Sistemas genéticos para un nuevo abordaje del riesgo de progresión de la retinopatía diabética

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Artículo original

Sistemas genéticos para un nuevo abordaje del riesgo de progresión de la retinopatía diabética夽 M.D. Pinazo-Durán a,b,∗,1,3 , V. Zanón-Moreno a,b,2,3 , A. Lleó-Perez a , J.J. García-Medina a,c,1 , C. Galbis-Estrada a,b,1 , M.J. Roig-Revert a , C. Marco-Ramírez a , M. López-Gálvez d,1 , R. Dolz-Marco e,1 , L. Duarte a,b,c,d,e , C. Campos Borges a,b,c,d,e , J. Salgado-Borges a,b,c,d,e y R. Gallego-Pinazo e,1 a

˜ Unidad de Investigación Oftalmológica Santiago Grisolía, Valencia, Espana Departamento de Cirugía, Unidad de Investigación en Oftalmología, Facultad de Medicina y Odontología, Universidad de Valencia, ˜ Valencia, Espana c Departamento de Oftalmología, Hospital Universitario Reina Sofía, Murcia, Espana ˜ d Departamento de Oftalmología, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia, Espana ˜ e Sección de Retina, Departamento de Oftalmología, Complejo Hospitalar Entre Douro e Vouga, Oporto, Portugal b

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO

R E S U M E N

Historia del artículo:

Objetivo: Evaluar el riesgo de progresión de la retinopatía diabética (RD) utilizando nue-

Recibido el 14 de diciembre de 2015

vas estrategias para obtener información genética en diabéticos tipo 2 (DT2) basadas en

Aceptado el 13 de enero de 2016

interferencia por ácido ribonucleico (ARN).

On-line el xxx

Material y métodos: Estudio multicéntrico, prospectivo de casos-controles en 132 participantes divididos en: grupo DT2 (GDT2) con RD (+RD) y sin RD (−RD) (n = 77) y grupo control (GC)

Palabras clave:

(n = 55). Tras entrevista personal y examen oftalmológico, se extrajeron lágrimas para análi-

Interferencia por ARN

sis molecular (expresión de micro-ARN [miARN] [miRCURYTM ARN Isolation Kit, Qiagen]). En

Micro-ARN

18 muestras (GDT2+RD = 6; GDT2–RD = 6; GC = 6) obtuvimos librerías de 137 vs. 140 pares de

Diabetes mellitus tipo 2

bases (GeneMapper, Applied Biosystems) y realizamos secuenciación de próxima generación

Retinopatía diabética

(NGS). El programa SPSS 15.0 vehiculizó el análisis estadístico.

Biomarcadores preclínicos

˜ ˜ Resultados: Edad media: 67 ± 12 anos en GDT2 vs. 55 ± 21 anos en GC. Distribución hombres/mujeres: 51/28 en GDT2 vs. 25/30 en GC. Los antecedentes familiares de DM, cumplir dieta, fumar, beber y realizar ejercicio mostraron diferencias significativas entre grupos (p < 0,001). Con 20-25 ␮L de lágrimas extrajimos 9,42 ± 3,30 ng/mL de ARN purificado, con diferencias significativas entre GDT2/GC (p = 0,002) y GDT2+RD/GC (p = 0,004). La expresión lagrimal

夽

˜ Este trabajo recibió el Premio de Investigación Doctores Galo y Gustavo Leoz de la Sociedad Espanola de Oftalmología (Sevilla, 2015). Autor para correspondencia. Correo electrónico: [email protected] (M.D. Pinazo-Durán). 1 OFTARED: Red Temática de Investigación Cooperativa en Patología Ocular del Instituto de Salud Carlos III. Colaboración entre los nodos Valladolid OFTARED G04 y Valencia OFTARED G14. 2 CIBEROBN: Consorcio de Investigación Biomédica en Red sobre Nutrición y Obesidad del Instituto de Salud Carlos III. Colaboración con el nodo de Valencia. 3 Ambos autores MDP-D y VZ-M han colaborado de igual forma en la realización de este trabajo, por lo que comparten el primer lugar entre los autores. http://dx.doi.org/10.1016/j.oftal.2016.01.016 ˜ 0365-6691/© 2016 Sociedad Espanola de Oftalmología. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Todos los derechos reservados. ∗

