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Purification de la catéchol-O-méthyltransférase (EC. 2.1.1.6) du placenta humain et étude de quelques propriétés
BIOCHIMIE, 1976, ~8, 1401-1403.
Purification de la catdchol-O-m6thyhransfdrase (EC. 2.1.1.6) du placenta humain et 6tude de quelques propri6tds c)("). P a t r i c k DARMENTON, L u c i e n CRONENBERGER ~ et H e n r i PACHECO. 5eruice de Chimie Biologique, B ~ t i m e n t ~06, I n s t i l u t National des Sciences Appliqades, 20 Avenue Albert Einstein, 69621 Villeurbanne Cddex.
(5-5-1976).
INTRODUCTION. La c a t d c h o l - O - m f i t h y l t r a n s f ~ r a s e (COMT) (EC 2.1.1.6) c a t a l y s e le t r a n s f e r t d ' u n g r o u p e m e n t m ~ t h y l e de la S - a d 6 n o s y l m ~ t h i o n i n e (SAM) s u r u n accepteur de s t r u c t u r e o r t h o d i p h d n o l i q u e ou 6he diol [1]. Largem e n t r 6 p a n d u e d a n s l ' o r g a n i s m e [2, 3], elle est a u s s i p r d s e n t e darts le ,placenta [4]. P o u r Lisalo et coll. [41 la COMT i n t e r v i e n d r a i t darts le c a t a b o l i s m e des catdc h o l a m i n e s d o n t la presence en q u a n t i t 6 excessive serait d a n g e r e u s e p o u r le fcetus. Gulger et coll. s o n t les seuls h avoir tent~ la purification et l'6tude de la COMT du p l a c e n t a h u m a i n [5]. E n ce qui n o u s coneerne, ec t r a v a i l s'int6gre d a n s le cadre d ' u n e dtude des e n z y m e s p l a c e u t a i r e s p o u v a n t poss~der u n int~r~t t h 6 r a p e u t i q u e . II f a i l suite h la purification de l ' h i s t a m i n a s e ou d i a m i n e : oxyg6ne o x y d o - r d d u c t a s e [6].
Produits. Nous a v o n s pr~par$ la SAM h p a r t i r de c u l t u r e de levure de b o u l a n g e r i e , s u r u n m i l i e u enrichi en m(~t h i o n i n e [7] en s ' i n s p i r a n t d u b r e v e t prdsent5 p a r Haiti et coll. [8]. La g a i a c o l p h t a l 6 i n e (GP) a 6t6 s y n t h d t i s ~ e a u l a b o r a t o i r e (par A. M. Malaweille) d'apr6s les l r a v a u x a n c i e a s de B a e y e r et K o c h e n d o r f e r [9]. P o u r l'61ectrofocalisation, les a m p h o l i n e s s o n t f o u r n i e s p a r LKB et tes a u t r e s p r o d u i t s sont des p r o d u i t s Merck e x t r a purs. Enfin les diverses prot6ines ~talons u t i lisdes p o u r la d ~ t e r m i n a t i o n du poids m o l $ c u l a i r e sont les s u i v a n t e s : l y s o z y m e du b l a n c d'ceuf (Sigma), m y o g l o b i n e de cheval (NBC), p e p s i n e cristallisde (NBC), h 6 m o g l o b i n e h u m a i n e cristallis~e (NBC), calalase de foie de bceuf (NBC), t h y r o g l o b u l i n e dc porc (Mann R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s ) . Solution et tampons. S o l u t i o n A : s o l u t i o n de s a c c h a r o s e (0,25 M) + m e r c a p t o 6 t h a n o l (10-3 M) ; t a m p o n B : pH 7,4 ; t a m p o n C : pH 6,2. Ces d e u x d e r n i e r s s o n t des t a m p o n s p h o s p h a t e s de p o t a s s i u m (KH._,POJK~HPO~.3H_oO) 2.10-2 M - f o r c e i o n i q u e : I = 0,120 4- m e r c a p t o d t h a n o l (10-3 M). Pr~cisions concernant la purification. T o n t e s les m a n i p u l a t i o n s s o n t faites & 4°C et les c e n t r i f u g a t i o n s rdalisdes h 20 000 g p e n d a n t 15 m i n u t e s 4°C ( c e n t r i f u g e u s e MSE). Les p o u r c e n t a g e s de s a t u (*) Ce m ~ m o i r e c o n s t i t u e u n e p a r t i e de la th6se de Doctorat-6s-Sciences P h y s i q u e s que dolt s o u t e n i r P. D a r m e n t o n . (**) Ce t r a v a i l a ~t~ r~alis~ darts le cadre d ' u n cont r a t de recherche entre l ' I n s t i t u t Mdrieux (69 Marcy l'Etoile) et I'INSA. A q u i route c o r r e s p o n d a n c e doit ~tre adressde.
r a t i o n a n s u l f a t e d ' a m m o n i u m cit6s s o n t calcu16s en s a c h a n t q u ' u n e s o l u t i o n saturde de (NHD~SO~ c o n t i e n t 4,1 M h 25°C [10]. L o r s q u e la t e c h n i q u e de c h r o m a t o g r a p h i e s u r $ c h a n g e u r d ' i o n s (CM- S e p h a d e x C 50) est utilisde cu bain, la r d c u p d r a t i o n du filtrat et de l'~luat est facilitde p a r l ' e m p l o i de p a n i c r s de c e n t r i f u g a t i o n con~us selon le mod61e propos6 par D e t e r m a n [;11]. Vitesse d'essorage : 3 000 t / m i n .
Mesure de l'activitd COMT. C'est la t e c h n i q u e c o l o r i m 6 t r i q u e d ' A n d e r s o n et d'Iorio [!12] h la p y r o c a t d c h o l p h t a l 6 i n e (CP) modifi~e p a r Gugler et coll. [5] que n o u s a v o n s employee. Dosage des prot~ines. Los protdines des e x t r a i t s peu purifi6s o n t ~t~ dos6es avec la t e c h n i q u e de W a r b u r g et C h r i s t i a n [13]. P o u r les e x t r a i t s p r ~ s e n t a n t u n e faible t e n e u r en prot6ines, n o u s a v o n s employ6 le dosage de Lowry et coll. [14] dont les courbes d ' ~ t a l o n n a g e ont 5l~ r6alis6es en presence de m e r c a p t o 6 t h a n o l p u i s q n e ce d e r n i e r i n t e r f e r e d a n s le dosage [15]. Electrofocalisation el ddtermination du p h i . La t e c h n i q u e est celle d6velopp~e p a r O. Vesterberg [!1~6], p o u r u n g r a d i e n t de pH s ' d t e n d a n t de 3,5 h 9,5. L ' a p p a r e i l (LKB 2117 Multiphor) est r~frig~r~ p a r u n c r y o s t a t qui m a i n t i e n t u n e t e m p e r a t u r e de 2°C. Apr~s m i g r a t i o n , le gel est d6coup5 en b a n d e s de 5 m m de l a r g e u r qne l ' o n h o m o g d n 6 i s e d a n s 2 m l d ' e a u d~sionis6e. S u r c h a q u e fraction, le pH est m e s u r ~ e t l a d6tecl i o n de l'activit~ COMT a t t r i b u e h l ' e n z y m e c o m m e p h i , lc pH de la f r a c t i o n off elle est prSsente. PURIFICATION DE LA COMT PLACENTAIRE.
