Tests de diagnostic rapide et grandes endémies bactériennes

TESTS DE DIAGNOSTIC RAPIDE – Applications en infectiologie

Tests de diagnostic rapide et grandes endémies bactériennes Hélène Astier-Théfennea,*, Fabrice Biotb, Stanislas Rebaudetc, Renaud Piarrouxc, Eric Garnotela

RÉSUMÉ

SUMMARY

Les grandes épidémies historiques d’infections bactériennes, disparues des pays les plus développés, restent un véritable problème de santé publique dans les pays les moins favorisés. Dépourvus de moyens diagnostiques dans les zones les plus reculées, les tests de diagnostic rapide (TDR) seraient une alternative intéressante pour la mise ne place de mesures thérapeutiques et prophylactiques. Les différents TDR développés pour les méningites à méningocoques, le choléra, les shigelloses, la peste et la mélioïdose sont passés en revue. La plupart d’entre eux ne font l’objet que de développement dans des centres de recherche. Malgré des performances intéressantes, peu sont commercialisés. Leur manque de disponibilité limite les études de terrain déjà difficiles à réaliser.

Rapid diagnostic test and epidemics of bacterial infectious diseases The historic epidemics of bacterial infectious diseases, disappeared from the most developed countries, remain a real problem of public health in the least favored countries. Deprived by diagnostic capacities in remote areas, the TDR would be an interesting alternative to implement therapeutic and prophylactic control measures. The various TDR developed for meningococcal meningitis, cholera, shigellosis, plague and mélioïdosis are reviewed. Most of them are only developped in research centers. In spite of interesting performances, little are industrially produced. Their lack of availability limits field studies already difficult to realize.

Tests de diagnostic rapide – Neisseria meningitidis – Vibrio cholerae – Shigella – Yersinia pestis – Burkholderia pseudomallei.

1. Introduction Les grandes épidémies d’origine bactérienne ont marqué l’histoire, influencé les sociétés, intégré les religions. Représentées par le quatrième cavalier de l’Apocalypse, personnage céleste mentionné dans le Nouveau Testament, surmontant un cheval pâle, ces épidémies étaient associées à la mort et à la fin du monde. Ainsi, peste et choléra se sont répandus en Europe sous formes de vagues épidémiques successives dévastatrices. L’amélioration des conditions de vie et d’hygiène, la mise en place de mesures de contrôle efficaces en cas d’épidémies, l’apparition des antibiotiques ont permis la disparition de la plupart de ces maladies dans les pays les plus développés. Sont-elles devenues des maladies du passé évoquées dans les livres d’histoire de la médecine ? a Laboratoire de biologie Hôpital d’Instruction des Armées Laveran 34, bd Laveran – CS 50004 13384 Marseille cedex 13 b Département de biologie des agents transmissibles Unité de bactériologie-UMR-MD1 Institut de recherche biomédicale des Armées 91220 Brétigny-sur-Orge c Laboratoire de parasitologie Hôpital de la Timone (AP-HM) 264, rue Saint-Pierre 13385 Marseille cedex 5

* Correspondance [email protected] article ti l reçu le l 11 avril, il accepté té le l 15 avril il 2015 © 2015 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés.

Rapid diagnostic test – Neisseria meningitidis – Vibrio cholerae – Shigella – Yersinia pestis – Burkholderia pseudomallei.

Ces agents bactériens n’ont pas disparu et ont trouvé leur niche écologique dans les pays ne pouvant pas mettre en œuvre les moyens de lutte suffisant, dans des populations dénutries ou aux conditions d’hygiène précaire. Une lutte efficace contre ces maladies passe par le diagnostic précoce des cas dans un intérêt à la fois individuel par la mise en charge thérapeutique mais aussi collectif par la mise en place des mesures barrière (lutte contre la transmission, protection du sujet réceptif). Malheureusement, c’est justement dans ces pays que les moyens diagnostiques sont insuffisants notamment loin des capitales là où émergent ces maladies. Les méthodes de références font souvent appel à la culture, technique dont les moyens de laboratoire sont trop contraignants sur le plan logistique. Dans ce contexte, les TDR sont une alternative séduisante permettant un diagnostic simple, rapide, au plus près du patient, par un personnel soignant non spécialisé. Il s’agirait donc en toute logique de l’outil idéal. La réalité est plus complexe et un état des lieux est effectué pour les principaux agents bactériens responsables d’épidémies : les méningites à méningocoques, les agents des diarrhées (Vibrio cholerae et Shigella), Yersinia pestis et une bactérie mal connue car présente essentiellement en Asie du Sud-Est, Burkholderia pseudomallei, responsable de la mélioïdose. Tous ces TDR, contrairement à ceux développés en virologie recherchent les antigènes des agents infectieux.

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2. Les méningites à Neisseria meningitidis

3. Le test Pastorex

Les méningites restent un problème de santé publique préoccupant avec 1 M de cas par an dans le monde et une forte mortalité [1]. Trois agents étiologiques dominent cette maladie : Neisseria meningitidis (Nm), Streptococus pneumoniae et Haemophilus influenzae. L’Afrique regroupe à elle seule 50 % des cas. Le méningocoque de par son mode de transmission est responsable d’épidémies saisonnières meurtrières dans toute la région sahélienne qui va du Sénégal à l’Éthiopie formant l’historique ceinture de la méningite de Lapeyssonie, touchant 22 pays et 430 M d’habitants. Si le sérogroupe A reste dominant à 80 %, d’autres circulent également et notamment le sérogroupe W135 introduit en Afrique depuis 2002 mais aussi X et Y. Pour faire face à ces épidémies, l’OMS a mis en place une stratégie qui consiste en une détection précoce de l’épidémie et la mise en œuvre rapide d’une vaccination de masse avec un vaccin approprié. Pendant très longtemps, les épidémies étaient dues à Nm A, la réponse faisait alors appel au vaccin polysaccharidique AC largement disponible. L‘émergence des autres sérogroupes a modifié cette stratégie et conduit les laboratoires à l’élaboration d’autres valences vaccinales avec le vaccin ACW135. Par ailleurs, des vaccins conjugués du fait de leur efficacité durable ont vu le jour avec le C en Europe mais surtout le A conjugué plus destiné à l’Afrique (MenAfriVac®). Du fait de leur coût de fabrication et de leur utilisation plus conjoncturelle, leur disponibilité est moindre. Il est donc indispensable à l’échelon le plus périphérique des structures de santé d’avoir les moyens d’une surveillance des sérogroupes circulant afin d’adapter la réponse vaccinale. En Afrique, le diagnostic biologique des méningites est souvent limité. L’examen direct du LCR nécessite des moyens (microscope, colorants), de l’expérience et reste difficile. Dans l’étude de Borel, 42 % des résultats sont rendus douteux [2]. Si les techniques de référence restent la culture puis le sérogroupage par immun sérum et maintenant la PCR (polymerase chain reaction), ces analyses ne sont mises en œuvre que dans les capitales, les grandes villes ou les rares centres de référence. La culture est difficile : bactérie fragile, délais d’acheminement trop longs, contamination des prélèvements, traitements antibiotiques préalables. La PCR (diagnostic, sérogroupage) s’est imposée dans les centres de référence : elle permet le diagnostic des autres agents des méningites, présente des performances excellentes notamment avec les techniques de Nested PCR [3] et elle s’affranchit des délais et des conditions de température lors de l’acheminement des prélèvements. Elle est largement utilisée au Niger. Pour pallier le défaut d’accessibilité des techniques de référence et pour un diagnostic au niveau des centres de santé les plus périphériques, deux tests de diagnostic rapide existent actuellement mettant en œuvre une technique d’agglutination de particules de latex ou une technique d’immunochromatographie sur membrane. Dans les deux cas, la cible est le polysaccharide capsulaire qui est à la fois le plus abondant dans le LCR mais aussi celui qui détermine le sérogroupe de Nm.

