Structure des parois de Bacillus megaterium KM II. Étude des complexes mucopeptidique et phosphomucopolysaccharidique

BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

297

BBA 3786

STRUCTURE

DES PAROIS DE BACILLUS

MEGATERIUM

KM.

II. E T U D E DES COMPLEXES M U C O P E P T I D I Q U E ET P H O S P H O MUCOPOLYSACCHARIDI QUE J. M. GHUYSEN*, MELINA LEYH-BOUILLE* ET L. DIERICKX ~* Service de Bactdriologie* et Centre National de Production et d'Etude des Substances d'origine microbienne**, Universitd de Liege, Liege (Belgique) (Re~u le 25 avril, 1962)

SUMMARY Structure of the cell walls of Bacillus megaterium K M . II. Study of the mucopeptide and phosphomucopolysaccharide complexes Bacillus megaterium KM cell walls are composed of two distinct heteropolymers. The first, referred as to X-teichoic acid, presents a molecular weight of about ILOOO. I t consists of about IO subunits containing P, glucose and GlcNHAe in the molar ratio I/2/I.3 as well as a polyol compound. It does not play any role in mainraining the rigidity of the wall. The second can be visualized as a three-dimensional network of structural subunits consisting of four mucopeptide residues with an average composition GlcNHAca(N-acetylmuramic acid)l-Ala2.~o-Glul-(cc,e-diaminopimelic acid)l. They also contain glucose. This mucopeptide is the basal structure of the wall. The two heteropolymers are present in equimolar proportions. They are covalently bound through glucosido-muraminyl bridges branched on some of the alanine residues of the basal mueopeptide thanks to amidic linkages.

INTRODUCTION Des recherches ant6rieures 1 ont montr6 que les patois de Bacillus megaterium KM sont constitu6es par l'association de deux h6~6ropolym~res chimiquement tr~s diff6rents: le premier est un complexe phosphomucopolysaccharidique (PMS) ; le deuxi~me est le complexe mucopeptidique pr6sent dans toute paroi cellulaire bact6rienne et souvent d6sign6, depuis la suggestion de WORK2, SOUSle nom de mucopeptide de base. Le complexe PMS et les aeides teichoiques que BADDILEY et al. ~-5 extrayent par l'acide triehlorac6tique de parois d'autres bact6ries gram-positives pr6sentent beaucoup de propri6t6s communes. Le complexe PMS n'est cependant pas extractible par l'acide trichlorac6tique froid (10%; 4°; 3 jours). I1 a ~t6 d6montr61 qu'il est covalentiellement associ6 au mucopeptide de base. Abr6viations: AAM, acide N-ac6tylmuramique; DAP, acide ~-e diatminopim6lique; PMS, complexe phospbomucopolysaccharidique. Biochim. Biophys. Acta, 63 (1962) 297-3o7

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J. M. GHUYSEN, M. LEYH-BOUILLE, L. DIERICKX

Dans ce travail, la structure des deux complexes constitutifs de la paroi de B.

megaterium KM et leur mode d'association ont 6t6 pr6cis6s. MATI~RIEL ET METHODES

Patois de B. megaterium KM Voir l'article pr6c6dent e.

Extraction du complexe PMS Le complexe PMS peut ~tre extrait des parois bact~riennes par proc6d6 enzymatique ou par proc6d6 chimique. Procddd enzymatique: Le lysozyme, la N-ac6tylhexosaminidase de Streptomyces 7 et l'enzyme "32" (voir r6f. 6) lib+rent le complexe PMS en m~me temps qu'ils dissolvent les parois de B. megaterium KM (incubation 24 h, 37 °, I 0.005 pour l'enzyme "32"; I compris entre o.oi et o.I pour les hexosaminidases; tampon phosphate pH 7 ou acetate d'ammonium). Le complexe PMS peut ~tre isol6 du produit de la digestion par dialyse et ~lectrophor+se sur papier de la fraction non-dialysable (condition d'61ectrophor~se : voir r6f. 6, Fig. I). Le complexe PMS occupe la zone A des dlectrophor6ogrammes. I1 est tr&s facilement r~v61able par le r~actif de Schiff apr+s oxydation periodique. Procddd chimique: I g de parois est trait6 pendant 20 min ~ 15o ° par 4 ° ml de formamide. Apr+s refroidissement et addition de 40 ml d'eau, la suspension est centrifugue et le culot lav~ deux fois & l'eau et s~ch~ sous vide. Le liquide surnageant et les eaux de lavage sont r6unis et additionn~s de 300 ml d'alcool. Un pr6cipitd blanch~tre apparatt et, apr+s un s~jour de 24 h &4 °, est recueilli par centrifugation, lard &l'alcool et s6ch~ sous vide. I1 est constitud par le complexe PMS qui est ult6rieurement purifi6 par ~lectrophor+se sur papier (voir proc6d6 enzymatique).