Extraction de l'enzyme. 300 h 400 g de p l a c e n t a f r a i s d 6 p o u r v u de m e m b r a nes et de cordon o m b i l i c a l s o n t broy~s h l ' u l t r a t u r r a x d a n s la s o l u t i o n saccharosge A d a n s la p r o p o r t i o n de 70 m l p o u r 30 g de poids f r a i s d'organe. La ceutrifugation permet d'obtenir un surnageant limpide ( e x t r a i t S). Prdcipitation au sulfate d ' a m m o n i u m . Sur l ' e x t r a i t S (500 ml), on effectue u n e double pr6c i p i t a t i o n qui laisse s d d i m e n t e r les prot6ines i n s o l n bles d a n s les l i m i t e s de 40-55 p. cent de s a t u r a t i o n ell sel. N o u s avons vdrifi6 que ]e r e n d e m e n t d'activit6 COMT dtait m a x i m u m p o u r u n e dur~e de p r e c i p i t a t i o n d ' u n e heure. Chromatographie sur CM Sephadex C 50. Le cnlot protdique est repris d a n s u n v o l u m e m i n i m u m de t a m p o n B, p u t s d~ssal6 a v a n t d'etre c h r o m a -
P. Darmenton.
1402
L. Cronenberger
t o g r a p h i 6 s u r d c h a n g e u r d ' i o n s . C e t t e o p 6 r a t i o n a 5td r~alis~e p a r u n e f i l t r a t i o n s u r gel S e p h a d e x G 25. Le f i l t r a t o b t e n u : e x t r a i t G 25 (4 l o i s le v o l u m e i n i t i a l ) est acidifi6 h p H 6,2 ( + CH~COOH-M), p u t s p a s s 6 s u r u n e c o l o n n e (H : 16 cm, d i a m 6 t r e : %5 cm) de CM 8 e p h a d e x C 50 p r 6 e d d e m m e n t gonfl6 e t d q u i l i b r 6 h ce m 6 m e pH. O n o b t i e n t a i n s i u n e x t r a i t CM C 50, renfermant une faible teneur en h6moglobine.
Chrornatographie d ' e x c l u s i o n - d i f f u s i o n sur Biogel A 0,5 m. L e s p r o t d i n e s de l ' e x t r a i t CM C 50 s o n t p r d c i p i t d e s a u s u l f a t e d ' a m m o n i u m (70 p. c e n t de s a t u r a t i o n e n sel), isol6es p a r c e n t r i f u g a t i o n p u i s r e m i s e s e n s o l u t i o n d a n s u n v o l u m e m i n i m u m de t a m p o n B. A i n s i 300 m g e n v i r o n de p r o t 6 i n e s (soit la m o i t i 6 de l ' e x t r a i t CM C 50) s o n t d~posds s u r la c o l o n n e (H : 92 e m , d i a m 6 t r e 2,5 c m ) . L ' 6 1 u t i o n e s t r6alis~e avcc |e tampon B avec u n e v i t e s s e d ' 6 c o u l e m e n t de 10,2 m I / h e u r c / c m 2 .
Chromatographie sur Biogel P 100. De m S m e , a p r b s p r 6 c i p i t a t i o n a u s u l f a t e d ' a m m o n i u m et r e d i s s o l u t i o n d a n s le m i n i m u m de t a m p o n B, les p r o t d i n e s (20 m g e n v i r o n ) i s o l 6 e s de l a p r 6 c 6 d e n t e 6 t a p e s o n t d 6 p o s 6 e s s u r l a c o l o n n e de gel (H : 88 c m , d i a m 6 t r e : 2,5 c m ) . La c h r o m a t o g r a p h i e e s t d 6 v e l o p p6e s o u s u n e p r e s s i o n m a x i m a l e de 45 c m d ' e a u (d6bit a s s u r 6 6,5 m l / h e u r e / c m 2 ) .
et H. Pacheco.
Instabilitd de la COMT placentaire. S u r Ies e x t r a i t s S et CM C 50 o b t e n u s a p r 6 s p u r i f i c a t i o n de l ' e n z y m e , e n l ' a b s e n c e de t o u t c o n s e r v a t e u r , n o u s a v o n s 6 t u d i 6 la s t a b i l i t 6 de ]a COMT c o n s e r v 6 e h 4 ° . L a d u r 6 e de d e m i - v i e e s t de 10 h e u r e s p o u r l ' e x t r a i t S et de 18 h e u r e s e n v i r o n ~pour l ' e x t r a i t CM C 5.0. P a r c o n t r e ce d e r n i e r e x t r a i t , u n e f o i s l y o p h i lis6 et c o n s e r v 6 h - - 2 0 °, s e m b l e s t a b l e , p u i s q u ' i l f a u t 9 m o i s e n v i r o n p o u r q u e l ' e n z y m e p c r d e 50 p. c e n t de son activit6 initia%.
Recherche d'un agent stabilisant. S u b s t r a t s de la rdaction e n z y m a t i q u e . L ' ~ t u d e de la p r o t e c t i o n de l ' e n z y m e p a r ]es diff6r e n t s c o n s t i t u a n t s de la r 6 a c t i o n e n z y m a t i q u e , et s e l o n t o u t e s les c o m b i n a i s o n s p o s s i b l e s , a 6t6 f a i t e s u r u n e x t r a i t S r d a l i s 6 a v e r d u t a m p o n p h o s p h a t e 0,5 M p H 7,4. L a c o m b i n a i s o n d e s d e u x s u b s t r a t s avec l ' i o n activ a t e u r p r 6 s e n t e le m e i l l e u r p o u v o i r p r o t e e t e u r . Le CP r e t a r d e 1 6 g ~ r e m e n t la d 6 n a t u r a t i o n , q u a n t h l a SAM et a u Mg2~, e m p l o y ~ e n s e m b l e ou s 6 p a r 6 m e n t , l e u r p r e sence s'av6re n6faste.