Le test Pastorex (Bio-Rad) est une technique bien connue des hôpitaux. Ses indications restent très limitées même exceptionnelles pour un diagnostic individuel du fait de sa faible sensibilité et spécificité. Le problème est différent dans le cadre d’un diagnostic en situation épidémique. La technique consiste à porter à ébullition le LCR pendant 3 min puis, après centrifugation, réaliser l’agglutination avec le surnageant. Elle permet le diagnostic des autres agents des méningites et notamment le pneumocoque fréquent au cours des épidémies à Nm mais ne permet pas de différencier les sérogroupes W135 et Y même si ce dernier reste rare. La technique peut être réalisée facilement en 30 min par un opérateur non spécialisé. L’agglutination est parfois difficile à interpréter [4]. Cette technique nécessite cependant un minimum de matériel souvent absent même si le coût est modéré : centrifugeuse et bain-marie. Les inconvénients majeurs sont le respect de la chaîne du froid difficile à assurer en zone sahélienne, le délai de péremption après ouverture et le coût de ces réactifs.

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3.1. La technique

3.2. Les performances Les études de performances lors d’une utilisation sur le terrain sont rares et toujours réalisées dans des laboratoires de référence. Au Niger, lors d’une épidémie en 2006 où le sérogroupe A représentait 99 % de souches de Nm, la technique a révélé une sensibilité (Se) à 88 % et une spécificité à 93 % pour le Nm A [2] sur 484 LCR. Une autre étude sur LCR congelés et collectés entre 2002 et 2004 au Niger et Burkina Faso [5], permettant le recrutement du sérogroupe W135, a montré des résultats équivalents pour Nm A (Se : 87 % ; Sp : 93 %) et pour les sérogroupes Y/W135 une Se de 85 % et Sp de 97 % [5]. Les valeurs prédictives positives et négatives ont été évaluées en fonction du sérogroupe et du taux de prévalence de Nm dans les méningites (tableau I). L’absence de matériel pour prétraiter le LCR a conduit dans certaines circonstances à l’utilisation du réactif Pastorex directement sur le LCR. On observe alors une chute des performances avec une Se à 69 % et une spécificité à 81 % [5] rappelant la nécessité absolue du prétraitement dont l’objectif est d’extraire le polysaccharide capsulaire de la bactérie.

Tableau I – Évaluation des valeurs prédictives positives et négatives du réactif Pastorex en fonction du taux de prévalence d’un sérogroupe selon le taux de prévalence (situation épidémique ou non) de ce sérogroupe parmi les patients victimes de méningite. Situation épidémique (70 % de Nm)

Hors situation épidémique (20 % de Nm)

Nm A

Nm W135

Nm A

Nm W135

VPP

97 %

99 %

75 %

89 %

VPN

75 %

73 %

97 %

96 %

D’après [5].

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4. L’immunochromatographie

Figure 1 – Interprétation des TDR pour le diagnostic de Nm mis au point par l’Institut Pasteur.

Plus proche d’une réalité de terrain, de véritables tests de diagnostic rapide par immunochromatographie sur membrane ont été développés par l’Institut Pasteur.

4.1. La technique Ces TDR utilisent des anticorps monoclonaux (Ac mc) conjugués à des particules d’or colloïdal. Ces Ac mc ont été obtenus après sélection d’hybridomes produits par des souris immunisées par l’injection de polysaccharides capsulaires des sérogroupes A, C, Y et W135 [1]. Les Ac mc dirigés contre A, C et Y sont spécifiques de groupe. En revanche, l’Ac mc dirigé contre W135 présente une réaction croisée avec le sérogroupe Y. Ainsi le test a été élaboré à l’aide de 2 bandelettes : l’une comportant les Ac mc contre A et Y/W135 et l’autre contre C et Y. L’analyse nécessite d’utiliser les deux bandelettes et l’interprétation se fait selon la figure 1. La technique est simple : un volume de 150 à 200 μL (7 gouttes) est déposé dans un tube à hémolyse et la bandelette introduite verticalement. La lecture se fait après 10 à 15 min Comme tous les TDR, une bande faible non spécifique peut apparaître tardivement. Une bande contrôle permet de valider la migration. Le témoin positif est constitué d’une suspension de souches de référence (à 108 UFC/mL). La limite de détection est de 105 UFC/mL quel que soit le sérogroupe. Ces tests ne sont actuellement pas commercialisés et produits par l’Institut Pasteur de Paris (production des Ac mc) et le Centre de recherche médicale et sanitaire de Niamey (CERMES) (dépôt des Ac mc sur les bandelettes). Ils sont produits de façon irrégulière, avant la saison sèche et distribués au Niger dans le cadre de la surveillance des méningites ou lors d’évaluations. Une étude de stabilité a montré un maintien des performances après une conservation de 3 semaines à 60 °C qui selon les auteurs peut s’extrapoler à 2 ans à 25 °C [1]. Le test doit être cependant gardé à l’abri de l’humidité dans des étuis étanches.

D’après [5].

tation de ces tests permettant à des infirmiers après une formation rudimentaire d’une journée de pouvoir les réaliser avec une bonne fiabilité. Les études de Se et Sp ont été réalisées essentiellement sur les sérogroupes A et W135 et sont représentées dans le tableau II. Sur des souches de référence et de petits effectifs, les Se et Sp pour C et Y paraissent excellentes [1]. Une évaluation en Europe où le sérogroupe C est bien représenté serait intéressante. Dans l’étude de 2007 au Burkina Faso [3], on observe une baisse des performances du test sur le sérogroupe A. Après analyse, il s’agissait d’un défaut de stabilité de l’Ac mc utilisé [7]. L’utilisation d’un autre hybridome et donc d’un autre Ac mc a permis la réalisation sur LCR congelés d’une étude récente avec un fort effectif notamment en W135, ce qui n’était pas le cas dans les études précédentes [7]. La Se et Sp globale pour Nm A et W135 sont respectivement de 91 et 85 %. Les performances n’ont pas été calculées séparément pour les deux sérogroupes. Enfin, il faut souligner le caractère indispensable mais difficile des évaluations des TDR sur le terrain : dans l’étude de Collard [7], un plus grand nombre de LCR sont positifs en TDR qu’en PCR conventionnelle (61 % vs 53 %) ; dans celle de Rose [3], à côté de la PCR conventionnelle, une PCR plus performante (Nested PCR) a été aussi utilisée comme test de référence, et, dans ces conditions, la Se du TDR passe de 70 % à 31 % [3].

4.2. Les performances L’étude de leur performance a fait l’objet de peu de publications du fait de la faible disponibilité des tests. Dans certaines études, les TDR ont été réalisés à la fois sur le terrain par les infirmiers qui effectuaient les ponctions lombaires et dans des laboratoires de référence. La concordance des résultats est excellente (93 % [6], 95 % [7]) soulignant la facilité de réalisation et d’interpré-

Tableau II – Se et Sp des TDR, réalisés en laboratoire de référence, calculées dans les différentes études. Réf. Pays Année Effectif

Chanteau [1]

Boisier [6]

Rose [4]

Rose [3]

Collard [7]

Niger 2003-5

Niger 2006

Niger 2006

Burkina Faso 2007

Niger 2008-12

517 LCR

527 LCR

517 LCR

126 LCR

268 LCR

A

W135

A

W135

A

A

A

W135

255

48

110

9

73

43

704

416

Se %

94 (90-96)

100 (92-100)

87 (80-92)

Sp %

97 (94-98)

99 (98-100)

Sérogroupe Effectif

89 (57-98)

93 (90-95)

2095 LCR

88 (80-95)

70 (65-82)

91 (90-93)

68 (48-75)

97 (93-99)

85 (82-87)

Les résultats sont donnés avec un IC de 95 %. Le test de référence pour le calcul est la PCR multiplex et/ou la culture.

