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Régulation de la biosynthèse de l'aspartate-ammonium lyase (aspartase) de Pseudomonas fluorescens
BIOCHIMIE, 1976, 58, 1329-1336.
R6gulation de la biosynth6se de l'aspartate-ammonium lyase (aspartase) de Pseudomonas fluorescens. J e a n - C l a u d e HUBERT (> et B e n o i t WURTZ. Laboratoire de Biochimie Microbienne, Universit~ Louis Pasteur, 4, rue Blaise Pascal, 67000 Strasbourg.
(6-10-1976). Summary. - - Variations in aspartasic activity in various media are due to aspartatea m m o n i u m lyase induction and to regulation of the biosynthesis of this enzyme. Evidence for neosynthesis of the enzyme is provided by labelling and separation of the protein. The inducer appears to be aspartic acid. The biosynthesis is subject to pronounced catabolic repression. The physiological function of aspartate-ammonium lyase is discussed.
INTRODUCTION. L ' e x i s t e n c e c h e z Pseudomonas fluorescens d ' u n e a s p a r t a t e - a m m o n i u m l y a s e ( a s p a r t a s e ) (E.C.4.3.1.1.) c a t a l y s a n t la r 6 a c t i o n r 6 v e r s i b l e : F u m a r a t e + NH 3 ~ - - > a s p a r t a t e (°) a 6t6 d 6 m o n t r 6 e p a r V i r t a n e n et T a r n a n e n [11. Cette r 6 a c t i o n (°) c a t a b o l i q u e d a n s le s e n s de la d 6 s a m i n a t i o n de I ' a s p a r t a t e est 6 g a l e m e n t c o n s i d 6 r 6 e p a r de n o m b r e u x a u t e u r s [2-5] c o m m e 6rant l ' u n e de eelles p e r m e t t a n t h d i v e r s e s esp6ces b a c t 6 r i e n n e s d ' a s s i m i l e r l ' a m m o n i a q u e et de synt h 6 t i s e r u n a c i d e a m i n 6 essentiel. Elte a fait l ' o b j e t (te n o m b r e u s e s ~tudes [1-14]. C e p e n d a n t , p a r r o t l ' e n s e m b l e des r e c h e r c h e s c o n s a c r 6 e s h ce p r o c e s s u s , seules celles de Liess, M e c k e et H o l z e r [5], H a l p e r n et U m b a r g e r [2], F a r l e y et L i c h s t e i n [9] a b o r d e n t le p r o b l 6 m e de la r 6 g u l a t i o n de la b i o s y n t h 6 s e de l ' e n z y i n e . Ces a u t e u r s c o n s t a t e n t en p a r t i c u l i e r q u e c h e z E. colt, l ' a d d i t i o u de g l u c o s e au m i l i e u de c u l t u r e d i m i n u e son a c t i v i t 6 sp6cifique. La p r 6 s e n t e 6tude, f o n d 6 e s u r des o b s e r v a t i o n s a n t 6 r i e u r e s [15] a y a n t t r a i t a u x v a r i a t i o n s de l ' a c tivit6 a s p a r t a s i q u e de c e l l u l e s c u l t i v 6 e s en m i l i e u x c o m p l e x e s ( a v e c e x t r a i t de v i a n d e et e x t r a i t de l e v u r e ) , a eu p o u r b u t de s u i v r e l ' 6 v o l u t i o n de c e t t e a c t i v i t 6 e n z y m a t i q u e en m i l i e u x s y n t h 6 t i q u e s et d ' e s s a y e r de d6finir les m 6 c a n i s m e s r 6 g u l a t e u r s de la b i o s y n t h 6 s e de l ' a s p a r t a t e - a m m o n i u m lyase. MATI~,RIEL
ET
MI~THODES.
- - S o u c h e b a c t 6 r i e n n e : La s o u c h e de Pseudomonas fluorescens u t i l i s 6 e a 6t6 isol6e p a r W u r t z
To w h o m all em'respondencc should be addressed.
I16] et ses c a r a c t 6 r e s ont 6t6 d 6 c r i t s p a r M e y e r et W u r t z [17]. E l l e est d6pos6e d a n s la c o l l e c t i o n t c h 6 c o s l o v a q u c de m i c r o o r g a n i s m e s sous le N ° CCM2799. E l l e est e n t r e t e n u e sur le m i l i e u s y n t h 6 t i q u e utilis6 p o u r les c u l t u r e s , g~los6 h 15 g / 1 .
--Pr6culture : Une c o l o n i e est pr61ev6e s u r m i l i e u s o l i d e et e n s c m e n c 6 e d a n s 50 m l de m i l i e u s y n t h 6 t i q u e . L a p r 6 c u l t u r e est i n c u b 6 e 'h 25°C a v e c a g i t a t i o n p e n d a n t 24 h. --Milieu
de c u l t u r e :
(voir tableau
I).
- - Milieu d ' i n c u b a t i o n des s u s p e n s i o n s n o n - p r o l i f 6 r a n t e s : Les b a c t 6 r i c s r6colt6es p a r c e n t r i f u gation, lav6es "h 3 r e p r i s e s a v e c dc l ' e a u distill6e s o n t renfises en s u s p e n s i o n d a n s du t a m p o n T r i s 0,05 M p H 7,2 "a r a i s o n d ' e n v i r o n 100 m g de b a c t 6 r i e s ( p o i d s sec) p o u r 5'0.0 m l de t a m p o n . On a j o u t e 5 ces m i l i e u x d ' i n c u b a t i o n les s u b s t r a t s d o n t on v e u t 6 t u d i e r l ' i n f l u e n c e s u r la b i o s y n t h 6 s e de l ' e n z y m e . Les s u s p e n s i o n s s o n t s o u m i s e s h l'agit a t i o n h 25°C p e n d a n t des d u r 6 e s c o m p r i s e s e n t r e 2 et 5 h. L ' a b s e n c e de p r o l i f 6 r a t i o n de la s u s p e n s i o n b a c t @ i e n n e est v@ifi6e p a r la m e s u r e d u p o i d s sec au d 6 p a r t et h la fin de l ' e x p 6 r i e n c e . - - O b t e n t i o n de l ' e x t r a i t b a c t 6 r i e n : Au t e m p s c h o i s i les c e l l u l e s sont r6colt6es, lav6es h l ' e a u et d ~ t r u i t e s p a r a c t i o n des u l t r a - s o n s ( a p p a r e i l M.S.E., p u i s s a n c e 150 watts, f r 6 q u e n c e 20 KHz) h q - 4 ° G p e n d a n t 3 m n p a r s a c c a d e s de 3:0 sec. ( R e m a r q u e : le c u l o t b a c t 6 r i e n destin6 "h O r e s o u m i s a u x u l t r a s o n s est r e m i s en s u s p e n s i o n en eau distill6e. Des essais effectu6s en t a m p o n ou en p r 6 s e n c e des substrats de l ' e n z y m e c o n d u i s e n t aux m 6 m e s r6sultats). L ' e x t r a i t o b t e n u est c e n t r i f u g 6 'h 40 000 g p e n d a n t 30 m n h q- 4°C. L ' a c t i v i t 6 de l ' a s p a r t a t e -
J.-C. Hubert et B. W u r t z .
1 3 3 0
a m m o n i u m l y a s e est d 6 t e r m i n S e s u r le s u r n a g e a n t ainsi obtenu. Fractionnement de l'asparate-ammonium l y a s e m a r q u 6 e a u d e u t e r i u m et h l ' h y d r o g 6 n e e n gradient de densit6 de chlorure de cesium: On e f f e c t u e la c e n t r i f u g a t i o n h l ' 6 q u i l i b r e d a n s u n r o t o r '~ a n g l e fixe t y p e 50, d a n s u n e c e n t r i f u g e u s e B e c k m a n L5-50 h 39 0~0,0 t o u r s / r a n p e n d a n t 62 h h +2°C. -
-
Le gradient s'6tablit au cours g a t i o n d a n s le t u b e c o n t e n a n t :
de la centrifu-
--6 m l d ' u n e s o l u t i o n p u r e de c h l o r u r e d e c e s i u m d e d e n s i t 6 1,3.0.49 ('0,3105 g d e c h l o r u r e csuprapur Merck>> p a r g r a m m e de solution
totale). - 0,1 ml d'extrait b r u t bact6rien r e n f e r m a n t en m o y e n n e 1 nag de prot6ines tctales. - de l ' h u i l e de vaseline en quantit6 suffisante p o u r r e m p l i r totalement le tube. Apr~s centrifugation, le fond du tube est perc6 l'aide d ' u n e 6pingle et les fractions sont recueill i e s d a n s 48 t u b e s ~t h 6 m o l y s e ~ r a i s o n d e 3 g o u t t e s p a r t u b e s o i t u n v o l u m e d e 0,12 ml. La densit6 de chaque fraction par son indice de r6fractiou. L'activit6 aspartasique de chaque fraction que
est d 6 t e r m i n 6 e
est I n e s u r 6 e s u r 5,0 ~1 l'on introduit dans un
t u b e .~ h 6 m o l y s e c o n t e n a n t 0,5 m l d ' u n e s o l u t i o n d e f u m a r a t e d e N a 0,66 M, SO 4 (NH4) 2 2 M, T r i s 0;05 M p H 8,0. A p r ~ s 2 h d e c o n t a c t a u b a i n - m a r i e h 37°C, la r b a c t i o n est a r r + t 6 e p a r i m m e r s i o n d u tube bouch6 dans l'eau bouillante. Les quantit6s d'acide aspartique form6es sont d6termin6es sur d e s a l i q u o t s d e 20 ~1 p a r d o s a g e e n z y m a t i q u e . D6termination de l'activit6 aspartasique dans les e x t r a i t s b r u t s : L ' a c t i v i t 6 a s p a r t a s i q u e est d 6 t e r m i n 6 e p a r l a m e s u r e d e la v i t e s s e d ' a m i n a t i o n de l'acide fumarique. Les conditions standard ont 6tb d 6 c r i t e s p r 6 c 6 d e m m e n t [18]. L ' a c i d e a s p a r t i q u e f o r m 6 est dos6 e n s u i v a n t la t e c h n i q u e d e P f l e i d e r e r et coll. [19]. -
-
L ' a c t i v i t ~ s p 6 c i f i q u e a s p a r t a s i q u e est e x p r i m 6 e e n v m o l e s d ' a c i d e a s p a r t i q u e f o r m 6 p a r h e u r e et p a r nag d e p r o t 4 i n e s b a c t 6 r i e n n e s d o s 6 e s d ' a p r 6 s la m 6 t h o d e d e L o w r y et coll. [20].
RI~SULTATS. Variations de l'activit6 aspartasique des cellules caltiv6es en milieu synth6tique : Le t a b l e a u I r 6 s u m e les r ~ s u l t a t s d ' u n c e r t a i n nombre d'exp@iences faites en ajoutant, individuellement au milieu salin, diff@entes sources c a r b o n ~ e s et azot6es. Les b a c t 6 r i e s s o n t a d a p t 6 e s chaque milieu par subcultures successives about i s s a n t a u x p r 6 c u l t u r e s u t i l i s 6 e s p o u r les e n s e m e n -
TABLEAU ]. Influence
d e la c o m p o s i t i o n
du milieu
de culture sur l'activitO aspartasique.
