Synthese de polymeres a proprietes pharmacologiques

Europe~m Polymer Journul Vol, 17, pp. 801 to 805. 1981 Printed in Great Britain All rights reserved

0014-3057 81070801-05502,00 0 Copyright © 1981 Pergamon Press Ltd

SYNTHESE DE POLYMERES A PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES INTRODUCTION

DE SEQUENCE PEPTIDIQUE CHAINE LATERALE

EN

A . P L E U R D E A U , J. C . R A B A D E U X , H . G U E N I F F E Y

et C. LENUZ Facult6 des Sciences, Universit6 du Maine, Route de Laval, 72017 Le Mans C6dex, France [Recu le 23 decembre 1980)

R6sum6--L'introduction en chaTne lat6rale d'un r6sidu acide amin6 au sein de polym6res h propri6t6s pharmacologiques a 6t6 envisag6e. Deux voies ont 6t~ prospect6es: synth6se d'un monomere portant l'entit6 drogue-acide amin6 puis polym6risation; modification chimique d'un support polym6e par I'entit6 drogue-acide amin/:. Les drogues retenues dans cette 6tude sont des st6roides (cholest6rol testosthrone). Le r~sidu acide amin/~ introduit en chalne laterale est la L-lysine. La pr/~paration du motif drogue-acide aminb est r6aslisbe par r6action du dbriv6 chloroformiate du st~ro'ide sur la fonction amine en ~ de la lysine apr~s blocage de la fonction ~t acide amin/~ sous forme de complexe cuivrique. Le monom~re m6thacrylique est obtenu par r~action du chlorure de m6thacryloyle sur le motif drogue acide amin6. Les polymeres r6sultants sont caract6risds par i.r., RMN ~H et ~3C et par GPC. Des essais pharmacoIogiques sont actuellement en cours visant ~i mettre en 6vidence un effet retard dfi ~ un rel:~chement progressif de la drogue seule ou du motif drogue acide amin6 par hydrolyse chimique ou enzymatique au sein de l'organisme vivant auquel ces prodrogues macromol6culaires auront 6t6 administrSes.

INTRODUCTION

Le d6veloppement des recherches visant/t l'obtention de polym6res /l activit6 pharmacologique met en 6vidence rint6r6t que pr6sente la fixation de drogues sur support macromoleculaires. Les 6tudes effectu~es darts ce domaine, au Laboratoire, ont permis de d6finir une m6thodologie d'acc6s fi de tels eompos6s [1]. Cr6ation d'un site insatur6 (structures vinyliques, m6thacryliques} sur la drogue, sans alt6ration des sites d'int6r~t pharmacologique et polym6risation du monom6re form& Fixation de la mol6cule active sur un support polym6re fonctionnel avec cr6ation de liaisons covalentes drogue-polym6re sensibles A l'hydrolyse chimique et enzymatique. Condensation de mol6cules actives difonctionnelles ou de leurs d6riv6s. Ces voies ont 6t6 prospect6es/l partir de mol6cules actives prises dans la famille des st6rdides [2], des antipaludiques [3], des anticoagulants [4]. La diversit6 des cas 6tudi6s, en particulier au niveau des fonctionnalit6s du principe actif et de la nature de la liaison drogue-support, a permis une certaine g6n6ralisation des m6thodes pr6cedemment cit6es et la raise en 6vidence des crit&es fi retenir en fonction des propri6t6s pharmacologiques recherch6es. Les essais in vivo r6alis6s/l partir de telles prodrogues macromol6culaires tant sur le plan toxicit6 et immunog6nicit6 que celui de l'activit6 pharmacologique proprement dite ont permis de mettre en 6vidence, outre les propri6t6s traditionnelles de la drogue envisag6e, un net effet retard 1i6/l la lib6ration