Composition chimique du complexe PMS Des aliquots, hydrolysis par HC1 6 N, 18 h, IOO° ont 6t6 chromatographi6s selon deux dimensions, en pyridine-eau (8:2, v/v) puis en n butanol-acide ac~tique-eau (3:1:1, v/v/v). Les acides amin6s ont 6t6 doses et la proportion relative GlcNHAc/ AAM a 6t6 d6terminde par r6v6lation des chromatogrammes ~ la ninhydrine, extraction des taches dans le mdlange ac6tone-eau (3:1, v/v) et d6termination des absorbances & 57 ° m F. Les hexosamines ont 6t6 dos~es par le proc6d6 de NEUHAUER ET LETZRING8 sur des aliquots 6galement hydrolys6s par HC1 6 N, 18 h, IOO°. (Des hydrolyses de 18 h & IOO° par HC1 2 N e t 4 N lib~rent du complexe extrait par la formamide des quantit6s d'hexosamines inf~rieures & celle lib6r6e par HC1 6 N.) Les quantit6s respectives de glucosamine et d'acide muramique (exprim~es en GlcNHAc et AAM) ont 6t6 calculdes en se basant sur la proportion trouv~e par extraction des taches ninhydrine-positives correspondantes des chromatogrammes et en utilisant un rapport Aglueos~mlne/ Aaclde muramlque de 2.30 pour la r~action de coloration des hexosamines 9. Les acides amin6s ont 6galement ~td dos6s par dinitrophdnylation apr~s hydrolyse par HC1 6 N, 18 h, IOO° et les groupe3 C et N terminaux par les proc6dds d6j& d6crits (voir rdf. 6). Le glucose a 6td dos6 par la glucose-oxydase apr~s hydrolyse par HC1 2 N, IOO°, 3 h (une hydro]yse de 5 h ne modifie pas la quantit6 de glucose lib6rd; apr~s des hydroBiochim. Biophys. Acta, 63 (1962) 297-3o7

megaterium

STRUCTURE DES PAROIS DE B a c i l l u s

KM

299

lyses plus prolong6es, la quantit6 de glucose libre est moindre) ou par H~SO 4 o.5 N, 18 h, IOO° ou encore, directement, par application de la r6action ~ la diph6nylamine 1. Le phosphore a 6t6 dos6 par le proc6d6 de KINGn apr&s min6ralisation perchlorique.

Ultracentrifugation du complexe PMS Les ultracentrifugations ont dt~ r6alis6es A la Spinco analytique ~ l'aide de la "synthetic boundary cell". RESULTATS EXPI~RIMENTAUX

Extraction du complexe PMS La formamide extrait 42 %, poids sec, des parois bact~riennes et 86 % du phosphore qu'elles contiennent. Le traitement ~ l'alcool de l'extrait pr6cipite 75 % du phosphore solubilisd. Le rendement total en phosphore r6cup~r6 est de 65 % de la quantit6 initialement pr6sente dans les patois. Extrait par la formamide, le complexe PMS n'est pas color6, sur papier, par la ninhydrine. L'examen au microscope ~ contraste de phase du r6sidu de l'extraction montre la pr6sence de structures de forme identique ~ celle des parois non trait~es. TABLEAU

I

SENSIBILITt~ )t LA NINHYDRINE DES COMPLEXES P M S EXTRAITS DES PAROIS DE Bacillus megaterium K M Mode de prdparat~on

SensiMlitd

C h i m i q u e (formamide)

o

Enzymatique Pr6paration F2B Lysozyme Enzyme "32"

o + + +

Le complexe PMS isol6 du produit de la digestion enzymatique des parois bactdriennes repr6sente environ 4 ° % du poids de celles-ci. La sensibilit6 du complexe PMS la ninhydrine varie seton la nature de l'enzyme utilis6 (Tableau I). Outre les trois enzymes purs proposes dans MATt~RIELET MI~THODESpour la dissolution des parois, on peut 6galement utiliser la pr@aration F2B (voir r6f. 6). La sensibilit6 ~ la ninhydrine du complexe PMS obtenu par l'interm~diaire de F2B est tr~s faible ou m~me nulle si l'incubation est r6alis6e en pr6sence de quantit6s sufflsantes de F2B (24 h). Tout le phosphore des parois de B. megaterium KM est engag6 dans le complexe PMS. En effet, les parois extraites par la formamide contiennent encore 14 % du P present dans les parois intactes. Ce P r6siduel a 6t6 retrouv6 sous forme de complexe PMS par 61ectrophor&se sur papier du produit de la digestion par F2B des parois extraites par la formamide.