Le saccharose. Nous avons not6 l'interf6rencc du saccharose dans le dosag.c de l ' a c t i v i t d COMT et 6 t a b l i l e s c o r r e c t i o n s q u i s ' i m . p o s a i e n t . N 6 a n m o i n s r o u t e s les e x p 6 r i e n c e s r 6 a l i s 6 e s s o n t e n f a v e u r d ' u n p o u v o i r p r o t e c t e u r de ce dioside.
P o i n t isodlectrique.
RESULTATS.
Bilan des diffdrentes dtapes de la p u r i f i c a t i o n de la COMT du placenta h u m a i n ( t a b l e a u I).
L a t e c h n i q u e d ' 6 1 e c t r o f o c a l i s a t i o n n o u s a p e r m i s de d 6 t c r m i n e r le p o i n t i s o 6 1 e e t r i q u e de l ' e n z y m e . A p r b s d 6 c o u p a g e d u gel e n u n e v i n g t a i n e , de b a n d e s , la
TABLEAU I.
P u r i f i c a t i o n de la COMT placentaire : t a u x de purification, dtude de rendement.
Etapes considdr~es
S u r n a g e a n t de c e n t r i f u g a t i o n ( E x t r a i t S)
Taux de protdines mg/ml
Hb p. cent/taux de prot6ines totales
Activitd spdcifique mU/mg de prot~ines
Taux de purification
Rendement de }'6tape
Rendement l'extrait S
100
100
35,25
46,2
0,019
P r 6 c i p i t a t i o n a n (NH4)o_ SO 4 40-: 55 p. c e n t -J- p a s s a g e s u r Sephad e x G 25 ( e x t r a i t G 25)
8,30
18,8
0,078
3,9
34,6
34,6
CM S e p h a d e x C 50 (colonne) ext r a i t (CM C 50)
3,18
4,0
0,125
6,3
69,1
23,9
B i o g d A 0 , 5 m ( e x t r a i t Biogel 0,5m)
0,29
<
Blogel P 100 ( e x t r a i t P 100)
0,05
<~4,0
4,0
L ' h 6 m o g l o b i n e (Hb) e s t e x p r i m 6 e e n p. c e n t p a r r a p p o r t t h 6 s e s : la d d s i g n a t i o n de l ' e x t r a i t .
L a COMT p ~ a c e n t a i r e a 6t6 o b t e n u e purifi6e 200 f o i s e n v i r o n , p a r r a p p o r t a u s u r n a g e a n t de c e n t r i f u g a t i o n et avec u n r e n d e m e n t de l ' o r d r e d e 10 p. cent. De p l u s , l ' ~ l e c t r o f o c a l i s a t i o n p r a t i q u 6 e s u r les d i f f 6 r e n t s e x t r a i t s o b t e n u s a p r 6 s c h a q u e 6 t a p e et a m e n d s / t u n t a u x de p r o t 6 i n e s c o n s t a n t (3,6 m g / m ] ) p e r m e t de j u g e r de l e u r s 5 t a t s de p u r e t 6 .
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.
1,055
53
69,4
16,6
4,350
218
80,8
13,4
aux protdines totales
[r6f. 17], E n t r e p a r e n -
m e s u r e d u p H a p r b s h o m o g 6 n d l s a t i o n p e r m e t de t r a c e r la c o u r b e de p H = f ( d i s t a n e e / h l ' a n o d e ) . L a COMT p l a c e n t a i r e e s t f o c a l i s d e a u pH~ = 5,0.
Poids mol~culaire (figure 1). Cette d d t e r m i n a t i o n a dr6 effectude e n u t i l i s a n t la m d t h o d e de f i l t r a t i o n s u r gel El7]. La e o l o n n e de gel
Pm'ification de la catdchol-O-mdthyltransfdrase (EC. 2.1.1.6). est p r 6 a l a b l e m e n t 6 t a l o n n 4 e a v e c 6 p r o t 6 i n e s p u r e s et V,. de p o i d s m o l 6 c u l a i r e d6fini. L a r e l a t i o n ~ o = f (log p o i d s m o l 6 c u l a i r e ) p e r m e t d ' a t t r i b u e r h la COMT d u p l a c e n t a h u m a i n le p o i d s m o l 6 e u l a i r e de 49 000 d a l tons. Volume d" dlution relatif Ve/
Vo
.2.5
LYSOZYME MYOGLOBINE
•2 0 ~ i l e s l ~ E ...............
-o---,~. COMT =
~HEMOG£OBINE
1,5
THYRoGLOBULINE
to
'& ....
~
Poids
.........
5
,o
.,o ~
mol~culaire.
Ddtermination du poids moldculaire de la COMT du placenta humain.
Fro. 1. - -
C h r o m a t o g r a p h i e d e s c e n d a n t e s u r Biogel A 1,5 m 5 0 - 1 0 0 m e s h (98 × 2,5 e m ) K ~ = 0,59. T h y r o g l o b u l i n e (6,5.10~) - - G a t a l a s e (2,3.105) - H 6 m o g l o b i n e (6,5.104) - - P e p s i n e (3,5.104). T a m p o n d ' 6 1 u l i o n : B + s a c c h a r o s e 0,5 M, p H = 7,4 - - v i t e s s e d ' 6 c o u l e m e n t : 5,7 m l / h / c m 2 - - Ve : v o l u m e d ' 6 1 u t i o n de la p r o t 6 i n e - - V o : v o l u m e m o r t de la c o l o n n e (184 m l ) . DISCUSSION.