progressive de la drogue dans I'organisme vivant suivant une cin~tique d'hydrolyse enzymatique compatible avec l'apparition d'un tel effet [5]. Cependant ces essais pharmacologiques font apparaTtre les limites d'utilisation de ces nouveaux types de m6dicamerits: ainsi l'hydrosolubilite et la biocompatibilit6 des prodrogues macromol6culaires sont des crit~res importants fi retenir et les m6thodes utilis~es conduisent souvent fi des produits non solubles dans les milieux biologiques. Afin de limiter les inconv6nients inh6rents /l la nature macromol6culaire du support, l'introduction de s~quences peptidiques au sein de polymSres A activit6 pharmacologique a ~t~ envisag~e. Les testes peptidiques peuvent ~tre introduits soit en chaine lat~rale et dans ce cas ils assureront essentiellement un r61e de spacer minimisant les interactions entre l'agent th~rapeutique et le support, soit au sein de la chalne macromol6culaire elle m~me ou ils joueront le r61e de z6ne susceptible d'am~liorer h la lois la biocompatibilit~ et la biod~gradabilit~ au sein de l'organisme lors de l'administration de la prodrogue. L'objectif vis~ par la pr6sente recherche est l'insertion d'un r6sidu acide amin~ entre le polym~re de nature synth&ique assurant le r61e de vecteur et la drogue. Les liaisons X et Y doivent ~tre hydrolysables enzymatiquement ou chimiquement: liaisons ur6thanne, amide, ester ou carbonate selon la nature de l'acide amin& de la drogue et des sites fonctionnels r6actifs presents sur le polym~re support (ou le monom~re correspondant). Les drogues ou molecules actives d~jfi 801

A. PLEURDEAUet al.

802 1

Polym~re vecteur

Liaison hydrolysoble R~sidu acide ornin6

Li.aison hydrolysoble J Drogue Fig. 1.

6tudi6es au cours des pr6cddentes 6tudes ont 6t6 reprises afin que des 616ments de comparaison puissent 6tre 6ventuellement 6tablis. Elles se rattachent la classe des st6ro'ides: cholest&ol, testost6rone. RgSULTATS ET DISCUSSIONS Le r~sidu acide amin~ choisi dans cette 6tude est la L-lysine. Outre que cet acide amin~ soit facilement assimil6 par l'organisme, il pr~sente plusieurs crit6res structuraux qui ont d6termin6 son choix par rapport A d'autres acides amines: les deux fonctions amine, en et 6, permettent la mise en oeuvre de r~actions de chimie organique entrainant la fixation d'une part de la drogue, d'autre part du site insatur6 polym6risable (double liaison m&hacrylique); la fonction acide, si elle reste libre, devrait favoriser l'hydrosolubilit6 du polym6re final; enfin, la possibilit6 de bloquer temporairement les fonctions acide et amine en a permet de mettre ~ profit la r6activit~ du troisi6me group¢ fonctionnel sans craindre des r6actions secondaires g6nantes. Les s6quences r6actionneUes envisag6es pour la synth~se des polym6res sont sch6matis6es dans la Fig. 2. La premiere phase consiste h synth~tiser l'entit6 drogue-acide amin~. Afin de pouvoir fixer s61ectivement le principe actif ou son d&iv6 sur la fonction amine, le blocage temporaire de l'acide ~ amin6 sous forme de complexe cuivrique (I) a 6t6 r~alis6 [5]. D'autre part les st6roi'des retenus sont transform6s en leurs d6riv6s chloroformiates (II) par action du phosgene en exc6s [7]. La r6action entre le chloroformiate et le complexe cuivrique de la L-lysine se fait ~t temperature ambiante, en presence de Na2CO3, et conduit au complexe cuivrique (HI) dans lequel la liaison ur6thanne est mise en ~vidence en i.r. par l'apparition d'une bande d'absorption A 1715cm -1. L'~tape suivante consiste en un d6blocage de la fonction acide amin6, par destruction du complexe cuivrique et obtention de l'acide amin6 libre correspondant (IV). Les caract~ristiques spectrales sont rassembi6es dans les Tableaux 1 et 2, et confirment la structure propos6e. La pr6sence de liaisons ur6thanne est mise en 6vidence en RMN. 1H par un p i c h 6, 15.10 -6 dans IVa et 3,85-10 -6 dans IVb, correspondant au proton du groupement - - N H - - . Voie A Sur cette entit6 drogue-acide amin6, le site polym6risable est cr66 par fixation sur le chlorure de m6tha-