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Tableau III – Liste non exhaustive des tests de diagnostic rapide du choléra disponibles sur le marché international. Produit

Compagnie

Type de test

Prélèvements recommandés

Sérogroupes testés

Sensibilité Évaluation et spécificité disponible indiquées par dans la le fabricant littérature

Site internet

Crystal VC

Span Diagnostics Ltd., Inde

CIA

Selles

V. cholerae O1 et O139

Oui

Oui

http://www.span.co.in/ProductList/ProductDetails/ REAGENTS/279-Crystal_VC_%28Dipstick%29.HTM

One Step V. cholera O1/ O139 Antigen Test

Standard Diagnostics, Inc., Corée

CIA

Selles

V. cholerae O1 et O139

Oui

Oui

http://www.standardia.com/en/home/product/rapid/ infectious-disease/Cholera_Ag_O1-0139.html

SMART ™ II Cholera O1

New Horizons Diagnostics, USA

CIA

Selles fraiches ou congelées

V. cholerae O1

Non

Oui

http://www.nhdiag.com/cholera_bt.shtml

SMART ™ II Cholera O139

New Horizons Diagnostics, USA

CIA

Selles fraiches ou congelées

V. cholerae O139

Non

Oui

http://www.nhdiag.com/cholera_bt.shtml

V. cholerae Combo Test Kit

Artron Laboratories Inc., Canada

CIA

Selles, eau

V. cholerae O1 et O139

Non

Non

http://artronbio.com/index.php/InfectiousDiseases_ spanish.html

Vibrio Cholera O139 (VCO139) Test Kit

Artron Laboratories Inc., Canada

CIA

Selles, eau

V. cholerae O139

Non

Non

http://www.alibaba.com/product-detail/VibrioCholerae-O139-Test-Kits_110360606.html

Vibrio Cholera O1 Ogawa (VCO1-O) Test Kit

Artron Laboratories Inc., Canada

CIA

Selles, eau

V. cholerae O1 Ogawa

Non

Non

http://www.alibaba.com/product-detail/VibrioCholerae-O1-Ogawa-Test-Kits_110360605.html

Vibrio Cholera O1 Inaba (VCO1-I) Test Kit

Artron Laboratories Inc., Canada

CIA

Selles, eau

V. cholerae O1 Inaba

Non

Non

http://www.alibaba.com/product-detail/VibroCholerae-O1-Inaba-Test-Kits_110360598.html

AccuTest™ VIBRIO CHOLERAE RAPID TEST

DTA Pty Ltd, Afrique du Sud

CIA

Selles

V. cholerae

Non

Non

http://www.drugtesting.co.za/docs/AccuTest%20 Cholera%20Insert.pdf

Vibrio cholerae Colloidal Gold rapid test kit

Hangzhou Eastbiopharm Co., Ltd., chine

CIA

Selles, eau, nourriture

V. cholerae O1

Non

Non

http://eastbiopharm.en.alibaba.com/ product/814918955-219208978/Vibrio_cholerae_ Colloidal_Gold_rapid_test_kit.html

Vibrio cholerae Colloidal Gold rapid test kit

Hangzhou Eastbiopharm Co., Ltd., chine

CIA

Selles, eau, nourriture

V. cholerae O139

Non

Non

http://eastbiopharm.en.alibaba.com/ product/814918955-219208978/Vibrio_cholerae_ Colloidal_Gold_rapid_test_kit.html

One Step Vibrio Cholera Test

Blue Cross BioMedical (Beijing) Co., Ltd., Chine

CIA

Selles, eau

?

Non

Non

http://www.bcbmcn.com/en/pro_info.aspx?id=263

One Step Vibrio Cholera O1 Ogawa (VC O1) Test

Blue Cross BioMedical (Beijing) Co., Ltd., Chine

CIA

Selles, eau

V. cholerae O1 Ogawa

Non

Non

http://www.bcbmcn.com/en/pro_info.aspx?id=263

One Step Vibrio Cholera O1 Inaba (VC O1) Test

Blue Cross BioMedical (Beijing) Co., Ltd., Chine

CIA

Selles, eau

V. cholerae O1 Inaba

Non

Non

http://www.bcbmcn.com/en/pro_info.aspx?id=263

One Step Vibrio Cholera O139 (VC O139) Test

Blue Cross BioMedical (Beijing) Co., Ltd., Chine

CIA

Selles, eau

V. cholerae O139

Non

Non

http://www.bcbmcn.com/en/pro_info.aspx?id=263

CIA

*

V. cholerae O1 et O139

Non

Non

http://french.alibaba.com/product-gs/vibriocholerae-o1-o139-colloidal-gold-rapid-testkit-1243174528.html

Vibro. cholerae o139/o1 Nantong Diagnos ogawa& o1 inaba combo. Biotechnology Co., test Ltd., Chine Vibrio cholerae O1 Antigen Rapid Test

Nanjing Liming Bio-Products Co., Ltd.,Chine

CIA

Selles

V. cholerae O1

Non

Non

http://french.alibaba.com/product-gs/ strongstep-vibrio-cholerae-o1-antigen-rapid-testdevice-585642871.html

One Step Vibrio Cholera O1 (Ogawa) Test kit

Gemc Technology (Zhengzhou) Co., Ltd., Chine

CIA

Selles, eau

V. cholerae O1

Non

Non

http://www.alibaba.com/product-detail/One-StepVibrio-Cholera-O1-Ogawa_1706594544.html

Rapid V.Cholerae O1/ O139 Dual Test Kit

Xiamen Boson Biotech Co., Ltd., Chine

CIA

Selles, eau, nourriture

V. cholerae O1 et O139

Non

Non

http://bosonbio.en.alibaba.com/ product/369237831-200702332/Rapid_V_ Cholerae_O1_O139_Dual_Test_Kit.html

Rapid V.Cholerae O1 Test Kit

Xiamen Boson Biotech Co., Ltd., Chine

CIA

Selles, eau, nourriture

V. cholerae O1

Non

Non

http://bosonbio.en.alibaba.com/ product/369237831-200702332/Rapid_V_ Cholerae_O1_O139_Dual_Test_Kit.html

Rapid V.Cholerae O139 Test Kit

Xiamen Boson Biotech Co., Ltd., Chine

CIA

Selles, eau, nourriture

V. cholerae O139

Non

Non

http://bosonbio.en.alibaba.com/ product/369237831-200702332/Rapid_V_ Cholerae_O1_O139_Dual_Test_Kit.html

Vibrio Cholera Rapid Test Kits (LJ-MS-11)

Guangdong Lejin Medicine Co. Ltd., chine

CIA

Selles, eau

?

Oui

Non

http://lejinmedicine.en.made-in-china.com/product/ xvLmazROvDcP/China-Vibrio-Cholera-Rapid-TestKits-LJ-MS-11-.html

Cholera SMART™ DFA New Horizons (Direct Fluorescent Assay) Diagnostics, USA

DFA

Selles, eau, nourriture

V. cholerae O1

Oui

Oui

http://www.nhdiag.com/cholera01.shtml

Bengal SMART™ DFA New Horizons (Direct Fluorescent Assay) Diagnostics, USA

DFA

Selles, eau, nourriture

V. cholerae O139

Oui

Oui

http://www.nhdiag.com/cholera01.shtml

DFA, immunofluorescence directe. CIA, immunochromatographie.

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TESTS DE DIAGNOSTIC RAPIDE – Applications en infectiologie

4.3. La stratégie La circulation en Afrique des sérogroupes A et W135 et en parallèle la présence de vaccins dont les valences ne couvrent pas systématiquement ces deux sérogroupes justifient une surveillance rapprochée de leur circulation. De plus, la vaccination de masse engagée en Afrique par le vaccin conjugué A (objectif de 300 M de personnes vaccinées en 2016) efficace également sur le portage rhinopharyngé, risque de modifier par la pression immunitaire la circulation des sérogroupes actuels [8]. D’autre part, étant donné la performance des tests, il pourrait être envisagé de les utiliser également au lit du malade pour un diagnostic individuel et la prise en charge thérapeutique [8] d’autant plus qu’un TDR pour le diagnostic du pneumocoque existe déjà et pourrait être utilisé en parallèle. Ces nouvelles stratégies passent par des préalables indispensables : la prise en charge par les industriels de la fabrication de ces tests et leur commercialisation à un prix raisonnable, l’identification de laboratoires de référence mettant en place un système d’assurance qualité, le positionnement de ces TDR dans la stratégie du diagnostic collectif et individuel des méningites en Afrique.