L ' 6 t u d e de l ' a e t i v i t 6 r 6 s i d n e l l e de l ' e x t r a i t S e n f o n c t i o n d~ t e m p s a m i s e n 6 v i d e n c e q u ' a p r 6 s 10 h e u r e s de c o n s e r v a t i o n h 4°C, il n e r e s t a i t p l u s qt~e 50 p. c e n t de l ' a c t i v i t 6 COMT i n i t i a l e . Ce r 6 s u l t a t s o u l i g n e l ' i n s t a bilit6 de la COMT d u p l a c e n t a h u m a i n c o m p a r a t i v e m e n t h celle d u r e i n [18] p a r e x e m p l e . L e s s u b s t r a t s s t a b i l i s e n t l ' e n z y m e darts la m e s u r e off ils f i g u r e n t s i m u l t a n 6 m e n t d a n s le m i l i e u et en p r 6 s e n c e de Mg *+. Le s a e c h a r o s e p o s s 6 d e u n b o n p o u v o i r c o n s e r v a t e u r q u i s e m b l e li6 h sa c o n c e n t r a t i o n d a n s le m i l i e u . P o u r e x p l i q u e r cette p r o t e c t i o n o n p e u t p e n s e r h u n e m o d i f i c a t i o n d u s o l v a n t a q u e u x , h m o i n s q u ' i l n e se f o r m e u n c o m p l e x e p r o t 6 i n e - s u c r e , e o m m e le p r o p o s e Y o n [19] p o u r le eas de ia ~ l a c t o g i o b u l i n e . S u r le p l a n p r a t i q u e ces d e u x p o s s i b i l i t 6 s f u r e n t e n f a i l d ' u n e m p l o i diffieile. E n effet ]a SA'M et le CP a b s o r b e n t 260-280 n m , ce q u i r e n d la d 6 t e c t i o n UV d e s p r o t 6 i n e s p r e s q u e i m p o s s i b l e . P o u r cette m 6 m e r a i s o n le d o s a g e
BIOCHIMIE,
1976, 58, I1° 11-12.
d e s p r o t 6 i n e s p a r la m 6 t h o d e de W a r b u r g e s t d f l a i s s G a l o r s q n e le CP i n t e r f b r e d a n s la m 6 t h o d e de Lo'wry. Q u a n t h la SAM elle se d 6 g r a d e e n m i l i e u 1 6 g 6 r e m e n t b a s i q u e [8]. L ' i n t e r f 6 r e n c e d u s a c c h a r o s e d a n s la m e s u r e de l ' a c t i v i t 6 e n z y m a t i q u e e s t f a c i l e m e n t s u r m o n table. P a r c o n t r e , h la c o n c e n t r a t i o n de 0,5 M il r a l e n t i t les f i l t r a t i o n s s u r gel et r e n d difficile la p r 6 c i p i t a t i o n des extraits enzymatiques au sulfate d'ammonium. C'est d o n c e n p r 6 s e n c e de m e r c a p t o 6 t h a n o l (10-3 M) q u e n o u s a v o n s purifi6 200 fois e n v i r o n la COMT d u placenta humain. Q u a n t a n p o i d s m o l 6 c u l a i r e , s e u l e la COMT d u p l a centa humain semble avoir un poids mol6culaire d o u b l e de celui d e s a u t r e s COMT d 6 j h 6 t u d i 6 e s [18, 20, 21]. P o u r 61ucider cette q u e s t i o n , u n e 6 t u d e d e s sous-unit6s serait & envisager. N o u s c o n c l u r o n s cette c o n t r i b u t i o n h l ' 6 t u d e de la COMT p l a c e n t a i r e e n p o s a n t la q u e s t i o n : q u i est r e s p o n s a b l e de cette activit6 COMT ? E s t - c e le s a n g a v e c ses g l o b u l e s r o u g e s o u le t i s s u p l a c e n t a i r e l u i m 4 m e ? S a n s a v o i r p u p e r f u s e r u n p l a c e n t a d a n s les p l u s b r e f s d61ais, les r 6 s u l t a t s de G r i f f i t h s et L i n k l a t e r [22] c h i f f r a n t l ' a c t i v i t 6 COMT d e s g l o b u l e s r o u g e s d u s a n g h u m a i n (20 h 58.10-4 U / m l de s a n g t o t a l ) p e r m e t t e n t de p e n s e r , darts u n e p r e m i 6 r e a p p r o x i m a t i o n , q u e le t i s s u p l a c e n t a i r e e s t d o u 6 d ' u n e a c t i v i t 6 COMT intrins6que. BIBLIOGRAPHIE.
L,4T,4ZASe
'
1403
1. A x e l r o d , J. (1957) Science, !126, 400. 2. A x e l r o d , J. a T h o m c h i c k , R. (1958) J. Biol. Chem., 233 (1), 702-705. 3. P e y r i n , L. ~ F a v r e , J. M. (1973) Lyon Pharmaceutique, 24 (3), 303-340. 4. L i s a l o , E. a C a s t r e n , O. (1967) Ann. Med. Exp. Fenn., 45, 253. 5. G u g l e r , R., K n u p p e n , R. ~ B r e u e r , H. (1970) Biochim. Biophys. Acta, 220, 10-21. 6. P a o l u c c i , F. (1972) T h 4 s e de D o e t o r a t 4 s - S c i e n c e s , Lyon. 7. S c h l e n k , F., Z y d e k , C. R., E h i n g e r , D. J. ~ D a i n k o , J. L. (1965) EnzymoIogia, 29, 283-298. 8. H a i d , E. z~ N e l b o e c k - H o s c h s t e t t e , M. ( B o e h r i n g e r M a n n h e i m ) Ger. Often. 1,803,978 (C1. C. 07 d) 27 M a y 1970, A p p l 18 O c t . 1968, 15 pp. 9. B a e y e r , A. ~ K o c h e n d o r r e r , S. P. (1889) Ber., 22, 2199. 10. Colowiek, S. P. z, K a p l a n , N. O. (1955) Methods in Enzymology, Aead. P r e s s . Vol. 1, 75-78. I1. D e t e r m a n n , ~t. (I968) Gel Chromatography, S p r i n ger Verlag New-York. 12. A n d e r s o n , P. J. ~ D'iorio, A. (1966) Can. J. of Biochem., 44, 347-354. 13. W a r b u r g , O. ~ C h r i s t i a n , "W. (1942) Biochem. Z., 3~10, 384. 14. L o w r y , O. H., R o s e b r o u g h , N. J., F a r r , A. L. R a n d a l l , R. J. (1951) J. Biol. Chem., 193, 265275. 15. Geiger, P. J. e~ B e s s m a n , S. P. (1972) Anal. Biochem., 49 (2), 467-473. 16. V e s t e r b e r g , O. (1973) Science Tools, 20 (2-3), 22-28. 17. P a o l u c c i , F., C r o n e n b e r g e r , L., P l a n , R. ~ P a c h 6 c o , H. (1971) Biochimie, 53, 735-749. 18. D a r m e n t o n , P., C r o n e n b e r g e r , L. ~ P a c h ~ c o , H., (19.76) Biochimie, 58, 1031-1045. 19. Yon, J. (1969) <
Purification de la catdchol-O-m6thyhransfdrase (EC. 2.1.1.6) du placenta humain et 6tude de quelques propri6tds c)("). P a t r i c k DARMENTON, L u c i e n CRONENBERGER ~ et H e n r i PACHECO. 5eruice de Chimie Biologique, B ~ t i m e n t ~06, I n s t i l u t National des Sciences Appliqades, 20 Avenue Albert Einstein, 69621 Villeurbanne Cddex.