Cómo citar este artículo: Pinazo-Durán MD, et al. Sistemas genéticos para un nuevo abordaje del riesgo de progresión de la retinopatía diabética. Arch Soc Esp Oftalmol. 2016. http://dx.doi.org/10.1016/j.oftal.2016.01.016

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de miARN en GDT2 correlacionó directamente con: edad/obesidad/duración de DM (p < 0,05), e indirectamente con: agudeza visual (p < 0,05). Hemos identificado 14 miARN relacionados con la presencia, mecanismos patogénicos y factores de riesgo para la progresión de la RD. Conclusiones: Proponemos utilizar lágrimas como fuente de información genética para la DM. Los miARN específicos implicados en desarrollo o progresión de la RD pueden utilizarse como biomarcadores moleculares y, a partir de ellos, desarrollar futuras bioterapias. ˜ de Oftalmología. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Todos los © 2016 Sociedad Espanola derechos reservados.

Genetic systems for a new approach to risk of progression of diabetic retinopathy a b s t r a c t Keywords:

Objective: To evaluate the risk of progression of diabetic retinopathy (DR) using new strategies

Interference by RNA

to obtain genetic information in type 2 diabetes (T2D) based on interfering ribonucleic acid

Micro RNAs

(RNA).

Type 2 diabetes mellitus

Material and methods: A prospective multicentre case-control study of 132 participants was

Diabetic retinopathy

distributed into: T2D with (+DR) or without (−DR) (T2DG; n = 77), and a control group (CG;

Pre-clinical biomarkers

n = 55). After an eye examination and personal interview, tears were collected for molecular analysis (expression of microRNAs [miRNAs] (miRCURY

TM

ARN Isolation Kit, Qiagen)].

Libraries, 137 vs. 140 bp (GeneMapper, Applied Biosystems), were obtained in 18 samples (T2DG+DR = 6; T2DG−DR = 6; CG = 6) by performing next-generation sequencing (NGS). SPSS 15.0 statistical program was used to perform data analysis. Results: The mean age was 67 ± 12 years in the T2DG vs. 55 ± 21 years in the CG. Distribution men/women: 25/30 in T2DG vs. 51/28 in CG. A family history of DM, diet compliance, smoking, drinking and exercise, showed significant differences between groups (P<.001). A 20-25 microlitre sample of tears contained a mean of 9.42 ± 3.30 ng/mL of purified ARN, with significant differences between T2DG/CG (P=.002) and T2DG+RD/CG (P=.004). Tear expression of miARNs in T2DG directly correlated with age/obesity/T2D duration (P<.05), and indirectly with visual acuity (P<.05). A total of 14 miRNAs related to the presence, pathogenic mechanisms and risk factors for the progression of diabetic retinopathy, were identified. Conclusions: We propose to use tears as a source of genetic information for DM. Specific miRNAs involved in DR development and/or progression can be used as molecular biomarkers, and based on these, for developing future biotherapies. ˜ © 2016 Sociedad Espanola de Oftalmología. Published by Elsevier España, S.L.U. All rights reserved.

Introducción ˜ (Fundación Según el estudio sobre la ceguera en Espana RetinaPlus, 2012) sabemos que alrededor de un millón de personas padecen algún tipo de discapacidad visual en nuestro país y alrededor de 70.000 personas presentan ceguera legal. La mayoría de las enfermedades que originan pérdida de visión presentan una gran prevalencia, y entre ellas destaca la retinopatía diabética (RD), primera causa de ceguera en individuos en edad laboral1–3 . A pesar de la fotocoagulación láser y de las ventajas del examen mediante tomografía de coherencia óptica (OCT) una cifra demasiado elevada de pacientes con diabetes mellitus (DM) continúa perdiendo visión. Sin embargo, el nuevo abordaje intravítreo de los fármacos antiangiogénicos y antiinflamatorios4,5 y la investigación de nuevas terapias parecen aportar nuevas