5. Les épidémies de choléra

Pour pallier ce déficit, des tests de diagnostic rapide (TDR) réalisables au lit du malade et fournissant un résultat en quelques minutes ont été développés au cours des vingt dernières années. Compte-tenu de leurs caractéristiques intrinsèques non optimales, ces tests ne sont pas destinés à remplacer la confirmation du choléra par culture. La plupart des TDR-choléra disponibles sur le marché sont des bandelettes fonctionnant selon le principe de l’immunochromatographie (CIA). Ces tests n’utilisent qu’un seul réactif, sont d’utilisation facile et ne coûtent « que » 1 à 2 US$ l’unité. Il existe aussi des tests basés sur la coagglutination (COAT) ou sur l’immunofluorescence directe (DFA) (tableau III). Ces différents TDR ont essentiellement été développés par l’Institut Pasteur (France) puis l’entreprise Span Diagnostics Ltd qui commercialise les Crystal VCTM, ainsi que New Horizon Diagnostics Co (firme américaine émanant de l’Université du Maryland). Une vingtaine de publications présentent l’évaluation de leurs performances selon des protocoles variés [14-33] souvent problématiques [34]. Selon les études, les sensibilités et spécificités mentionnées pour les tests CIA s’échelonnent respectivement de 65,6 % à 100 % et de 43,8 % à 100 %. Notons que les valeurs de 100 % de sensibilité et de spécificité ne sont atteintes que dans de petites séries, et généralement après une étape d’enrichissement des échantillons difficilement applicable sur le terrain. Après méta-analyse portant sur 4 386 échantillons cliniques, la sensibilité (Se) globale des tests CIA apparaît bonne 92,7 % [91,693,8] mais leur spécificité est moyenne 78,3 % [76,6-80,0], soit un diagnostic odds ratio (DOR) globalement bon à 52,3 [41,5-65,9] (figure 2). Ces performances apparaissent

Le choléra est une diarrhée hydrique sévère volontiers épidémique, causée par des Vibrio cholerae O1 (ou O139, rarement retrouvé en Asie du Sud) producteurs de la toxine cholérique. Selon les estimations hautes les plus fréquemment citées, il occasionnerait de 3 à 5 millions de cas et de 100 000 à 120 000 décès dans les pays où l’accès à une eau potable et à l’assainissement ne sont pas assurés [9, 10]. La réalité se situe très probablement en deçà de ces Figure 2 – Méta-analyse portant sur 13 études ayant évalué chiffres mais bien au-delà des quelques centaines les caractéristiques de TDR immunochromatographiques (CIA) de milliers de cas et quelques milliers de décès pour le Vibrio cholerae sur des échantillons cliniques. suspects officiellement notifiés à l’OMS, essentiellement en provenance du continent africain et, depuis 2010, d’Haïti [11]. Estimer l’incidence du choléra est d’autant plus compliqué qu’une partie des cas échappe aux systèmes de surveillance de ces pays, ou bien, comme dans divers pays d’Asie, ne sont pas déclarés [12]. Le diagnostic des cas de choléra repose généralement sur une définition syndromique peu spécifique. Par exemple, à peine 62 % des 2 703 cultures de selles réalisées au Laboratoire national de Santé publique d’Haïti au cours des 2 premières années de l’épidémie se sont avérées positives pour le V. cholerae O1 [13] montrant ainsi que même en phase épidémique, le diagnostic clinique de choléra est souvent posé en excès. La culture de selles réalisée sur un milieu de type TCBS (thiosulfate-citrate-bile-saccharose) suivie de l’isolement des V. cholerae suspects, de leur identification phénotypique (sérogroupage O1/O139, biotypage El Tor, puis serotypage Inaba/Ogawa/ Hikojima) et d’un antibiogramme, constitue en effet la méthode de référence. Malheureusement, celle-ci s’avère difficile à réaliser faute de laboAnalyse portant sur 4 386 échantillons après exclusion 3 études aux données insuffisamment précises, et réalisée sous R 3.1.1 avec le package metafor et un modèle à effets fixés. Diagnostic odds ratios >10 ratoires spécialisés opérationnels en nombre habituellement considérés comme bons. suffisant dans les pays affectés par le choléra. REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - JUILLET/AOÛT 2015 - N°474//

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significativement meilleures pour les V. cholerae O139 que pour les O1 et lorsque les TDR sont réalisés après enrichissement des prélèvements (notamment des écouvillons) dans de l’eau peptonée. La spécificité des tests CIA s’est montrée significativement supérieure lorsqu’effectués par des techniciens au laboratoire (89,4 % [87,5-91,0 %]) plutôt que par des cliniciens au lit du malade (63,9 % [60,837,0 %]). De manière surprenante, les caractéristiques du Crystal VC en laboratoire (Se = 84, 4 % [80,9-87,5 %] ; Sp = 87,2 % [82,3-91,2 %] ; DOR = 31,2 [18,7-52,2]) apparaissent inférieures à celle de l’IP Dipstick, qui était développé par l’Institut Pasteur avant transfert de technologie (Se = 96,1 % [94,3-97,5 %] ; Sp = 88,8 % [86,5-90,8 %] ; DOR = 125,0 [78,0-200,4]). Néanmoins, la sensibilité du Crystal VC semble moins affectée par la prise préalable d’antibiotiques que celle de la culture de selles, et apparaît meilleure dans les cas graves que dans les cas les moins sévères [21]. En contexte de campagne de vaccination orale contre le choléra, il a été observé une fréquente positivation des TDR Crystal VC dans les 24 h suivant la vaccination [30]. Enfin, des expériences en laboratoire suggèrent une utilisation possible de ces tests pour la détection des V. cholerae O1 dans les eaux de surface après enrichissement préalable [32]. D’autres TDR immunochromatographiques (CIA) sont également disponibles sur le marché (liste non exhaustive dans le tableau III). Cependant, en l’absence de données d’évaluation satisfaisantes présentées, l’utilisation de la plupart d’entre eux sur le terrain doit être considérée avec réserve. Du fait des faibles performances de ces tests, en particulier lorsqu’ils sont réalisés au lit du malade, le résultat d’un TDR ne permet ni d’affirmer, ni d’éliminer un diagnostic de choléra chez un individu donné. De plus, l’utilisation à large échelle des TDR pour suivre l’évolution d’une épidémie pose en pratique un certain nombre de problèmes sur le terrain. L’achat, le stockage et la diffusion des tests, la formation des prestataires, et le recueil des résultats peuvent s’avérer complexes et coûteux. Un stockage non optimal et une formation insuffisante peuvent être la source de résultats souvent aberrants : tests invalides, nombre inapproprié de tests positifs O139, etc. L’interprétation d’un résultat positif avec la bande O139, présente sur les tests les plus utilisés, s’avère difficile dans les contextes d’épidémies à V. cholerae O1. Tenant compte de ces limites, quelques indications peuvent être cependant retenues. Réalisés de manière groupée lors de l’investigation de l’émergence d’une flambée suspecte, ils peuvent fournir des premiers arguments en faveur ou en défaveur du choléra en attendant la confirmation par culture. Ainsi, en cas de flambée de diarrhée aiguë aqueuse, le résultat cumulé d’une dizaine de TDR peut permettre de retenir (≥ 8 positifs) ou de rejeter (≤ 4 positifs) le diagnostic de choléra avec une probabilité acceptable, en attendant le résultat des cultures [35]. Dans le cadre du suivi d’une épidémie, les valeurs prédictives positive et négative des TDR varient fortement en fonction de la prévalence suspectée du choléra, qui s’avère très hétérogène dans l’espace et le temps. En contexte de faible transmission et de moyens de prévention limités en milieu communautaire, il peut ainsi être légitime de ne

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cibler les réponses que sur les zones de provenance de patients dont les TDR sont positifs. Cependant, dans un tel contexte, seule la confirmation par culture permettra d’estimer correctement l’incidence réelle du choléra et le cas échéant, de s’assurer de l’arrêt de l’épidémie. En conséquence, lors d’une épidémie de choléra, il reste indispensable de renforcer la surveillance syndromique du choléra, de prélever régulièrement des échantillons de selles et de les acheminer vers des laboratoires, que des tests rapides soient disponibles ou non.