(5-5-1976).
INTRODUCTION. La c a t d c h o l - O - m f i t h y l t r a n s f ~ r a s e (COMT) (EC 2.1.1.6) c a t a l y s e le t r a n s f e r t d ' u n g r o u p e m e n t m ~ t h y l e de la S - a d 6 n o s y l m ~ t h i o n i n e (SAM) s u r u n accepteur de s t r u c t u r e o r t h o d i p h d n o l i q u e ou 6he diol [1]. Largem e n t r 6 p a n d u e d a n s l ' o r g a n i s m e [2, 3], elle est a u s s i p r d s e n t e darts le ,placenta [4]. P o u r Lisalo et coll. [41 la COMT i n t e r v i e n d r a i t darts le c a t a b o l i s m e des catdc h o l a m i n e s d o n t la presence en q u a n t i t 6 excessive serait d a n g e r e u s e p o u r le fcetus. Gulger et coll. s o n t les seuls h avoir tent~ la purification et l'6tude de la COMT du p l a c e n t a h u m a i n [5]. E n ce qui n o u s coneerne, ec t r a v a i l s'int6gre d a n s le cadre d ' u n e dtude des e n z y m e s p l a c e u t a i r e s p o u v a n t poss~der u n int~r~t t h 6 r a p e u t i q u e . II f a i l suite h la purification de l ' h i s t a m i n a s e ou d i a m i n e : oxyg6ne o x y d o - r d d u c t a s e [6].
Produits. Nous a v o n s pr~par$ la SAM h p a r t i r de c u l t u r e de levure de b o u l a n g e r i e , s u r u n m i l i e u enrichi en m(~t h i o n i n e [7] en s ' i n s p i r a n t d u b r e v e t prdsent5 p a r Haiti et coll. [8]. La g a i a c o l p h t a l 6 i n e (GP) a 6t6 s y n t h d t i s ~ e a u l a b o r a t o i r e (par A. M. Malaweille) d'apr6s les l r a v a u x a n c i e a s de B a e y e r et K o c h e n d o r f e r [9]. P o u r l'61ectrofocalisation, les a m p h o l i n e s s o n t f o u r n i e s p a r LKB et tes a u t r e s p r o d u i t s sont des p r o d u i t s Merck e x t r a purs. Enfin les diverses prot6ines ~talons u t i lisdes p o u r la d ~ t e r m i n a t i o n du poids m o l $ c u l a i r e sont les s u i v a n t e s : l y s o z y m e du b l a n c d'ceuf (Sigma), m y o g l o b i n e de cheval (NBC), p e p s i n e cristallisde (NBC), h 6 m o g l o b i n e h u m a i n e cristallis~e (NBC), calalase de foie de bceuf (NBC), t h y r o g l o b u l i n e dc porc (Mann R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s ) . Solution et tampons. S o l u t i o n A : s o l u t i o n de s a c c h a r o s e (0,25 M) + m e r c a p t o 6 t h a n o l (10-3 M) ; t a m p o n B : pH 7,4 ; t a m p o n C : pH 6,2. Ces d e u x d e r n i e r s s o n t des t a m p o n s p h o s p h a t e s de p o t a s s i u m (KH._,POJK~HPO~.3H_oO) 2.10-2 M - f o r c e i o n i q u e : I = 0,120 4- m e r c a p t o d t h a n o l (10-3 M). Pr~cisions concernant la purification. T o n t e s les m a n i p u l a t i o n s s o n t faites & 4°C et les c e n t r i f u g a t i o n s rdalisdes h 20 000 g p e n d a n t 15 m i n u t e s 4°C ( c e n t r i f u g e u s e MSE). Les p o u r c e n t a g e s de s a t u (*) Ce m ~ m o i r e c o n s t i t u e u n e p a r t i e de la th6se de Doctorat-6s-Sciences P h y s i q u e s que dolt s o u t e n i r P. D a r m e n t o n . (**) Ce t r a v a i l a ~t~ r~alis~ darts le cadre d ' u n cont r a t de recherche entre l ' I n s t i t u t Mdrieux (69 Marcy l'Etoile) et I'INSA. A q u i route c o r r e s p o n d a n c e doit ~tre adressde.
r a t i o n a n s u l f a t e d ' a m m o n i u m cit6s s o n t calcu16s en s a c h a n t q u ' u n e s o l u t i o n saturde de (NHD~SO~ c o n t i e n t 4,1 M h 25°C [10]. L o r s q u e la t e c h n i q u e de c h r o m a t o g r a p h i e s u r $ c h a n g e u r d ' i o n s (CM- S e p h a d e x C 50) est utilisde cu bain, la r d c u p d r a t i o n du filtrat et de l'~luat est facilitde p a r l ' e m p l o i de p a n i c r s de c e n t r i f u g a t i o n con~us selon le mod61e propos6 par D e t e r m a n [;11]. Vitesse d'essorage : 3 000 t / m i n .
Mesure de l'activitd COMT. C'est la t e c h n i q u e c o l o r i m 6 t r i q u e d ' A n d e r s o n et d'Iorio [!12] h la p y r o c a t d c h o l p h t a l 6 i n e (CP) modifi~e p a r Gugler et coll. [5] que n o u s a v o n s employee. Dosage des prot~ines. Los protdines des e x t r a i t s peu purifi6s o n t ~t~ dos6es avec la t e c h n i q u e de W a r b u r g et C h r i s t i a n [13]. P o u r les e x t r a i t s p r ~ s e n t a n t u n e faible t e n e u r en prot6ines, n o u s a v o n s employ6 le dosage de Lowry et coll. [14] dont les courbes d ' ~ t a l o n n a g e ont 5l~ r6alis6es en presence de m e r c a p t o 6 t h a n o l p u i s q n e ce d e r n i e r i n t e r f e r e d a n s le dosage [15]. Electrofocalisation el ddtermination du p h i . La t e c h n i q u e est celle d6velopp~e p a r O. Vesterberg [!1~6], p o u r u n g r a d i e n t de pH s ' d t e n d a n t de 3,5 h 9,5. L ' a p p a r e i l (LKB 2117 Multiphor) est r~frig~r~ p a r u n c r y o s t a t qui m a i n t i e n t u n e t e m p e r a t u r e de 2°C. Apr~s m i g r a t i o n , le gel est d6coup5 en b a n d e s de 5 m m de l a r g e u r qne l ' o n h o m o g d n 6 i s e d a n s 2 m l d ' e a u d~sionis6e. S u r c h a q u e fraction, le pH est m e s u r ~ e t l a d6tecl i o n de l'activit~ COMT a t t r i b u e h l ' e n z y m e c o m m e p h i , lc pH de la f r a c t i o n off elle est prSsente. PURIFICATION DE LA COMT PLACENTAIRE.
