Physiologische Untersuchungen über thermophile Kohlenwasserstoffverwertende hyphenpilze

Zbl. B akt. II. Abt. 135 (1980 ), 275 -289 [A us del' Sektion B iolog ie d el' Fried rich-Schi ller-Unive rs itiit, Wis senschaftsbereich Allge meine Mikrobiologie]

Physiologische Untersuchungen tiber thermophile Kohlenwasserstoffverwertende Hyphenpilze Physiological Studies on Thermophilic Hydrocarbon-utilizing Hyphae Fungi W . BEr.mANN und A. VOIGT Mit 12 Abbildungen

Summary Out of dilferent substrates, t hermophilic n-alkane-assimilating h yphae fungi were isolat ed and t hc st ra ins of Aspergillus [u miqatu« and Mucor lusitanicus select ed for physiological investi gati on s. The growt h curves, obtain ed in hydrocarbon and gluco e at d iffer ent t emperatures, sho wed three p h ases : I ) initial growth phase, 2) linear growt h p hase, and 3) ly sis ph ase. Ma ximum dry m atter an d maxim um p rot ei n con te nt occurred wit h in a r ang e of :3 5 - 40 "C. During t he ent ire t ime of g ro wth the D N A content pel' mg dry matter wa s almost the sa me , i.e. , 0. 1-0.2 per cent. The ascertaine d sp ecifi c prot ea se ac t ivi ty of Aspergill us f um igatus correla te d with protein synt hesis and prot ein decomposition of the b iom as s. The resu lts of our in vest igat ions a re being discus sed .

Zusammenfassung Au s ve rsc h iede ne n Subs trate n wurclen t hermophile n -Alk an -assim ilier r-n do H yphenpilze isoliert, von denen d ie Stiimme A sp ergillu s [urn iqatu s u nd M ucor lusitanicus Iur physiologische Untersu ch ung en a u sgew iihl t wurd en . D ie er m it telten W a ch stumsku rvs n im K ohlen wasserst offu nd Gluk ose-Med iu rn zeigten bei versch ied en en T emper atu ren drei Ab schnitte : 1. Anlaufwach st u ms phase, 2. 1ineare " ' a ch st u msph ase und 3. L ysephase. D ie m ax im al e Trockenmasse und del' h ochste P roteingehalt wurden von 35 - 40 °C geb ild et. Del' D N S-Geh al t pro l\lilligra mm Trocken subst a n z betrug tiber di e gesamte W a ch st.umszeit fast gleichbleib end 0, 1- 0,2 P ro zent . Di e im l\l yzel u nd Kulturfiltrat bestimmte s pe zifische Prot eaeeakti vit.at von A sp ergillus [umiqatue kO I'reli erte mit del' P ro tein sy nthese unci dem Prot ein a bbau del' Bi om a sse. D ie E rgebn isse de l' Unter su chu ngen wurd en di skut iert.

Erst seit wenigen Jahren sind thermophile Kohlenwa sser stoff-(KW-)verwertende Mikroorganismen, die fur di e Forsc hung und industrielle N utzung offenbar zunehmend a n Bedeutung gew in nen , bekannt . Von BORODINA et a l. (1972), HAGGSTROM (1975), K LUG und MARKOVETZ (1967), KVASNIKOV et al. (1971), MALASHENKO et al. (1975), MATELES et a l. (1967), MIKHALEVA et al. (1976), PHI LIPS und PERRY (1976), P OZr.IOGOVA (1971), SNEDEDOR un d COONEY (1974) sow ie v on VYBORNYKH und E GOIWV (1975) w urden t he rmophi le Bakterienstamme, die ha ufig methy lotro ph sind, nachgewi esen. B ORODINA et a l. (1972) fanden b ei T orulopsis candida, I SAKovA et a l. (1974), K VASNIKOV et a l. (1969) , L OGINOVA und P OZJIOGOVA (1969), LOIKo et al. (1974) und P OZ"IOGOVA (1972) bei Can dida tropicalis sowie LE VINE und COONEY (1973) bei H ans enula t h ermotolcrante, K'V-konv er ti er ende St iim m e. Vo n den H y ph enpilzstammen Chaetomium thermophile, J1[ ucor pueilius lind S tilbea therrnophila (FERGUS 1966) sowie vo n A sperqiliu« /umigatus und Cladosporium. resinae (SCOTT und IS"