Composition chimique du complexe PMS (Tableau II) Extrait par la formamide, le complexe PMS est constitu6 de P (I), de GlcNHAc (1.3) et de glucose (2.1). I1 ne contient ni AAM ni acides amin6s. Biochim. Biophys. Acta, 63 (1962) 297-307

300

J. M. GHUYSEN, M. LEYH-BOUILLE, L. DIERICKX TABLEAU COMPOSITION

CHIMIQUE

DES

PAROIS

II

CELLULAIRES

DE

Bacillus megaterium KM

Complexes PMS

Mucopeptides

Complexes PMS* (z96z)

Mode d'obtention Formamide

F2B

Lysozyme Enzyme' '3 2''

I)

I

I

I

GIcNHAc AAM Glucose : Glucostat Diphenylamine

1.31 o

1.39 0.35

1.34 0.32

2.o7 2.09

1.53 2.42

1.48 2.5 °

"~ .~ ~ "~ = = "~ ~ ~ ~

DAP

o

o

o.18

Glu Ala F o n c t i o n s acid es de p K ~ 2

trace trace

trace trace

o.18 0.39

Lysozyme

F2B

Lysozyme

0

I

I

1 1

1.67 o.15

2.31 1.8o

1.5o

o.I

1.52

0.34

?

?

¢~ .~

i.i

o.io

1.6o

H e~ ~ ~

I 2.20

O.IO o.21

1.60 2.85

+

* V a l e u r s rep rises du T a b l e a u I I I , r6f. I.

Iso16 apr6s digestion des parois par F2B, le complexe PMS contient en plus de I'AAM. La teneur en glucose est augrnent4e. On ne d6c61e que des traces d'acides amin6s. Iso16 apr6s digestion de parois par le lysozyme, le complexe PMS a une composition chimique proche de celle du pr6c6dent. I1 contient cependant en plus des r6sidus peptidiques de composition moyenne DAP i ; Glu I ; Ala 2.20. La proportion P/peptide est 6gale/t 1/o.18. Iso16 apr~s digestion des parois par l'enzyme "32", le complexe PMS n'a pas ~t6 analys6. Sa forte sensibilit6 ~ la ninhydrine (r6f. 6, Fig. IC) t6moigne de l'existence d'une proportion 61ev6e de r6sidus peptidiques. L'estimation de la teneur en glucose n'est ind6pendante du proc6d6 de dosage que dans le cas du complexe PMS extrait ~t la formamide, n e s t vraisemblable que, dans ce cas, la proportion glucose/P dgale/~ 2.08 soit exacte. Dans les autres cas, la m~thode ~ la glucose-oxydase donne des rdsultats inf6rieurs, non seulement ~ ceux obtenus par la diph6nylamine, mais mSme /t ceux obtenus par la glucose-oxydase partir du complexe PMS extrait par la formamide. I1 a 6t6 d6montr61 que l'hydrolyse acide qui pr6c~de le test enzymatique ne lib&re pas tout le glucose et que celui-ci reste partiellement engag~ dans divers complexes isolables par chromatographie. Le dosage du glucose par la diph6nylamine donne des r~sultats certainement plus exacts quoique entach6s probablement eux aussi d'un certain d6ficit. En effet, I mg de paroi contient 13.5/~g de P e t , d'apr+s la m6thode ~ la diph6nylamine, i18/~g de glucose. Comme tout le P des patois est engag6 dans le complexe PMS extrait par la formamide, I mg de paroi devrait contenir au minimum 16o ~g de glucose.

