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Rôle des neutrophil extracellular traps (NETs) dans la maladie de Behçet
74e Congrès franc¸ais de médecine interne – Deauville, 8 au 10 décembre 2016 / La Revue de médecine interne 37 (2016) A62–A140
Déclaration de liens d’intérêts de liens d’intérêts.
Les auteurs déclarent ne pas avoir
http://dx.doi.org/10.1016/j.revmed.2016.10.029 CO022
Épitopes T d’ADAMTS13 chez les patients atteints de purpura thrombotique thrombocytopénique L. Gilardin 1,∗ , S. Delignat 1 , B. Maillère 2 , I. Peyron 1 , M. Ing 1 , A. Veyradier 3 , J.B. Latouche 4 , S. Kaveri 1 , P. Coppo 5 , S. Lacroix-Desmazes 1 1 Centre de recherche des cordeliers, Umrs 1138, Inserm, Paris 2 Institut de biologie, CEA Saclay, Gif-sur-Yvette 3 Hémostase, hôpital Lariboisière, Paris 4 Inserm, faculté de médecine, Rouen 5 Hématologie, hôpital Saint-Antoine, Paris ∗ Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (L. Gilardin) Introduction Le purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT) est une maladie auto-immune rare et grave caractérisée par la présence d’anticorps dirigés contre ADAMTS13. L’implication des lymphocytes T CD4+ spécifiques d’ADAMTS13, dans la physiopathologie de la maladie est suggérée par une restriction pour l’haplotype HLA-DRB11*1 (DR11) et l’isotype IgG des anticorps. Cependant, la réponse T auto-immune anti-ADAMTS13 n’a jamais été étudiée. Dans ce travail, nous avons identifié les épitopes T immunodominants d’ADAMTS13. Matériels et méthodes À l’aide de l’algorythme de prédiction du site web http://www.iedb.org/, nous avons sélectionné in silico les peptides d’ADAMTS13 susceptibles d’être présentés par les molécules HLA-DR11. Ensuite, l’étude de la liaison de ces peptides à des molécules HLA-DR11 par des tests Elisa compétitifs a permis d’identifier les peptides les plus affins. Enfin, nous avons déterminé les peptides d’ADAMTS13 reconnus par les lymphocytes T CD4+ de donneurs sains et de patients porteurs de l’haplotype DR11, au diagnostic de leur maladie ou en rémission. Pour cela, nous avons stimulé de manière répétée les lymphocytes T CD4+ circulants par des cellules dendritiques chargées avec ces peptides, afin de générer des lignées cellulaires après amplification des cellules sécrétant de l’interféron gamma sous stimulation. Ensuite, l’effet de chaque peptide individuel sur les lignées obtenues a été évalué par test ELISPOT de sécrétion d’interféron gamma. Nous avons ensuite déterminé si les peptides identifiés pour l’haplotype HLA-DR11 étaient partagés par d’autres haplotypes, en particulier HLA-DR1. Enfin, nous avons déterminé si ces peptides étaient impliqués dans une réponse immunitaire in vivo chez un modèle murin de souris transgénique humanisée exprimant l’haplotype HLA-DR1, immunisée par de l’ADAMTS13 humaine recombinante. Résultats Une première liste de 48 peptides affins pour HLADR11 fut établie par l’analyse IEDB. Parmi ces peptides, seuls dix-neuf ont montré une capacité de fixation significative aux molécules HLA-DR11, lors des tests Elisa compétitifs. Ces 19 peptides ont alors permis de générer des lignées cellulaires T CD4+ issues de patients et de donneurs sains HLA-DR11 (n = 11). Six peptides issus d’ADAMTS13 étaient capables d’activer les lignées T CD4+ lors des tests ELISPOT interféron gamma. Ces peptides sont localisés dans différents domaines de la protéine, en particulier dans les domaines spacer et CUB2. De fac¸on intéressante, deux de ces peptides étaient également retrouvés chez des patients DR1. De plus, l’immunisation de souris transgéniques humanisées DR1, par la protéine ADAMTS13 recombinante humaine, nous a permis de générer des hybridomes T CD4+ spécifiques d’ADAMTS13 et seul un de ces peptides était capable d’induire une stimulation des hybridomes obtenus. La séquence de ce peptide a été définie plus précisément, il est situé dans le domaine CUB2 et représente l’épitope T immunodominant d’ADAMTS13.