cryloyle selon la m6thode de Schotten-Baumann [8]. La formation des compos6s attendus V e s t confirm6e par analyse spectrale i.r. et RMN. Les caract6risiques de V sont rassembl6es dans les Tableaux 3 et 4. L'apparition en i.r. d'une bande d'absorption h 1715 cm- 1 caract6ristique de la fonction carbonyle et en RMN tH de pics ~t 2.08, 5.60, 6.05 et 6,33.10 -6 attribuables aux protons m6thacryliques est en accord avec la structure propos6e. Ces monom6res V sont polym6ris6s par processus radicalaire en milieu benz6nique par action de I'AIBN comme amorceur. Les caract6ristiques des polym6res obtenus VI sont indiqu6es dans les Tableaux 5 et 6. Vole B L'autre m&hode consiste ~ proc6der par modification d'un polychlorure de m6thacryloyle h l'aide de l'entit~ drogue-acide amin~ IVb. Le polym~re initial soumis ~ modification poss6dait une masse mol6culaire Mn de 9900. I1 est trait6 par une solution de soude contenant l'entit6 L-lysine-testosthrone IV. La solution r6sultante est ensuite acidifi6e permettant l'obtention du polym6re VII. Les analyses 616mentaires et spectrales indiquent un taux de modification de 30~o. Les caract6ristiques des polym6res VII sont indiqu6es dans le Tableau 7.

CONCLUSION Par deux voies, monom6risation puis polym6risation d'une part, modification chimique d'un polym6re fonctionnel d'autre part, il a 6t6 possible d'obtenir des polym6thacrylates porteurs en cha]ne lat6rale du principe actif et d'un r6sidu acide amin6 (L-lysine). Malgr6 le choix d'un acide amin6 portant, une fois incorpor6 comme spacer, une fonction carboxylique, libre --CO2H, rhydrosolubilit6 des polym&es obtenus par l'une ou l'autre des voies reste faible. Ceci est vraisemblablement dfi h la pr6sence des squelettes st6ro'idiques. I1 conviendrait d'am61iorer cette propri6t6 d'hydrosolubilit6 par copolym6risation des monom6res m6thacryliques actifs obtenus par la voie A avec des comonom6res comme l'acrylamide ou l'acide acrylique. Cette 6tude est en cours et des 6chantillons de ces divers polym6res, porteurs du squelette de la testost6rone, seront soumis h des essais pharmacologiques in vivo. Les r6sultats pourront ~tre compar6s ~t ceux obtenus h partir d'autres supports polym6res porteurs du m6me principe actif [9], en particulier au niveau de l'effet retard 1i6 ~ la lib6ration de la drogue par hydrolyse des liaisons ur6thanne et amide pr6sentes. PARTIE EXPERIMENTALE

Diamino-2,6 hexanoate de cuivre (complexe cuivrique de la L-lysine) I

Treize g de sulfate de cuivre pentahydrate en solution aqueuse sont additionn6s sous agitation 18,2g. de chlorhydrate de L-lysine en solution dans 100 ml de soude 2N. Chloroformiates stdroi'diques lla,b [1] Fixation des chloroformiates lla,b sur I Synth~se de llla. 5,5' 10- 3 mol de I e s t additionn6e 1,1.10 -2 mol de l l a en solution dans le THF, en

Synth6se de polym6res a propri6t6s pharmacologiques

803

(~C;-O, /NH2 H2 N "("CH2~ C/H ,,~Cu,,,"~tCH"("CH2"~-4NH2 "NH 2 0-~) I

rr o,b NHe

(~j~- 0

O

O -(~ - HN"(- CH, "~'/~H _~CU I .CH-(-CH,-.~4NH- CO~ v ~ , 11 - x. ,," \_ I II U NHz O-C" 0 0 Tr'r o,b

l. H O/EDTA 2.HCI 3.No0H

o

J

-0-(~"CH, / -4--CHz~NH-~-0 O NH~ 1"O"a,b

ure de m~thocryloyle

NH-CH +CH z ~ N H - C - 0 " ~ -C02H H•I (~Hz)4

IAIB N

"0" O,b

NH I c

,

HN-~H "('CH,~NH-~-O CO~H

o

®

®

"~" o, b a : Cholest~'yl O

b: Testost~ryl

Fig. 2. pr6sence de Na2CO 3. Apr6s 4 hr sous agitation, la solution est laiss6e au repos pendant 3 jours. Le m61ange r6actionnel est pr6cipit6 dans l'6ther 6thylique, filtr6, lav6 h l'eau, au THF et h l'6thanol. Ilia se pr6sente sous forme d'une poudre bleue, insoluble dans les solvants organiques. Synthkse de lllb. Le mode op6ratoire est identique, mais le milieu r~actionnel est maintenu/t O.