Prdsence d'un polyol dans le complexe P M S Apr~s hydrolyse acide m6nag6e (2 mg/ml; HC1 2 N; 15 min; IOO°) des complexes PMS, on peut sdparer par 61ectrophor~se sur papier (20 V/cm; 3 h; pH 5.5; acideac6tique-pyridine-eau (2:4:IOOO, v/v/v); d6part pr&s de la cathode) un compos6 charg6 tr+s n6gativement (migration: 31 cm vers l'anode) sensible au Schiff apr~s Biochim. Biophys. Acta, 63 (1962) 297-3o7

STRUCTURE DES PAROIS DE Bacillus megaterium KM

3Ol

oxydation periodique, mais insensible ~ la ninhydrine, ~ la diph6nylamine-acide trichlorac6tique 1 et ~ la p-dim6thylbenzaldehyde 1°. Apr~s 61ution de la bande (nonr6v616e) correspondante de l'61ectrophor6ogramme, on constate que ce compos6 renferme 45 % du P contenu dans le complexe PMS soumis ~t l'hydrolyse. Chromatographi6 en butanol ac6tique, il se d6place de fa~on homog+ne avec un RF de o.13 (voir r~f. I). Soumis aux tests ehimiques d6crits dans MATI~RIELET METHODES, il ne r6v~le ni glucose, ni hexosamines, ni acides amin6s. Par contre, il donne un test d'Hestrin positif apr~s ac6tylation en pyridine 1. Le P du complexe PMS est donc combin6 ~ une substance pr6sentant les propri6t6s des polyols (r6action d'Hestrin apr~s ac6tylation et r6action de Schiff aprbs oxydation periodique). Sa nature exacte reste h pr6ciser. ElectrophorOse du complexe P M S d pH 2.2

Le complexe PMS (extrait par F2B) et du ribitol ont 6t6 soumis ~ une 61ectrophor~se sur papier en acide formique o.i N, 4 h e n utilisant la technique d6j~t d6crite 1 qui consiste ~ pratiquer le d6p6t le long d'une diagonale de l'61ectrophor6ogramme. La position d'6quilibre du complexe PMS a dt6 trouv6e distante de 18 cm, en direction de l'anode, de celle du ribitol utilis6 comme substance neutre standard. Le complexe PMS contient donc des fonctions acides encore fortement ionis6es ~ p H 2. Poids mol~culaire du complexe P M S

L'ultracentrifugation du complexe PMS (obtenu au moyen de F2B) donne des "pics" homog+nes et sym6triques (Fig. i) et un coefficient de s6dimentation s°20~-- 1.8o S. En combinant cette valeur avec une estimation grossi+re de la constante de diffusion (calcul6e ~ partir des images d'ultracentrifugation; valeur comprise entre IO et 17-1o v cm~/sec), on obtient un poids mol6culaire compris entre ioooo et 15000. Ce complexe PMS a un poids mol6culaire minimum de 1292 (en effet, 1292 /zg poids sec, renferment 31 t~g de P) et serait donc constitu6 d'environ IO sous-unit6s. La somme du contenu de ce complexe PMS en phosphore (compt~ comme H~PO~), en GlcNHAc, en AAM et en glucose (d'apr~s le proc6d6 ~t la diph6nylamine) ne repr6sente qu'environ 70% du poids total. Le d6ficit s'explique par la pr6sence du polyol

Fig. 1. Ultracentrifugation du complexe PMS isol6 apr6s digestion des parois de Bacillus megaterium KM par la pr6paration F2B, Concentration 0.5% (p/v): temp6rature x8-2o°; rev./min: 59 78o; tampon acide citrique-citrate sodique o.I M, pH 6; photos ~ intervalle de 4 minutes. s~0: ~ o.5%:1.o6; ~ o.25%:1,345; s%0:I.8O. Biochim. Biophys, Acta, 63 (1962) 297-307

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J.

M. GHUYSEN, M. L E Y H - B O U I L L E , L. D I E R I C K X

directement combin6 au phosphore (et non-dos6), par une sous estimation 6ventuelle des teneurs en glucose et en N-ac6tylhexosamines (destruction partielle lors de l'hydrolyse). En soustrayant du poids de ce complexe PMS son contenu en AAM ainsi que la quantitd de glucose qu'il contient en excbs par rapport ~t celle du complexe PMS extrait par la formamide, le poids mol6culaire minimum de ce dernier est trouv6 6gal environ ILOOO. TABLEAU

III

CARACTERISTIQUES DU COMPLEXE MUCOPEPTIDIQUE DES PAROIS DE Bacillus m e g a l e r i u m

KM

V a l e u r absolue, / , m o l e s / g , des g r o u p e s C t e r m i n a u x D A P . P a t o i s : 250 ; K M . L y s . N D : 172 ; P M S : 63 ; P M S (1961): 149. A cides aminds totaux

Groupes C terminaux

Groupes N terminaux

Substrats* DA P

Glu

Patois KM.Lys.ND Mucopeptides

18

19 n o n dosCs (i)

36

PMS Peptide P M S (1961)