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Conclusion Nous avons donc identifié plusieurs épitopes T d’A13 chez des patients DR11, dont un localisé dans le domaine CUB2 apparaît être immunodominant. Cela nous permet d’envisager l’isolation et la caractérisation des lymphocytes T CD4+ spécifiques d’ADAMTS13 impliqués dans la survenue de la maladie et potentiellement prédictifs de rechute chez les patients en rémission. Déclaration de liens d’intérêts Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d’intérêts. http://dx.doi.org/10.1016/j.revmed.2016.10.030 CO023
Rôle des neutrophil extracellular traps (NETs) dans la maladie de Behc¸et A. Le Joncour 1,∗ , S. Loyaux 2 , N. Lelay 2 , M.C. Bouton 2 , A. Dossier 3 , F. Domont 1 , T. Papo 3 , M. Jandrot-Perrus 2 , P. Cacoub 1 , N. Ajzenberg 4 , D. Saadoun 1 , Y. Boulaftali 2 1 Département de médecine interne et immunologie clinique, groupe hospitalier Pitié-Salpêtrière, Paris 2 Unité inserm 1148, CHU Xavier-Bichat, Paris 3 Médecine interne, hôpital Bichat–Claude-Bernard, Paris 4 Laboratoire d’hématologie, CHU Xavier-Bichat, Paris ∗ Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (A. Le Joncour) Introduction La maladie de Behc¸et (MB) est une affection inflammatoire, systémique chronique évoluant par poussées. Elle est caractérisée par l’atteinte de plusieurs organes parmi lesquelles les thromboses artérielles et veineuses sont retrouvées chez environ 30 % des patients. La physiopathologie de la MB est en grande partie inconnue. Plusieurs hypothèses impliquant des facteurs génétiques, environnementaux, et l’immunité adaptative et innée tentent de l’expliquer. Il existe une activation des polynucléaires neutrophiles (PNN) sans que sa place ne soit clairement établie. Sous différents stimuli, les PNN peuvent libérer leur ADN dans l’espace extracellulaire générant un filet de chromatine décoré de composés granulaires. Il a été récemment montré que ces neutrophils extracellulaire traps (NETs) étaient impliqués dans la physiopathologie de plusieurs pathologies auto-immunes, inflammatoires mais ceux-ci n’ont jamais été étudiés dans la MB. L’objectif de cette étude était de rechercher la présence de NETs et de préciser leur rôle dans les thromboses associées à la MB. Résultats Soixante-treize patients présentant une MB (International Team for the revision of the international criteria for Behc¸et disease) et 15 témoins sains, appariés sur l’âge et le sexe, ont été inclus. Le taux d’ADN libre, mesuré par un intercalent fluorescent est significativement plus élevé dans le plasma des MB que dans celui des témoins (928 ± 36,7 ng/mL vs 711 28,4 ng/mL, p = 0,0005). Les complexes myéloperoxydase-ADN, dosés en Elisa, témoignent d’un taux plus élevé de NETs dans le plasma des MB que celui des témoins (0,30 ± 0,06 UDO vs 0,07 ± 0,01 UDO, p = 0,0039). In vitro, le co-marquage de l’ADN et de la myéloperoxydase révèle que les PNN de MB forment plus de NETs que ceux des témoins, sans stimulation (31,7 ± 4,4 % vs 5,4 ± 1,9 % respectivement, p = 0,004) et après stimulation par le PMA (41,8 ± 2,7 % et 18 ± 3,8 % respectivement, p = 0,0021). Les PNN de sujets sains incubés avec du sérum de MB forment plus de NETs que ceux incubés avec du sérum de témoins (22,4 ± 3,4 % vs 4,7 ± 1,1 % respectivement, p = 0,0079) suggérant la présence d’inducteurs de NETs dans le sérum des MB. La génération de thrombine, analysée par thrombinographie sur plasma pauvre en plaquettes, est significativement augmentée chez les MB par rapport aux témoins : pic de génération de thrombine 284,2 nM ± 46,1 vs 203 nM ± 59 respectivement, p = 0,0069 et vélocité de génération de thrombine 88,4 nM/min ± 22,7 vs 51,7 nM ± 23,3 respectivement, p = 0,0051. Le taux circulant d’ADN libre est corrélé au pic de génération de thrombine (r2 = 0,9 ; p < 0,001) et à la vélocité de génération de thrombine (r2 = 0,84 ;