276

W. BEM~IAKK und A. VOIGT

FORSYTH 1976) konnte ebenfalls ein Wachstum auf KW-haltigem Nshrmedium in einem thermophilen Temperaturbereich festgestellt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden wachstumsfreudige thermophile n-Alkanverwertende Hyphenpilzstamme isoliert und physiologische Leistungen, wie Biomasse-, Protein- und DNS-Bildung sowie spezifische Protease-Aktivitat bei einem pH-Bereich von 7 -8 im Myzel und Kulturfiltrat in dem Temperaturbereich von 30-55 "C, ermittelt. Weiterhin erfolgte die Bestimmung der Temperaturlimitation des Wachstums von beiden Stammen.

Material und Methoden Erdproben, die mit Schmierolen und Verbrennungskraftstoffen angereichert waren, und Proben aus Boden mit hohem Gehalt an organischer Substanz, wie Lauberde, Kompost und Torf, dienten zur Isolierung thermophile I' Paraffin-avsimilierender Hyphenpilzstamme, Fiir die physiologischen Untersuchungen wurden von den eigenen Isolaten die wachstumsfreudigen Pilzstammo Aspergillus fumigatus (AT) und Mucor lusitanicus (MT) ausgewahlt, Ein Nahrrnedium, abgewandelt nach LODDER und KREGER VAN RIJ (1952), kam Iur die Isolierung, Stammhaltung und Kultivierung zum Einsatz, wobei als alleinige C- und Energiequelle 5 ml steril filtriertes n-ParoxParaffin II bzw. im Vergleich 7,94 g Glukose pro Liter verwendet wurden. Zur Ermittlung del' spezifischen Protoassaktivitat wurde ein Nahrsubst.rat nach SCHRODER und WErDE (1973) benutzt. Auf Agarplabten mit KW-Medium, das bei 43 oder 47 "C bebriitet wurde, erfolgte die Isolierung von Pilzstammsn. Zur Bestimmung del' minimalen und maximalen Temperut.urgrcnze des Wachstums wurdon die St.ammo auf Schragagarrohrchen in einem Thermostaten vom Typ U 10 kultiviert., Die Standkultur wurde mit 50 ml Nahrlosung in 200 ml Erlenmeyerkolben in einem Brutaohrank bei Ternporaturen von 30, 35, 40, 50 und 55°C durchgefuhrt. Ein Zweilitel'-Eigenbaufermentel' kam fiir eine batch-Kultur mit folgenden Bedingungen zum Einsatz: I I Nahrlosung, 800 oder 200 U . min " ! Riihrgeschwindigkeit, 350 I . h- 1 Beliiftungsmenge, 35°C und Anfangs-pH-Wert 5,4-5,5. Die aus dem Fermentergefaf entnommene Probenmenge wurde volurnenmafiig durch frische Ns.hrloaung ohne C-Quelle ersetzt. Das Inokulat wurde von sporulierenden Kulturen auf Schragagarrohrchsn mit Aqua dest. abgeschwemmt. Die mit einer Thomakammer ermittelte Sporenzahl betrug beim Stamm AT 1,09-3,92 X 10 5 und beim Stamm MT 1,4-5,63 X 104 pro Milliliter Nahrlosung bzw. pro Agarplat.te, Die gebildete Biomasse wurde vom Kulturfiltrat abgesaugt, mit Aqua dest. gewaschen und wieder aufgenommen. Danach folgte die Trocknung auf Filterpapierplat.tchan vom Typ Filtrak Nr.389 72 Std. bei 100°C im Trockenschrank. Von lyophil getrockneter Biomasse wurde die Proteinmenge nach del' Methode LOWRY et al, (1951) und del' DNS-Gehalt nach del' Methode HESSE et al. (1975) bestimmt. I'm Kultufiltrat wurde del' pH-Wert elektrometrisch, die Proteinmenge, del' Glukosegehalt mit dem Fermognost-Blutzucker-Testbesteck, die P0 43--Menge nach del' Methode MARTELAND und ROBINSON (1962) und del' NH 4-Gehalt in Conway-Schalen mit K 2COa-Losung ermittelt. Nach einer modifizierten Methode von ANSON (1938) erfolgte die Bestimmung von Protoase-Akt.ivit.at bei einem pH-Bereich von 7 -8 in Myzel und Kulturfiltrat. Eingefrorones Myzel wurde mit gleicher Volumenmenge Ballotinis del' Korngrofie 0,5-0,7 mm Durchmesser in einem Vibrationshomogenisator vom Typ VH 61 bei 4°C zerstort, mit Aqua dest. gewaschen und 15 Min. bei 15000 X g abzentrifugiert. Del' Uborstand lieferte nach einer Filtration durch Filterpapier vom Typ Filtrak Nr, 389 das Rohenzymgemisch, dessen Aktivitat an einer 0,1 % (wjv) Caseinlosung in Mjl5 Phosphatpuffer pH 7,2 bei 35, 40 und 45°C gemessen wurde, Eine Tyrosin-St.ammlosung diente zur Angabe del' spezifischen Aktivitat del' Enzymlosung Iur ,uM 'I'yrosin pro mg Protein und pro Minute.

