , l ' ~ n e r g i e d ' a . e t i v a t i o n a p p a r e n t e d e la r d a c t i o n (mesur@e e n t r e 20 et 33 °) e s t relativement faible : 4 500 c a l / m o l e (BGG) ; 3 400 c a l / m o l e (M. phlei).

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 7.

FIG. 1. - - Cindtique d'inactivation a 60 ° et & 65 °. • • BCG ( 6 0 ° ) ; • • BCG ( 6 5 ° ) ; O ....O M. phlei (60 o) ; [] [] M. phlei (65°). T e n e m - e n p r o t 6 i n e s : BCG ----- 70 itxg/ml ; M. p h l e l ---- 60 !~g/ml.

1 ' e n z y m e d,e M. p h l e i ; e e t t e d i f f 6 r e n e e d e v i e n t n e t t e a n delft de 55 °. A 60 °, e o m m e h 65 °, l ' i n a e t i v a t i o n d e ces e n z y m e s , e n f o n e t i o n d u t e m p s de e h a u f f a g e , e s t l i n ~ a i r e (fig. 1). BIBLIOGRAPHIE. 1. A n d r e j e w , A., O r f a n e l l i , M.-T. & D e s b o r d e s , J. (1975) Bioehimie, 57, 13'89-1390. 2. A n d r e j e w , A., O r f a n e l l i . M.-T. & D e s b o r d e s , J. (1974) Ann. Microbiol. (Inst. P a s t e u r ) , 125 A, 323-339. 3. K l o t z s e h , H. R. (1969) in Meth. Enzymol., 13, 381386. 4. S t a d t m a n , E. R. (1952) J. Biol. Chem., 1~6, 527-534. 5. T o u r a i l l e , C. a Berg~re, J.-L. (1974) Bioehimie, 56, 405-422. 6. S u z u k i , T. (19'69) Biochim. Biophys. Acta, 191, 559569. 7. R a d o , T. A. & H o e h , J. A. (1973) Biochim. Biophys. Aeta, 321, 114-125. 8 S h i m i z u , M., Suztrki, T., K a m e d a , K. Y. z, Abiko, Y. (19'69) Biochim. Biophys. Aeta, 191, 550-558.