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74e Congrès franc¸ais de médecine interne – Deauville, 8 au 10 décembre 2016 / La Revue de médecine interne 37 (2016) A62–A140
p = 0,002). L’addition de DNase réduit plus la génération de thrombine chez les MB que les témoins, suggérant un rôle pro-coagulant de l’ADN libre des NETS dans la MB. Conclusion Une augmentation significative des NETs a été mise en évidence chez les patients atteints de maladie de Behc¸et par rapport aux témoins. Ceux-ci pourraient jouer un rôle dans le sur-risque thrombotique. Les mécanismes impliqués dans cette augmentation de NETs et leur rôle dans la thrombose restent à préciser. De nouvelles thérapeutiques à base d’inhibiteurs de NEtose pourraient être envisagées. Déclaration de liens d’intérêts Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d’intérêts. http://dx.doi.org/10.1016/j.revmed.2016.10.031 CO024
La cytokine BAFF et les cellules T CD4+ sont des facteurs de survie majeurs pour les plasmocytes spléniques dans le contexte de déplétion B chez la souris AID-Cre-EYFP. Implications thérapeutiques pour les maladies auto-immunes L.H. Thai 1,∗ , A. Robbins 2 , S. Legallou 2 , N. Cagnard 3 , J. Mégret 4 , J.C. Weill 2 , C.A. Reynaud 2 , M. Mahévas 5 1 Médecine interne, hôpital Henri-Mondor, AP–HP, Créteil cedex 2 Inserm u1151-équipe 12 « développement du système immunitaire », institut Necker–Enfants-Malades, université Paris Descartes, Paris 3 Plateforme bio-informatique Paris Descartes, institut imagine, hôpital Necker–Enfants-Malades, Paris 4 Plateforme de cytométrie en flux, structure fédérative de recherche Necker, Paris 5 Médecine interne, hôpital Henri-Mondor, Créteil ∗ Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (L.H. Thai) Introduction Nous avons mis en évidence que la déplétion lymphocytaire B par l’anti-CD20 induisait un processus de différenciation plasmocytaire dans la rate chez l’homme et chez la souris dans le modèle AID-Cre-EYFP. Nous avons donc souhaité déterminer les mécanismes sous-jacents responsables de la différenciation et/ou du maintien des PC dans la niche splénique dans le contexte de déplétion B chez la souris. Nous avons utilisé le modèle de souris transgénique AID-Cre-ERT2 × Rosa26-loxP-EYFP qui permet de marquer irréversiblement par la protéine EYFP les cellules B lors de leur passage dans un centre germinatif au cours d’une réponse immune après injection de tamoxifène. Les PC qui se sont différenciés à partir de ces cellules B conservent le marquage EYFP, permettant de les identifier, de les dater et de les suivre in vivo. Résultats Les plasmocytes de longue durée de vie résident dans une niche spécifique contenant des facteurs de survie favorables à leur maintien. En situation normale, les PLDV résident dans la moelle qui contient des cellules stromales, des éosinophiles et des facteurs solubles tels que CXCL12, a proliferation-inducing ligand (APRIL) et IL-6, qui agissent de fac¸on synergique pour assurer le maintien des PLDV. Dans le contexte de déplétion B, nous avons pu identifier plusieurs facteurs nécessaires à la survie des PC dans la rate. De même que chez l’homme, nous avons observé une augmentation du taux de B-cell activating factor (BAFF), un facteur essentiel à la survie des cellules B, à la fois dans le sérum et les surnageants spléniques après traitement par anti-CD20. In vivo, la combinaison des anticorps anti-CD20 et anti-BAFF a permis d’obtenir une diminution drastique (fold > 5, p < 0,001) du nombre de plasmocytes de longue vie EYFP+ dans la rate comparé à la condition anti-CD20 seule, signifiant un rôle majeur de BAFF dans le maintien des PC dans la niche splénique dans le contexte de déplétion B. Au niveau de la moelle, le nombre de PC EYFP+ était aussi dimi-