Nature des sources carbon6es F u m a r a t e de Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P y r u v a t e de Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Malate dc Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Succinate de Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Citrate de Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aspartate de Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Asparagine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Glutamate de Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Glutamine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Glucose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aspartate de Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -~- f u m a r a t e (100 m g / l ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ~, -~- fumarate (500 mg/1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ,, + fumarate ( l g / l ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ~- f u m a r a t e (5g/l) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A s p a r t a t e de Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -~- glucose (5g/l) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Activit6 sp6cifique 4,3 3,9 2,4 2,7 4,7 174 142 83 77 5,9 171 167 li6 107 71 74,5 43,5
Composition du milieu de culture : K,_MPOa, 7 g/1 ; KH2PO4, 3 g/l ; MgSO,, 7 H_,O, 0 J g'/1 ; FeCI,, 1 ml d'une solution h 48:0~ mg p. cent ; CuCt~, 1 ml d ' u n e solution h 54 lug p. cent ; (NH~)~M'oTO._.,, 1 mt d ' u n e solution h 2,0'0 mg p. cent ; source carbon5e, 5 g/1 ; source azot6e 1 g/1 ; pH 7,0. L'activit~ spdcifique a s p a r t a s i q u e est exprim~e en i~moles d'acide a s p a r t i q u e form5 p a r h e u r e et p a r mg de prot~ines. B I O C H I M I E , 1976, 58, n ° 11-12.
Induction
de l'aspartate-ammonium
1331
lyase.
cements dans les m i l i e u x de m6me c o m p o s i t i o n . Les r6sultats rassembl6s dans le tableau I montrent que l'activit6 a s p a r t a s i q u e des cellules r6colt6es en d6but de p h a s e s t a t i o n n a i r e est :
li~rement p e n d a n t toute cette phase p o u r se stabiliser p e n d a n t la phase stationnaire.
- - trbs forte dans les cultures off la s o u r c e carbon@e et azot6e est l ' a s p a r t a t e ;
a) l ' a u g m e n t a t i o n d'activit6 a s p a r t a s i q u e dans les cultures en m i l i e u sy n t h 6 t i q u e oh la s o u r c e carbon6e est l'aspartate, est-elle due h une bio-
- - forte en pr6sence d ' a s p a r a g i n e ;
Ces o b s e r v a t i o n s posent les questions suivantes :
- - plus faible en pr6sence de glutamate et de g l u t am i n e ; -
trbs faible dans t o u s l e s autres cas.
-
~400
!
E
D ' a u t r e part, la p r 6 s e n c e de f u m a r a t e ou de glucose dans le m i l i e u s'oppose plus ou m o i n s efficacement, h la s t im u la ti o n p r o v o q u 6 e p a r l ' a c i d e aspartique. L ' a n t a g o n i s m e est d ' a u t a n t plus marqu6 que la c o n c e n t r a t i o n en a c i d e f u m a r i q u e est plus forte. Enfin, l'activit6 a s p a r t a s i q u e a 6t6 suivie en f o n c t i o n de la c r o i s s a n c e sur deux types de milieux, l'un 6rant constitu6 p a r le m i l i e u m i n i mal additionn6 d ' a s p a r t a t e de N a h raison de 5 g/l, l ' a u t r e de f u m a r a t e de Na fi la m6me con-
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Fro. 2. - - Activitd aspartasique en f o n c t i o n de l'dge de la cullure en m i l i e u s y n t h ~ t i q u e (( f u m a r a t e >>. (La T:
400 ^
source carbon6e est repr~sent6e par du fumarate de Na raison de 5 g/1. M~mes conditions d'ensemencements que figure 1).
~oo
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~oo
i lot
~o
~o
3o
40
Fzc,. 1. - - Aclivitd aspartasique en f o n c l i o n de l'dlge de la culture en m i l i e u s y n t h d t i q u e ¢ aspartate >>. (La seule source carbon6e est repr~sent6e par de l'aspartate de Na /~ raison de 5 g/1. L'inoculum est constitu6 de 5 ml d'une pr6cnlture de 24 heurcs sur le m~me milieu. La culture est effectu6e en fioles de 1 1 de capacit~ contenant 500 ml de milieu.
centration. Les r6sultats sont repr6sent6s p a r les figures 1 et 2. On constate que : - - les cellules p r o v e n a n t du m i l i e u r e n f e r m a n t l ' a c i d e f u m a r i q u e pr6sentent une trbs 16g~re augm e n t a t i o n de l'activit6 sp6cifique en fin de ph ase e x p o n e n t i e l l e de croissance, mais la v a l e u r absolue reste faible (inf6rieure h 1~0 unit6s). --tes cellules p r o v e n a n t du m i l i e u dont la source earbon6e est l'aspartate, pr6sentent au cont r a i r e une activit6 forte et m a x i m a l e au d6but de la phase exponentielle. Elle d i m i n u e ensuite r6guBIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.
synthbse i n d u i t e de l ' e n z y m e (par d6r6pression) ou h une a c t i v a t i o n de l ' e n z y m e p r 6 e x i s t a n t e ? b) Quel r61e doit-on a t t r i b u e r h l 'asp ar ag i n e, au glutamate, h la g l u t am i n e dans la s t i m u l a t i o n de l'activit6 aspartasique ? c) Quel r61e doit-on a t t r i b u e r aux diverses sources carbon6es ,(citrate, fulnarate, succinate, malate, p y r u v a t e , glucose) dans la d i m i n u t i o n de cette activit6 ? Une r6ponse p a r t i e l l e ~ ces questions a pu 6tre apport6e p a r les observations suivantes : 1) Mise en 6vidence d 'u n e biosynthbse i n d u i t e de l ' a s p a r t a t e - a m m o n i u m lyase. a) L'6tude en suspension n o n - p r o l i f 6 r a n t e des v a r i a t i o n s de l'activit6 a s p a r t a s i q u e confirme les o b s e r v a t i o n s faites en culture. Des cellules r6colt6es en d6but de phase stationn a i r e ~ p a r t i r d'un m i l i e u dont la s o u r c e carbon6e est constitu6e p a r du f u m a r a t e de Na "~ 5 g/l, pr6sentant une activit6 a s p a r t a s i q u e faible (9 unit6s), acqui~rent p ar i n c u b a t i o n en t a m p o n Tris en pr6sence d ' a s p a r t a t e de N a h la c o n c e n t r a t i o n 7.10-~ M une activit6 b e a u c o u p plus forte (113 unit6s aprbs 5 h d ' i n c u b a t i o n ) . Le m6me ph6nom~ne peut 6tre constat6 en t a m p o n phosphate. De plus l 'au g m en ration d'activit6 est abolie p ar le c h l o r a m p h 6 n i c o l 91
J.-C. H u b e r t et B. W u r t z .
13,32
(10 mg/1), p a r le 2-4 d i n i t r o p h 6 n o l (3.10-~M) ou p a r i n c u b a t i o n en ana6robiose. Ces o b s e r v a t i o n s c o n s t i t u en t des a r g u m e n t s en f a v e u r de r i n t e r p r 6 t a t i o n d'aprbs laquelle l ' a u g m e n t a t i o n d'activit6 a s p a r t a s i q u e consiste dans u n e n6osynth6se prot6ique. b) Mise en 6 v i d e n c e de la n 6 o f o r m a t i o u de l ' a s p a r t a t e - a m m o n i u m lyase p e n d a n t l ' i n c u b a t i o n en suspension n o n prolif6rante. La p r e u v e d i r e c t e de l ' i n d u c t i o n , m o n t r a n t sans ambiguit6 la n6osynthbse de l ' a s p a r t a t e a 6t6 apport6e p a r la nlise en 6 v i d e n c e d i r e c t e de l ' e n z y m e n6oform6e. La t e c h n i q u e utilis6e consiste m a r q u e r l ' e n z y m e synth6tis6e de novo au deuterium. Cette e n z y m e pr6sente une densit6 plus g r a n d e que celle de l ' e n z y m e c o n s t i t u t i v e synth6-
tis6e p e n d a n t la c r o i s s a n c e et pr6sente dans la cellule avant i n d u c t i o n . La s6paration des deux prot6ines peut se faire p ar c e n t r i f u g a t i o n h l'6quilibre en g r a d i e n t de c h l o r u r e de cesium (centrifugation iso-pycnique). Cette in6thode de s6paration a b o n d a m m e n t d6crite [21-23] p o u r diverses en zy m es et en p a r t i c u l i e r p a r E h r e s m a n n et coll. [ ~ ] darts le cas des a m i n o a c y l - t R N A synth6tases a 6t~ r e p r i s e et adapt6e ~ la s @ a r a t i o n de l ' a s p a r tase. Les c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n t a l e s sont r e p r o d u i t e s dans la 16gende de la figure 3. Des e x p 6 r i e n c e s pr61iminaires ont p e r m i s de v6rifier que l'augm e n t a t i o n de l'activit6 a s p a r t a s i q u e constat6e en m i l i e u tt20 se p r o d u i s a i t 6galement en D20. Les divers p a r a m 6 t r e s de la c e n t r i f u g a t i o n ont 6t6 d6termin6s e x p 6 r i m e n t a l e m e n t . On obtient, dans les c o n d i t i o n s d6finies darts la p a t t i e t e c h n i q u e , deux profils d ' a c t i v i t 6 diff,rents repr6sent6s dans la figure 3.
,#4
Cette figure fait a p p a r a i t r e : d m lt27:1
~o ~t
d=1,302 i n c v b ~ t J ~ n en D20 et ~sp~rtate
d =1~272
plc 020 pi( N20
Fro. 3. - - Fraclionnenaent de l'asparlase induile en D~O. 1 - - Activit6 des cellules incubdes en D~O. 2 - - Activitd des cellules incub6es en DoO et aspartate. Sch6ma expdrimental : 1,5 1 de culture'en milieu synth~tique ~> sont r6colt~s aprbs 25 h de croissance. Les'bact~ries sont lav~es avec H_.O et renaises en suspension en D~O /~ raison de 300 mg (6valud en protdines) par ml. 1 nal de cette suspension, constituant le tdmoin est incub~ darts ~0 nal de tampon Tris pH 7,2 0,{)5 ~ pr~par6 en D~O. 1 nal de la suspension est incub6 dans 40 nal du m~me tampon darts lequel on ajoute Paspartate de Na ~ la concentration de 7.10-3 M. Les suspensions sont agit~es pendant 3 h 25°C puis centrifug~es /t -J-4°C et lav~es /~ 2 reprises avec H.O. Los bact6ries ~sont t~truites par action des ultra-sons. L'extrait obtenu est centrifug6 pendant 60 nan ~ 36~)00 g ~t +2oC. 0,1 ml d'extrait sont d~pbs6s sur 6 na] de CsC1 de densit~ 1,3049 et centrifug6 dans un rotor: ~t angle fixe pendant 62 heures /~ 3,9000 tours/ nan h -~2°C. Le tube tbmoin et le tube essai sont fractionn~s en 48 fractions. On d~ternaine l'indice de r6fraetion de chaque fraction ainsi que son activit~ aspartasique.