Ergebnisse und Diskussion Aus den verschiedenen Erdproben konnten zahlreiche Hyphenpilzstamme isoliert werden, wobei von wenigen zentimetergroBen Filterpapierstiicken, getrankt mit Substratsuspension, die Agaroberflache am lippigsten bewachsen wurde. Zwei Stamme mit gro13er Myzelbildung wurden fur physiologische Untersuchungen ausgewahlt,

277

Physiologische Untersuchungen

Nach dem Bestimmungsschliissel von RAPER und FENELL (1965) und ZYCHA (1969) konnten die Stiimme als Aspergillus fumigatus und Mucor lusitanicus taxonomisch eingeordnet werden. Bei del' Isolierung waren nul' die Substrate ergiebig, die thermophile Potenzen aufwiesen, nicht abel' die Substrate mit Kohlenwasserstoffen. Die Fahigkeit zur KW·Konvertierung ist bekanntlich bei vielen Mikroorganismen, die natiirlicherweise andere C· und Energiequellen nutzen, vorhanden. :FERGUS (1966) konnte beim Test von thermophilen Hyphenpilzen auf KW·Niihrmedium zwei Spezies mit Wachstum nachweisen.

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Abb. 1. Trockenmasse und pH-Wel'te auf KvV-i\Iedium in St.andkultur des Prlzstannncs AT.

278

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"OcC "5°C 50°C Abb.2. T rock enmasse unrl p H ·\\'e rte a uf Gluko se -Medi um des Pilzstammes AT .

Die Temperaturgrenzen fur das Wachstum auf KW-Mediumlagen beim Stamm AT bei 23 und 50 °0 und beim Stamm M1' bei 25 und 52 °0 . Auf Glukoseagar wuchs der Stamm AT im Temperaturbereich von 19-51 °0 un:! d er Stam m lV11' von 25 - 56 °0 . Der Stamm M. lusitan icus ist na ch den Krit erien vo n OOOXEY und E;\IERSON (1964) als obligat t hermophil lind von EVANS (1971) als stark t her mop hil einzuordnen, woo gegen der Sta mm A. furnigatus als t hermophil bzw. stark th erm ot oleran t zu bezeichnen ist. D ie Unt ersuch ungen von J UNO et al. (1974) sowie von H ABERSTICH und ZUBER (1974) best iitigen , dall sich die K ardinalwachstumst em pera turen a ndern konnen, hiiufig begleitet von Anderung im Enzymspiegel und in der Thermo stabilitiit gewisser Enzyme. Der zeitli che VerIauf der Biomassebildung und d ie cH+ des Kulturfiltrates bei verschiedenen Temperaturen in Standkultur beider Stiimme ist in den Abb . 1-4 dargestellt,