expectativas hacia un tratamiento definitivo que permita preservar la visión de los diabéticos6–9 . El conocimiento del genoma conlleva grandes expectativas para estos enfermos, aunque el componente genético de muchas oftalmopatías continúa siendo una incógnita. La interferencia por ácido ribonucleico (ARN) (ARN de interferencia [ARNi]) es un proceso de silenciamiento génico10 . Una de las teorías más difundidas para explicar su existencia es que funciona como un sistema inmune a nivel celular que permite a la célula distinguir su propia información genética de la que no lo es. La segunda función importante que se le reconoce es que regula la expresión de genes durante el desarrollo. ˜ Se han descrito varias clases de moléculas pequenas de ARN que desencadenan el silenciamiento génico por el proceso de interferencia. Las más conocidas: los ARN interferentes ˜ (siARN, interfering ARN) que tienen un origen exópequenos geno; los micro-ARN (miARN) de origen endógeno (es decir que

Cómo citar este artículo: Pinazo-Durán MD, et al. Sistemas genéticos para un nuevo abordaje del riesgo de progresión de la retinopatía diabética. Arch Soc Esp Oftalmol. 2016. http://dx.doi.org/10.1016/j.oftal.2016.01.016

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han sido codificados en el propio genoma) y los ARN asociados a piwi (piARN). Los miARN fueron descubiertos en 1993 por Ambros, Lee y Feinbaum11 al comprobar que el gen lin-4 (control del desarrollo del gusano Caenorhabditis elegans) no codificaba para ˜ (uno de 22 nucleóproteína, pero producía 2 ARN pequenitos tidos, otro de 61 nucleótidos de longitud). Entre las funciones que se les atribuyen destacan: el control de la diferenciación, proliferación y muerte celular, con un papel fundamental en la formación del patrón neuronal, diferenciación hematopoyética, miogénesis, cardiogénesis y vasculogénesis, el ˜ metabolismo de los ácidos grasos y las senales de transducción, entre otras muchas que aún están por elucidar12–14 . ˜ que poseen entre 21 y 25 nucleótidos, Los ARN pequenos monocatenarios y no codificantes se conocen como miARN y funcionan mediante regulación de la expresión génica de forma transcripcional/postranscripcional10–14 . La biogénesis de miARN es un proceso regulado temporoespacialmente que incluye una serie de pasos secuenciales catalizados por distintas enzimas, cuyo fin es la formación de miARN maduros. Los miARN se producen en el núcleo y son sintetizados como precursores (miARN primarios o primiARN). Estos son transcritos por la enzima ARN polimerasa II y posteriormente procesados por el complejo DROSHA (ARN polimerasa III y la proteína de unión DGCR8) para formar los pre-miARN. Los pre-miARN son, a su vez, exportados del núcleo al citoplasma por la enzima exportina-5 y, ya en el citoplasma, son procesados por la enzima DICER, que interacciona con la proteína del dominio de unión a la doble hélice de ARN (TRBP) y corta el stem-loop formando 2 moléculas complementarias cortas, aunque solamente una, la hebra guía, es seleccionada por las proteínas ARGONAUTA (enzima ARN polimerasa) y es la que se va a integrar en el conplejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), ahora activado, y que es el encargado de buscar a los mensajeros (ARNm) complementarios en la célula. Una vez localizados, los miARN se emparejan de acuerdo con su secuencia de bases con la molécula complementaria del mensajero (ARNm), inhibiendo la traducción de ese ARNm que no sintetizará la proteína esperada. Así, se produce el proceso de silenciamiento de los genes mediado por los miARN (y de la interferencia por ARN mediada por siARN). Bartel et al.12 , Kroll et al.13 y, más recientemente, Ha y Kim14 han realizado una revisión muy completa sobre la homeostasis de los miARN que puede ayudar a comprender la secuencia de la biogénesis explicada anteriormente. En la figura 1 se incluye un resumen de la biogénesis de los miARN. Los miARN «no codifican» para ninguna proteína, y sí actúan como reguladores de la expresión génica. Los miARN cada vez suscitan mayor atención a nivel mundial, ya que cualquier alteración que surja en el transcurso de su biogénesis provocará cambios en cualquiera de las funciones que dependen de ellos, por lo que se han relacionado con diversas enfermedades, entre ellas las anomalías del desarrollo15 , el cáncer16,17 , el desarrollo del sistema nervioso18 y procesos neurodegenerativos19 . Entre los métodos descritos para identificar miARN y evaluar su homeostasis nucleocitoplasmática cabe destacar la reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real (RT-PCR) y la secuenciación de próxima generación (NGS), o los microarrays. De hecho, la transcripción de los genes de los miARN se regula de la misma forma que la biosíntesis proteica,