nué d’un facteur deux, mais portant majoritairement sur les IgM+, nous n’avons pas observé d’hypogammaglobulinémie IgG. Les granuleux Gr1+ co-localisent dans la pulpe rouge de la rate avec les PC EYFP+. Leur nombre, ainsi que leurs interactions avec les PC EYFP+, augmentent dans le contexte de déplétion B. De plus, nous avons identifié les neutrophiles Gr1 + Ly6G+ comme la principale source de production de BAFF dans la rate, suggérant un possible rôle dans la niche de survie plasmocytaire. Enfin, les T CD4+ interagissent également de fac¸on étroite avec les PC EYFP+ de la rate. En les déplétant spécifiquement in vivo, associé à la déplétion B, nous avons observé une diminution (fold > 2, p < 0,05) du nombre de PC EYFP+ spléniques, signifiant leur participation au maintien des PC dans la niche splénique. Les tests de déplétion des T CD4+ seuls in vivo et de co-culture in vitro des PC avec les T CD4+ suggèrent que les T CD4+ dans le contexte de déplétion B ont un meilleur effet sur la survie des PC que les T CD4+ issus de rate de souris non traitées. Ceci signifierait que les T CD4+ rec¸oivent des signaux différents provenant du milieu splénique après traitement par anti-CD20, confortant l’observation de modifications de l’environnement induites par la déplétion B. Conclusion En conclusion, nos résultats suggèrent qu’inhiber les facteurs de survie de la niche plasmocytaire, en particulier en utilisant l’anticorps anti-BAFF, dans le contexte du traitement par anti-CD20 permet d’interférer sur le processus de différenciation paradoxale des plasmocytes. Dans cette optique, la combinaison anti-CD20 + anti-BAFF pourrait être bénéfique dans le traitement des cytopénies auto-immunes, voire plus largement au cours des maladies auto-immunes. Déclaration de liens d’intérêts Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d’intérêts. http://dx.doi.org/10.1016/j.revmed.2016.10.032 CO025
Différenciation des plasmocytes dans la rate en plasmocytes de longue durée de vie dans le contexte de déplétion B chez le modèle murin AID-Cre-EYFP L.H. Thai 1,∗ , A. Robbins 2 , S. Legallou 2 , N. Cagnard 3 , J. Mégret 4 , J.C. Weill 2 , C.A. Reynaud 2 , M. Mahévas 5 1 Médecine interne, hôpital Henri-Mondor, AP–HP, Créteil cedex 2 Inserm u1151-équipe 12 « développement du système immunitaire », institut Necker–Enfants-Malades, université Paris Descartes, Paris 3 Plateforme bio-informatique Paris Descartes, institut imagine, hôpital Necker–Enfants-Malades, Paris 4 Plateforme de cytométrie en flux, structure fédérative de recherche Necker, Paris 5 Médecine interne, hôpital Henri-Mondor, Créteil ∗ Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (L.H. Thai) Introduction L’anticorps (Ac) monoclonal anti-CD20 (rituximab) est largement utilisé dans le traitement des maladies auto-immunes, avec pourtant des résultats hétérogènes selon les indications, voire même décevants au cours du lupus. De précédentes études au cours du purpura thrombopénique immunologique (PTI) et de l’anémie hémolytique auto-immune (AHAI) ont suggéré que l’Ac anti-CD20 induisait de fac¸on paradoxale la différenciation des plasmocytes (PC) de la rate en plasmocytes de longue durée de vie (PLDV), proches des plasmocytes de longue vie naturels de la moelle osseuse. Certains de ces PLDV sont autoréactifs, pouvant expliquer l’échec au rituximab et le succès de la splénectomie. Nous avons souhaité explorer les mécanismes qui sous-tendent ce processus de différenciation plasmocytaire paradoxale dans un modèle murin. Pour ce faire, nous avons utilisé le modèle de souris transgénique AID-Cre-ERT2 × Rosa26-loxP-EYFP qui permet de marquer irréversiblement par la protéine EYFP les
Déclaration de liens d’intérêts de liens d’intérêts.