6. Les shigelloses La shigellose est une infection intestinale invasive aiguë provoquée par des entérobactéries appartenant au genre Shigella qui se manifeste cliniquement par une diarrhée souvent sanglante. Il existe quatre espèces, chacune subdivisée en sérotypes. Les espèces les plus importantes sont S. flexneri sérotype 2a, responsable des formes endémiques et S. dysenteriae sérotype 1, responsable d’épidémies brutales et graves, dans les pays en développement. S. sonnei, moins virulente, est prévalente dans les pays développés. Si elle n’est pas la plus fréquente des maladies diarrhéiques, la shigellose dans sa forme dysentérique est la plus sévère. On estime le nombre de cas annuels à 164,7 M, dont 163,2 M dans les pays en développement et 1,5 M dans les pays industrialisés. Les shigelloses tuent chaque année 1,3 M de personnes dans les pays en développement dont 61 % d’enfants de moins de 5 ans [36]. Les shigelles sont transmises par voie féco-orale. Ce sont des bactéries particulièrement virulentes : 10 à 100 bacilles suffisent à provoquer la maladie. L’homme est le seul réservoir et la transmission interhumaine est le plus souvent directe. Les manifestations cliniques des shigelles sont liées à un phénomène invasif auquel s’ajoute pour S. dysenteriae sérotype 1 la sécrétion d’une toxine (ou shiga toxine), cytotoxique, responsable de complications telles que le syndrome hémolytique et urémique [37]. À la différence des autres maladies diarrhéiques, la shigellose ne peut être traitée par la seule réhydratation et une antibiothérapie est recommandée, ce qui souligne l’importance du diagnostic étiologique. L’intérêt du traitement est de diminuer le portage et la contagion, de réduire la durée des symptômes et les risques de complications. Cependant, le traitement est compliqué par l’émergence de souches multirésistantes, particulièrement pour S. flexneri et S. dysenteriae 1. Ces souches apparaissent fréquemment résistantes à tous les antibiotiques dits de première ligne (ampicilline, tétracycline, sulfaméthoxazole-triméthoprime, chloramphénicol, acide nalidixique), nécessitant l’usage d’antibiotiques plus coûteux (fluoroquinolones et céphalosporines de 3e génération). À ce jour, les fluoroquinolones ont été actives vis-à-vis de Shigella, mais des flambées dues à des souches de S. dysenteriae 1 résistantes à ces antibiotiques ont été observées en Asie et en Afrique [38]. Des résistances à la ceftriaxone ont aussi été rapportées en Asie pour S. flexneri et S. sonnei [38]. Les selles diarrhéiques contiennent de 106 à 108 Shigella par gramme. Une fois excrété, le bacille est très sensible

TESTS DE DIAGNOSTIC RAPIDE – Applications en infectiologie

aux conditions environnementales et meurt rapidement, surtout s’il est exposé à la dessiccation ou à la lumière solaire directe, au changement de température et de pH. C’est pourquoi, l’analyse bactériologique des prélèvements par des méthodes conventionnelles (isolement et identification des shigelles par coproculture) doit être effectuée dans les 2 à 4 heures suivant leur recueil. Si les échantillons doivent être conservés, ils seront placés dans un milieu de transport (glycérol tamponné en soluté salin ou milieu de Carry-Blair). Ceci nécessite de disposer d’un laboratoire de bactériologie, situation rare en zone tropicale. Par ailleurs, le diagnostic nécessite un délai de 48 heures. L’intérêt de disposer de tests de diagnostic rapide (TDR), simples, fiables, facilement utilisables sur le terrain est donc majeur, notamment pour orienter le praticien vers le traitement adéquat dans les meilleurs délais et limiter ainsi la propagation d’une épidémie. C’est pourquoi, l’Institut Pasteur a développé des TDR basés sur une technique d’immunochromatographie sur membrane [39-41]. Ils se présentent sous forme d’une bandelette directement introduite dans un tube contenant les selles du malade (diluées dans de l’eau distillée pour les selles non liquides). Il est aussi possible de travailler à partir d’un écouvillonnage rectal déchargé 2 minutes dans un tube contenant 500 μL d’eau distillée [41]. Au bout de 5 à 15 minutes, l’apparition ou non de deux traits rouges signe la présence ou l’absence de la bactérie, chaque bandelette comprenant une zone contrôle constituée d’Immunoglobulines G anti-souris permettant de valider la migration et une zone spécifique de la shigelle à détecter. Il existe actuellement des TDR pour le diagnostic des shigelloses à S. flexneri sérotype 2a, à S. dysenteriae sérotype 1 et à S. sonnei. Ils sont basés sur la détection du lipopolysaccharide et plus particulièrement de l’antigène somatique O, constitué d’unités répétées d’oligosaccharides définissant le sérotype dont la variabilité est liée à la nature des sucres, leur arrangement et les liens entre les différentes unités [42]. La détection de cet antigène se fait à l’aide d’anticorps monoclonaux spécifiques couplés à des particules d’or colloïdal. Les principales caractéristiques de ces 3 tests sont présentées dans le tableau IV. En termes de sensibilité, les études effectuées sur le terrain (en zone d’endémie ou non), ont montré une sensibilité élevée, supérieure à 91 %. Les méthodes de bactériologie conventionnelle manquent souvent de sensibilité en raison du faible nombre de shigelles excrétées dans les selles par

rapport à flore commensale, de l’effet délétère des changements de température et de pH durant le transport des selles et de la prise éventuelle d’antibiotiques. De plus, ces TDR présentent à la fois une limite de détection très faible, sans effet prozone, ce qui permet d’éviter les faux négatifs avec les échantillons contenant une forte concentration en antigènes somatiques. La spécificité a été évaluée en testant différents sérotypes de shigelles et différentes espèces de bactéries entéropathogènes (Salmonella, Vibrio, E. coli entétrotoxinogènes, entéropathohgènes, Campylobacter, Aeromonas, Plesiomonas, Yersinia…). Sur le terrain (en zone d’endémie ou non), les TDR ont montré une spécificité élevée, supérieure à 95 %. Avec le test permettant la détection de S.  dysenteriae 1, aucune réaction croisée n’a été observée avec E. coli O148 :H28, cause la plus courante de diarrhées chez l’enfant et les voyageurs dans les pays en voie de développement alors que la structure de leur antigène O ne diffère que par un glucose remplacée par un galactose [40]. De nombreuses techniques moléculaires basées sur les régions des gènes ipaH, IS1, tuf, uidA et 16S-ITS-23S présentent des difficultés dans le diagnostic de S. sonnei qu’elles ont du mal à différencier des autres espèces de shigelles et des E. coli entéroinvasifs [41]. D’un point de vue pratique, des études de stabilité accélérée effectuées après conservation des tests plusieurs semaines à température ambiante et à 56 ou 60 °C dans un incubateur ont montré que la limite de détection était toujours aussi basse. Ainsi, ces tests peuvent être stockés à température ambiante pendant 2 ans. Suite à la baisse de sensibilité observée en raison de l’humidité pour la détection de S. flexneri 2a [39], chaque bandelette est désormais conditionnée en sachet individuel avec un dessicant. De plus, ces TDR en dehors de fournir une réponse rapide (en moins de 15 minutes), sont faciles à réaliser avec un minimum de formation et ne présentent pas de difficultés de lecture particulière. Enfin, ils ne nécessitent aucun réactif (en dehors de l’eau distillée), ni d’équipement de laboratoire à la différence des méthodes de bactériologie conventionnelle ou de biologie moléculaire. Une autre approche indirecte du diagnostic des shigelles est d’identifier la shiga toxine de S. dysenterie sérotype 1, quasiment identique à la toxine Stx1 produite par E. coli. Or il existe des tests pour détecter les toxines (Stx1 et Stx2) des E. coli entérohémorragiques. Ces derniers sont responsables de diarrhées hématogènes et hydriques

Tableau IV – Caractéristiques des TDR pour le diagnostic des shigelloses. TDR

Echantillon

Temps de lecture

LD en UFC/ mL

Sensibilité

Spécificité

VPP

VPN

N

S. dysenteriae 1

Selles

10 min

4,9x106

91,7 % 59,8-99,6 %

98,7 % 96,6-99,6 %

73,3 % 44,8-91,1 %

99,7 % 98-100 %

328

S. flexneri 2a

Selles

15 min

5x107

91,5 % 83,6-99,4 %

99,2 % 97,8-100 %

79,6 % 69-90,3 %

97 % 89,6-100 %

191

S. sonnei

Écouvillonage rectal

6 min

4x106

100 %

95,3 % 92,9-97,7 %

77 % 65-86,5 %

100 %

342

100 %

96 % 92-98 %

72,4 % 56,1-88,6 %

100 %

219

Selles

VPP : valeur prédictive positive, VPP : valeur prédictive négative.