17 (I)

17 (i) n o n dos6s

36 (2.28)

Moyenne

17.5

17

(i.i)

A la

(2.20)

36

DA P

A la

io 4.3 (io) (3) n o n dosCs io 4.4 n o n dos6s (io) (3.8) io

3.85

e-DA P

A la**

9.2 -(lO.5) (4.3) n o n dosCs 7

6 n o n dos6s (lO.2) (7) 9.2

5.7

* P o u r la signification d e s s u b s t r a t s : v o i r texte. ** Libdr6 apr~s i n c u b a t i o n a v e c l ' a m i d a s e . A v a n t t r a i t e m e n t p a r cet e n z y m e , a u c u n g r o u p e N A l a t e r m i n a l n ' e s t dCcelable.

Composition chimique du mucopeptide de base (Tableau II) La zone B de l'61ectrophorCogramme (rCf. 6, Fig. Ia) de la fraction non-dialysable des parois de B. megaterium KM digCrCes par le lysozyme, est occupCe par divers complexes mucopeptidiques d~pourvus de P. L'ensemble de ces complexes prCsente une composition chimique moyenne qui est celle habituellement caractCristique du "mucopeptide de base". En particulier, la proportion GlcNHAc/AAM est 6gale ~ i. Ces complexes contiennent dgalement du glucose dont la teneur est donnCe avec les m~mes rCserves que prCcCdemment.

Composition chimique du complexe PMS isold aprks digestion enzymatique de la prdparation z96z des parois de B. megaterium KM (Tableau II) Les valeurs sont reprises du Tableau III, rCf. I. Isol6 apr+s digestion des parois par F2B, le complexe PMS prCsente une proportion P - g l u c o s e - G l c N H A c - A A M assez semblable ~ celle du complexe PMS correspondant, 6tudid au cours du prCsent travail. Au contraire, isol6 apr+s digestion des parois par le lysozyme, le complexe PMS (1961) reste associ6 A de tr+s nombreux rCsidus mucopeptidiques.

Sensibilitd enzymatique des complexes PMS obtenus par action du lysozyme Le complexe PMS (1961) est sensible ~ l'amidase et ~ l'enzyme "32" (rCf. 6, Fig. 8). Le complexe PMS prCpar6 au cours des prdsentes recherches est insensible Biochim.

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megaterium

KM

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l'enzyme "32" mais est sensible & l'amidase (r6f. 6, Fig. 4). Le mat6riel peptidique dissoci6 dans ces conditions et r6cup6r6 de la zone centrale de l'61ectrophor6ogramme (r6t. 6, Fig. 4, voir la remarque) donne par chromatographie en butanol ac6tique une tache unique mais de RF nul.

Caractdristiques du complexe mucopeptidique des parois de B. megaterium K M Aussi souvent que possible, les groupes C et N terminaux et les acides amin6s totaux ont 6t6 dos6s/t partir (I) des parois intactes; (2) de la fraction non-dialysable obtenue par digestion des parois au moyen du lysozyme (KM.Lys.ND) ; (3) des complexes mucopeptidiques (zone B des electrophor6ogrammes, r6f. 6, Fig. I a et b) isol6s de cette fraction); (4) du complexe PMS (zone A des 61ectrophor6ogrammes, (r6f. 6, Fig. I a et b) isol6 de la m~me fraction) ; (5) du complexe peptidique s6par6 du complexe PMS pr6c6dent sous l'action de l'amidase; (6) du complexe PMS isol6 de la fraction non-dialysable obtenu par digestion des parois 1961 au moyen du lysozyme (KM.Lys.ND) (1961). Les r6sultats sont consign6s dans le Tableau III DISCUSSION

Le complexe phosphomucopolysaccharidique Apr6s extraction du complexe PMS des parois de B. megaterium KMparlaformamide chaude, le r6sidu, examin6 au microscope ~ contraste de phase, pr6sente une structure identique ~ celle des patois non-trait6es. Le complexe PMS ne participe donc pas ~ la rigidit6 des parois bact6riennes et ne leur conf6re pas leur forme particuli6re. Le complexe PMS est fortement acide (pr6sence de fonctions acides ionis4es ~ pH 2). I1 a un poids mol6culaire d'environ ILOOO et est constitu6 d'environ IO sous-unit6s contenant du P, du glucose et de la GlcNHAe dans les proportions molaires 1/2/1,3o. I1 renferme 6galement une substance encore ind6termin6e mais pr6sentant certaines propri6t6s chimiques des polyols. La formule chimique globale du complexe PMS serait : [H3PO 4 - - ((O~fi~-) ; glucose2; GlcNHAcl.~0 ] ± Io