3

Biogénesis de miRNA: a. Síntesis por RNA polimerasa II (o III). Procesamiento por DROSHA en núcleo,

b. Exportar el pre-miRNA del núcleo al citoplasma por exportina-5, c. En citoplasma 2º procesamiento por DICER d. identificación y desnaturalización del miRNA por miRISC e. Selección asimétrica de una cadena del miRNA f. Apareamiento con el mRNA blanco

Represión de la traducción Inhibición síntesis proteica

Figura 1 – Biogénesis de los micro-ARN.

pudiendo inducirse o inhibirse10–14 , por lo que los miARN han podido ser identificados y cuantificados en distintos fluidos corporales con resultados óptimos y relacionados con diversas enfermedades, entre ellas algunas de las enfermedades oculares de mayor prevalencia20,21 . En estos momentos podemos afirmar que los miARN suponen un nuevo nivel de regulación génica, de manera específica en los tejidos y, por ello, muestran una distribución tisular restringida. Esto los hace particularmente interesantes en la DM. Por ejemplo, se ha descrito el miR-146b-3p como regulador de la respuesta inflamatoria retiniana en diabéticos, con relación a la supresión de adenosín deaminasa (ADA2)22 , y también se sabe que miR-23a, miR-320a y miR-320b (relacionados con la angiogénesis y fibrosis) aumentan su expresión en el vítreo de ojos con RD proliferativa23 . ˜ un estudio genético para realizar una serie Hemos disenado de ensayos en pacientes diabéticos tipo 2 (GDT2) y compararlos con los datos obtenidos de sujetos no diabéticos que forman el grupo control (GC). Nos proponemos utilizar las lágrimas como muestra biológica, para llevar a cabo la extracción de ARN purificado, obtener librerías y realizar la NGS para identificar los miARN y analizar su expresión diferencial con relación al desarrollo o progresión de la RD.

Sujetos, material y métodos ˜ del estudio Diseno Estudio multicéntrico, prospectivo de casos-controles en 132 participantes divididos en 2 grupos: diabéticos (GDT2; n = 7), con RD (+RD) o sin RD (−RD), y controles (GC; n = 55). Los

Cómo citar este artículo: Pinazo-Durán MD, et al. Sistemas genéticos para un nuevo abordaje del riesgo de progresión de la retinopatía diabética. Arch Soc Esp Oftalmol. 2016. http://dx.doi.org/10.1016/j.oftal.2016.01.016

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Personas citadas en el Dept. de oftalmología de los centros de estudio (n=165) Diabéticos T2: GDMT2 (n = 90)

Controles: GC (n = 75)

Entrevista: datos Personales/Familiares, características y estilo de vida Agudeza visual con mejor C

Exploración oftalmológica

Examen del fondo ocular Tomografía de coherencia optica

Clasificación: Grado de severidad de la RD DM2 + DR

Elección y decision de aceptar participación en el estudio (n = 132)

DM2 – DR GC

Diabéticos T2: GDMT2 (n = 77)

Controles: CG (n = 55)

˜ del estudio. Figura 2 – Diagrama de flujo correspondiente al diseno

centros del estudio son algunos de los hospitales y unidades de investigación que pertenecen a la Red Temática de Investigación Cooperativa del Instituto de Salud Carlos III OFTARED (Valencia y Valladolid) y al centro Hospital entre Douro e Vouga de Oporto (Portugal). Todos los centros participantes obtuvieron los permisos de las instituciones correspondientes y de los jefes de cada uno de los servicios de oftalmología. Cada participante fue previamente informado del estudio y firmó el consentimiento, que fue archivado junto a la docu˜ una hoja Excel para que cada uno de mentación. Se disenó los oftalmólogos y los investigadores pudieran incluir todos los datos de los participantes en el estudio. Se realizó entrevista personal para obtención de datos demográficos, características personales y familiares (antecedentes de DM, peso corporal, talla), estilo de vida (toxicomanías, realización de ejercicio, tipo de nutrición, etc.), examen oftalmológico (agudeza visual con mejor corrección [AVMC], exploración de fondo de ojo y examen mediante tomografía de coherencia óptica [SD-OCT]) y finalmente se procedió a la extracción de lágrimas reflejas para análisis molecular (extracción de 25-30 ␮l de lágrima por capilaridad —micropipeta Pasteur— desde el menisco inferior de ambos ojos), que se colocó en microeppendorf y se congeló a −80 ◦ C hasta su procesamiento). En la figura 2 puede apreciarse un resumen de la metodología empleada en este estudio y de los participantes seleccionados distribuidos por grupos y subgrupos.

