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Régulation de l’interleukine-8 par les ZOs : un mécanisme dépendant de NF-κB
306
J2R - Communications orales
BPCO
Cancer
CO3
CO4
Senescence of pulmonary vascular cells is related to overactivation of the mTOR signaling pathway in chronic obstructive pulmonary disease (COPD)
Régulation de l’interleukine-8 par les ZOs : un mécanisme dépendant de NF-B
Houssaini 1 ,
Marcos 1,∗ ,
Saker 1 ,
Kebe 1 ,
Wan 1 ,
A. E. M. K. F. D. Rideau 1 , M. Latiri 1 , M. Breau 1 , A. Parpaleix 1 , V. Amsellem 1 , P. Validire 2 , A. Caniard 3 , S. Meiners 3 , G. Derumeaux 1 , S. Adnot 1 1 Inserm U955, Créteil, France 2 Institut Mutualiste Montsouris, Paris, France 3 Helmholtz-Center Munich, Munich, Germany ∗ Corresponding author. E-mail address: [email protected] (E. Marcos) Background Telomere dysfunction and exaggerated lung cell senescence now appear as major pathological processes leading to lung alterations in COPD. Pulmonary vascular endothelial cells (P-ECs) and smooth muscle cells (PA-SMCs) derived from lungs of patients with COPD exhibit increased susceptibility to replicative senescence compared to controls. However, the mechanisms underlying lung cell senescence in COPD remain poorly understood. Recent studies suggest that cell senescence and aging occur in response to overactivation of the mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling pathway. Methods To investigate whether lung cell senescence is related to overactivation of the mTOR signaling pathway in COPD, we studied lung specimens and derived cultured PA-SMCs and P-ECs from patients with COPD and age- and sex-matched control smokers. Results Marked activation of the mTOR-Akt signaling pathway was found in lungs from patients with COPD compared to controls, with a marked PTEN decrease and activation of mTOR complex 1 (mTORC1) substrates S6K and 4EBP and of mTORC2 substrates PAkt473 and GSK3, together with an increase in p21 protein levels. In-situ analysis of lung specimens revealed prominent P-Akt473 , PS6K, and P-GSK3 staining in PA-SMCs and P-ECs from patients with COPD compared to controls, most notably the cells exhibiting staining for p16 and p21. In cultured PA-SMCs from patients and controls that were subjected to repeated passages, the onset of replicative cell senescence was associated with similar alterations, including decreased PTEN and activation of mTORC1 and mTORC2 substrates. Cell exposure to low-dose rapamycin, which selectively inhibits mTORC1 but not mTORC2, delayed the early onset of senescence, increasing the cell-population doublings and decreasing the percentage of beta-galactosidase-positive cells; and suppressed the senescence-associated secretory phenotype associated with COPD. Cell exposure to sulforaphane, which stimulates nff2, or bortezomib, which inhibits the proteasome, did not alter or potentiated the cell senescence process. Conclusion These results show that the increased propensity of lung vascular cells to senescence in COPD is related to overactivation of the mTOR/Akt signaling pathway and can be suppressed by rapamycin treatment. Disclosure of interest The authors have not supplied their declaration of conflict of interest. http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2015.02.010
J. Lesage 1,∗ , S. Grelet 1 , B. Nawrocki-Raby 1 , P. Birembaut 1,2 , C. Gilles 3 , M. Polette 1,2 1 Inserm UMR-S 903, IFR53, Université de Reims Champagne-Ardenne, Reims, France 2 CHU Maison-Blanche, Laboratoire Pol-Bouin, Reims, France 3 Laboratoire de Biologie des Tumeurs et du Développement, Université de Liège, Liège, Belgique ∗ Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (J. Lesage) Introduction Lors de l’invasion tumorale tumorale, les cellules épithéliales tumorales acquièrent des propriétés migratoires et invasives impliquant des modifications phénotypiques importantes. Ce phénomène est associé au processus de transition épithéliomésenchymateuse (TEM), mécanisme dynamique qui se traduit par la perte et le gain de caractéristiques épithéliales (cohésion cellulaire) et mésenchymateuses (capacités migratoires). Au niveau moléculaire, cette conversion conduit à une réorganisation ou une disparition des complexes jonctionnels. Dans cette étude, nous nous sommes particulièrement intéressés à ZO-1, molécule des jonctions serrées, qui une fois délocalisée dans le cytoplasme