279

Physiologische Un tersuc hunge n

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An den Abbildungen ist zu erkennen, daf die maximale Biomassebildung bei beiden Stammen auf KW· und Glukose -Medium bei 35 °C auftrat, wobei beim Vergleich der Ertragshohe von K W· und Glukose.Nahrsubstanz bei dem Stamm MT im Gegensatz ZUlU Stamm AT kein nen nenswerte r Unterschied festst ellbar war. Die Abb. 5 - 8 stellen d ie Wachstumskurven und die cH+ des Kulturfiltrates beider St am me von einer F erm entkult ur bei 35 °C da r. Die Kultivierung erfolgte mit Gluko se als limitierendem Faktor, St ickstoff und Phosph or waren wa hrend der gesamt en Wachstumszeit im Ub erschull vorha nden . Ubereinstimmend mit den Abb, 1-4 zeigen die Abb . 5-8 drei abgrenzbare Wachstumsphasen: 1. Anla ufwachstumspha se, in der da s Wachstum lan gsam bega nn, 2. lineare \Vachstul11sph ase, bei der die Trockenmasse linear zunahm und

3. Lyseph ase, in der die T rockenm asse im wesent lichen ab na hm, sicherlich bed ingt d urch Iy tisehe Prozesse in der Biomasse.

280

W. BEMl\IA~N und A.

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Abb, 4. Trockenmasse und pH- '\Verte des Pilzstammes ::\IT auf Glukose-Medium.

Weiterhin ist aus den Abbildungen zu entnehmen, daB sich die Zeit bis zum Erreichen des Maximums in der Biomassebildung im Fermenter gegenuber der Standkultur verkiirzte, wenngleich der Peak im KW-Nahrsubstrat niedriger und im GIukose-Medium hoher als in der Standkultur lag. Die Ergebnisse der cH+-Untersuchungen bestatigen die Feststellung von COURTOIS (1973), wonach die cH+ in direkter Beziehung zur Biomassebildung steht. In den Abb. 9 und 10 werden die Untersuchungsergebnisse tiber die prozentualen Protein- und DNS-Mengen in der Trockenmasse wahrend des Wachstums bei verschiedenen Temperaturen in Standkultur wiedergegeben. Die Abb. 5, 6 und 8 zeigen auch die Protein- und DNS-Mengen von der Biomasse, die in der Fermenterkultur erzeugt wurde. Der Stamm MT bildete in KW-Nahrsubstrat zu geringe Trockenmassen, so daB nicht zu allen MeBzeiten Protein- und DNS-Gehalt ermittelt werden konnten. Es ist auffallend, daB der hochste Proteingehalt in der Anlaufphase des Wachstums nachweisbar war und die proteinreichste Biomasse bei 40°C (Stamm AT 37,3 % und Stamm MT 34,2 %) gebildet wurde. In der linearen Wachstumsphase verminderte sich die Proteinmenge auf den von Hyphenpilzen bekannten Wert von 15-25 %. Eigenartigerweise erreichte der Stamm AT im Fermenter maximal nur 12 % Protein. Die DNS-Menge erreichte etwa parallel mit dem Protein-Peak ebenfalls ihr Maximum und blieb in den folgenden Wachstumsphasen mit 0,1-0,2 % nahezu konstant. Die Protein- und DNS-Synthese war beim Stamm MT bei 55°C sichtlich gehemmt.

Physiologische Untersuc h ungen

281

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Abb.5. Tr ockenmasse, Prot ein- und Medium d es P ilzst a mmes A 'T.