Acides amings modifids IVa,b 2,3"10-3mol de IIIa en suspension dans 5Oral

d'eau est additionn6e fi 6,9.10- 2 mol de sel disodique de I'EDTA. La suspension chauff6e h 50 ° est maintenue sous agitation pendant 2 hr. Puis on additionne au milieu r6actionnel de l'acide chlorhydrique 4N' jusqu'h apparition d'une coloration verte indiquan', la destruction du complexe (pH -- 1). Le p H e s t ensuite ajust6 ~ 3 ~ par addition de soude en pastille. Le pr6cipit6 blanc r6sultant est filtrb lav6 h l'eau, ~t l'+ther 6thylique puis s6ch6 sous pression r6duite. Le mode op6ratoire est identique pour IVb. pF. (IVa) = 270°; pF. (IVb) = 220 °.

804

A. PLEURDEAUet al.

Tableaux 1 et 2. Caract6ristiques spectrales des entit6s L-lysine testost6rone et L-lysine cholest6rol CO2H

/ H~, RMN 6 × 10" ~H 100MHz

Ht~

Ht~

CD3CO.,D IVb

0.86 Is1

1.21 (sl

CsDsN IVa

0,70 (s~

1.08 is)

H2

CH

CH2-N

NH

~ H., 1

H~. ~:

0.88 (sl

0.95 (sl

H.

H4

H~,

H~

N

2,40 (ma)

5,85 (s)

4,60 (ma)

2.40 (real

4.60 (real

3,20 (real

5.45 Ima)

2,10 (real

4,90 (ma)

2,64 Id)

2,30 (real

3.40 (ma)

C1~

Cl~

CD3CO 2D lVb

12.45

17,61

C~ D ~N IVa

12.10

19,46

19.03

22.72 22.96

6.15 (ma)

4.10 (ma)

3370-2600 1715-1695 1680 1275

3,85 (ma)

5.76 (sl

3400-1720 1690-1270 1635

/ C~O 1 OH

N

C3

C~

C~

C~O ~ NH

203,21

123.93

--

159,11

175,58

51,02

74.07

-

123,98

159,99

164,06

50,45

C,~,_ 2~

C21

i.r. Ivcm -I)

O

/ RMN c~ x 100 t3C 20 MHz

NH 2 ou NH3

C CO

Tableaux 3 et 4. Caracteristiques spectrales du monom~re m6thacrylique porteur de la testost&one CO,H

/

H

CH RMN 6 × 10" IH CD~CO_,D Vb

NHCO

NHC

H

~ HI,

HI9 H~ 2

Hit ,

0.88 1,23 2.35 4.60 (sl (sl Ima) Ima)

H ~

N

CH 2 N

H4

O

4.30 Ima)

3.20 (ma)

5.88 (s)

5.48 (ma)

~C=C

~

0

CH3

C~C

8.10 (ma}

1.92 (sl

5.71 (s)

~

i.r. Icm -1)

H 6,22 (s}

3340-2800-2400 1730-1715-1695 1240 1620 965 945

N

/ CH RMN 6 x 100 3C C D 3CO_~D vb

C ~~

C ~,~

C3

C4

C=O Carbamate

C~O Acide

15,52

17,67

205,16

123,82

158.99

177,63

~ CO

C~O A mide

51,16

193.70

C~C 179.94 179.52

1 hr d'agitation, le milieu r6actionnel est acidifi6 par une solution d'acide chlorhydrique 4 N , jusqu'fi pH = 4. Le pr6cipit6 bleu de Va est r6cup6r6, lav6/l l'eau, ~t l'6ther 6thylique puis s6ch6 sous pression