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.
1) Profil r e p r 6 s e n t a n t l'activit6 a s p a r t a s i q u e du tube t6moin ( i n c u b a t i o n des cellules en eau l o u r d e sans aspartate). I1 n 'y a q u ' u n seul p i c d'activit6, c o r r e s p o n d a n t /~ l ' e n z y m e non deut6ri6e pr6sente dans la cellule avant i n cu b at i o n . Sa densit6 est celle t r o u v 6 e h a b i t u e l l e m e n t dans les e x p 6 r i e n c e s pr61iminaires p o r t a n t sur l ' e n z y m e pr6sente dans les cultures en H.20 , elle est 6gale h 1,272. 2) Profil r e p r 6 s e n t a n t l'activit6 a s p a r t a s i q u e dans le f r a c t i o n n e m e n t essai (cellules incub6es en D~O en presence d'aspartate). Ce profil c o m p o r t e deux pics d'activit6 aspartasique distincts et p a r f a i t e m e n t s6par6s. Le plus 16ger qui c o r r e s p o n d ~ celui mis en 6 v i d e n c e dans le f r a c t i o n n e m e n t des cellules t6moins (mbme densit6 d = 1,272) est dfi a l ' e n z y m e native pr6sente darts les cellules avant i n c u b a t i o n en eau lourde, c'est l ' e n z y m e non deut6ri6e. Le deuxibme p i c plus dense (d = 1,3'02) corresp o n d ~ l ' e n z y m e l o u r d e m a r q u 6 e au d e u t 6 r i u m et synth6tis6e en pr6sence d 'eau l o u r d e et d'aspartate. Ce r6sultat p e r m e t d ' a f f i r m e r que l ' a u g m e n t a t i o n d'activit6 a s p a r t a s i q u e p r o v o q u 6 e p a r incubation des cellules en pr6sence d ' a c i d e a s p a r t i q u e consiste bien darts une n6osynth6se de la p r o t 6 i n e e n z y m a t i q u e . On peut en d6duire que la forte activit6 a s p a r t a s i q u e mesur6e en cu l t u r e sur acide a s p a r t i q u e est la co n s6 q u en ce de r i n d u c t i o n de l ' a s p a r t a t e p e n d a n t la phase de latence. La d i m i n u t i o n d'activit6 constat6e p e n d a n t la phase expo-
Induction
de l ' a s p a r t a t e - a m m o n i u m
nentielle (figure 1 ) p e u t 6tre attribu6e q u a n t h elle h une d i l u t i o n h la suite d ' u n e synthbse diff6rentielle d'autres prot6ines. 2) R61e de l'asparagine, de l'acide glutamique et de la glutamine. Seul l'acide L(+) aspartique et h u n degr6 m o i n d r e l'asparagine, l'aeide L(+) glutamique et la glutamine i n d u i s e n t la synthbse de l'aspartase.
lyase.
1333
form6e dans les divers m6canismes cit6s ne permettrait pas la d6r6pression m a x i m a l e de la biosynthbse de l'aspartase. Nous avons pu m o n t r e r , en effet, qu'il existe une relation entre la concent r a t i o n en aeide aspartique du m i l i e u d ' i n c u b a t i o n et le n i v e a u atteint par l ' i n d u c t i o n . La figure 4 r e n d compte de cette relation. Elle m o n t r e que p o u r des c o n c e n t r a t i o n s en acide
TABLEAU II. I n f l u e n c e de divers c o m p o s ~ s sur r i n d u c t i o n de l'aspartase.
Aetivit6 sp6cifique aspartasique
Composition du milieu d'incubation de la suspension non-prolif6rante
Tampon phosphates pH 7, 2, 0, 05M . . . . . . . . . . . -~- L ( + ) aspartate (7.10-~M) * + D (--) ~spartate (7.10-3M) -~- methylaspartate (7.10-3M) ~- aeide cyst6ique L7.10-aM) -{- L ( + ) glutamate (7.10-3M) -~- glutamine (7.10-3M) . . . . . . ~ -~- asparagine (7.10-3M) . . . . . ~ -~- DL-alanine (7.10-ZM) . . . . . -[- glycine (7.10-3M). . . . . . . . . * -~- L (--) s~rine (7.10-3M). . . .
Les analogues de l'acide aspartique, l'acide D(--) aspartique, l'acide cyst6ique et l'acide m6thyl aspartique ne p r o v o q u e n t a u c u n e i n d u c t i o n . D'autres amino-acides tels la glycine, l ' a l a n i n e ou la s6rine n ' o n t a u c u n effet. Ces r6sultats seraient en faveur d ' u n e sp6cificit6 6troite de l ' i n d u c t e u r s'it ne snbsistait pas toutefois une c o n t r a d i c t i o n au sujet du r61e de l'asparagine, de l'acide glutamique et de la glutamine. Une hypothbse peut 6tre formul6e p o u r r e n d r e compte de l'activit6 de ces trois compos6s. Ils p e u v e n t en effet tous les trois cond u i r e n t r a p i d e m e n t chez P s e u d o m o n a s [luorescens h u n e p r o d u c t i o n d'acide aspartique. L'effet i n d u c t e u r de l ' a s p a r a g i n e p o u r r a i t s'exp l i q u e r p a r la pr6sence d ' u n e asparaginase [251 catalysant la d 6 s a m i n a t i o n de l ' a s p a r a g i n e en acide aspartique. L'activit6 i n d u c t r i c e de l'acide glutanfiqne s ' e x p l i q u e r a i t q u a n t h e l l e p a r la pr6sence de l ' a s p a r t a t e - a m i n o transf6rase c a t a l y s a n t la t r a n s a m i n a t i o n du glutamate en aspartate. La glutamine est transform~e en pr6senee de la glutaininase de P s e u d o m o n a s [luorescens E25! en aeide glutamique et r e j o i n t par cons6quent le cas pr6c6dent. Toutefois dans les trois cas, on observe q u ' u n e i n d u c t i o n partielle ; il faut donc admettre que la qnantit6 d'acide a s p a r i i q u e i n t r a c e l l u l a i r e BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.
Exp. n° I
2
3
2,1 57
0,8 80,5
2,1 50,6 3,8 2,6 2,8
42 d
I E
32 60 1,9 2
1,2
aspartique inf6rieures h 1 g/l (7.1.0-3 M), l ' a u g m e n ration d'activit6 aspartasique est parallble h l'augm e n t a t i o n de la c o n c e n t r a t i o n en aspartate. Au delh de ce seuil la c o n c e n t r a t i o n de l ' i n d u c t e u r n ' a pas d ' i n f l u e n c e sur le n i v e a u de l ' i n d u c t i o n .
!4
l°s~~ ~
, , ,OSM
'~oo
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Fro. 4. - - Influence de ta concentration en aspartate du milieu d'ineubation sur l'aelivitd asparlasiqne des cellules non prolif~rantes aprbs 5 heures d'ineubaHon.
J.-C. H u b e r t et B. lVurtz.
1334
Nous avons compar6 les taux d ' i n d u c t i o n obtenus en pr6sence de c o n c e n t r a t i o n s croissantes d'aspartate et de glutamate. Dans les deux cas la c o n c e n t r a t i o n externe de 7.10 -8 M est celle qui permet la d6r6pression maximale. TABLEAU III.
Influence de Vacide glutamique sur la biosynth6se induite de l'aspartase. Concentration en aspartate ou en glutamate du milieu d'incubation
Aetivit6 sp6eifique aspartasique Incubation en aspartate
Incubation en glutamate
10,8 56 72 70,5 69
10,8 26,6 33 33,9 30
0 (t~moins) . . . . . . . . . . . . . .
3,5.10-3M . . . . . . . . . . . . . . . 7.1O-3M . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,4.10-~M . . . . . . . . . . . . . . . 2,8.10-eM . . . . . . . . . . . . . . .
cessus c o n n u sous le nora de r6pression catabolique semble i n t e r v e n i r darts la r6gulation de la biosynth~se de l'aspartase. Nous avons constat6 (tableau I) que le glucose, l'acide p y r u v i q u e et divers i n t e r m 6 d i a i r e s du cycle de Krebs et plus p a r t i c u l i 6 r e m e n t l'acide fumarique, r 6 p r i m a i e n t au cours de la croissance, l'activit6 aspartasique des cellules. De plus il existe u n effet antagoniste entre l'acide aspartique et l'acide f u m a r i q u e ; l'activit6 aspartasique 6taut d ' a u t a n t plus 61ev6e que la c o n c e n t r a t i o n en acide f u m a r i q u e est plus faible. Nous avons pu pr6ciser que l ' a n t a g o n i s m e manifest~ p a r l'acide f u m a r i q u e ne s'exerce pas d i r e c t e m e n t sur l'activit6 de l ' e n z y m e comme le m o n t r e l ' e x p 6 r i e n c e s u i v a n t e : des cellules induites (cultiv6es en presence d ' a c i d e aspartique) raises en i n c u b a t i o n en s u s p e n s i o n non-prolif6r a n t e en pr6sence de fumarate, d'aspartate et du m61ange aspartate et fulnarate sont r6colt6es apr~s 5 h d ' i n c u b a t i o n . On mesure leur activit6 aspartasique. TABLEAU IV.