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Tableau V – Caractéristiques des tests pour la détection des shiga toxines. Test

Principe

Cible

Echantillon

Temps de lecture

Sensibilité

Spécificité

3 heures

100 87 sur selles directement

100

2,5 heures

100 79 sur selles directement

98

ProSpecT Shiga Toxin E. coli Microplate Assay (Remel)

Enzyme immunoassay en microplaque

Shiga toxines sans différence

Selles directes ou en Cary-Blair Milieu enrichi

Premier EHEC (Meridian Diagnostics)

Enzyme immunoassay en microplaque

Shiga toxines sans différence

Selles directes Milieu enrichi Culture

Immunocard STAT! EHEC (Meridian Diagnostics)

Immunochromatographie

Stx1 Stx2

Milieu enrichi Culture

20 min

92

100

BioStar OIA SHIGATOX (Inverness Medical)

Immunoassay optique

Shiga toxines sans différence

Selles directes ou en Cary-Blair Milieu enrichi Culture

15 min

100

98

Duopath Verotoxins Gold Labeled Immunosorbent Assay (Merck)

Immunochromatographie

Stx1 Stx2

Culture

20 min

100 (Stx 1) 99 (Stx 2)

98 (Stx1) 97 (Stx2)

SHIGA TOXIN QUIK CHEK (Alere)

Immunochromatographie

Stx1 Stx2

Selles directes ou en Cary-Blair Culture

25 min

98,0 (Stx1) 98,0 (Stx2)

99,8 (Stx1) 100 (Stx2)

qui, en l’absence de diagnostic, peuvent évoluer en colite hémorragique et/ou en syndrome urémique et hémolytique. Différents tests immunologiques sont disponibles sur le marché et présentés dans le tableau V [43-47]. Seuls les tests se faisant par immunochromatographie ou par immunoassay optique directement sur selles sans phase d’enrichissement (et non sur culture) seraient utilisables sur le terrain. Ainsi, deux tests allient praticabilité et rapidité. Le test Shiga Toxin Quik Chek comprend 2 étapes de 15 et 10 minutes. La première étape consiste à déposer l’échantillon de selles mélangé avec un diluant et un conjugué. Les complexes toxine-anticorps-péroxydase migrent à travers une membrane et sont capturés par les anticorps monoclonaux fixés, spécifiques de Stx1 et Stx2. La deuxième étape comporte un lavage et l’ajout du substrat permettant de visualiser la réaction antigène-anticorps sous forme d’une bande bleue. Les performances du test ont été comparées au test de la cytotoxine anti-cellules Vero (avec neutralisation), considéré comme la méthode de référence, sur 873 échantillons frais de selles et 14 échantillons congelés. La toxine produite par S. dysenteriae, si elle est présente à des taux détectables, produit un résultat positif au niveau de la zone Stx1. Ce test présente pour la toxine Stx1, une Se de 98,0 %, une Sp de 99,8 %, une VPP de 96,0 % et une VPN de 99,9 % avec une corrélation totale de 99,7 % avec le test de la cytotoxine [47]. Aucune réactivité croisée n’a été trouvée avec S. sonnei et S. flexneri. Le test BioStar OIA SHIGATOX comporte une surface optique recouverte d’anticorps antitoxines se liant à la toxine stx1 et/ou stx2 de l’échantillon. L’ajout d’anticorps anti-stx1 et anti-stx2 augmente l’épaisseur de la surface, modifiant ainsi la réflexion de la lumière perçue visuellement par un changement de couleur. L’évaluation du test sur 742 échantillons de selles a montré une sensibilité de 96,8 % et une spécificité de 99,4 % [45]. La sensibilité est supérieure à celle du kit Premier EHEC évaluée en parallèle (83,9 %) avec un temps de réalisation bien inférieur (20 minutes contre 2,5 heures). Après une phase d’enrichissement, la sensibilité et la spécificité ont atteint 100 % (avec aucune différence significative entre les deux tests évalués).

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Ainsi, ces deux TDR donnent des résultats rapidement à partir de selles fraîchement émises, avec des performances satisfaisantes en termes de sensibilité et spécificité et sont facilement réalisables sur le terrain sans matériel, ni réactif autres que ceux fournis dans le kit. Ils présentent cependant deux inconvénients majeurs : ils doivent être conservés entre 2 et 8 °C et ne permettent que le diagnostic indirect de S. dysenteriae 1. Les TDR s’ils sont suffisamment sensibles et spécifiques contribuent à la fois au diagnostic individuel et collectif, en apportant des bénéfices au malade mais aussi d’un point de vue épidémiologique. Leur objectif n’est pas de remplacer les méthodes de bactériologie conventionnelles qui resteront indispensables notamment pour évaluer l’antibio-résistance et pour caractériser les souches. Ils trouvent leur place en première ligne, au chevet du malade, sur le terrain, dans les pays où les moyens de laboratoire sont limités et parce qu’un retard de diagnostic est la principale cause de décès et de propagation d’une épidémie.

7. La peste La peste reste l’une des maladies la plus imprégnée d’histoire. Fléau des temps passés pour nos pays, la peste s’est implantée durablement dans certains pays où les conditions économiques ne permettent pas son éradication et où l’écosystème local favorise sa persistance. Présente dans 22 pays, le continent le plus touché reste l’Afrique (95 % des cas mondiaux) avec des épidémies de faible ampleur mais régulières en République démocratique du Congo (RDC, épidémie en 2005-6, [48]) et surtout à Madagascar (41 % des cas). Zoonose des rongeurs transmise par les puces, la maladie se présente chez l’homme sous sa forme bubonique dans la majorité des cas (80 à 95 % des cas suspects). Les formes septicémiques plus rares (10 à 20 %) se caractérisent par une forte létalité (22 %). Les formes pulmonaires sont les plus graves avec 100 % de mortalité si un traitement antibiotique n’est pas instauré

TESTS DE DIAGNOSTIC RAPIDE – Applications en infectiologie

dans les 24 h [49]. Yersinia pestis est un agent du bioterrorisme en tête de la liste du CDC et c’est sous cette forme pulmonaire que les cas surviendraient après un épandage aérien. Un diagnostic précoce de cette maladie d’évolution rapide est donc essentiel afin de réduire la mortalité par un traitement précoce et de limiter l’extension de la maladie par la prise en charge des cas contacts et les mesures de contrôle vectoriel [50]. Les techniques de référence sont classiquement, comme pour beaucoup d’endémies bactériennes, l’examen direct et la culture. La lecture des lames à la coloration de Gram ou de Wayson (coloration plus sensible) est difficile. La culture nécessite un laboratoire spécialisé de niveau 3 de sécurité et se heurte à la fragilité de la bactérie durant le transport notamment dans les prélèvements polymicrobiens tels que les crachats. Yersinia pestis est caractérisée par la production d’un antigène (Ag) spécifique : l’Ag F1 codé par le gène caf1. Cet Ag est présent en grande quantité dans les échantillons biologiques. Il est stable dans les prélèvements et peut être détecté plusieurs jours après traitement. Il n’est produit qu’à 37 °C et sera donc absent dans les prélèvements environnementaux mais présent chez le réservoir principal, les rongeurs. Quelques techniques de laboratoires spécialisées utilisent cet Ag pour le diagnostic : immunofluorescence direct sur frottis de crachat ou de pus de bubon, recherche de l’Ag par technique ELISA en microplaque [51], PCR sur le gène caf1. Aucune de ces techniques n’est exportable actuellement sur le terrain et elles servent essentiellement de tests de référence dans les laboratoires centraux. Mais c’est naturellement vers la recherche de cet Ag F1 que les tests de diagnostic rapide se sont orientés. Avec l’influence du risque de bioterrorisme, deux TDR ont été développés et sont commercialisés mais uniquement pour la détection de l’Ag F1 dans un environnement contaminé intentionnellement : Yersinia Pestis (F1) Smart II (New Horizons Diagnostics, Columbia, MD) et Plague BioThreat Alert test strips (Tetracore, Inc., Rockville, MD). Ils ne sont pas validés sur des prélèvements humains. Cependant, des études expérimentales réalisées chez la souris montrent des performances excellentes pour la détection de cette bactérie dans le sang des rongeurs, réservoir naturel de la maladie : le seuil de détection de l’Ag F1 est de 0,5 μg/mL ou 1 à 5x105 UFC/mL de sang [52]. Ayant le foyer le plus actif, le seul TDR utilisable pour le diagnostic de la peste chez l’homme a été développé par l’Institut Pasteur de Madagascar. Des souris immunisées par l’Ag F1 ont permis de sélectionner 2 hybridomes dont la spécificité des Ac mc a permis la mise au point du TDR. Un Ac en phase mobile est fixé à des particules d’or colloïdal, l’autre étant déposé au niveau de la bande réactive sur la membrane. Ces TDR ont été utilisés essentiellement sur des pus de bubon, des prélèvements pulmonaires mais aussi sur des prélèvements post mortem (poumon, ponction hépatique). Des faux négatifs sont observés sur les prélèvements pulmonaires probablement en rapport avec leur viscosité empêchant la réaction Ag-Ac et la migration [51]. Ainsi, il est recommandé de diluer 0,5 mL de prélèvements