(1)

Ces propri6t6s assimilent donc le complexe PMS des parois de B. megaterium KM aux acides ribitol teichoiques et glyc6rol teichoiques de BADDILEY. En attendant que la nature du polyol soit 61ucid6e, il sera d6nomm6 acide X-teichoique. L'acide X-teichoique n'est pas extrait des parois bact6riennes par l'acide trichlorac6tique froid (3 jours, 4 °, IO %) quoique apr6s son isolement (par la formamide ou par traitement enzymatique) il soit totalement soluble dans ce milieu. L'acide X-teichoique est covalentiellement associ6 ~ la structure de base des parois. En effet, apr6s digestion enzymatique de cette structure de base et, par vole de cons6quence, apr6s dissolution de la paroi, l'acide X-teichoique peut 6tre isol6. On le retrouve alors associ6 ~ des fragments de la structure de base, en quantit6s variables selon la nature de l'enzyme utilis6. I1 semble que dans certains cas, les acides glyc6rol et ribitol teichoiques soient 6galement associ6s covalentiellement & la structure de base. Ce serait en particulier le cas de l'acide ribitol teichoique des parois de Staphylococcus aureus Copenhagen 12. De plus, un traitement prolong6 k l'acide trichlorac6tique est parfois n6cessaire pour Biochim. Biophys. Acfa, 63 ([962) 297-307

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extraire ces acides teichoiques et il a 6t6 d6montr6 par SALTONla que ces conditions sont hydrolytiques.

Le complexe mucopeptidique de base Les complexes mucopeptidiques non associ6s A l'acide X-teichoique et isol6s de la fraction non-dialysable des parois dig6r6es par le lysozyme, pr6sentent une composition chimique moyenne 6gale A: [GlcNHAc1 - - AAM1] [DAP x; Glu, ; Ala2.2o] [Glucos%]

(z)

Ces proportions molaires des trois acides aminds ont 6t6 retrouvdes A partir (i) des parois intactes; (2) du complexe PMS obtenu par Faction du lysozyme; (3) du peptide isol6 du complexe PMS pr6cddent sous Faction de l'amidase (Tableau III). II semble donc que la Formule 2 puisse ~tre considdrde comme 6tant caractdristique d'une sous-unit6 structurelle minimale. Celle-ci contient du glucose autre que celui pr6sent dans l'acide X-teichoique. La pr6sence de glucose dans le mucopeptide de base n'est pas particuli6re aux parois de B. megateriurn KM. I1 entre peut-~tre dans la constitution du mucopeptide de la couche R des parois d'Escheriehia coli 14. I1 semble bien fake partie aussi du mucopeptide des parois de Micrococcus lysodeikticus 15. 23oo g de parois intactes renferment 3I g (ou I mol) de P e t par cons6quent environ IiO0 g (c'est A dire I mole) d'acide X-teichoique. I1 est remarquable que les 12oo g restant coincident presque parfaitement avec le poids moldculaire (1137) de la sous-unit6 de la Formule 2 pour laquelle on admettrait une proportion molaire en glucose dgale A I (ce qui paralt bien 6tre un maximum). Une sous-unit6 structurelle minimale de l'ensemble de la paroi de B. megateriurn KM aurait done un poids moldculaire de 23o0 environ et serait reprdsentde par: [HAP0a - - ((6-H77-) ; Glucos% ; GlcNHAc, a] [GlcNHA% - - AAM1] [DAP 1; AI~.=; Glu,] [Glucos%]

(3)

Une proportion 6quimol6culaire entre les deux h6t6ropolym6res constitutifs des parois de B. megaterium KM est en bon accord avec la quantit6 d'acide X-teichoique extrait (environ 4 ° %) et avec le contenu des parois en acides aminds totaux (valeurs th6oriques en /~moles/g: 435 DAP; 435 Glu ; 980 Ala; valeurs exp6rimentales : 450 DAP ; 480 Glu; 90o Ala). La Formule 3 ne permet cependant pas d'expliquer la proportion exp6rimentalement trouv6e entre les acides aminds totaux et les groupes C et N terminaux (Tableau III). D'apr6s ces r6sultats, en effet, les fonctions COOH de 57 % du DAP total et de I I % de l'alanine totale ainsi que les fonctions e-NH~ de 52 % du DAP total sont libres. Des caract6ristiques proches de ces derni6res peuvent 6tre retrouv6es /~ partir d'une unit6 structurelle telle que celle repr6sent6e par la Fig. 2 et obtenue par l'association de 4 sous-unit6s de Formule 2. Dans une telle unit6 structurelle, les Ionctions COOH de 5o % du DAP total et de I I % de l'alanine totale ainsi que les fonctions e-NH~ de 5o% du DAP total sont libres. D6pourvu de tout r6sidu saccharidique, l'unit4 structurelle de la Fig. 2 pr6sente Im rapport fonctions COOHflonctions N H 2 4gal ~ 9/5. Or les divers fragments mucopeptidiques prdsents dans la fraction non-dialysable obtenue apr4s digestion des parois