Extraction de l'enzyme. 300 h 400 g de p l a c e n t a f r a i s d 6 p o u r v u de m e m b r a nes et de cordon o m b i l i c a l s o n t broy~s h l ' u l t r a t u r r a x d a n s la s o l u t i o n saccharosge A d a n s la p r o p o r t i o n de 70 m l p o u r 30 g de poids f r a i s d'organe. La ceutrifugation permet d'obtenir un surnageant limpide ( e x t r a i t S). Prdcipitation au sulfate d ' a m m o n i u m . Sur l ' e x t r a i t S (500 ml), on effectue u n e double pr6c i p i t a t i o n qui laisse s d d i m e n t e r les prot6ines i n s o l n bles d a n s les l i m i t e s de 40-55 p. cent de s a t u r a t i o n ell sel. N o u s avons vdrifi6 que ]e r e n d e m e n t d'activit6 COMT dtait m a x i m u m p o u r u n e dur~e de p r e c i p i t a t i o n d ' u n e heure. Chromatographie sur CM Sephadex C 50. Le cnlot protdique est repris d a n s u n v o l u m e m i n i m u m de t a m p o n B, p u t s d~ssal6 a v a n t d'etre c h r o m a -
P. Darmenton.
1402
L. Cronenberger
t o g r a p h i 6 s u r d c h a n g e u r d ' i o n s . C e t t e o p 6 r a t i o n a 5td r~alis~e p a r u n e f i l t r a t i o n s u r gel S e p h a d e x G 25. Le f i l t r a t o b t e n u : e x t r a i t G 25 (4 l o i s le v o l u m e i n i t i a l ) est acidifi6 h p H 6,2 ( + CH~COOH-M), p u t s p a s s 6 s u r u n e c o l o n n e (H : 16 cm, d i a m 6 t r e : %5 cm) de CM 8 e p h a d e x C 50 p r 6 e d d e m m e n t gonfl6 e t d q u i l i b r 6 h ce m 6 m e pH. O n o b t i e n t a i n s i u n e x t r a i t CM C 50, renfermant une faible teneur en h6moglobine.
Chrornatographie d ' e x c l u s i o n - d i f f u s i o n sur Biogel A 0,5 m. L e s p r o t d i n e s de l ' e x t r a i t CM C 50 s o n t p r d c i p i t d e s a u s u l f a t e d ' a m m o n i u m (70 p. c e n t de s a t u r a t i o n e n sel), isol6es p a r c e n t r i f u g a t i o n p u i s r e m i s e s e n s o l u t i o n d a n s u n v o l u m e m i n i m u m de t a m p o n B. A i n s i 300 m g e n v i r o n de p r o t 6 i n e s (soit la m o i t i 6 de l ' e x t r a i t CM C 50) s o n t d~posds s u r la c o l o n n e (H : 92 e m , d i a m 6 t r e 2,5 c m ) . L ' 6 1 u t i o n e s t r6alis~e avcc |e tampon B avec u n e v i t e s s e d ' 6 c o u l e m e n t de 10,2 m I / h e u r c / c m 2 .
Chromatographie sur Biogel P 100. De m S m e , a p r b s p r 6 c i p i t a t i o n a u s u l f a t e d ' a m m o n i u m et r e d i s s o l u t i o n d a n s le m i n i m u m de t a m p o n B, les p r o t d i n e s (20 m g e n v i r o n ) i s o l 6 e s de l a p r 6 c 6 d e n t e 6 t a p e s o n t d 6 p o s 6 e s s u r l a c o l o n n e de gel (H : 88 c m , d i a m 6 t r e : 2,5 c m ) . La c h r o m a t o g r a p h i e e s t d 6 v e l o p p6e s o u s u n e p r e s s i o n m a x i m a l e de 45 c m d ' e a u (d6bit a s s u r 6 6,5 m l / h e u r e / c m 2 ) .
et H. Pacheco.
Instabilitd de la COMT placentaire. S u r Ies e x t r a i t s S et CM C 50 o b t e n u s a p r 6 s p u r i f i c a t i o n de l ' e n z y m e , e n l ' a b s e n c e de t o u t c o n s e r v a t e u r , n o u s a v o n s 6 t u d i 6 la s t a b i l i t 6 de ]a COMT c o n s e r v 6 e h 4 ° . L a d u r 6 e de d e m i - v i e e s t de 10 h e u r e s p o u r l ' e x t r a i t S et de 18 h e u r e s e n v i r o n ~pour l ' e x t r a i t CM C 5.0. P a r c o n t r e ce d e r n i e r e x t r a i t , u n e f o i s l y o p h i lis6 et c o n s e r v 6 h - - 2 0 °, s e m b l e s t a b l e , p u i s q u ' i l f a u t 9 m o i s e n v i r o n p o u r q u e l ' e n z y m e p c r d e 50 p. c e n t de son activit6 initia%.
Recherche d'un agent stabilisant. S u b s t r a t s de la rdaction e n z y m a t i q u e . L ' ~ t u d e de la p r o t e c t i o n de l ' e n z y m e p a r ]es diff6r e n t s c o n s t i t u a n t s de la r 6 a c t i o n e n z y m a t i q u e , et s e l o n t o u t e s les c o m b i n a i s o n s p o s s i b l e s , a 6t6 f a i t e s u r u n e x t r a i t S r d a l i s 6 a v e r d u t a m p o n p h o s p h a t e 0,5 M p H 7,4. L a c o m b i n a i s o n d e s d e u x s u b s t r a t s avec l ' i o n activ a t e u r p r 6 s e n t e le m e i l l e u r p o u v o i r p r o t e e t e u r . Le CP r e t a r d e 1 6 g ~ r e m e n t la d 6 n a t u r a t i o n , q u a n t h l a SAM et a u Mg2~, e m p l o y ~ e n s e m b l e ou s 6 p a r 6 m e n t , l e u r p r e sence s'av6re n6faste.