Les auteurs déclarent ne pas avoir
http://dx.doi.org/10.1016/j.revmed.2016.10.029 CO022
Épitopes T d’ADAMTS13 chez les patients atteints de purpura thrombotique thrombocytopénique L. Gilardin 1,∗ , S. Delignat 1 , B. Maillère 2 , I. Peyron 1 , M. Ing 1 , A. Veyradier 3 , J.B. Latouche 4 , S. Kaveri 1 , P. Coppo 5 , S. Lacroix-Desmazes 1 1 Centre de recherche des cordeliers, Umrs 1138, Inserm, Paris 2 Institut de biologie, CEA Saclay, Gif-sur-Yvette 3 Hémostase, hôpital Lariboisière, Paris 4 Inserm, faculté de médecine, Rouen 5 Hématologie, hôpital Saint-Antoine, Paris ∗ Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (L. Gilardin) Introduction Le purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT) est une maladie auto-immune rare et grave caractérisée par la présence d’anticorps dirigés contre ADAMTS13. L’implication des lymphocytes T CD4+ spécifiques d’ADAMTS13, dans la physiopathologie de la maladie est suggérée par une restriction pour l’haplotype HLA-DRB11*1 (DR11) et l’isotype IgG des anticorps. Cependant, la réponse T auto-immune anti-ADAMTS13 n’a jamais été étudiée. Dans ce travail, nous avons identifié les épitopes T immunodominants d’ADAMTS13. Matériels et méthodes À l’aide de l’algorythme de prédiction du site web http://www.iedb.org/, nous avons sélectionné in silico les peptides d’ADAMTS13 susceptibles d’être présentés par les molécules HLA-DR11. Ensuite, l’étude de la liaison de ces peptides à des molécules HLA-DR11 par des tests Elisa compétitifs a permis d’identifier les peptides les plus affins. Enfin, nous avons déterminé les peptides d’ADAMTS13 reconnus par les lymphocytes T CD4+ de donneurs sains et de patients porteurs de l’haplotype DR11, au diagnostic de leur maladie ou en rémission. Pour cela, nous avons stimulé de manière répétée les lymphocytes T CD4+ circulants par des cellules dendritiques chargées avec ces peptides, afin de générer des lignées cellulaires après amplification des cellules sécrétant de l’interféron gamma sous stimulation. Ensuite, l’effet de chaque peptide individuel sur les lignées obtenues a été évalué par test ELISPOT de sécrétion d’interféron gamma. Nous avons ensuite déterminé si les peptides identifiés pour l’haplotype HLA-DR11 étaient partagés par d’autres haplotypes, en particulier HLA-DR1. Enfin, nous avons déterminé si ces peptides étaient impliqués dans une réponse immunitaire in vivo chez un modèle murin de souris transgénique humanisée exprimant l’haplotype HLA-DR1, immunisée par de l’ADAMTS13 humaine recombinante. Résultats Une première liste de 48 peptides affins pour HLADR11 fut établie par l’analyse IEDB. Parmi ces peptides, seuls dix-neuf ont montré une capacité de fixation significative aux molécules HLA-DR11, lors des tests Elisa compétitifs. Ces 19 peptides ont alors permis de générer des lignées cellulaires T CD4+ issues de patients et de donneurs sains HLA-DR11 (n = 11). Six peptides issus d’ADAMTS13 étaient capables d’activer les lignées T CD4+ lors des tests ELISPOT interféron gamma. Ces peptides sont localisés dans différents domaines de la protéine, en particulier dans les domaines spacer et CUB2. De fac¸on intéressante, deux de ces peptides étaient également retrouvés chez des patients DR1. De plus, l’immunisation de souris transgéniques humanisées DR1, par la protéine ADAMTS13 recombinante humaine, nous a permis de générer des hybridomes T CD4+ spécifiques d’ADAMTS13 et seul un de ces peptides était capable d’induire une stimulation des hybridomes obtenus. La séquence de ce peptide a été définie plus précisément, il est situé dans le domaine CUB2 et représente l’épitope T immunodominant d’ADAMTS13.