pulmonaire dans 1 mL de tampon PBS et d’utiliser 200 μL pour la migration [48]. Les performances du TDR ont été évaluées à Madagascar. Le seuil de détection de l’Ag F1 est de 0,5 ng/mL sans effet de zone, ce qui est important étant donnée la forte concentration retrouvée dans certains prélèvements (jusqu’à 30 ng/mL). Le réactif est stable plus de 21 jours dans des conditions variables de température (de +60 °C à -80 °C), ce qui permettrait d’extrapoler une conservation de 2 ans à température ambiante. Seule l’humidité peut dégrader les bandelettes avec disparition de la bande contrôle lors de la migration. Sur des souches de référence en culture provenant de 15 pays et 3 continents, la sensibilité est de 100 %, quels que soient l’origine et le biotype de la souche (sauf pour les souches délétées pour le gène caf1). Le TDR peut donc être utilisé sur des souches circulant sur d’autres pays ou d’autres continents. Une étude a également été menée sur le terrain dans 26 centres de santé durant l’épidémie de 2000-1 recrutant 671 cas suspects [50] et les TDR réalisés par des personnels non spécialisés. Sur prélèvements humains, les TDR effectués au lit du patient se sont avérés plus sensibles que la culture et la détection de l’Ag F1 par technique ELISA. La fragilité de la bactérie et la possible diffusion de l’Ag F1 dans le milieu Carry Blair utilisé pour transporter les prélèvements pourraient être à l’origine de cette perte de sensibilité. Lors d’une étude de terrain sur 128 patients, les valeurs prédictives positives et négatives ont été respectivement de 90 % (IC 95 % : 79-96 %) 87 % (IC 95 % : 76-93 %) lorsque les tests sont pratiqués au lit du malade et de 93 % (IC 95 % : 82-98 %) et 90 % (IC 95 % : 81-96 %) dans les centres de référence. Enfin, de façon plus anecdotique, des TDR ont également été utilisés à la recherche de l’AgF1 sur des restes humains (os et dents) d’individus décédés de la peste aux XVIe, XVIIe et XVIIIe siècles : sur 18 sujets, 12 étaient positifs en Ag F1 par TDR [53]. Les épidémies de peste surviennent de manière sporadique dans des zones souvent difficiles d’accès. Lors d’une étude à Madagascar en 2001 [50], la durée médiane d’acheminement des prélèvements était de 8 jours (0 à 66 jours). Elle était de 18 jours (8 à 40 jours) pour l’épidémie de RDC en 2005 [48]. Cette réalité de terrain rend difficile l’utilisation des tests de référence. Le TDR peu coûteux, facile d’utilisation permet de confirmer rapidement une suspicion clinique. Il joue également un rôle dans le contrôle d’une épidémie. En effet, l’activité la plus consommatrice en temps est la prise en charge des sujets contacts (en RDC, 25 par malade). Les TDR permettent en 15 min de cibler uniquement les contacts des sujets atteints de la peste. Les TDR ont donc leur place à la fois dans les foyers endémiques pour renforcer la surveillance mais aussi au niveau des équipes d’investigation de nouveaux foyers [48]. Si ce test peut avoir un rôle dans la détection précoce d’une épidémie, la confirmation par une technique de référence, notamment la culture, est cependant indispensable pour affirmer de façon absolue la nature de l’agent infectieux et déterminer le profil de résistance aux antibiotiques. REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - JUILLET/AOÛT 2015 - N°474//

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8. La mélioïdose La mélioïdose est une infection due à Burkholderia pseudomallei, une bactérie de l’environnement à Gram négatif et oxydase positive particulièrement pathogène chez l’homme. B. pseudomallei est endémique dans le sudest de l’Asie et dans le nord de l’Australie, ainsi que dans d’autres régions tropicales du monde situées dans les latitudes comprises entre les 20° nord et 20° sud, c’està-dire l’Asie, l’Amérique centrale, l’Amérique du Sud, les îles de l’Océan Indien et quelques pays d’Afrique [54]. Récemment des cas autochtones de mélioïdose ont été rapportés dans l’Île de la Réunion et à Madagascar et la présence de la bactérie pathogène semble être plus générale en Afrique notamment du fait de résultats de sérologie, d’analyse de sols et surtout de retour de voyageurs infectés en provenance de ces régions [55-57]. Ainsi, de nombreuses fièvres inexpliquées ou attribuées au paludisme pourraient être expliquées par la mélioïdose. Il faut également souligner que B. pseudomallei est susceptible d’être un agent utilisable à des fins de bioterrorisme. Le diagnostic clinique de la mélioïdose est difficile car cette maladie présente des manifestations cliniques non pathognomoniques, variant de formes aiguës septiques fulminantes à des formes chroniques et tout retard dans le diagnostic peut être fatal mais il n’y a actuellement pas de test de diagnostic rapide commercial disponible et fiable pour la mélioïdose [58]. De ce fait, le diagnostic courant standard reste la culture d’échantillons cliniques multiples dans leur nature (sang, urine, pus, expectorations,…), considérée pour l’instant comme méthode de référence. B. pseudomallei n’est pas un organisme du microbiote normal et n’en détecter ne serait-ce qu’une seule colonie dans un prélèvement d’un patient présentant des symptômes correspondant à un processus infectieux doit être interprété comme un résultat positif d’une mélioïdose [59]. Cependant, la culture n’est pas une méthode parfaite, de par sa durée (entre 1 et 7 jours) et sa sensibilité ayant été évaluée à 60 %, l’isolement de la bactérie pouvant s’avérer parfois difficile. C’est pourquoi, le clinicien doit particulièrement persister dans sa recherche de mélioïdose en cas d’une exposition potentielle à B. pseudomallei (résidence ou voyage passé en zone d’endémie, une épidémie connue, un accident de laboratoire ou acte de bioterrorisme) et plus particulièrement si le patient présente des facteurs de risque majeurs (diabète, insuffisance rénale chronique, alcoolisme, pathologie pulmonaire chronique, corticothérapie et tumeur [59]). La présence de facteurs de risque n’est pas constante et la mélioïdose est régulièrement diagnostiquée chez des jeunes adultes en bonne santé notamment de retour de voyage en zone d’endémie. De même, la période d’incubation peut varier entre moins d’un jour à plus de 60 ans, ce qui rend parfois difficile la recherche étiologique [54]. La problématique du diagnostic de la mélioïdose diffère donc selon si l’on se situe en zone d’endémie ou non. En zone d’endémie et particulièrement de haute endémie, les cliniciens connaissent en général bien cette pathologie mais sont davantage limités par les outils diagnostiques et thérapeutiques parfois difficilement accessibles dans des régions qui