˜ breve, se anade una cantidad conocida de miARN sintético (spike-in cel-miR-39) antes de la separación orgánica de fases que servirá como control de normalización del proceso de extracción y permitirá reducir el error experimental. Una vez obtenido el ARN total de las lágrimas de cada participante, se escogieron al azar 18 muestras de las lágrimas (12 del GDMT2 [6 pacientes +RD; 6 pacientes –RD] y 6 del GC), que se utilizaron para la obtención de librerías que permiten distinguir, dentro del pool de ARN que poseemos, los miARN presentes en cada muestra. Para ello hemos trabajado con kits que permiten ˜ trabajar con pequenas cantidades de ARN. Las librerías son reamplificadas y purificadas para cuantificar mediante RT-PCR, calculando su cantidad total mediante un método de cuantificación absoluta y curvas patrón de las concentraciones conocidas y evaluación mediante GeneMapper ® Software to v4.0, Applied Biosystems (Thermo Fisher technologies, USA). El proyecto genoma humano llevó a cabo la secuenciación de primera generación conocida como la secuenciación Sanger (método de terminación de la cadena)25 . En nuestro estudio se realizó el procedimiento de secuenciación mediante NGS según descripción del grupo de genética del Dr. Millán26 , para determinar el orden exacto de los nucleótidos presentes en una molécula de ácido nucleico (en este caso ARN). Las muestras de lágrima de cada participante se procesaron mediante un panel personalizado HaloPlex para la plataforma Illumina (Inc. San Diego, CA, USA), obteniendo una amplia gama de datos que nos permitieron evaluar las diferencias entre los miARN identificados en los pacientes del GDT2 y del GC.

Procesamiento de las lágrimas Análisis estadístico Se procede a descongelación en el momento de comienzo del protocolo, cuyo fin es la extracción de ARN purificado de las muestras de lágrima de los 2 grupos de estudio (GDT2 vs. GC). El ARN se extrae mediante kits de aislamiento de ARN total usando el miRCURYTM ARN Isolation Kit–Biofluids (Qiagen, Hilden, Alemania) según descripciones anteriores24 . De forma

El estudio estadístico se realizó mediante el programa IBM SPSS 15.0 (Chicago, Illinois, EE. UU.). Los datos se muestran como las medias y desviaciones estándar. Se seleccionó un riesgo alfa del 5% (p < 0,05) en todos los contrastes. Y en este sentido, los contrastes entre variables cuantitativas y