joue un rôle dans l’acquisition des propriétés invasives des cellules tumorales. Une étude antérieure du laboratoire a également montré un rôle de ZO-1 dans la régulation de l’expression de l’interleukine-8 (IL8), cytokine pro-inflammatoire et pro-angiogénique. L’objectif de ce travail est d’évaluer l’implication potentielle de la voie NF-B dans cette régulation de l’IL-8 par ZO-1. Méthodes Afin de mieux comprendre le rôle de ZO-1 dans la régulation de l’IL-8, ZO-1 a été surexprimé par transfection transitoire de son cDNA dans deux lignées cellulaires (lignée bronchique Beas2B et mammaire SK-BR-3). L’expression de l’IL-8 ainsi que celle des molécules impliquées dans la voie de signalisation NF-B ont été mesurées par Elisa, Western blot et qRT-PCR. L’activité du promoteur de l’IL-8 a également été analysée grâce à la technique de « gène rapporteur ». Les lignées ont été co-transfectées avec un plasmide inducteur (soit le plasmide contrôle pLNCX, soit le plasmide surexprimant ZO-1) et un plasmide rapporteur permettant l’expression de la luciférase dont le contrôle est placé sous celui du promoteur de l’IL-8. Trois rapporteurs ont été utilisés : la partie minimale du promoteur de l’IL-8 (« 131 pro IL-8 »), le même promoteur mais muté dans sa séquence de fixation du facteur de transcription NF-B (« 131 pro IL-8 NF-B mut »), et une séquence promotrice contenant de multiples séquences de liaison du facteur NF-B (« NF-B Luc »). Résultats Nos résultats montrent que ZO-1 régule l’expression de l’IL-8 au niveau protéique et transcriptionnel. Ils indiquent également que ZO-1 contrôle l’activité du promoteur de l’IL-8 via la voie NF-B. De plus, nos analyses en western blot révèlent une augmentation des formes phosphorylées d’IB␣ et p65 en condition de surexpression de ZO-1, ce qui témoigne de l’activation de la voie NF-B. Conclusion L’ensemble de ces résultats montre que ZO-1 régule l’expression de l’IL-8 via l’activation de la voie NF-B, L’impact de ces régulations sur l’angiogenèse et l’inflammation tumorale médiées par l’IL-8 est en cours d’investigation. Mot clé Cancer Déclaration d’intérêts Les auteurs n’ont pas transmis de déclaration de conflits d’intérêts. http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2015.02.011
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Senescence of pulmonary vascular cells is related to overactivation of the mTOR signaling pathway in chronic obstructive pulmonary disease (COPD)
Régulation de l’interleukine-8 par les ZOs : un mécanisme dépendant de NF-B
Houssaini 1 ,
Marcos 1,∗ ,
Saker 1 ,
Kebe 1 ,
Wan 1 ,
A. E. M. K. F. D. Rideau 1 , M. Latiri 1 , M. Breau 1 , A. Parpaleix 1 , V. Amsellem 1 , P. Validire 2 , A. Caniard 3 , S. Meiners 3 , G. Derumeaux 1 , S. Adnot 1 1 Inserm U955, Créteil, France 2 Institut Mutualiste Montsouris, Paris, France 3 Helmholtz-Center Munich, Munich, Germany ∗ Corresponding author. E-mail address: [email protected] (E. Marcos) Background Telomere dysfunction and exaggerated lung cell senescence now appear as major pathological processes leading to lung alterations in COPD. Pulmonary vascular endothelial cells (P-ECs) and smooth muscle cells (PA-SMCs) derived from lungs of patients with COPD exhibit increased susceptibility to replicative senescence compared to controls. However, the mechanisms underlying lung cell senescence in COPD remain poorly understood. Recent studies suggest that cell senescence and aging occur in response to overactivation of the mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling pathway. Methods To investigate whether lung cell senescence is related to overactivation of the mTOR signaling pathway in COPD, we studied lung specimens and derived cultured PA-SMCs and P-ECs from patients with COPD and age- and sex-matched control smokers. Results Marked activation of the mTOR-Akt signaling pathway was found in lungs from patients with COPD compared to controls, with a marked PTEN decrease and activation of mTOR complex 1 (mTORC1) substrates S6K and 4EBP and of mTORC2 substrates PAkt473 and GSK3, together with an increase in p21 protein levels. In-situ analysis of lung specimens revealed prominent P-Akt473 , PS6K, and P-GSK3 staining in PA-SMCs and P-ECs from patients with COPD compared to controls, most notably the cells exhibiting staining for p16 and p21. In cultured PA-SMCs from patients and controls that were subjected