Les valeurs rassembl6es dans le t a b l e a u IH i n d i q u e n t que dans le cas de l ' i n d u c t i o n p a r l ' a c i d e glutamique, les valeurs les plus fortes ne r e p r 6 s e n t e n t que la moiti6 de celles obtenues en pr6sence d'aspartate. Ce r6sultat semble i n d i q u e r q u ' u n facteur autre que la c o n c e n t r a t i o n en acide glutamique est facteur l i m i t a n t de l ' i n d u c t i o n . Ce facteur p o u r r a i t 8tre l'activit6 de l ' a s p a r t a t e - a m i n o transf@ase (E.C.2.6.1.1.) qui reste constante pendant l ' i n d u c t i o n de l'aspartase. L'acide aspartique d6rivant dans ce cas de l'acide glutamique p a r t r a n s a m i n a t i o n en pr6sence d'acide oxalac6tique, i n t e r m 6 d i a i r e du cycle de Krebs, prdsent darts la cellule, n ' a t t e i n d r a i t pas la c o n c e n t r a t i o n p o u r p e r m e t t r e l ' i n d u c t i o n maximale. 3) R61e du fumarate, du malate, du citrate, du succinate, du p y r u v a t e et du glucose darts la dimin u t i o n de l'activit6 aspartasique. Epps et Gale [26] ont mis en 6vidence F a c t i o n d6Dressive du glucose present darts le m i l i e u de culture sur la biosynth6se de certains enzymes chez E. colt. Depuis, Stevenson et Mandelstam [27], Ornston [28], Higgin et Mandelstam [29] ont montr6 sans ambiguit6 que la synth6se de nombreuses enzymes responsables du catabolisme est i n d u i t e p a r leur substrat ou par u n i n t e r m 6 d i a i r e r6sultant de sa d6gradation et est r6prim6e p a r u n ou Dlusieurs compos6s d6rivant eux aussi de cette d6gradation. Ainsi Lessie et N e i d h a r d t [3,0] out d6montr6 que la biosynth6se de l'histidase de Pseudomonas aeruginosa est r6prim6e p a r le glucose et le gluconate d ' u n e part et par le citrate, le glutamate et l'oxalac6tate d ' a u t r e part. Ce pro-
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Influence de l'acide fumarique sur l'activit~ aspartique de cellules induites, incub~es en suspension non-prolifdrante. (Activit6 des cellules avant i n c u b a t i o n : 255). Composition du milieu d'ineubatiou Tampon Tris O,05M
pH 7,2 Tampon Tris -~- aspartate (7.1O-3M) Tampon Tris -~- aspartate (7.10-aM) + fumarate (7.10-3M) Tampon Tris -4- fumarate
(7.10-3M)
Aetivit6 sp~cifique (apr6s 5h d'incubation)
211 205
207
206
On constate que la pr6sence d'acide f u m a r i q u e ne lnodifie pas l'activit6 de l ' e n z y m e synth6tisde, d6jh pr6sente darts la cellule avant i n c u b a t i o n , elle reste constante en pr6sence ou en absence de fumarate. II a p p a r a i t d o n c r a i s o n n a b l e de p e n s e r quc l'acide f u m a r i q u e agit comme r6presseur de la biosynth6se de l'aspartase. Le probl6me qui reste pos6 est celui de la sp6cificit6 du r6presseur de cette biosynthbse. S'il est i n d 6 n i a b l e que la biosynth6se est soumise "~ u n e r6pression catabolique, il n ' a pas 6t6 possible de m o n t r e r de m a n i 6 r e directe que l'acide fumarique, p r o d u i t t e r m i n a l de la r6action catalys6e par
I n d u c t i o n de l ' a s p a r t a t e - a m m o n i u m lyase. l'aspartase, ~tait u n r~presseur ~ sp~cifique ~ ou s'il fallait le consid~rer comme r~presseur au mSme titre que le glucose ou les i n t e r m ~ d i a i r e s du cycle de Krebs. Des essais d~crits pr~c~demm e n t [31] p e r m e t t e n t de supposer que la p r e m i e r e hypoth~se est la plus plausible. Malheureusement il n ' a pas ~t~ possible d'isoler de m u t a n t s d~ficients dans l ' u t i l i s a t i o n des sources carbon~es impliqu~es dans le ph~nom~ne. DISCUSSION. L ' i n d u c t i o n de l'aspartase peut ~tre compar~e celle d'autres enzymes responsables du catabolisme d'acides amines. P a l l e r o n i et Stanier I32] chez Pseudomonas [luoreseens, Rosenfeld ct Feigelson [33] chez Pseudomonas acidovorans, ont d6crit la r6gulation de la t r y p t o p h a n e oxyg6nase, p r e m i e r e enzyme du catabolisme du t r y p t o p h a n e . Cette enzyme est i n d u i t e par la L(--) k y n u r 6 n i n e , p r e m i e r p r o d u i t de d~gradation de l'acide amin6. I1 e n e s t de m~me de l'histidase dont la r b g u l a t i o n a 6t6 d6crite p a r Newell et Lessie ~341 chez Pseudomonas aeruginosa et qui est i n d u i t e p a r l'urocanate, p r e m i e r i n t e r m 6 d i a i r e de la d6gradation de l ' h i s t i d i n e . Darts les deux cas l ' i n d u c t i o n est d~clench6e p a r u u p r o d u i t de d~gradation de l'acide amin6 et n o n pas comme dans le cas de l'aspartase par l'acide amin6 lui-m6me. La r6gulation par u n i n t e r m 6 d i a i r e rev6t p o u r P a l l e r o n i et Stanier [32] une signification physiologique importante. Ils admettent que ce m~canisme est u n processus d'6conomie qui emp6che l ' i n i t i a t i o n du catabolisme de l'acide amin6 et p a r cons6quent le gaspillage de l'~nergie qu'a n~cessit6 sa biosynthbse. Ces constatations p o u r r a i e n t c o n d u i r e h admettre que la r6action est u n processus peu r e n t a b l e pour la cellule, l'acide aspartique biosynth6tis~ 6tant catabolis6 au fur et 'h mesure et h m e s u r e de sa p r o d u c t i o n . Un 616merit de r~ponse peut 6tre apport6 par les t r a v a u x de Van de Casteele et H e r m a n n ~35] qui out mis en 6vidence u n ph~nom~ne i d e n t i q u e dans le cas de la d~gradation de la lysine chez Pseudomonas putida. Ils a d m e t t e n t que dans la majorit6 des cas la c o n c e n t r a t i o n i n t r a c e l l u l a i r e de lysine est tr~s faible de sorte que le processus catabolique n'est jamais amorc~ ; seules des conditions exceptionnelles tel que apport massif de lysine dans le m i l i e u de culture ou le cas particulier d ' u n m u t a n t s y n t h 6 t i s a n t des quantit6s importantes de lysine, i n d u i s e n t la lysine oxyg~nase. On peut p e n s e r qu'il e n e s t de m6me p o u r l'aspartase de Pseudomonas fluorescens qui n'est i n d u i t e
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que lorsque la c o n c e n t r a t i o n i n t r a c e l l u l a i r e de l'acide aspartique atteint u n seuil 61ev6 et que la c o n c e n t r a t i o n de l'acide f u m a r i q u e est faible. L ' e n s e m b l e des r6sultats pr6c6dents c o n d u i t h envisager le r61e de l'aspartase de la m a n i ~ r e suivante : - - l ' e n z y m e est constitutive. Sa pr6sence "~ u n taux faible, en absence d'acide aspartique dans le m i l i e u de culture, est toutefois c o m p a r a b l e "h celui de la glutamate deshydrog6nase mesur6 dans les m6mes cellules. On ne peut d6nier h l ' e n z y m e u n r61e de catalyseur de la biosynth~se de l ' a c i d e amin6. Cette c o n c e p t i o n d6fendue p a r Liess et coll. I5], p a r Vender et R i c k e n b e r g E3] p o u r Fenzyme de E. colt et p a r Ort6ga et Aguilar E36] p o u r celui de Salmonella typhimurium, est 6galement en accord avec la th6orie 6volutioniste formul6e p a r Kurata [37] : l'aspartase qui selon cet auteur fut F u n des p r e m i e r s enzymes /t 6tre a p p a r u sur T e r r e en m6me temps que la n i t r a t e reductase (quand l'atmosph~re 6tait r i c h e en a m m o n i a c ) a p o u r f o n c t i o n d ' a s s i m i l e r l ' i o n NH4 ÷ et de catalyser la synth~se du p r e m i e r acide amin6. - - l ' e n z y m e est de plus i n d u c t i b l e , son i n d u c teur est l'acide aspartique. Son r61e, darts ce cas, est essentiellement catabolique. L'acide aspartique est t r a n s f o r m 6 en acide fumarique, compos6 raptdement m6tabolisable dans le cas d ' u n germe a6robie strict tel que Pseudomonas [luorescens. La form a t i o n d'acide f u m a r i q u e h p a r t i r d'acide aspartique rev6t alors la signification d ' u n e r6action anapl6rotique capable de f o u r n i r de m a n i b r e constante h la cellule F u n des i n t e r m 6 d i a i r e s du cycle de Krebs i n d i s p e n s a b l e h son f o n c t i o n n e m e n t . Ces r6sultats n ' e x c l u e n t pas l'hypoth~se de l'existence de deux enzymes <~aspartase ~> catalysant la m6me r6action mats avec u n e efficacit6 diff6rente dans le sens a n a b o l i q u e et dans le sens catabolique. L'aspartase (< constitutive >> catalyserait la biosynthbse de l'acide aspartique ; l'aspartase <(inductible ~), n ' a p p a r a i s s a n t q u ' e n pr6sence d ' a c i d e aspartique dans le milieu, contr61erait la d6samin a t i o n de l'acide amin6. I1 est c e p e n d a n t plus logique de p e n s e r q u ' i l s'agit de la m6me enzyme. Cohen I38] souligne en effet ~ q u ' u n m6me enzyme peut ~tre constitutif dans u n e souche et i n d u c t i b l e dans une autre ou p a r t i e l l e m e n t constitutif, c'est-h-dire synth6tis6 quoiqu'h des taux diff~rents en absence d ' i n d u c teur ajout~ >). Une r6ponse "~ cette question p o u r r a i t 6tre apport6e p a r l ' a n a l y s e de la prot6ine p r o d u i t e
1336
J.-C. H u b e r t et B. W u r t z .
c o n s t i t u t i v e i n e n t et c e l t e s y n t h 6 t i s 6 e , e n g r a n d e
quantit6, en pr6sence d ' a c i d e aspartique. Compte t e n u de cette hypoth6se, nos r6sultats c o n d u i s e n t ~ l ' i n t e r p r 6 t a t i o n globale s u i v a n t e : la biosynthbse de l'aspartase est c o n s t a m m e n t r @ r i m 6 e dans la cellule p a r u n compos6 tel que l ' a c i d e f u n l a r i q u e (sa sp6cificit6 comme r6presseur restant h d6montrer) et dans ce cas les conc e n t r a t i o n s i n t r a c e l l u t a i r e s faibles d'acide aspartique, dont la pr6sence est d ' a u t r e part i n d i s p e n sable p o u r de n o m b r e u s e s biosynth6ses de la cellule, n ' e n t r a i n e n t pas la raise en jeu du processus catabolique. Cette biosynth6se est i n d u i t e q u a n d la c o n c e n t r a t i o n en acide aspartique devient plus i m p o r t a n t e , l'aspartate est alors utilis6 p a r la cellule comme substrat 6nerg~tique. Remerciements. Les auteurs r e m e r c i e n t M'onsieur le P r o f e s s e u r J. C. Patte pour lcs avis judicieux formul6s au cours de frdquents dchanges de vue et discussions ainsi que Monsieur le P r o f e s s e u r J. H. Well et Monsieur B. E h r e s m a n n pour leurs conseils concernant les s6parations en gradients de densitd. R~SUM~.. Les variations de l'aetivit~ aspartasique dans des milieux de diverse composition sont dues h une induetion de l ' a s p a r t a t e - a m m o n i u m lyase et h la r~gulation d,e la biosynth6se de cet enzyme. La r~alit~ de ]a ndosynth6se de l'enzyme a pu 8tre d~montrde par m a r quage et s~paration de la prot~ine. L'inducteur spdcifique semble etre l'aspartate. La biosynth~se est souraise h une forte r @ r e s s i o n catabolique. Le r61e p h y siologique de l ' a s p a r t a t e - a m m o n i u m lyase est diseut6. BIBLIOGRAPHIE. 1. Virtanen, A. I. & Tarnanen, J. (1932) Biochem. Z., :250, 193-211. 2. Halpern, Y. S. a Umbarger, H. E. (1960) J. Bact., 80, 285-288. 3. Vender, J. & Ricl~enberg, H. V. (1964) Biochim. Biophgs. Acta, 90, 218-219. 4. Vender, J., J a y a r a m a n , K. & Rickenberg, H. V. (1965) J. Bact., 90, 1304-1307. 5. Liess, K., Mecke, D. a Holzer, H. (1966) Biochem. Z., 346, 244-251.