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Resultados

Expresión de RNA en lágrimas de los participantes en el estudio

12 10 8

ng/µL

12

6 4 2

«

«

«

- RD

+ RD

Total

10 8 6 4 2 0

Controles

˜ La edad media del GDMT2 fue 67 ± 12 anos, frente a 55 ± ˜ del GC. La distribución por género fue en GDT2 de 51 21 anos hombres/28 mujeres y en el GC de 25 hombres/30 mujeres. Existían diferencias estadísticamente significativas entre los grupos principales (GDT2 y GC; p < 0,001) respecto a: antecedentes familiares de DM, cumplir la dieta (dieta baja en hidratos de carbono), fumar (diariamente), beber (diariamente) y realizar ejercicio físico reglado (caminar todos los días o realizar gimnasia pautada). La AVMC mostró diferencias significativas entre diabéticos vs. controles (p = 0,015 para ojo derecho y 0,004 para ojo izquierdo). Las agudezas visuales entre diabéticos con RD y sin RD mostraron diferencias significativas en ambos ojos. (p = 0,045 para ojo derecho y 0,037 para ojo izquierdo). Con 20-25 ␮L de lágrimas obtuvimos una media de 9,42 ± 3,30 ng/mL de ARN purificado (longitud menor de 200 nucleótidos [nt]), con una diferencia de expresión significativa entre GDT2 y GC (p = 0,001) tal como se puede apreciar en la figura 3, y también entre GDT2+RD y GC (p = 0,004). Cuando analizamos el GDT2, obtuvimos una correlación directa entre la expresión lagrimal de ARN purificado total con las siguientes variables: edad, índice de masa corporal y duración de la DM (p < 0,05), e indirecta entre la AVMC con cada ojo (p < 0,05). Además, el análisis de la covariable ejercicio físico mostró que, en los pacientes que no realizaban ejercicio físico, el ANOVA de la comparación de las medias no mostró diferencias estadísticamente significativas entre

0

Cantidad de miRNAs en los grupos de estudio 14

miRNAs (ng/µL)

cualitativas (es decir, entre los niveles de expresión génica con relación a los datos demográficos, características de los pacientes y estilo de vida) se llevaron a cabo mediante pruebas no paramétricas para comparación de 2 grupos (U de Mann-Whitney) y más de 2 grupos (H de Kruskal-Wallis). En las correlaciones entre variables cuantitativas (correlaciones de los niveles de expresión génica con parámetros oftalmológicos) se empleó la correlación no paramétrica de Spearman (rho).

Diabéticos

Figura 4 – Información obtenida de las librerías de las muestras de las lágrimas de los pacientes de este estudio frente a otro tipo de muestras (conocidas). Las librerías de miARN de las lágrimas se obtuvieron a 137 vs. 140 pares de bases. Se muestran las cantidades de miARN en los distintos grupos de participantes en este estudio. Los datos son la media ± DE. * p < 0,05.

los valores medios de ARN entre los grupos (p = 0,601). Por el contrario, los pacientes que practicaban ejercicio físico reglado mostraron diferencias significativas en los valores medios de ARN (p = 0,039). El análisis de comparaciones múltiples nuevamente mostró que las diferencias significativas se presentaban entre los subgrupos GC y GDT2+RD (p = 0,031). El procesado del ARN total permitió obtener librerías en las 18 muestras de lágrimas seleccionadas para este procedimiento, extrayendo la información correspondiente a los ARN ˜ (137 vs. 140 pares de bases) respecto al pool de ARN pequenos total. La figura 4 muestra los datos de la cantidad de miARN encontrada en los grupos de estudio. Tras la secuenciación y análisis bioinformático con comprobación de bases de datos de miARN, se han identificado 66 miARN en las lágrimas de nuestros participantes, aunque solo 14 mostraron diferencias significativas entre el GDM2 y el GC. En la figura 5 se muestra la representación gráfica del procesamiento de los datos obtenidos de la NGS, que fue factible pese a las dificultades provocadas por la cantidad de muestra y las características de las lágrimas, y cuyos datos mostraron las diferencias en la expresión de miARN específicos en lágrimas del GDT2 y del GC. Además, los datos se procesaron para comparar el perfil diferencial de expresión de miARN con relación a los principales mecanismos implicados en la RD (inflamación, disfunción endotelial, estrés oxidativo, apoptosis) y también con relación a los principales factores de riesgo individuales para la DM2 (edad, antecedentes familiares de DM, duración de la DM, obesidad, etc.).

Discusión GCMT2

GC

Figura 3 – Expresión de ARN total en las lágrimas humanas. Comparación de los grupos de pacientes del GDT2 y del GC. Los datos son la media ± DE. ** p < 0,001.