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Conclusion Nous avons donc identifié plusieurs épitopes T d’A13 chez des patients DR11, dont un localisé dans le domaine CUB2 apparaît être immunodominant. Cela nous permet d’envisager l’isolation et la caractérisation des lymphocytes T CD4+ spécifiques d’ADAMTS13 impliqués dans la survenue de la maladie et potentiellement prédictifs de rechute chez les patients en rémission. Déclaration de liens d’intérêts Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d’intérêts. http://dx.doi.org/10.1016/j.revmed.2016.10.030 CO023
Rôle des neutrophil extracellular traps (NETs) dans la maladie de Behc¸et A. Le Joncour 1,∗ , S. Loyaux 2 , N. Lelay 2 , M.C. Bouton 2 , A. Dossier 3 , F. Domont 1 , T. Papo 3 , M. Jandrot-Perrus 2 , P. Cacoub 1 , N. Ajzenberg 4 , D. Saadoun 1 , Y. Boulaftali 2 1 Département de médecine interne et immunologie clinique, groupe hospitalier Pitié-Salpêtrière, Paris 2 Unité inserm 1148, CHU Xavier-Bichat, Paris 3 Médecine interne, hôpital Bichat–Claude-Bernard, Paris 4 Laboratoire d’hématologie, CHU Xavier-Bichat, Paris ∗ Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (A. Le Joncour) Introduction La maladie de Behc¸et (MB) est une affection inflammatoire, systémique chronique évoluant par poussées. Elle est caractérisée par l’atteinte de plusieurs organes parmi lesquelles les thromboses artérielles et veineuses sont retrouvées chez environ 30 % des patients. La physiopathologie de la MB est en grande partie inconnue. Plusieurs hypothèses impliquant des facteurs génétiques, environnementaux, et l’immunité adaptative et innée tentent de l’expliquer. Il existe une activation des polynucléaires neutrophiles (PNN) sans que sa place ne soit clairement établie. Sous différents stimuli, les PNN peuvent libérer leur ADN dans l’espace extracellulaire générant un filet de chromatine décoré de composés granulaires. Il a été récemment montré que ces neutrophils extracellulaire traps (NETs) étaient impliqués dans la physiopathologie de plusieurs pathologies auto-immunes, inflammatoires mais ceux-ci n’ont jamais été étudiés dans la MB. L’objectif de cette étude était de rechercher la présence de NETs et de préciser leur rôle dans les thromboses associées à la MB. Résultats Soixante-treize patients présentant une MB (International Team for the revision of the international criteria for Behc¸et disease) et 15 témoins sains, appariés sur l’âge et le sexe, ont été inclus. Le taux d’ADN libre, mesuré par un intercalent fluorescent est significativement plus élevé dans le plasma des MB que dans celui des témoins (928 ± 36,7 ng/mL vs 711 28,4 ng/mL, p = 0,0005). Les complexes myéloperoxydase-ADN, dosés en Elisa, témoignent d’un taux plus élevé de NETs dans le plasma des MB que celui des témoins (0,30 ± 0,06 UDO vs 0,07 ± 0,01 UDO, p = 0,0039). In vitro, le co-marquage de l’ADN et de la myéloperoxydase révèle que les PNN de MB forment plus de NETs que ceux des témoins, sans stimulation (31,7 ± 4,4 % vs 5,4 ± 1,9 % respectivement, p = 0,004) et après stimulation par le PMA (41,8 ± 2,7 % et 18 ± 3,8 % respectivement, p = 0,0021). Les PNN de sujets sains incubés avec du sérum de MB forment plus de NETs que ceux incubés avec du sérum de témoins (22,4 ± 3,4 % vs 4,7 ± 1,1 % respectivement, p = 0,0079) suggérant la présence d’inducteurs de NETs dans le sérum des MB. La génération de thrombine, analysée par thrombinographie sur plasma pauvre en plaquettes, est significativement augmentée chez les MB par rapport aux témoins : pic de génération de thrombine 284,2 nM ± 46,1 vs 203 nM ± 59 respectivement, p = 0,0069 et vélocité de génération de thrombine 88,4 nM/min ± 22,7 vs 51,7 nM ± 23,3 respectivement, p = 0,0051. Le taux circulant d’ADN libre est corrélé au pic de génération de thrombine (r2 = 0,9 ; p < 0,001) et à la vélocité de génération de thrombine (r2 = 0,84 ;