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R6gulation de la biosynth6se de l'aspartate-ammonium lyase (aspartase) de Pseudomonas fluorescens. J e a n - C l a u d e HUBERT (> et B e n o i t WURTZ. Laboratoire de Biochimie Microbienne, Universit~ Louis Pasteur, 4, rue Blaise Pascal, 67000 Strasbourg.
(6-10-1976). Summary. - - Variations in aspartasic activity in various media are due to aspartatea m m o n i u m lyase induction and to regulation of the biosynthesis of this enzyme. Evidence for neosynthesis of the enzyme is provided by labelling and separation of the protein. The inducer appears to be aspartic acid. The biosynthesis is subject to pronounced catabolic repression. The physiological function of aspartate-ammonium lyase is discussed.
INTRODUCTION. L ' e x i s t e n c e c h e z Pseudomonas fluorescens d ' u n e a s p a r t a t e - a m m o n i u m l y a s e ( a s p a r t a s e ) (E.C.4.3.1.1.) c a t a l y s a n t la r 6 a c t i o n r 6 v e r s i b l e : F u m a r a t e + NH 3 ~ - - > a s p a r t a t e (°) a 6t6 d 6 m o n t r 6 e p a r V i r t a n e n et T a r n a n e n [11. Cette r 6 a c t i o n (°) c a t a b o l i q u e d a n s le s e n s de la d 6 s a m i n a t i o n de I ' a s p a r t a t e est 6 g a l e m e n t c o n s i d 6 r 6 e p a r de n o m b r e u x a u t e u r s [2-5] c o m m e 6rant l ' u n e de eelles p e r m e t t a n t h d i v e r s e s esp6ces b a c t 6 r i e n n e s d ' a s s i m i l e r l ' a m m o n i a q u e et de synt h 6 t i s e r u n a c i d e a m i n 6 essentiel. Elte a fait l ' o b j e t (te n o m b r e u s e s ~tudes [1-14]. C e p e n d a n t , p a r r o t l ' e n s e m b l e des r e c h e r c h e s c o n s a c r 6 e s h ce p r o c e s s u s , seules celles de Liess, M e c k e et H o l z e r [5], H a l p e r n et U m b a r g e r [2], F a r l e y et L i c h s t e i n [9] a b o r d e n t le p r o b l 6 m e de la r 6 g u l a t i o n de la b i o s y n t h 6 s e de l ' e n z y i n e . Ces a u t e u r s c o n s t a t e n t en p a r t i c u l i e r q u e c h e z E. colt, l ' a d d i t i o u de g l u c o s e au m i l i e u de c u l t u r e d i m i n u e son a c t i v i t 6 sp6cifique. La p r 6 s e n t e 6tude, f o n d 6 e s u r des o b s e r v a t i o n s a n t 6 r i e u r e s [15] a y a n t t r a i t a u x v a r i a t i o n s de l ' a c tivit6 a s p a r t a s i q u e de c e l l u l e s c u l t i v 6 e s en m i l i e u x c o m p l e x e s ( a v e c e x t r a i t de v i a n d e et e x t r a i t de l e v u r e ) , a eu p o u r b u t de s u i v r e l ' 6 v o l u t i o n de c e t t e a c t i v i t 6 e n z y m a t i q u e en m i l i e u x s y n t h 6 t i q u e s et d ' e s s a y e r de d6finir les m 6 c a n i s m e s r 6 g u l a t e u r s de la b i o s y n t h 6 s e de l ' a s p a r t a t e - a m m o n i u m lyase. MATI~,RIEL
ET
MI~THODES.
- - S o u c h e b a c t 6 r i e n n e : La s o u c h e de Pseudomonas fluorescens u t i l i s 6 e a 6t6 isol6e p a r W u r t z
To w h o m all em'respondencc should be addressed.
I16] et ses c a r a c t 6 r e s ont 6t6 d 6 c r i t s p a r M e y e r et W u r t z [17]. E l l e est d6pos6e d a n s la c o l l e c t i o n t c h 6 c o s l o v a q u c de m i c r o o r g a n i s m e s sous le N ° CCM2799. E l l e est e n t r e t e n u e sur le m i l i e u s y n t h 6 t i q u e utilis6 p o u r les c u l t u r e s , g~los6 h 15 g / 1 .
--Pr6culture : Une c o l o n i e est pr61ev6e s u r m i l i e u s o l i d e et e n s c m e n c 6 e d a n s 50 m l de m i l i e u s y n t h 6 t i q u e . L a p r 6 c u l t u r e est i n c u b 6 e 'h 25°C a v e c a g i t a t i o n p e n d a n t 24 h. --Milieu
de c u l t u r e :
(voir tableau
I).
- - Milieu d ' i n c u b a t i o n des s u s p e n s i o n s n o n - p r o l i f 6 r a n t e s : Les b a c t 6 r i c s r6colt6es p a r c e n t r i f u gation, lav6es "h 3 r e p r i s e s a v e c dc l ' e a u distill6e s o n t renfises en s u s p e n s i o n d a n s du t a m p o n T r i s 0,05 M p H 7,2 "a r a i s o n d ' e n v i r o n 100 m g de b a c t 6 r i e s ( p o i d s sec) p o u r 5'0.0 m l de t a m p o n . On a j o u t e 5 ces m i l i e u x d ' i n c u b a t i o n les s u b s t r a t s d o n t on v e u t 6 t u d i e r l ' i n f l u e n c e s u r la b i o s y n t h 6 s e de l ' e n z y m e . Les s u s p e n s i o n s s o n t s o u m i s e s h l'agit a t i o n h 25°C p e n d a n t des d u r 6 e s c o m p r i s e s e n t r e 2 et 5 h. L ' a b s e n c e de p r o l i f 6 r a t i o n de la s u s p e n s i o n b a c t @ i e n n e est v@ifi6e p a r la m e s u r e d u p o i d s sec au d 6 p a r t et h la fin de l ' e x p 6 r i e n c e . - - O b t e n t i o n de l ' e x t r a i t b a c t 6 r i e n : Au t e m p s c h o i s i les c e l l u l e s sont r6colt6es, lav6es h l ' e a u et d ~ t r u i t e s p a r a c t i o n des u l t r a - s o n s ( a p p a r e i l M.S.E., p u i s s a n c e 150 watts, f r 6 q u e n c e 20 KHz) h q - 4 ° G p e n d a n t 3 m n p a r s a c c a d e s de 3:0 sec. ( R e m a r q u e : le c u l o t b a c t 6 r i e n destin6 "h O r e s o u m i s a u x u l t r a s o n s est r e m i s en s u s p e n s i o n en eau distill6e. Des essais effectu6s en t a m p o n ou en p r 6 s e n c e des substrats de l ' e n z y m e c o n d u i s e n t aux m 6 m e s r6sultats). L ' e x t r a i t o b t e n u est c e n t r i f u g 6 'h 40 000 g p e n d a n t 30 m n h q- 4°C. L ' a c t i v i t 6 de l ' a s p a r t a t e -
J.-C. Hubert et B. W u r t z .
1 3 3 0
a m m o n i u m l y a s e est d 6 t e r m i n S e s u r le s u r n a g e a n t ainsi obtenu. Fractionnement de l'asparate-ammonium l y a s e m a r q u 6 e a u d e u t e r i u m et h l ' h y d r o g 6 n e e n gradient de densit6 de chlorure de cesium: On e f f e c t u e la c e n t r i f u g a t i o n h l ' 6 q u i l i b r e d a n s u n r o t o r '~ a n g l e fixe t y p e 50, d a n s u n e c e n t r i f u g e u s e B e c k m a n L5-50 h 39 0~0,0 t o u r s / r a n p e n d a n t 62 h h +2°C. -
-
Le gradient s'6tablit au cours g a t i o n d a n s le t u b e c o n t e n a n t :
de la centrifu-
--6 m l d ' u n e s o l u t i o n p u r e de c h l o r u r e d e c e s i u m d e d e n s i t 6 1,3.0.49 ('0,3105 g d e c h l o r u r e csuprapur Merck>> p a r g r a m m e de solution
totale). - 0,1 ml d'extrait b r u t bact6rien r e n f e r m a n t en m o y e n n e 1 nag de prot6ines tctales. - de l ' h u i l e de vaseline en quantit6 suffisante p o u r r e m p l i r totalement le tube. Apr~s centrifugation, le fond du tube est perc6 l'aide d ' u n e 6pingle et les fractions sont recueill i e s d a n s 48 t u b e s ~t h 6 m o l y s e ~ r a i s o n d e 3 g o u t t e s p a r t u b e s o i t u n v o l u m e d e 0,12 ml. La densit6 de chaque fraction par son indice de r6fractiou. L'activit6 aspartasique de chaque fraction que
est d 6 t e r m i n 6 e
est I n e s u r 6 e s u r 5,0 ~1 l'on introduit dans un
t u b e .~ h 6 m o l y s e c o n t e n a n t 0,5 m l d ' u n e s o l u t i o n d e f u m a r a t e d e N a 0,66 M, SO 4 (NH4) 2 2 M, T r i s 0;05 M p H 8,0. A p r ~ s 2 h d e c o n t a c t a u b a i n - m a r i e h 37°C, la r b a c t i o n est a r r + t 6 e p a r i m m e r s i o n d u tube bouch6 dans l'eau bouillante. Les quantit6s d'acide aspartique form6es sont d6termin6es sur d e s a l i q u o t s d e 20 ~1 p a r d o s a g e e n z y m a t i q u e . D6termination de l'activit6 aspartasique dans les e x t r a i t s b r u t s : L ' a c t i v i t 6 a s p a r t a s i q u e est d 6 t e r m i n 6 e p a r l a m e s u r e d e la v i t e s s e d ' a m i n a t i o n de l'acide fumarique. Les conditions standard ont 6tb d 6 c r i t e s p r 6 c 6 d e m m e n t [18]. L ' a c i d e a s p a r t i q u e f o r m 6 est dos6 e n s u i v a n t la t e c h n i q u e d e P f l e i d e r e r et coll. [19]. -
-
L ' a c t i v i t ~ s p 6 c i f i q u e a s p a r t a s i q u e est e x p r i m 6 e e n v m o l e s d ' a c i d e a s p a r t i q u e f o r m 6 p a r h e u r e et p a r nag d e p r o t 4 i n e s b a c t 6 r i e n n e s d o s 6 e s d ' a p r 6 s la m 6 t h o d e d e L o w r y et coll. [20].