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STRUCTURE DES PAROIS DE Bacillus

megaterium KM

305

par le lysozyme, donnent, apr+s traitement par l'amidase, un m~me complexe apparemment homog~ne et encore acide ~ p H 4 (r6f. 6, Figs. 4 et 5 ; voir aussi texte). Le caract+re plus acide des complexes mucopeptidiques non-trait6s par l'amidase rfsulterait du bloquage des fonctions a - N H 2. Ala par des r6sidus saccharidiques euxm~mes 6ventuellement porteurs de fonctions COOH libres. ~-

GIcNHAc- AAM - ~ II

(glucose),v~

\ (glucose) ~-

II GIcNHAc - AAM- GIcNHAc- AAM-

NH e

% COOH

Fig. 2. Unit6 structurelle des parois de Bacillus megaterium KM. Ala et Glu sont a r b i t r a i r e m e n t repr6sent6s sous leur forme L. D A P est a r b i t r a i r e m e n t repr6sent~ sous la forme m6so. P o u r certaines unit~s structurelles, i ou 2 r6sidus saccharidiques sont remplac6s p a r des p o n t s glucos i d o - m u r a m i n y l e s a s s u r a n t la liaison avec l'acide X-teichoique.

L'unit6 structurelle de la Fig. 2 a un poids mol6culaire d'environ 4500. Or, les fragments mucopeptidiques, hormis ceux associ6s ~ l'acide X-teichoique, r6sultant de la digestion enzymatique des parois doivent avoir un poids mol6culaire de quelques milliers (moins de IOOOO). En effet, ils ont la propri6t6 de se distribuer par dialyse dans les deux fractions, dialysables et non-dialysables (rdf. 6, Fig. i). La s6quence des acides aminds de l'unit6 structurelle de la Fig. 2 est diff6rente de celle trouv6e dans les pr6eurseurs des parois d'Escherichia coli TM ( A A M - A l a - G l u D A P - Ala - Ala) et de staphylococcus aureus 17 (AAM- Ala- G l u - Lys - Ala - Ala). L'~tude par SALTON13 de la fr6quence des groupes C et N terminaux prdsents dans 15 types de parois cellulaires bact6riennes, montre que les parois de B. megaterium constituent un cas assez exceptionnel caract6ris6 par la pr6sence de quantit6s fort 61ev6es de groupes C terminaux DAP. Mode d'association entre l'acide X-teichoique et le mucopeptide de base La composition chimique des acides X-teichoiques obtenus, d'une part, par extraction ~ la formamide et, d'autre part, par digestion enzymatique des parois bact& riennes (Tableau II), montre que l'acide X-teichoique et le mucopeptide de base sont associds par des ponts constitu~s de glucose et d'AAM. La nature de la liaison entre l'acide X-teiehoique et les ponts glucosido-muraminyles est encore inconnue. Elle est hydrolys6e par la formamide ~ 15 o°. D'autre. part, la liaison entre ces ponts et le mucopeptide de base est une liaison amidique entre le COOH de I'AAM du pont et un a - N H 2 alanine du mucopeptide. Elle est sensible/~ l'amidase de Streptomyces, La teneur en acides amin6s de l'acide X-teichoique obtenu par action du lysozyme (Tableau II) montre que 22 P (soit approximativement 2 moles d'acide X-teichoique) Biochim. Biophys. Acta, 63 (1962) 297--307

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sont associ6s A I unit6 structurelle h 4 r6sidus peptidiques du type de la Fig. 2. Une seule fonction a-NH~ alanine resterait donc disponible pour unir l'ensemble de ce complexe au mucopeptide de base. Ainsi, quoique les deux h6tdropolym~res soient pr6sents dans les parois de B. megaterium KM en proportion 6quimoldculaire, certaines unitds structurelles ~ 4 r6sidus peptidiques seraient associ6es/t plus d'acide X-teichoique que d'autres. Ce type de structure laisse entrevoir 1'existence,/t d'autres endroits du mucopeptide, de segments oligosaccharidiques (GIcNHAc-AAM) importants, non associds h des r6sidus peptidiques. 11 permet ainsi d'interpr6ter la libdration, sous l'action du lysozyme, d'unit6s disaccharidiques GlcNHAcfl i - 6AAM (voir rdf. 6).