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74e Congrès franc¸ais de médecine interne – Deauville, 8 au 10 décembre 2016 / La Revue de médecine interne 37 (2016) A62–A140
p = 0,002). L’addition de DNase réduit plus la génération de thrombine chez les MB que les témoins, suggérant un rôle pro-coagulant de l’ADN libre des NETS dans la MB. Conclusion Une augmentation significative des NETs a été mise en évidence chez les patients atteints de maladie de Behc¸et par rapport aux témoins. Ceux-ci pourraient jouer un rôle dans le sur-risque thrombotique. Les mécanismes impliqués dans cette augmentation de NETs et leur rôle dans la thrombose restent à préciser. De nouvelles thérapeutiques à base d’inhibiteurs de NEtose pourraient être envisagées. Déclaration de liens d’intérêts Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d’intérêts. http://dx.doi.org/10.1016/j.revmed.2016.10.031 CO024
La cytokine BAFF et les cellules T CD4+ sont des facteurs de survie majeurs pour les plasmocytes spléniques dans le contexte de déplétion B chez la souris AID-Cre-EYFP. Implications thérapeutiques pour les maladies auto-immunes L.H. Thai 1,∗ , A. Robbins 2 , S. Legallou 2 , N. Cagnard 3 , J. Mégret 4 , J.C. Weill 2 , C.A. Reynaud 2 , M. Mahévas 5 1 Médecine interne, hôpital Henri-Mondor, AP–HP, Créteil cedex 2 Inserm u1151-équipe 12 « développement du système immunitaire », institut Necker–Enfants-Malades, université Paris Descartes, Paris 3 Plateforme bio-informatique Paris Descartes, institut imagine, hôpital Necker–Enfants-Malades, Paris 4 Plateforme de cytométrie en flux, structure fédérative de recherche Necker, Paris 5 Médecine interne, hôpital Henri-Mondor, Créteil ∗ Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (L.H. Thai) Introduction Nous avons mis en évidence que la déplétion lymphocytaire B par l’anti-CD20 induisait un processus de différenciation plasmocytaire dans la rate chez l’homme et chez la souris dans le modèle AID-Cre-EYFP. Nous avons donc souhaité déterminer les mécanismes sous-jacents responsables de la différenciation et/ou du maintien des PC dans la niche splénique dans le contexte de déplétion B chez la souris. Nous avons utilisé le modèle de souris transgénique AID-Cre-ERT2 × Rosa26-loxP-EYFP qui permet de marquer irréversiblement par la protéine EYFP les cellules B lors de leur passage dans un centre germinatif au cours d’une réponse immune après injection de tamoxifène. Les PC qui se sont différenciés à partir de ces cellules B conservent le marquage EYFP, permettant de les identifier, de les dater et de les suivre in vivo. Résultats Les plasmocytes de longue durée de vie résident dans une niche spécifique contenant des facteurs de survie favorables à leur maintien. En situation normale, les PLDV résident dans la moelle qui contient des cellules stromales, des éosinophiles et des facteurs solubles tels que CXCL12, a proliferation-inducing ligand (APRIL) et IL-6, qui agissent de fac¸on synergique pour assurer le maintien des PLDV. Dans le contexte de déplétion B, nous avons pu identifier plusieurs facteurs nécessaires à la survie des PC dans la rate. De même que chez l’homme, nous avons observé une augmentation du taux de B-cell activating factor (BAFF), un facteur essentiel à la survie des cellules B, à la fois dans le sérum et les surnageants spléniques après traitement par anti-CD20. In vivo, la combinaison des anticorps anti-CD20 et anti-BAFF a permis d’obtenir une diminution drastique (fold > 5, p < 0,001) du nombre de plasmocytes de longue vie EYFP+ dans la rate comparé à la condition anti-CD20 seule, signifiant un rôle majeur de BAFF dans le maintien des PC dans la niche splénique dans le contexte de déplétion B. Au niveau de la moelle, le nombre de PC EYFP+ était aussi dimi-