El objetivo principal del estudio ha sido extraer el ARN total de las muestras de lágrima y analizarlas para obtener información del contenido y de la cantidad de los miARN y conocer su valor como posibles biomarcadores moleculares pronósticos y diagnósticos de la RD. Además, hemos relacionado

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– log10 (PValue)

3

2

1

0 –4

0

4

logFC

Figura 5 – La gráfica corresponde a los datos obtenidos de la secuenciación (NGS) de las muestras de lágrimas y los valores demuestran que el cambio (expresado en logaritmo) de la proporción de varios miARN es diferente entre las muestras de lágrima del GDT2 (color azul) y del GC (color naranja). Específicamente se ha podido apreciar que solo 6 miARN tienen p < 0,001 (también expresada en logaritmo), y además 8 miARN tienen un valor de significación estadística p < 0,05.

los valores obtenidos respecto a las variables demográficas, características y estilo de vida, así como respecto a los datos del examen oftalmológico. Los resultados obtenidos confirmaron un patrón diferencial de expresión del ARN total, así como de los miARN, en las lágrimas de los pacientes del GDT2 frente a los individuos del GC. El mayor interés de nuestro estudio radica en que no existen publicaciones que analicen la presencia de los miARN en lágrimas con relación a la RD. Mediante este estudio, queremos enfatizar que las lágrimas poseen un valor intrínseco como muestras biológicas para estudios genéticos y que los miARN tienen una importancia fundamental en la fisiopatología de la microangiopatía diabética. Nuestra hipótesis principal es que los miARN participan en los procesos inflamatorios, mecanismos de apoptosis, disfunción endotelial y procesos de estrés oxidativo en el curso de la DT2. Pensamos que su identificación y la posibilidad de determinarlos en lágrimas de una forma relativamente fácil y atraumática nos permitiría obtener un diagnóstico precoz y no invasivo del riesgo de desarrollar la RD o de progresar hacia las complicaciones vitreorretinianas y la pérdida de visión, evitando así procesos diagnósticos y terapéuticos agresivos y largos en situaciones de dudas diagnósticas o de instauración o monitorización del tratamiento a los pacientes en riesgo de perder la visión y la calidad de vida en el curso de la DT2. De hecho, se ha publicado que los miARN están implicados en la inflamación y respuesta del sistema inmunitario en enfermedades tales como artritis reumatoide (miARN-1885p), psoriasis (miARN-188-5p), osteoartritis (mARN-194-5p) o colitis ulcerosa y enfermedad de Chron (panel de miARN: miR-19a, miR-21, miR-31, miR-101, miR-146a, miR-375)27–30 . Una serie de investigadores concluyeron sus estudios determinando los miARN en diversos fluidos corporales, entre

ellos el plasma, suero, saliva, orina, o lágrimas, y habiendo comprobado la elevada concentración de miARN libres en muestras de sangre periférica31,32 . Además, hemos encontrado 4 trabajos que evalúan la expresión de miARN en fluidos oculares, todos ellos dirigidos hacia estudios en glaucoma, linfoma vitreorretiniano, uveítis, o cataratas20,21,33,34 . Recientemente se ha demostrado que es factible la identificación precisa de células hematopoyéticas presentes en otros tejidos basándose en su perfil de expresión de miARN. De hecho, estas células expresan 5 miARN muy específicos: miR-142, miR-144, miR-150, miR-155 y miR-22335 . También se ha descrito que distintas células del sistema inmune pueden ser identificadas por su perfil único de expresión de miARN como los linfocitos B y T que expresan miR-22336 . Bien es cierto que pueden llegar a correlacionarse los miARN expresados en determinadas células y los posibles genes diana que pueden regular, aunque son necesarios más estudios para completar el conocimiento de que son esos genes los que están en los objetivos de los miARN y no otros37 . Y a pesar de que ˜ los algoritmos bioiformáticos senalan que los miARN se dirigen a multitud de genes dentro de una sola célula, y, por lo tanto, puede existir un cierto desacuerdo con algunos de estudios de función, bien es cierto que algunos de los miARN han demostrado que solo unos pocos de los mARN diana pueden ser fundamentales para determinados procesos fisiológicos y, por tanto, también para los procesos patológicos particulares, aumentando el interés por estas vías, y erigiéndolos en potenciales biomarcadores de enfermedades concretas, como la RD. En el procesamiento de los datos obtenidos en el presente estudio se hallaron diferencias estadísticamente significativas entre los pacientes diabéticos y el grupo control respecto a los antecedentes familiares de DM en GDT2, cumplimiento de la dieta (adherencia a alimentación baja en hidratos de carbono más frecuente en GDT2), hábito de fumar (diariamente, era menos frecuente en GDT2), costumbre de beber (diariamente, que también resultó ser menos frecuente en GDT2) y realizar ejercicio físico reglado (caminar todos los días o realizar gimnasia pautada, que se presentaba con mayor frecuencia en el GDT2). Se sabe que el tiempo de evolución de la DM es el factor de riesgo más importante en el desarrollo de la RD38–40 . Con relación al índice de masa corporal, diversos autores en el análisis de algunas variables clínicas de la RD observaron que, del total de obesos que se vieron afectados por retinopatía no proliferativa, el 47,1% correspondían a los pacientes con DMT1 y un 19,8% a los DMT2, aunque la retinopatía proliferativa solo se evidenció en 5,8 y 0,6% de los pacientes diabéticos de tipo 1 y 2, respectivamente41 . El consumo de alcohol se ha relacionado con una disminución de RD en pacientes con DMT141 . En relación con el consumo de tabaco se conoce que este hábito produce hipoxia tisular y aumento de la agregabilidad plaquetaria, pero, aun así, otros autores no encontraron relación significativa con el desarrollo de la RD42 , lo que contrasta con los resultados de este estudio. Se ha obtenido una cantidad significativamente mayor de ARN purificado de las lágrimas de los pacientes del GDT2 que del GC, lo que puede comprobarse en la figura 2. Los datos también mostraron que los valores de ARN purificado total fueron significativamente mayores en las lágrimas de los pacientes del GDMT2+RD frente a los controles (p = 0,004). Además, el