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sowie p H -Wert e bei F errn enterkultur im KW-

Entsprechend der vorliegenden Ergebnisse bildeten beid e Sta mme auf KWMedium in Standkul tur im Vergleich zur F erm ent erkultur mehr 'I'ro ckenm asse, Protein und DNS, was mit den Abg ab en von BE:\IIItANN und TROGER (1975) tiber den Vergl eich von Stand- und Sohiittelk ult ur ub ereinstimmt. Bekanntlich wa chst ein H yphenp ilz bei Schiittel- lind F er ment erkult ur mit Rtihrung und Zusatzbeliift ung im wesentlichen subillers, wobei die Bewegung einer Niihrl6sung mit f1iissigen nAlkanen als alleiniger C· und Energiequ elle zu einer Trennung ode r a uch Vermi schung der vers chiedenen Phasen im Kulturgefiif3 fiihren kann. Wahrscheinlich fiihrt en die fur die Versuche gewahl t en Bedingungen nicht zu einem stetigen und ausreichenden Kontakt der Biomasse mit den flussigen Paraffinen und der einge blase nen Luft, so daf das Wachstum trotz des Vorha nde nseins a usreichende r Nahrstoffe gehem mt war. Beim Sta m m lHT war das Wachstum im Fermen ter bei einer R iihrgeschwindigkeit von 200 U . rnirr ! wesen tli ch hesser als hei 800 U· min- I. H OFFMANN lind R EHM (1976) fan den hei zahlreiehen St ammen a uf K\V- Agarmedium unci nur hei wenigen Stammen in flu ssigen Na hrsubstrate n eine op ti male Biomassebildung. Di e Abb . 11 und 12 vera nscha ulichen die sp ezifische Prot ein-Ak ti vitat im Myzel unci Kulturfiltrat vom P ilzst arnm AT bei verschiedenen Tempera turen. Aus cien Abbilciun gen ist ein deutli cher Unterschied der spezifischen Prot easeAktivitat im Myzel unci Kulturfiltrat erkennbar, bedingt durch den differierend en Proteingehalt irn Myzel und Kultursub strat, unci ciadurch au ch nicht miteinanrler vergleichh ar . Irn Myzel wurde die hochst e Prot.ease-Aktivitat Zll Wa chstumsbeginn nachgewiesen , die sich im weit eren W a chstumsv erlauf allma hlich verringerte . Da s

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W.

BEMMANN

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Abb. 6. Trockenmasse, Protein- und DNS.J\fenge Bowie pH- 'Yerte bei Fermenterkultur irn Glukoso-Medium des Pilzstammes AT.

Niveau der Enzymaktivitat lag im Myzel, das im Glukose-Medium gebildet wurde, hoher als im Myzel, das im KW-Niihrsubstrat heranwuchs. Im Kulturfiltrat war ebenfalls Enzymaktivitat vorhanden, die im KW-Medium au13er bei 45 °0 schon zu Kulturbeginn, dagegen in Glukose-Medium erst gegen Ende der KuIturzeit verstarkt auitrat, In Ubereinstimmung mit dem Proteingehalt der Trockenmasse trat die spezifische Proteaseaktivitat, die im ersten Drirtel des Wachstumsverlaufes und dem anschlieBenden Abbau von Protein hoch war, in Erscheinung. Sicherlich resultierte die im Kulturfiltrat freigesetzte Tyrosinmenge aus lytischen Prozessen der Biomasse, die bei Kulturen im KW·Medium scheinbar wesentlich friiher als im Glukose-Niihrsubstrat einsetzten.

Abb.7. Trockenmasse und pH-Werte bei Fermenterkultur im KW-Medium des Pilzstammes MT. Abb. 8. Trockenmasse, Protein- und DNS-Menge Bowie pH- ,",,'erte bei Fermenterkultur in Glukoso-Medium des Pilzstammes MT.

Physiologische Untersuchungen

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Abb. 9. Protein- und DNS-JHengen auf Glukose-l\Iedium in Standkultur des Pilzstammes AT

P hys iologische Unt ersu chu ngen

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286

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Abb. II. Spezifische Protease-Aktivitiit im Myzel auf KW- und Glukose-Medium des Pilzstammes AT.

P hysiologische Un t ersu chun gen

287

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Abb. 12. Spezifische P rotease-Aktivit iit im K ult urf ilt rat auf K W· un d Glukose-l\Iedi um de s Pi lzst a mmes AT.

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W. BEMMAKN und A. VOIGT

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