nué d’un facteur deux, mais portant majoritairement sur les IgM+, nous n’avons pas observé d’hypogammaglobulinémie IgG. Les granuleux Gr1+ co-localisent dans la pulpe rouge de la rate avec les PC EYFP+. Leur nombre, ainsi que leurs interactions avec les PC EYFP+, augmentent dans le contexte de déplétion B. De plus, nous avons identifié les neutrophiles Gr1 + Ly6G+ comme la principale source de production de BAFF dans la rate, suggérant un possible rôle dans la niche de survie plasmocytaire. Enfin, les T CD4+ interagissent également de fac¸on étroite avec les PC EYFP+ de la rate. En les déplétant spécifiquement in vivo, associé à la déplétion B, nous avons observé une diminution (fold > 2, p < 0,05) du nombre de PC EYFP+ spléniques, signifiant leur participation au maintien des PC dans la niche splénique. Les tests de déplétion des T CD4+ seuls in vivo et de co-culture in vitro des PC avec les T CD4+ suggèrent que les T CD4+ dans le contexte de déplétion B ont un meilleur effet sur la survie des PC que les T CD4+ issus de rate de souris non traitées. Ceci signifierait que les T CD4+ rec¸oivent des signaux différents provenant du milieu splénique après traitement par anti-CD20, confortant l’observation de modifications de l’environnement induites par la déplétion B. Conclusion En conclusion, nos résultats suggèrent qu’inhiber les facteurs de survie de la niche plasmocytaire, en particulier en utilisant l’anticorps anti-BAFF, dans le contexte du traitement par anti-CD20 permet d’interférer sur le processus de différenciation paradoxale des plasmocytes. Dans cette optique, la combinaison anti-CD20 + anti-BAFF pourrait être bénéfique dans le traitement des cytopénies auto-immunes, voire plus largement au cours des maladies auto-immunes. Déclaration de liens d’intérêts Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d’intérêts. http://dx.doi.org/10.1016/j.revmed.2016.10.032 CO025
Différenciation des plasmocytes dans la rate en plasmocytes de longue durée de vie dans le contexte de déplétion B chez le modèle murin AID-Cre-EYFP L.H. Thai 1,∗ , A. Robbins 2 , S. Legallou 2 , N. Cagnard 3 , J. Mégret 4 , J.C. Weill 2 , C.A. Reynaud 2 , M. Mahévas 5 1 Médecine interne, hôpital Henri-Mondor, AP–HP, Créteil cedex 2 Inserm u1151-équipe 12 « développement du système immunitaire », institut Necker–Enfants-Malades, université Paris Descartes, Paris 3 Plateforme bio-informatique Paris Descartes, institut imagine, hôpital Necker–Enfants-Malades, Paris 4 Plateforme de cytométrie en flux, structure fédérative de recherche Necker, Paris 5 Médecine interne, hôpital Henri-Mondor, Créteil ∗ Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (L.H. Thai) Introduction L’anticorps (Ac) monoclonal anti-CD20 (rituximab) est largement utilisé dans le traitement des maladies auto-immunes, avec pourtant des résultats hétérogènes selon les indications, voire même décevants au cours du lupus. De précédentes études au cours du purpura thrombopénique immunologique (PTI) et de l’anémie hémolytique auto-immune (AHAI) ont suggéré que l’Ac anti-CD20 induisait de fac¸on paradoxale la différenciation des plasmocytes (PC) de la rate en plasmocytes de longue durée de vie (PLDV), proches des plasmocytes de longue vie naturels de la moelle osseuse. Certains de ces PLDV sont autoréactifs, pouvant expliquer l’échec au rituximab et le succès de la splénectomie. Nous avons souhaité explorer les mécanismes qui sous-tendent ce processus de différenciation plasmocytaire paradoxale dans un modèle murin. Pour ce faire, nous avons utilisé le modèle de souris transgénique AID-Cre-ERT2 × Rosa26-loxP-EYFP qui permet de marquer irréversiblement par la protéine EYFP les