Le saccharose. Nous avons not6 l'interf6rencc du saccharose dans le dosag.c de l ' a c t i v i t d COMT et 6 t a b l i l e s c o r r e c t i o n s q u i s ' i m . p o s a i e n t . N 6 a n m o i n s r o u t e s les e x p 6 r i e n c e s r 6 a l i s 6 e s s o n t e n f a v e u r d ' u n p o u v o i r p r o t e c t e u r de ce dioside.
P o i n t isodlectrique.
RESULTATS.
Bilan des diffdrentes dtapes de la p u r i f i c a t i o n de la COMT du placenta h u m a i n ( t a b l e a u I).
L a t e c h n i q u e d ' 6 1 e c t r o f o c a l i s a t i o n n o u s a p e r m i s de d 6 t c r m i n e r le p o i n t i s o 6 1 e e t r i q u e de l ' e n z y m e . A p r b s d 6 c o u p a g e d u gel e n u n e v i n g t a i n e , de b a n d e s , la
TABLEAU I.
P u r i f i c a t i o n de la COMT placentaire : t a u x de purification, dtude de rendement.
Etapes considdr~es
S u r n a g e a n t de c e n t r i f u g a t i o n ( E x t r a i t S)
Taux de protdines mg/ml
Hb p. cent/taux de prot6ines totales
Activitd spdcifique mU/mg de prot~ines
Taux de purification
Rendement de }'6tape
Rendement l'extrait S
100
100
35,25
46,2
0,019
P r 6 c i p i t a t i o n a n (NH4)o_ SO 4 40-: 55 p. c e n t -J- p a s s a g e s u r Sephad e x G 25 ( e x t r a i t G 25)
8,30
18,8
0,078
3,9
34,6
34,6
CM S e p h a d e x C 50 (colonne) ext r a i t (CM C 50)
3,18
4,0
0,125
6,3
69,1
23,9
B i o g d A 0 , 5 m ( e x t r a i t Biogel 0,5m)
0,29
<
Blogel P 100 ( e x t r a i t P 100)
0,05
<~4,0
4,0
L ' h 6 m o g l o b i n e (Hb) e s t e x p r i m 6 e e n p. c e n t p a r r a p p o r t t h 6 s e s : la d d s i g n a t i o n de l ' e x t r a i t .
L a COMT p ~ a c e n t a i r e a 6t6 o b t e n u e purifi6e 200 f o i s e n v i r o n , p a r r a p p o r t a u s u r n a g e a n t de c e n t r i f u g a t i o n et avec u n r e n d e m e n t de l ' o r d r e d e 10 p. cent. De p l u s , l ' ~ l e c t r o f o c a l i s a t i o n p r a t i q u 6 e s u r les d i f f 6 r e n t s e x t r a i t s o b t e n u s a p r 6 s c h a q u e 6 t a p e et a m e n d s / t u n t a u x de p r o t 6 i n e s c o n s t a n t (3,6 m g / m ] ) p e r m e t de j u g e r de l e u r s 5 t a t s de p u r e t 6 .
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.
1,055
53
69,4
16,6
4,350
218
80,8
13,4
aux protdines totales
[r6f. 17], E n t r e p a r e n -
m e s u r e d u p H a p r b s h o m o g 6 n d l s a t i o n p e r m e t de t r a c e r la c o u r b e de p H = f ( d i s t a n e e / h l ' a n o d e ) . L a COMT p l a c e n t a i r e e s t f o c a l i s d e a u pH~ = 5,0.
Poids mol~culaire (figure 1). Cette d d t e r m i n a t i o n a dr6 effectude e n u t i l i s a n t la m d t h o d e de f i l t r a t i o n s u r gel El7]. La e o l o n n e de gel
Pm'ification de la catdchol-O-mdthyltransfdrase (EC. 2.1.1.6). est p r 6 a l a b l e m e n t 6 t a l o n n 4 e a v e c 6 p r o t 6 i n e s p u r e s et V,. de p o i d s m o l 6 c u l a i r e d6fini. L a r e l a t i o n ~ o = f (log p o i d s m o l 6 c u l a i r e ) p e r m e t d ' a t t r i b u e r h la COMT d u p l a c e n t a h u m a i n le p o i d s m o l 6 e u l a i r e de 49 000 d a l tons. Volume d" dlution relatif Ve/
Vo
.2.5
LYSOZYME MYOGLOBINE
•2 0 ~ i l e s l ~ E ...............
-o---,~. COMT =
~HEMOG£OBINE
1,5
THYRoGLOBULINE
to
'& ....
~
Poids
.........
5
,o
.,o ~
mol~culaire.
Ddtermination du poids moldculaire de la COMT du placenta humain.
Fro. 1. - -
C h r o m a t o g r a p h i e d e s c e n d a n t e s u r Biogel A 1,5 m 5 0 - 1 0 0 m e s h (98 × 2,5 e m ) K ~ = 0,59. T h y r o g l o b u l i n e (6,5.10~) - - G a t a l a s e (2,3.105) - H 6 m o g l o b i n e (6,5.104) - - P e p s i n e (3,5.104). T a m p o n d ' 6 1 u l i o n : B + s a c c h a r o s e 0,5 M, p H = 7,4 - - v i t e s s e d ' 6 c o u l e m e n t : 5,7 m l / h / c m 2 - - Ve : v o l u m e d ' 6 1 u t i o n de la p r o t 6 i n e - - V o : v o l u m e m o r t de la c o l o n n e (184 m l ) . DISCUSSION.