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restent majoritairement pauvres. Par exemple, dans le nord-est de la Thaïlande, c’est la troisième cause de mortalité par maladie infectieuse après les infections par VIH et la tuberculose et le taux de mortalité est supérieur à 40 % [54]. Ce taux est moindre dans le nord de l’Australie et la différence de mortalité entre ces deux régions de haute endémie est en partie attribuée au retard dans le diagnostic en Thaïlande [60]. En effet, le délai dans le diagnostic de confirmation est important du fait que B. pseudomallei requiert une antibiothérapie par ceftazidime ou par un carbapénème, qui ne sont pas forcément des traitements empiriques de premier choix. En revanche, en zone non endémique, c’est-à-dire soit principalement dans les pays occidentaux (Europe et Amérique du Nord) qui ont des ressortissants ayant effectué des séjours ou des voyages en zone d’endémie, soit dans les régions récemment identifiées comme abritant dans leurs sols B. pseudomallei, la principale difficulté consiste pour les équipes médicales a déjà bien connaître la mélioïdose pour penser à ce diagnostic. Dans ce cas, l’agent pathogène risque d’être identifié comme un contaminant ou une autre espèce, spécialement par les laboratoires qui ne sont pas familiers avec cet organisme et qui ne possèdent pas forcément de laboratoire de sécurité biologique de niveau 3 nécessaire à la culture de cet organisme. La problématique des tests de diagnostic rapide s’est donc posée depuis longtemps surtout en zone d’endémie. Différents laboratoires de ces régions ont créé leurs propres tests de dépistage, souvent basés sur la détection antigénique par immunofluorescence ou par agglutination au latex. L’immunofluorescence est par exemple employée en Thaïlande pour le diagnostic rapide direct d’échantillons de patients contenant des grandes quantités de B. pseudomallei (expectoration, pus, urine ou sécrétions respiratoires) et à partir d’hémocultures. Bien que la spécificité de cette technique soit élevée, la sensibilité a été évaluée entre 45 et 48 % pour une utilisation directe sur des échantillons cliniques. L’agglutination de particules de latex est une technique peu coûteuse qui est efficace pour l’identification de B. pseudomallei à partir de cultures sur gélose ou en bouillon de prélèvements de patients, mais les limites élevées de détection (~106 UCF/mL) de cette méthode la limite à une utilisation sur culture. Des tests de détection par PCR en temps réel existent mais sont très peu utilisés dans les pays endémiques [58]. Ce que recherchent principalement les cliniciens en zones d’endémie, ce sont des tests rapides, efficaces, peu onéreux, stables au stockage à température ambiante, ne nécessitant pas de culture et capables d’être mis facilement en œuvre par du personnel peu qualifié afin d’être largement distribués permettant de diriger rapidement un patient diagnostiqué vers un centre de traitement de référence. Le premier test de diagnostic rapide commercialisé a été un test indirect basé sur la détection des anticorps produits en réponse à une infection à B. pseudomallei chez le patient. Le Melioidosis Rapid Cassette Test, a été commercialisé initialement par la société australienne PanBio mais ne semble plus disponible. Des études préalables de la réponse humorale à la mélioïdose ont montré que les taux d’immunoglobulines G

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(IgG, particulièrement les sous-classes IgG1 et IgG2), pouvaient être un bon indicateur d’une infection active et pouvaient être même utilisés pour suivre la réponse au traitement. Au contraire, la réponse des immunoglobulines M (IgM) est plus faible en phase aiguë et cet anticorps est prévalent dans le sérum des populations saines mais exposées dans les zones d’endémie [61]. Ce test immunochromatographique est donc basé sur une détection en moins de 15 minutes des IgM et IgG sur des bandelettes à partir de quelques μL de sérum [62]. Seul le test IgM présentait des réactions croisées avec certaines infections (infections à Pseudomonas, la légionellose et la tuberculose). Les premières études en zones endémiques concernant ce test semblaient assez positives avec des valeurs de sensibilité comprises entre 67 et 100 % et de spécificité autour de 80-90 % selon les études [61-63]. Cependant, ces études étaient rétrospectives et ne permettaient pas de définir des valeurs prédictives positive et négative et il semble que des biais aient pu être introduits de par la nature des populations utilisées en contrôle [64]. Depuis, des études prospectives ont montré les limites de ce test indirect avec des taux importants de faux positifs, une faible valeur prédictive positive (17,5 % pour le test IgM et 31,8 % pour le test IgG) et une faible spécificité (< 50 %). En outre, une faible sensibilité a montré que même une sérologie négative ne permettait pas forcément d’exclure une mélioïdose [64, 65]. Ces résultats sont en grande partie expliqués par la proportion importante (50 %) de la population possédant des anticorps contre cette bactérie dans les zones endémiques. Ainsi, la plupart des individus âgés de plus de 4 ans sont séropositifs par immuno-hémagglutination indirecte (IgG et IgM), résultat d’une exposition environnementale répétée à l’organisme [61]. Par ailleurs, une sérologie négative initiale lors d’une mélioïdose aiguë est un phénomène bien connu. Par conséquent, ce test indirect n’est pas fiable en zone endémique, c’est sans doute pourquoi il n’est plus utilisé. En revanche, une étude réalisée en zone non endémique montre un intérêt de ce test pour le diagnostic des voyageurs mais pas pour les populations originaires des pays endémiques ayant immigré dans des pays non endémiques [63]. Pour remplacer les tests indirects qui ont montré leur limite, un test immunochromatographique (lateral flow) est actuellement en développement [60] par la société Inbios International (Seattle, Washington, USA). Ce test met en œuvre un anticorps monoclonal (mAb 3C5) qui reconnaît spécifiquement un des facteurs de virulence de B. pseudomallei, la capsule polysaccharidique (CPS). L’efficacité de ce système a été évaluée sur de nombreux échantillons cliniques provenant d’Australie et de Thaïlande, ainsi que sur différentes matrices comme le sérum, l’urine, les expectorations, le pus ou le liquide pleural. Sa limite de détection a été évaluée à environ 0,2 ng/mL d’antigène CPS purifié grâce à la haute affinité de cet anticorps. Ce test immunochromatographique a une sensibilité comparable à celle d’un test ELISA, mais légèrement plus faible quand l’antigène CPS est dans une matrice d’urine ou de sérum. Ce test a été capable de reconnaître 98,7 % des isolats de B. pseudomallei (test positif) et d’exclure 97,2 % des autres espèces

(test négatif). Les faux-positifs et faux négatifs observés ont pu être expliqués par la particularité des souches testées. Une étude préclinique est prévue en Thaïlande et en Australie afin de déterminer la sensibilité et la spécificité cliniques et l’utilité diagnostique de ce test. En conclusion, l’utilisation des tests directs de détection d’antigènes de B. pseudomallei semble être l’avenir des tests de diagnostic rapide de la mélioïdose pour une utilisation possible dans les zones endémiques et non endémiques, les tests indirects n’étant pas pour l’instant pas fiables dans les zones d’endémie. Cependant, des tests sérologiques de nouvelle génération sont actuellement à l’étude.

9. Conclusion Les TDR sont développés en Occident pour un diagnostic immédiat rapide au plus près du patient pour guider sa prise en charge et son traitement. C’est le cas de la recherche des antigènes solubles du pneumocoque ou des légionnelles dans les urines. Dans les pays en développement, pour des maladies à fort potentiel épidémique, les TDR prennent une autre dimension, celle de la collectivité. Leur premier intérêt devient le diagnostic rapide d’une épidémie ou la détection précoce des cas afin de prendre rapidement les mesures prophylactiques : lutte antivectorielle, vaccination, traitement des sujets contact. Dès lors les exigences peuvent être différentes même si une grande sensibilité reste souhaitable. Les avantages logistiques de ces TDR sont indéniables : simplicité d’utilisation avec une formation minimale, stabilité des réactifs avec une conservation à température ambiante, faible encombrement. Malgré cela, les performances sont au rendez-vous même si d’importantes variations sont notées selon les études probablement en rapport avec le caractère artisanal de leur production et les difficultés des études de terrain. Étant donné le déficit chronique des structures de diagnostic, les besoins en développement de nouveaux TDR sont importants. Malheureusement la réponse des industriels n’est pas à la hauteur et même quasiment inexistante malgré les efforts de certains centres de recherches et notamment des Instituts Pasteur pour développer les techniques et produire des anticorps monoclonaux performants. Seuls les industriels pourront par leur expérience dans la production de réactifs, mettre sur le marché des TDR de qualité constante et stable dans le temps et surtout accessibles au plus grand nombre. La commercialisation de tels tests permettrait également de compléter les études de performance encore trop rares et réalisées presque uniquement par les laboratoires les produisant. Enfin, avec le développement des techniques de PCR plus accessibles, notamment par amplification isotherme, la biologie moléculaire pourrait à terme s’approcher du patient dans les zones les plus reculées. Malgré un coût supérieur, pouvant être atténué par des subventions dans les pays en développement, la PCR pourrait supplanter les TDR avant qu’ils n’aient pu réellement voir le jour. Déclaration d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article. REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - JUILLET/AOÛT 2015 - N°474//

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