Monom&es m(thacryliques Va,b A une suspension de 2,3"10-amol de IVa dans 40 ml d'une solution de soude 0,25 N est additionn6e 0 -~, un exc6s de chlorure de m6thacryloyle. Apr~s

Tableaux 5 et 6. Caract6ristiques spectrales des polym6res porteurs des entit6s L-lysine cholest6rol et L-lysine testost6rone COzH

/ CH RMN 6 × 10" ~H C~DsN ATFA Via

NHCO ~

H~ 0.63 (sl

H,~

H , , :-

0.85 (s)

Ht~

H,

Ha,

N

0.92

1.0

5,30-5.7

4.60 5.1

2.30

(sl

Is)

(ma~

(ma)

(ma)

CH3

0

NHCO

i.r. (vcm -t)

3.40

1.28

Ima)

(mal

4,60 5.10 (real

5.30 5.70 Ima)

3340-2750-2400 1720 1710 lz60 1685

CH.,--N

CO:H / CH RMN 6 x 10" IH DMSO VIb

NHCO ~

OH

Hl~

HL9

Ht-=

N

7,35 (mal

0,78 (ma)

1.15 (mal

4.40 {ma)

3.80 Ima)

CH2 2.90 (ma)

N

H.~

O

5.61 (ma)

5.39 Imal

NHCO

CH 3

i.r. ( v c m ~1

6.95 Imal

1.40 (mal

3350-1725-1700 1715 1670-1250

Synth6se de polym6res b. propri6t6s pharmacologiques

805

Tableau 7. Caract6ristiques spectrales du polym6thacrylate modifi6 par l'entit6 L-lysine testost6rone / RMN ii x I0" ~H DMSO Vllb

Ht~

HI9

CH 3

H4

HI~

CH2--N

NHCO ]~ O

0,76 Is)

1.12 (s)

1,37 (maJ

5,60 (s)

4,40 (real

2,92 (ma)

3,78 (ma)

rSduite. Les conditions op6ratoires sont identiques pour Vb. pF. (Va) = 120°; pF. (Vb) = 85 °.

Polymbres Vla,b A 0,25 g de m o n o m 6 r e Va, en solution dans le benz~ne est additionn6 l°J~ en poids d'AIBN. La solution est port6e au reflux du benz6ne p e n d a n t 24 hr. Le polym6re V i a est pr6cipit6 dans l'6ther de p6trole, filtr6, s6ch6 sous pression r6duite. Le mode op6ratoire est identique pour Vlb.

Modification chimique du polychlorure de m~thacryloyle VII A 0,26 g. de polychlorure de m6thacryloyle en solution dans le T H F (Mn = 9900; I = 2,4) est additionn6 2,67.10 -3 mol de IVb en solution dans de la soude 0,1 N. Apr6s 4 8 h r , /t 0 °, sous agit/ttion, le milieu r6actionnel est acidifi6 jusqu'/t pH = 3, par addition d'une solution d'acide chlorhydrique 4 N .

NHC I~ O 7,00 (ma)

N

CH ~ CO 4,21 [trl

CO2H

i.r. (cm J)

8.45 (ma)

3320-2200 2800 1725 1710-12501690

Apr6s filtration, le pr6cipitb est lav6 au THF, ~ l'eau e t / t r6ther 6thylique puis s6ch6 sous pression r6duite. BIBLIOGRAPHIE

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Abstract--Amino acids have been introduced on to the side-chains of a polymer. Two schemes have been studied : the first involves the synthesis of a monomer containing the amino acid drug moiety and subsequent polymerization; the second depends upon chemical modification of a polymer with the amino acid drug moiety. The drugs used in this study are steroids (cholesterol testosterone). The amino acid moieties introduced on to the side-chains are L-lysine. The preparation of the drug containing the amino acid is done by reacting the chloroformate derivative of the steroid with the amine function of the lysine subsequent to the blocking of the amino acid as a copper complex. The methacrylic monomer is obtained by reacting methacryloyl chloride with the drug amino acid moiety. The polymers were characterized by i.r., NMR (tH and ~3C) and GPC. Pharmacological tests are being performed to observe the effect due to the hydrolysis of the drug or the amino acid drug in living organisms.