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procesamiento de datos del GDMT2 mostró que había mayor expresión lagrimal de ARN conforme mayor era la edad del paciente, mayor el índice de masa corporal y cuanto más prolongada era la duración de la DM. Y también demostró una mayor expresión de ARN cuanto menor era la agudeza visual con cada ojo. No podemos comparar nuestros datos con los de otros autores, ya que no existen publicaciones sobre este tema que utilicen las lágrimas como muestras biológicas para información del proceso de ARNi. La obtención de las librerías mediante el procesamiento del ARN total de cada uno de los grupos y subgrupos aportó ˜ la información de la presencia de los ARN pequenos (137 vs. 140 pares de bases) en cada uno de los grupos, conforme se muestra en la figura 3. Y cuando se realizó la secuenciación de las muestras de lágrima, logramos identificar 66 miARN, aunque el análisis bioinformático y la evaluación de las bases de datos de miARN nos demostraron diferencias en la expresión de miARN en lágrimas de pacientes del GDT2 y GC, lo que nos llevó a identificar 14 miARN en las lágrimas de los pacientes diabéticos frente a los controles. Respecto a la interferencia por ARN, Mc Arthur et al.43 describieron la alteración de varios miARN, incluyendo la baja regulación de miR-200b en la retina diabética, validada en el modelo experimental en la rata y en humanos. Las funciones de los miARN en la angiogénesis no diabética también han sido analizadas en ratones transgénicos para un alelo hipomórfico de la enzima DICER: se ha descrito que esos ratones no podían iniciar los procesos de angiogénesis y morían intraútero44 . Y otro modelo de isquemia y neovascularizacion ocular ha demostrado el aumento de 7 miARN y la disminución de otros 3 miARN en la retina lesionada45 . Como resultado de nuestros experimentos proponemos utilizar las lágrimas como muestras biológicas para obtener información genética en los DT2. Podemos afirmar que los miARN incrementan su expresión en lágrimas con relación a la DT2 y la RD, correlacionando con factores de riesgo para la progresión de la retinopatía. Tras la identificación precisa de los 14 miARN implicados en los mecanismos patogénicos de la RD (inflamación, disfunción endotelial, estrés oxidativo y apoptosis), proponemos su utilización como biomarcado˜ de futuras bioterapias para res moleculares y para el diseno el diagnóstico preclínico, seguimiento y monitorización de la terapia en los DT2.

Financiación El estudio se ha llevado a cabo con financiación FIS/FEDER al proyecto PI13/00480 (IP Dra. Pinazo-Durán), y de la Red Temática de Patología Ocular OFTARED (nodos de Valencia y de Valladolid) y en colaboración para infraestructuras y servicios por parte del CIBEROBN (Valencia).

Conflicto de intereses No hay interés comercial por parte de ninguno de los autores del estudio.

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