to repeated passages, the onset of replicative cell senescence was associated with similar alterations, including decreased PTEN and activation of mTORC1 and mTORC2 substrates. Cell exposure to low-dose rapamycin, which selectively inhibits mTORC1 but not mTORC2, delayed the early onset of senescence, increasing the cell-population doublings and decreasing the percentage of beta-galactosidase-positive cells; and suppressed the senescence-associated secretory phenotype associated with COPD. Cell exposure to sulforaphane, which stimulates nff2, or bortezomib, which inhibits the proteasome, did not alter or potentiated the cell senescence process. Conclusion These results show that the increased propensity of lung vascular cells to senescence in COPD is related to overactivation of the mTOR/Akt signaling pathway and can be suppressed by rapamycin treatment. Disclosure of interest The authors have not supplied their declaration of conflict of interest. http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2015.02.010
J. Lesage 1,∗ , S. Grelet 1 , B. Nawrocki-Raby 1 , P. Birembaut 1,2 , C. Gilles 3 , M. Polette 1,2 1 Inserm UMR-S 903, IFR53, Université de Reims Champagne-Ardenne, Reims, France 2 CHU Maison-Blanche, Laboratoire Pol-Bouin, Reims, France 3 Laboratoire de Biologie des Tumeurs et du Développement, Université de Liège, Liège, Belgique ∗ Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (J. Lesage) Introduction Lors de l’invasion tumorale tumorale, les cellules épithéliales tumorales acquièrent des propriétés migratoires et invasives impliquant des modifications phénotypiques importantes. Ce phénomène est associé au processus de transition épithéliomésenchymateuse (TEM), mécanisme dynamique qui se traduit par la perte et le gain de caractéristiques épithéliales (cohésion cellulaire) et mésenchymateuses (capacités migratoires). Au niveau moléculaire, cette conversion conduit à une réorganisation ou une disparition des complexes jonctionnels. Dans cette étude, nous nous sommes particulièrement intéressés à ZO-1, molécule des jonctions serrées, qui une fois délocalisée dans le cytoplasme joue un rôle dans l’acquisition des propriétés invasives des cellules tumorales. Une étude antérieure du laboratoire a également montré un rôle de ZO-1 dans la régulation de l’expression de l’interleukine-8 (IL8), cytokine pro-inflammatoire et pro-angiogénique. L’objectif de ce travail est d’évaluer l’implication potentielle de la voie NF-B dans cette régulation de l’IL-8 par ZO-1. Méthodes Afin de mieux comprendre le rôle de ZO-1 dans la régulation de l’IL-8, ZO-1 a été surexprimé par transfection transitoire de son cDNA dans deux lignées cellulaires (lignée bronchique Beas2B et mammaire SK-BR-3). L’expression de l’IL-8 ainsi que celle des molécules impliquées dans la voie de signalisation NF-B ont été mesurées par Elisa, Western blot et qRT-PCR. L’activité du promoteur de l’IL-8 a également été analysée grâce à la technique de « gène rapporteur ». Les lignées ont été co-transfectées avec un plasmide inducteur (soit le plasmide contrôle pLNCX, soit le plasmide surexprimant ZO-1) et un plasmide rapporteur permettant l’expression de la luciférase dont le contrôle est placé sous celui du promoteur de l’IL-8. Trois rapporteurs ont été utilisés : la partie minimale du promoteur de l’IL-8 (« 131 pro IL-8 »), le même promoteur mais muté dans sa séquence de fixation du facteur de transcription NF-B (« 131 pro IL-8 NF-B mut »), et une séquence promotrice contenant de multiples séquences de liaison du facteur NF-B (« NF-B Luc »). Résultats Nos résultats montrent que ZO-1 régule l’expression de l’IL-8 au niveau protéique et transcriptionnel. Ils indiquent également que ZO-1 contrôle l’activité du promoteur de l’IL-8 via la voie NF-B. De plus, nos analyses en western blot révèlent une augmentation des formes phosphorylées d’IB␣ et p65 en condition de surexpression de ZO-1, ce qui témoigne de l’activation de la voie NF-B. Conclusion L’ensemble de ces résultats montre que ZO-1 régule l’expression de l’IL-8 via l’activation de la voie NF-B, L’impact de ces régulations sur l’angiogenèse et l’inflammation tumorale médiées par l’IL-8 est en cours d’investigation. Mot clé Cancer Déclaration d’intérêts Les auteurs n’ont pas transmis de déclaration de conflits d’intérêts. http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2015.02.011