RI~SULTATS. Variations de l'activit6 aspartasique des cellules caltiv6es en milieu synth6tique : Le t a b l e a u I r 6 s u m e les r ~ s u l t a t s d ' u n c e r t a i n nombre d'exp@iences faites en ajoutant, individuellement au milieu salin, diff@entes sources c a r b o n ~ e s et azot6es. Les b a c t 6 r i e s s o n t a d a p t 6 e s chaque milieu par subcultures successives about i s s a n t a u x p r 6 c u l t u r e s u t i l i s 6 e s p o u r les e n s e m e n -
TABLEAU ]. Influence
d e la c o m p o s i t i o n
du milieu
de culture sur l'activitO aspartasique.
Nature des sources carbon6es F u m a r a t e de Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P y r u v a t e de Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Malate dc Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Succinate de Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Citrate de Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aspartate de Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Asparagine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Glutamate de Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Glutamine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Glucose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aspartate de Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -~- f u m a r a t e (100 m g / l ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ~, -~- fumarate (500 mg/1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ,, + fumarate ( l g / l ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ~- f u m a r a t e (5g/l) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A s p a r t a t e de Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -~- glucose (5g/l) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Activit6 sp6cifique 4,3 3,9 2,4 2,7 4,7 174 142 83 77 5,9 171 167 li6 107 71 74,5 43,5
Composition du milieu de culture : K,_MPOa, 7 g/1 ; KH2PO4, 3 g/l ; MgSO,, 7 H_,O, 0 J g'/1 ; FeCI,, 1 ml d'une solution h 48:0~ mg p. cent ; CuCt~, 1 ml d ' u n e solution h 54 lug p. cent ; (NH~)~M'oTO._.,, 1 mt d ' u n e solution h 2,0'0 mg p. cent ; source carbon5e, 5 g/1 ; source azot6e 1 g/1 ; pH 7,0. L'activit~ spdcifique a s p a r t a s i q u e est exprim~e en i~moles d'acide a s p a r t i q u e form5 p a r h e u r e et p a r mg de prot~ines. B I O C H I M I E , 1976, 58, n ° 11-12.
Induction
de l'aspartate-ammonium
1331
lyase.
cements dans les m i l i e u x de m6me c o m p o s i t i o n . Les r6sultats rassembl6s dans le tableau I montrent que l'activit6 a s p a r t a s i q u e des cellules r6colt6es en d6but de p h a s e s t a t i o n n a i r e est :
li~rement p e n d a n t toute cette phase p o u r se stabiliser p e n d a n t la phase stationnaire.
- - trbs forte dans les cultures off la s o u r c e carbon@e et azot6e est l ' a s p a r t a t e ;
a) l ' a u g m e n t a t i o n d'activit6 a s p a r t a s i q u e dans les cultures en m i l i e u sy n t h 6 t i q u e oh la s o u r c e carbon6e est l'aspartate, est-elle due h une bio-
- - forte en pr6sence d ' a s p a r a g i n e ;
Ces o b s e r v a t i o n s posent les questions suivantes :
- - plus faible en pr6sence de glutamate et de g l u t am i n e ; -
trbs faible dans t o u s l e s autres cas.
-
~400
!
E
D ' a u t r e part, la p r 6 s e n c e de f u m a r a t e ou de glucose dans le m i l i e u s'oppose plus ou m o i n s efficacement, h la s t im u la ti o n p r o v o q u 6 e p a r l ' a c i d e aspartique. L ' a n t a g o n i s m e est d ' a u t a n t plus marqu6 que la c o n c e n t r a t i o n en a c i d e f u m a r i q u e est plus forte. Enfin, l'activit6 a s p a r t a s i q u e a 6t6 suivie en f o n c t i o n de la c r o i s s a n c e sur deux types de milieux, l'un 6rant constitu6 p a r le m i l i e u m i n i mal additionn6 d ' a s p a r t a t e de N a h raison de 5 g/l, l ' a u t r e de f u m a r a t e de Na fi la m6me con-
a
i r
i 2oo
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~o h e u r e ~
Fro. 2. - - Activitd aspartasique en f o n c t i o n de l'dge de la cullure en m i l i e u s y n t h ~ t i q u e (( f u m a r a t e >>. (La T:
400 ^
source carbon6e est repr~sent6e par du fumarate de Na raison de 5 g/1. M~mes conditions d'ensemencements que figure 1).
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3o
40
Fzc,. 1. - - Aclivitd aspartasique en f o n c l i o n de l'dlge de la culture en m i l i e u s y n t h d t i q u e ¢ aspartate >>. (La seule source carbon6e est repr~sent6e par de l'aspartate de Na /~ raison de 5 g/1. L'inoculum est constitu6 de 5 ml d'une pr6cnlture de 24 heurcs sur le m~me milieu. La culture est effectu6e en fioles de 1 1 de capacit~ contenant 500 ml de milieu.
centration. Les r6sultats sont repr6sent6s p a r les figures 1 et 2. On constate que : - - les cellules p r o v e n a n t du m i l i e u r e n f e r m a n t l ' a c i d e f u m a r i q u e pr6sentent une trbs 16g~re augm e n t a t i o n de l'activit6 sp6cifique en fin de ph ase e x p o n e n t i e l l e de croissance, mais la v a l e u r absolue reste faible (inf6rieure h 1~0 unit6s). --tes cellules p r o v e n a n t du m i l i e u dont la source earbon6e est l'aspartate, pr6sentent au cont r a i r e une activit6 forte et m a x i m a l e au d6but de la phase exponentielle. Elle d i m i n u e ensuite r6guBIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.
synthbse i n d u i t e de l ' e n z y m e (par d6r6pression) ou h une a c t i v a t i o n de l ' e n z y m e p r 6 e x i s t a n t e ? b) Quel r61e doit-on a t t r i b u e r h l 'asp ar ag i n e, au glutamate, h la g l u t am i n e dans la s t i m u l a t i o n de l'activit6 aspartasique ? c) Quel r61e doit-on a t t r i b u e r aux diverses sources carbon6es ,(citrate, fulnarate, succinate, malate, p y r u v a t e , glucose) dans la d i m i n u t i o n de cette activit6 ? Une r6ponse p a r t i e l l e ~ ces questions a pu 6tre apport6e p a r les observations suivantes : 1) Mise en 6vidence d 'u n e biosynthbse i n d u i t e de l ' a s p a r t a t e - a m m o n i u m lyase. a) L'6tude en suspension n o n - p r o l i f 6 r a n t e des v a r i a t i o n s de l'activit6 a s p a r t a s i q u e confirme les o b s e r v a t i o n s faites en culture. Des cellules r6colt6es en d6but de phase stationn a i r e ~ p a r t i r d'un m i l i e u dont la s o u r c e carbon6e est constitu6e p a r du f u m a r a t e de Na "~ 5 g/l, pr6sentant une activit6 a s p a r t a s i q u e faible (9 unit6s), acqui~rent p ar i n c u b a t i o n en t a m p o n Tris en pr6sence d ' a s p a r t a t e de N a h la c o n c e n t r a t i o n 7.10-~ M une activit6 b e a u c o u p plus forte (113 unit6s aprbs 5 h d ' i n c u b a t i o n ) . Le m6me ph6nom~ne peut 6tre constat6 en t a m p o n phosphate. De plus l 'au g m en ration d'activit6 est abolie p ar le c h l o r a m p h 6 n i c o l 91
J.-C. H u b e r t et B. W u r t z .
13,32
(10 mg/1), p a r le 2-4 d i n i t r o p h 6 n o l (3.10-~M) ou p a r i n c u b a t i o n en ana6robiose. Ces o b s e r v a t i o n s c o n s t i t u en t des a r g u m e n t s en f a v e u r de r i n t e r p r 6 t a t i o n d'aprbs laquelle l ' a u g m e n t a t i o n d'activit6 a s p a r t a s i q u e consiste dans u n e n6osynth6se prot6ique. b) Mise en 6 v i d e n c e de la n 6 o f o r m a t i o u de l ' a s p a r t a t e - a m m o n i u m lyase p e n d a n t l ' i n c u b a t i o n en suspension n o n prolif6rante. La p r e u v e d i r e c t e de l ' i n d u c t i o n , m o n t r a n t sans ambiguit6 la n6osynthbse de l ' a s p a r t a t e a 6t6 apport6e p a r la nlise en 6 v i d e n c e d i r e c t e de l ' e n z y m e n6oform6e. La t e c h n i q u e utilis6e consiste m a r q u e r l ' e n z y m e synth6tis6e de novo au deuterium. Cette e n z y m e pr6sente une densit6 plus g r a n d e que celle de l ' e n z y m e c o n s t i t u t i v e synth6-
tis6e p e n d a n t la c r o i s s a n c e et pr6sente dans la cellule avant i n d u c t i o n . La s6paration des deux prot6ines peut se faire p ar c e n t r i f u g a t i o n h l'6quilibre en g r a d i e n t de c h l o r u r e de cesium (centrifugation iso-pycnique). Cette in6thode de s6paration a b o n d a m m e n t d6crite [21-23] p o u r diverses en zy m es et en p a r t i c u l i e r p a r E h r e s m a n n et coll. [ ~ ] darts le cas des a m i n o a c y l - t R N A synth6tases a 6t~ r e p r i s e et adapt6e ~ la s @ a r a t i o n de l ' a s p a r tase. Les c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n t a l e s sont r e p r o d u i t e s dans la 16gende de la figure 3. Des e x p 6 r i e n c e s pr61iminaires ont p e r m i s de v6rifier que l'augm e n t a t i o n de l'activit6 a s p a r t a s i q u e constat6e en m i l i e u tt20 se p r o d u i s a i t 6galement en D20. Les divers p a r a m 6 t r e s de la c e n t r i f u g a t i o n ont 6t6 d6termin6s e x p 6 r i m e n t a l e m e n t . On obtient, dans les c o n d i t i o n s d6finies darts la p a t t i e t e c h n i q u e , deux profils d ' a c t i v i t 6 diff,rents repr6sent6s dans la figure 3.
,#4
Cette figure fait a p p a r a i t r e : d m lt27:1
~o ~t
d=1,302 i n c v b ~ t J ~ n en D20 et ~sp~rtate
d =1~272
plc 020 pi( N20
Fro. 3. - - Fraclionnenaent de l'asparlase induile en D~O. 1 - - Activit6 des cellules incubdes en D~O. 2 - - Activitd des cellules incub6es en DoO et aspartate. Sch6ma expdrimental : 1,5 1 de culture'en milieu synth~tique ~
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.