Structure des troncs polysaccharidiques du mucopeptide de base Selon l'enzyme utilis6 pour la digestion des troncs polysaccharidiques des parois de B. megaterium KM et selon la prdparation de ces patois, l'acide X-teichoique iso16 est associ6 ~t des quantit6s plus ou moins importantes de r6sidus mucopeptidiques. Ceci indique que la frdquence et/ou la localisation des liaisons sensibles ~ chacun des enzymes est tr6s diff6rente dans une pr6paration de parois donn6e et peut varier d'une pr4paration ~ l'autre. La structure fine des troncs polysaccharidiques est donc beaucoup moins simple que ne le laissait prdvoir l'6tude de ses produits de d6gradation aux d6pens des parois de Micrococcus lysodeikticus ls,19. I1 est 6vident qu'une r6p6tition de GlcNHAc et d'AAM alternativement r6unis par des liaisons fi I -+ 4 et fl I -> 6 n'est pr6sente que dans des segments limit6s des troncs polysaccharidiques. De plus, aucune donn6e expdrimentale ne permet encore de pr6voir comment le glucose s'int6gre dans cette structure. REMERCIEMENT

Nous remercions le Dr. H. DIEU pour l'aide qu'il nous a apport6e dans la d6termination des constantes de s6dimentation et de diffusion.

RESUM]~

Les parois de Bacillus megaterium KM sont constitu6es de deux h6t~ropolym~res distincts. Le premier, d6nomm6 acide X-teichoique, a un poids mol6culaire voisin de ILOOO. I1 est constitu6 d'environ IO sous-unit6s contenant du P, du glucose et de la GlcNHAc dans les proportions I/2/1.3, ainsi qu'un polyol encore non pr6cis6. I1 ne participe pas ~ la rigidit6 de la paroi. Le second apparait comme un r6seau tridimensionnel form6 d'unit6s structurelles contenant quatre r6sidus mucopeptidiques de composition moyenne GlcNHAc 1AAM1-AI~.~o-Glul-DAP r Ils renferment 6galement du glucose. Ce mucopeptide constitue la structure de base de la paroi. Les deux h6t6ropolym6res sont prdsents en quantit6s 6quimol6culaires. Ils sont associ6s covalentiellement par l'interm6diaire de ponts glucosido-muraminyles dont l'union ~ certains r6sidus peptidiques du mucopeptide de base est r6alis6e par une liaison amidique. Biochim. Biophys. Acta, 63 (1962) 297-307

STRUCTURE DES PAROIS DE Bacillus

megaterium K M

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BBA 3689

T H E S T R U C T U R E OF C H I T I N G. N. RAMACHANDRAN AND C. R A M A K R I S H N A N

Department of Physics, University of Madras, Guindy, Madras (India) (Received J a n u a r y 24th, 1962)

SUMMARY

The structure factors for the various reflections of a-chitin have been calculated for both the structures of CARLSTROMand of DWELTZ. Comparison with observation does not indicate the definite superiority of one over the other, although CARLSTROM'S structure seems to be better from stereochemical considerations.

INTRODUCTION I n a r e c e n t c o m m u n i c a t i o n , CARLSTROM h a s c r i t i c i z e d t h e s t r u c t u r e s of a - c h i t i n a n d f l - c h i t i n p r o p o s e d f r o m t h i s l a b o r a t o r y b y DWELTZ 2,3. T h e m a i n c r i t i c i s m is t t l a t t h e p o l y s a c c h a r i d e c h a i n c o n f i g u r a t i o n is s t e r e o c h e m i c a l l y u n s a t i s f a c t o r y a n d t h a t it is n e c e s s a r y t o b u c k l e t h e c h a i n , as i n t h e s t r u c t u r e of c e l l o b i o s e 4, i n o r d e r t o a v o i d certain short contacts, in particular the H... H contact between the hydrogen atoms a t t a c h e d t o t h e c a r b o n a t o m s a d j a c e n t t o t h e b r i d g e o x y g e n (Fig. I a of CARLSTROM'S paper).

Biochim. Biophys. Acta, 63 (1962) 307-309