L ' 6 t u d e de l ' a e t i v i t 6 r 6 s i d n e l l e de l ' e x t r a i t S e n f o n c t i o n d~ t e m p s a m i s e n 6 v i d e n c e q u ' a p r 6 s 10 h e u r e s de c o n s e r v a t i o n h 4°C, il n e r e s t a i t p l u s qt~e 50 p. c e n t de l ' a c t i v i t 6 COMT i n i t i a l e . Ce r 6 s u l t a t s o u l i g n e l ' i n s t a bilit6 de la COMT d u p l a c e n t a h u m a i n c o m p a r a t i v e m e n t h celle d u r e i n [18] p a r e x e m p l e . L e s s u b s t r a t s s t a b i l i s e n t l ' e n z y m e darts la m e s u r e off ils f i g u r e n t s i m u l t a n 6 m e n t d a n s le m i l i e u et en p r 6 s e n c e de Mg *+. Le s a e c h a r o s e p o s s 6 d e u n b o n p o u v o i r c o n s e r v a t e u r q u i s e m b l e li6 h sa c o n c e n t r a t i o n d a n s le m i l i e u . P o u r e x p l i q u e r cette p r o t e c t i o n o n p e u t p e n s e r h u n e m o d i f i c a t i o n d u s o l v a n t a q u e u x , h m o i n s q u ' i l n e se f o r m e u n c o m p l e x e p r o t 6 i n e - s u c r e , e o m m e le p r o p o s e Y o n [19] p o u r le eas de ia ~ l a c t o g i o b u l i n e . S u r le p l a n p r a t i q u e ces d e u x p o s s i b i l i t 6 s f u r e n t e n f a i l d ' u n e m p l o i diffieile. E n effet ]a SA'M et le CP a b s o r b e n t 260-280 n m , ce q u i r e n d la d 6 t e c t i o n UV d e s p r o t 6 i n e s p r e s q u e i m p o s s i b l e . P o u r cette m 6 m e r a i s o n le d o s a g e
BIOCHIMIE,
1976, 58, I1° 11-12.
d e s p r o t 6 i n e s p a r la m 6 t h o d e de W a r b u r g e s t d f l a i s s G a l o r s q n e le CP i n t e r f b r e d a n s la m 6 t h o d e de Lo'wry. Q u a n t h la SAM elle se d 6 g r a d e e n m i l i e u 1 6 g 6 r e m e n t b a s i q u e [8]. L ' i n t e r f 6 r e n c e d u s a c c h a r o s e d a n s la m e s u r e de l ' a c t i v i t 6 e n z y m a t i q u e e s t f a c i l e m e n t s u r m o n table. P a r c o n t r e , h la c o n c e n t r a t i o n de 0,5 M il r a l e n t i t les f i l t r a t i o n s s u r gel et r e n d difficile la p r 6 c i p i t a t i o n des extraits enzymatiques au sulfate d'ammonium. C'est d o n c e n p r 6 s e n c e de m e r c a p t o 6 t h a n o l (10-3 M) q u e n o u s a v o n s purifi6 200 fois e n v i r o n la COMT d u placenta humain. Q u a n t a n p o i d s m o l 6 c u l a i r e , s e u l e la COMT d u p l a centa humain semble avoir un poids mol6culaire d o u b l e de celui d e s a u t r e s COMT d 6 j h 6 t u d i 6 e s [18, 20, 21]. P o u r 61ucider cette q u e s t i o n , u n e 6 t u d e d e s sous-unit6s serait & envisager. N o u s c o n c l u r o n s cette c o n t r i b u t i o n h l ' 6 t u d e de la COMT p l a c e n t a i r e e n p o s a n t la q u e s t i o n : q u i est r e s p o n s a b l e de cette activit6 COMT ? E s t - c e le s a n g a v e c ses g l o b u l e s r o u g e s o u le t i s s u p l a c e n t a i r e l u i m 4 m e ? S a n s a v o i r p u p e r f u s e r u n p l a c e n t a d a n s les p l u s b r e f s d61ais, les r 6 s u l t a t s de G r i f f i t h s et L i n k l a t e r [22] c h i f f r a n t l ' a c t i v i t 6 COMT d e s g l o b u l e s r o u g e s d u s a n g h u m a i n (20 h 58.10-4 U / m l de s a n g t o t a l ) p e r m e t t e n t de p e n s e r , darts u n e p r e m i 6 r e a p p r o x i m a t i o n , q u e le t i s s u p l a c e n t a i r e e s t d o u 6 d ' u n e a c t i v i t 6 COMT intrins6que. BIBLIOGRAPHIE.
L,4T,4ZASe
'
1403
1. A x e l r o d , J. (1957) Science, !126, 400. 2. A x e l r o d , J. a T h o m c h i c k , R. (1958) J. Biol. Chem., 233 (1), 702-705. 3. P e y r i n , L. ~ F a v r e , J. M. (1973) Lyon Pharmaceutique, 24 (3), 303-340. 4. L i s a l o , E. a C a s t r e n , O. (1967) Ann. Med. Exp. Fenn., 45, 253. 5. G u g l e r , R., K n u p p e n , R. ~ B r e u e r , H. (1970) Biochim. Biophys. Acta, 220, 10-21. 6. P a o l u c c i , F. (1972) T h 4 s e de D o e t o r a t 4 s - S c i e n c e s , Lyon. 7. S c h l e n k , F., Z y d e k , C. R., E h i n g e r , D. J. ~ D a i n k o , J. L. (1965) EnzymoIogia, 29, 283-298. 8. H a i d , E. z~ N e l b o e c k - H o s c h s t e t t e , M. ( B o e h r i n g e r M a n n h e i m ) Ger. Often. 1,803,978 (C1. C. 07 d) 27 M a y 1970, A p p l 18 O c t . 1968, 15 pp. 9. B a e y e r , A. ~ K o c h e n d o r r e r , S. P. (1889) Ber., 22, 2199. 10. Colowiek, S. P. z, K a p l a n , N. O. (1955) Methods in Enzymology, Aead. P r e s s . Vol. 1, 75-78. I1. D e t e r m a n n , ~t. (I968) Gel Chromatography, S p r i n ger Verlag New-York. 12. A n d e r s o n , P. J. ~ D'iorio, A. (1966) Can. J. of Biochem., 44, 347-354. 13. W a r b u r g , O. ~ C h r i s t i a n , "W. (1942) Biochem. Z., 3~10, 384. 14. L o w r y , O. H., R o s e b r o u g h , N. J., F a r r , A. L. R a n d a l l , R. J. (1951) J. Biol. Chem., 193, 265275. 15. Geiger, P. J. e~ B e s s m a n , S. P. (1972) Anal. Biochem., 49 (2), 467-473. 16. V e s t e r b e r g , O. (1973) Science Tools, 20 (2-3), 22-28. 17. P a o l u c c i , F., C r o n e n b e r g e r , L., P l a n , R. ~ P a c h 6 c o , H. (1971) Biochimie, 53, 735-749. 18. D a r m e n t o n , P., C r o n e n b e r g e r , L. ~ P a c h ~ c o , H., (19.76) Biochimie, 58, 1031-1045. 19. Yon, J. (1969) <