1) Profil r e p r 6 s e n t a n t l'activit6 a s p a r t a s i q u e du tube t6moin ( i n c u b a t i o n des cellules en eau l o u r d e sans aspartate). I1 n 'y a q u ' u n seul p i c d'activit6, c o r r e s p o n d a n t /~ l ' e n z y m e non deut6ri6e pr6sente dans la cellule avant i n cu b at i o n . Sa densit6 est celle t r o u v 6 e h a b i t u e l l e m e n t dans les e x p 6 r i e n c e s pr61iminaires p o r t a n t sur l ' e n z y m e pr6sente dans les cultures en H.20 , elle est 6gale h 1,272. 2) Profil r e p r 6 s e n t a n t l'activit6 a s p a r t a s i q u e dans le f r a c t i o n n e m e n t essai (cellules incub6es en D~O en presence d'aspartate). Ce profil c o m p o r t e deux pics d'activit6 aspartasique distincts et p a r f a i t e m e n t s6par6s. Le plus 16ger qui c o r r e s p o n d ~ celui mis en 6 v i d e n c e dans le f r a c t i o n n e m e n t des cellules t6moins (mbme densit6 d = 1,272) est dfi a l ' e n z y m e native pr6sente darts les cellules avant i n c u b a t i o n en eau lourde, c'est l ' e n z y m e non deut6ri6e. Le deuxibme p i c plus dense (d = 1,3'02) corresp o n d ~ l ' e n z y m e l o u r d e m a r q u 6 e au d e u t 6 r i u m et synth6tis6e en pr6sence d 'eau l o u r d e et d'aspartate. Ce r6sultat p e r m e t d ' a f f i r m e r que l ' a u g m e n t a t i o n d'activit6 a s p a r t a s i q u e p r o v o q u 6 e p a r incubation des cellules en pr6sence d ' a c i d e a s p a r t i q u e consiste bien darts une n6osynth6se de la p r o t 6 i n e e n z y m a t i q u e . On peut en d6duire que la forte activit6 a s p a r t a s i q u e mesur6e en cu l t u r e sur acide a s p a r t i q u e est la co n s6 q u en ce de r i n d u c t i o n de l ' a s p a r t a t e p e n d a n t la phase de latence. La d i m i n u t i o n d'activit6 constat6e p e n d a n t la phase expo-
Induction
de l ' a s p a r t a t e - a m m o n i u m
nentielle (figure 1 ) p e u t 6tre attribu6e q u a n t h elle h une d i l u t i o n h la suite d ' u n e synthbse diff6rentielle d'autres prot6ines. 2) R61e de l'asparagine, de l'acide glutamique et de la glutamine. Seul l'acide L(+) aspartique et h u n degr6 m o i n d r e l'asparagine, l'aeide L(+) glutamique et la glutamine i n d u i s e n t la synthbse de l'aspartase.
lyase.
1333
form6e dans les divers m6canismes cit6s ne permettrait pas la d6r6pression m a x i m a l e de la biosynthbse de l'aspartase. Nous avons pu m o n t r e r , en effet, qu'il existe une relation entre la concent r a t i o n en aeide aspartique du m i l i e u d ' i n c u b a t i o n et le n i v e a u atteint par l ' i n d u c t i o n . La figure 4 r e n d compte de cette relation. Elle m o n t r e que p o u r des c o n c e n t r a t i o n s en acide
TABLEAU II. I n f l u e n c e de divers c o m p o s ~ s sur r i n d u c t i o n de l'aspartase.
Aetivit6 sp6cifique aspartasique
Composition du milieu d'incubation de la suspension non-prolif6rante
Tampon phosphates pH 7, 2, 0, 05M . . . . . . . . . . . -~- L ( + ) aspartate (7.10-~M) * + D (--) ~spartate (7.10-3M) -~- methylaspartate (7.10-3M) ~- aeide cyst6ique L7.10-aM) -{- L ( + ) glutamate (7.10-3M) -~- glutamine (7.10-3M) . . . . . . ~ -~- asparagine (7.10-3M) . . . . . ~ -~- DL-alanine (7.10-ZM) . . . . . -[- glycine (7.10-3M). . . . . . . . . * -~- L (--) s~rine (7.10-3M). . . .
Les analogues de l'acide aspartique, l'acide D(--) aspartique, l'acide cyst6ique et l'acide m6thyl aspartique ne p r o v o q u e n t a u c u n e i n d u c t i o n . D'autres amino-acides tels la glycine, l ' a l a n i n e ou la s6rine n ' o n t a u c u n effet. Ces r6sultats seraient en faveur d ' u n e sp6cificit6 6troite de l ' i n d u c t e u r s'it ne snbsistait pas toutefois une c o n t r a d i c t i o n au sujet du r61e de l'asparagine, de l'acide glutamique et de la glutamine. Une hypothbse peut 6tre formul6e p o u r r e n d r e compte de l'activit6 de ces trois compos6s. Ils p e u v e n t en effet tous les trois cond u i r e n t r a p i d e m e n t chez P s e u d o m o n a s [luorescens h u n e p r o d u c t i o n d'acide aspartique. L'effet i n d u c t e u r de l ' a s p a r a g i n e p o u r r a i t s'exp l i q u e r p a r la pr6sence d ' u n e asparaginase [251 catalysant la d 6 s a m i n a t i o n de l ' a s p a r a g i n e en acide aspartique. L'activit6 i n d u c t r i c e de l'acide glutanfiqne s ' e x p l i q u e r a i t q u a n t h e l l e p a r la pr6sence de l ' a s p a r t a t e - a m i n o transf6rase c a t a l y s a n t la t r a n s a m i n a t i o n du glutamate en aspartate. La glutamine est transform~e en pr6senee de la glutaininase de P s e u d o m o n a s [luorescens E25! en aeide glutamique et r e j o i n t par cons6quent le cas pr6c6dent. Toutefois dans les trois cas, on observe q u ' u n e i n d u c t i o n partielle ; il faut donc admettre que la qnantit6 d'acide a s p a r i i q u e i n t r a c e l l u l a i r e BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.
Exp. n° I
2
3
2,1 57
0,8 80,5
2,1 50,6 3,8 2,6 2,8
42 d
I E
32 60 1,9 2
1,2
aspartique inf6rieures h 1 g/l (7.1.0-3 M), l ' a u g m e n ration d'activit6 aspartasique est parallble h l'augm e n t a t i o n de la c o n c e n t r a t i o n en aspartate. Au delh de ce seuil la c o n c e n t r a t i o n de l ' i n d u c t e u r n ' a pas d ' i n f l u e n c e sur le n i v e a u de l ' i n d u c t i o n .
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l°s~~ ~
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Fro. 4. - - Influence de ta concentration en aspartate du milieu d'ineubation sur l'aelivitd asparlasiqne des cellules non prolif~rantes aprbs 5 heures d'ineubaHon.
J.-C. H u b e r t et B. lVurtz.
1334
Nous avons compar6 les taux d ' i n d u c t i o n obtenus en pr6sence de c o n c e n t r a t i o n s croissantes d'aspartate et de glutamate. Dans les deux cas la c o n c e n t r a t i o n externe de 7.10 -8 M est celle qui permet la d6r6pression maximale. TABLEAU III.
Influence de Vacide glutamique sur la biosynth6se induite de l'aspartase. Concentration en aspartate ou en glutamate du milieu d'incubation
Aetivit6 sp6eifique aspartasique Incubation en aspartate
Incubation en glutamate
10,8 56 72 70,5 69
10,8 26,6 33 33,9 30
0 (t~moins) . . . . . . . . . . . . . .
3,5.10-3M . . . . . . . . . . . . . . . 7.1O-3M . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,4.10-~M . . . . . . . . . . . . . . . 2,8.10-eM . . . . . . . . . . . . . . .
cessus c o n n u sous le nora de r6pression catabolique semble i n t e r v e n i r darts la r6gulation de la biosynth~se de l'aspartase. Nous avons constat6 (tableau I) que le glucose, l'acide p y r u v i q u e et divers i n t e r m 6 d i a i r e s du cycle de Krebs et plus p a r t i c u l i 6 r e m e n t l'acide fumarique, r 6 p r i m a i e n t au cours de la croissance, l'activit6 aspartasique des cellules. De plus il existe u n effet antagoniste entre l'acide aspartique et l'acide f u m a r i q u e ; l'activit6 aspartasique 6taut d ' a u t a n t plus 61ev6e que la c o n c e n t r a t i o n en acide f u m a r i q u e est plus faible. Nous avons pu pr6ciser que l ' a n t a g o n i s m e manifest~ p a r l'acide f u m a r i q u e ne s'exerce pas d i r e c t e m e n t sur l'activit6 de l ' e n z y m e comme le m o n t r e l ' e x p 6 r i e n c e s u i v a n t e : des cellules induites (cultiv6es en presence d ' a c i d e aspartique) raises en i n c u b a t i o n en s u s p e n s i o n non-prolif6r a n t e en pr6sence de fumarate, d'aspartate et du m61ange aspartate et fulnarate sont r6colt6es apr~s 5 h d ' i n c u b a t i o n . On mesure leur activit6 aspartasique. TABLEAU IV.
Les valeurs rassembl6es dans le t a b l e a u IH i n d i q u e n t que dans le cas de l ' i n d u c t i o n p a r l ' a c i d e glutamique, les valeurs les plus fortes ne r e p r 6 s e n t e n t que la moiti6 de celles obtenues en pr6sence d'aspartate. Ce r6sultat semble i n d i q u e r q u ' u n facteur autre que la c o n c e n t r a t i o n en acide glutamique est facteur l i m i t a n t de l ' i n d u c t i o n . Ce facteur p o u r r a i t 8tre l'activit6 de l ' a s p a r t a t e - a m i n o transf@ase (E.C.2.6.1.1.) qui reste constante pendant l ' i n d u c t i o n de l'aspartase. L'acide aspartique d6rivant dans ce cas de l'acide glutamique p a r t r a n s a m i n a t i o n en pr6sence d'acide oxalac6tique, i n t e r m 6 d i a i r e du cycle de Krebs, prdsent darts la cellule, n ' a t t e i n d r a i t pas la c o n c e n t r a t i o n p o u r p e r m e t t r e l ' i n d u c t i o n maximale. 3) R61e du fumarate, du malate, du citrate, du succinate, du p y r u v a t e et du glucose darts la dimin u t i o n de l'activit6 aspartasique. Epps et Gale [26] ont mis en 6vidence F a c t i o n d6Dressive du glucose present darts le m i l i e u de culture sur la biosynth6se de certains enzymes chez E. colt. Depuis, Stevenson et Mandelstam [27], Ornston [28], Higgin et Mandelstam [29] ont montr6 sans ambiguit6 que la synth6se de nombreuses enzymes responsables du catabolisme est i n d u i t e p a r leur substrat ou par u n i n t e r m 6 d i a i r e r6sultant de sa d6gradation et est r6prim6e p a r u n ou Dlusieurs compos6s d6rivant eux aussi de cette d6gradation. Ainsi Lessie et N e i d h a r d t [3,0] out d6montr6 que la biosynth6se de l'histidase de Pseudomonas aeruginosa est r6prim6e p a r le glucose et le gluconate d ' u n e part et par le citrate, le glutamate et l'oxalac6tate d ' a u t r e part. Ce pro-
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Influence de l'acide fumarique sur l'activit~ aspartique de cellules induites, incub~es en suspension non-prolifdrante. (Activit6 des cellules avant i n c u b a t i o n : 255). Composition du milieu d'ineubatiou Tampon Tris O,05M
pH 7,2 Tampon Tris -~- aspartate (7.1O-3M) Tampon Tris -~- aspartate (7.10-aM) + fumarate (7.10-3M) Tampon Tris -4- fumarate
(7.10-3M)
Aetivit6 sp~cifique (apr6s 5h d'incubation)
211 205
207
206
On constate que la pr6sence d'acide f u m a r i q u e ne lnodifie pas l'activit6 de l ' e n z y m e synth6tisde, d6jh pr6sente darts la cellule avant i n c u b a t i o n , elle reste constante en pr6sence ou en absence de fumarate. II a p p a r a i t d o n c r a i s o n n a b l e de p e n s e r quc l'acide f u m a r i q u e agit comme r6presseur de la biosynth6se de l'aspartase. Le probl6me qui reste pos6 est celui de la sp6cificit6 du r6presseur de cette biosynthbse. S'il est i n d 6 n i a b l e que la biosynth6se est soumise "~ u n e r6pression catabolique, il n ' a pas 6t6 possible de m o n t r e r de m a n i 6 r e directe que l'acide fumarique, p r o d u i t t e r m i n a l de la r6action catalys6e par
I n d u c t i o n de l ' a s p a r t a t e - a m m o n i u m lyase. l'aspartase, ~tait u n r~presseur ~ sp~cifique ~ ou s'il fallait le consid~rer comme r~presseur au mSme titre que le glucose ou les i n t e r m ~ d i a i r e s du cycle de Krebs. Des essais d~crits pr~c~demm e n t [31] p e r m e t t e n t de supposer que la p r e m i e r e hypoth~se est la plus plausible. Malheureusement il n ' a pas ~t~ possible d'isoler de m u t a n t s d~ficients dans l ' u t i l i s a t i o n des sources carbon~es impliqu~es dans le ph~nom~ne. DISCUSSION. L ' i n d u c t i o n de l'aspartase peut ~tre compar~e celle d'autres enzymes responsables du catabolisme d'acides amines. P a l l e r o n i et Stanier I32] chez Pseudomonas [luoreseens, Rosenfeld ct Feigelson [33] chez Pseudomonas acidovorans, ont d6crit la r6gulation de la t r y p t o p h a n e oxyg6nase, p r e m i e r e enzyme du catabolisme du t r y p t o p h a n e . Cette enzyme est i n d u i t e par la L(--) k y n u r 6 n i n e , p r e m i e r p r o d u i t de d~gradation de l'acide amin6. I1 e n e s t de m~me de l'histidase dont la r b g u l a t i o n a 6t6 d6crite p a r Newell et Lessie ~341 chez Pseudomonas aeruginosa et qui est i n d u i t e p a r l'urocanate, p r e m i e r i n t e r m 6 d i a i r e de la d6gradation de l ' h i s t i d i n e . Darts les deux cas l ' i n d u c t i o n est d~clench6e p a r u u p r o d u i t de d~gradation de l'acide amin6 et n o n pas comme dans le cas de l'aspartase par l'acide amin6 lui-m6me. La r6gulation par u n i n t e r m 6 d i a i r e rev6t p o u r P a l l e r o n i et Stanier [32] une signification physiologique importante. Ils admettent que ce m~canisme est u n processus d'6conomie qui emp6che l ' i n i t i a t i o n du catabolisme de l'acide amin6 et p a r cons6quent le gaspillage de l'~nergie qu'a n~cessit6 sa biosynthbse. Ces constatations p o u r r a i e n t c o n d u i r e h admettre que la r6action est u n processus peu r e n t a b l e pour la cellule, l'acide aspartique biosynth6tis~ 6tant catabolis6 au fur et 'h mesure et h m e s u r e de sa p r o d u c t i o n . Un 616merit de r~ponse peut 6tre apport6 par les t r a v a u x de Van de Casteele et H e r m a n n ~35] qui out mis en 6vidence u n ph~nom~ne i d e n t i q u e dans le cas de la d~gradation de la lysine chez Pseudomonas putida. Ils a d m e t t e n t que dans la majorit6 des cas la c o n c e n t r a t i o n i n t r a c e l l u l a i r e de lysine est tr~s faible de sorte que le processus catabolique n'est jamais amorc~ ; seules des conditions exceptionnelles tel que apport massif de lysine dans le m i l i e u de culture ou le cas particulier d ' u n m u t a n t s y n t h 6 t i s a n t des quantit6s importantes de lysine, i n d u i s e n t la lysine oxyg~nase. On peut p e n s e r qu'il e n e s t de m6me p o u r l'aspartase de Pseudomonas fluorescens qui n'est i n d u i t e
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que lorsque la c o n c e n t r a t i o n i n t r a c e l l u l a i r e de l'acide aspartique atteint u n seuil 61ev6 et que la c o n c e n t r a t i o n de l'acide f u m a r i q u e est faible. L ' e n s e m b l e des r6sultats pr6c6dents c o n d u i t h envisager le r61e de l'aspartase de la m a n i ~ r e suivante : - - l ' e n z y m e est constitutive. Sa pr6sence "~ u n taux faible, en absence d'acide aspartique dans le m i l i e u de culture, est toutefois c o m p a r a b l e "h celui de la glutamate deshydrog6nase mesur6 dans les m6mes cellules. On ne peut d6nier h l ' e n z y m e u n r61e de catalyseur de la biosynth~se de l ' a c i d e amin6. Cette c o n c e p t i o n d6fendue p a r Liess et coll. I5], p a r Vender et R i c k e n b e r g E3] p o u r Fenzyme de E. colt et p a r Ort6ga et Aguilar E36] p o u r celui de Salmonella typhimurium, est 6galement en accord avec la th6orie 6volutioniste formul6e p a r Kurata [37] : l'aspartase qui selon cet auteur fut F u n des p r e m i e r s enzymes /t 6tre a p p a r u sur T e r r e en m6me temps que la n i t r a t e reductase (quand l'atmosph~re 6tait r i c h e en a m m o n i a c ) a p o u r f o n c t i o n d ' a s s i m i l e r l ' i o n NH4 ÷ et de catalyser la synth~se du p r e m i e r acide amin6. - - l ' e n z y m e est de plus i n d u c t i b l e , son i n d u c teur est l'acide aspartique. Son r61e, darts ce cas, est essentiellement catabolique. L'acide aspartique est t r a n s f o r m 6 en acide fumarique, compos6 raptdement m6tabolisable dans le cas d ' u n germe a6robie strict tel que Pseudomonas [luorescens. La form a t i o n d'acide f u m a r i q u e h p a r t i r d'acide aspartique rev6t alors la signification d ' u n e r6action anapl6rotique capable de f o u r n i r de m a n i b r e constante h la cellule F u n des i n t e r m 6 d i a i r e s du cycle de Krebs i n d i s p e n s a b l e h son f o n c t i o n n e m e n t . Ces r6sultats n ' e x c l u e n t pas l'hypoth~se de l'existence de deux enzymes <~aspartase ~> catalysant la m6me r6action mats avec u n e efficacit6 diff6rente dans le sens a n a b o l i q u e et dans le sens catabolique. L'aspartase (< constitutive >> catalyserait la biosynthbse de l'acide aspartique ; l'aspartase <(inductible ~), n ' a p p a r a i s s a n t q u ' e n pr6sence d ' a c i d e aspartique dans le milieu, contr61erait la d6samin a t i o n de l'acide amin6. I1 est c e p e n d a n t plus logique de p e n s e r q u ' i l s'agit de la m6me enzyme. Cohen I38] souligne en effet ~ q u ' u n m6me enzyme peut ~tre constitutif dans u n e souche et i n d u c t i b l e dans une autre ou p a r t i e l l e m e n t constitutif, c'est-h-dire synth6tis6 quoiqu'h des taux diff~rents en absence d ' i n d u c teur ajout~ >). Une r6ponse "~ cette question p o u r r a i t 6tre apport6e p a r l ' a n a l y s e de la prot6ine p r o d u i t e
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J.-C. H u b e r t et B. W u r t z .
c o n s t i t u t i v e i n e n t et c e l t e s y n t h 6 t i s 6 e , e n g r a n d e
quantit6, en pr6sence d ' a c i d e aspartique. Compte t e n u de cette hypoth6se, nos r6sultats c o n d u i s e n t ~ l ' i n t e r p r 6 t a t i o n globale s u i v a n t e : la biosynthbse de l'aspartase est c o n s t a m m e n t r @ r i m 6 e dans la cellule p a r u n compos6 tel que l ' a c i d e f u n l a r i q u e (sa sp6cificit6 comme r6presseur restant h d6montrer) et dans ce cas les conc e n t r a t i o n s i n t r a c e l l u t a i r e s faibles d'acide aspartique, dont la pr6sence est d ' a u t r e part i n d i s p e n sable p o u r de n o m b r e u s e s biosynth6ses de la cellule, n ' e n t r a i n e n t pas la raise en jeu du processus catabolique. Cette biosynth6se est i n d u i t e q u a n d la c o n c e n t r a t i o n en acide aspartique devient plus i m p o r t a n t e , l'aspartate est alors utilis6 p a r la cellule comme substrat 6nerg~tique. Remerciements. Les auteurs r e m e r c i e n t M'onsieur le P r o f e s s e u r J. C. Patte pour lcs avis judicieux formul6s au cours de frdquents dchanges de vue et discussions ainsi que Monsieur le P r o f e s s e u r J. H. Well et Monsieur B. E h r e s m a n n pour leurs conseils concernant les s6parations en gradients de densitd. R~SUM~.. Les variations de l'aetivit~ aspartasique dans des milieux de diverse composition sont dues h une induetion de l ' a s p a r t a t e - a m m o n i u m lyase et h la r~gulation d,e la biosynth6se de cet enzyme. La r~alit~ de ]a ndosynth6se de l'enzyme a pu 8tre d~montrde par m a r quage et s~paration de la prot~ine. L'inducteur spdcifique semble etre l'aspartate. La biosynth~se est souraise h une forte r @ r e s s i o n catabolique. Le r61e p h y siologique de l ' a s p a r t a t e - a m m o n i u m lyase est diseut6. BIBLIOGRAPHIE. 1. Virtanen, A. I. & Tarnanen, J. (1932) Biochem. Z., :250, 193-211. 2. Halpern, Y. S. a Umbarger, H. E. (1960) J. Bact., 80, 285-288. 3. Vender, J. & Ricl~enberg, H. V. (1964) Biochim. Biophgs. Acta, 90, 218-219. 4. Vender, J., J a y a r a m a n , K. & Rickenberg, H. V. (1965) J. Bact., 90, 1304-1307. 5. Liess, K., Mecke, D. a Holzer, H. (1966) Biochem. Z., 346, 244-251.
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