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The biosynthetic activity of transmination, studied with a variant of Bacillus subtilis
VOL. ].0 (1953)
SHORT COMMUNICATIONS,
PRELIMINARY NOTES
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T H E B I O S Y N T H E T I C A C T I V I T Y OF TRANSAMINATION, S T U D I E D W I T H A V A R I A N T OF B A C I L LU S S U B T I L I S by J. M. W I A M E , R. S T O R C K AND S. B O U R G E O I S
Laboratoire de Microbiologie du Centre d'Enseignement et de Recherches des Industries alimentaires, et Laboratoire de Biochimie des Microorganismes de l' Universitd Libre, Bruxelles (Belgique)
I n s p i t e of n u m e r o u s e n z y m i c s t u d i e s related to t r a n s a m i n a t i o n , t h e r e are o n l y few r e p o r t s on t h i s t y p e of reaction, s t u d i e d w i t h living o r g a n i s m s (see GALR1), available for a general discussion. I t h a s been s h o w n , however, t h a t a m i n o - a c i d - f r e e m u t a n t s of m i c r o - o r g a n i s m s supplied w i t h v i t a m i n B e are able to grow on t h e c o r r e s p o n d i n g ketoacid~, s. T h i s fact s u p p o r t s t h e idea t h a t t r a n s a m i n a t i o n r e a c t i o n s are i n v o l v e d in t h e s e bacteria. A m o r e direct d e m o n s t r a t i o n w o u l d be given if b o t h t h e a m i n o acid d o n o r of - N H 2 a n d t h e ketoacid acceptor were n e c e s s a r y for growth. A n o p p o r t u n i t y for s u c h a d e m o n s t r a t i o n h a s been given b y a c o m p a r a t i v e s t u d y of t w o p a r e n t s t r a i n s of Bac. subtilis, t h e s t r a i n s M 2- a n d $1-. I n a p r e v i o u s work w i t h t h e s t r a i n $1 -*, it h a s been s h o w n t h a t t h i s b a c t e r i u m n e e d s for its g r o w t h one of t h e following a m i n o acids: L - g l u t a m i c acid, L-arginine, L-ornithine, L-proline or L-aspartic acid. T h i s b a c t e r i u m is u n a b l e to u s e NH4+, e v e n p a r t i a l l y (as i n d i c a t e d b y t h e sign (--)). W i t h t h e s t r a i n M~-, a s p a r t i c acid alone is u n a b l e to s u p p o r t n o r m a l g r o w t h , which, h o w e v e r , is possible in t h e s i m u l t a n e o u s presence of a s p a r t i c acid p l u s citric acid, or a s p a r t i c acid p l u s a - k e t o g l u t a r i c acid (Fig. i). Citric acid or k e t o g l u t a r i c acid h a v e no effect on t h e s t r a i n S I - (Fig. 2). T h i s c o n s t i t u t e s a direct proof of t h e b i o s y n t h e t i c a c t i v i t y of t h e aspartic glutamic transamination. 1.1
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Fig. I. G r o w t h c u r v e s of Bac. sub. M s- a t 35 ° in a m e d i u m c o n t a i n i n g glycerol M/Io, m i n e r a l salts 4 a n d s u p p l e m e n t e d w i t h : i. × - - × - - × g l u t a m i c acid M / 2 o o ; 2 . 0 - - 0 - - O a s p a r t i c acid M / 2 o o a n d citric acid M / 2 0 o ; 3. -I- -- Jr- -- -F a s p a r t i c acid M/2oo a n d a - k e t o g l u t a r i c acid; 4. 0 - - 0 - - 0 a s p a r t i c acid.
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Fig. 2. G r o w t h c u r v e s of Bac. sub. S 1- a t 35 ° in a m e d i u m c o n t a i n i n g glycerol M / i o , m i n e r a l salts 4 a n d s n p p l e m e n t e d w i t h : i. O - - O - - O a s p a r t i c acid M / 2 o o ; 2. x - - X - - × aspar~c acid M/2oo a n d a - k e t o g l u t a r i c acid M / 2 b o ; 3. & - - A - - & a s p a r t i c acid M / 2 o o a n d .citric acid M/2oo.
I n c o n n e c t i o n w i t h o t h e r r e s u l t s f r o m this l a b o r a t o r y , t h i s o b s e r v a t i o n leads to o t h e r conclusions. I t w a s d e m o n s t r a t e d , b y t h e m e t h o d of s i m u l t a n e o u s a d a p t a t i o n s, t h a t L-arginine, L-ornithine a n d L-proline replace s t o i c h i o m e t r i c a l l y L-glutamic acid f o r m e d b y t h e i r p r e v i o u s conversion in t h e cells into t h i s a m i n o acid. I t was, however, impossible to m a k e certain t h a t a s p a r t i c acid is also u s e d t h r o u g h L - g l u t a m i c acid. T h e p r e s e n t e x p e r i m e n t s h o w s clearly t h a t t h i s is t h e case, a n d gives a clear d e m o n s t r a t i o n of t h e c e n t r a l role of g l u t a m i c acid in t h e n i t r o g e n m e t a b o l i s m of t h e cell. All t h e n i t r o g e n of t h e cell arises f r o m g l u t a m i c acid; t h e o t h e r c o m p o n e n t s w h i c h replace g l u t a m i c acid d o so a f t e r e n z y m i c a d a p t a t i o n ; in t h e case of a s p a r t i c acid, a - k e t o g l u t a r i c acid is n e e d e d as
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NH t acceptor. From the necessity of either u-ketoglutaric o r citric acid, in the presence of aspartic acid, to support growth, one may conclude t h a t the tricarboxylic acid cycle (without an obligatory energetic role) has a synthetic activity in the metabolism of this micro-organism. This hypothesis. which was first suggested by KRESSe, is also in agreement with other experiments reported elsewherd. It is worth while noting that, in contrast to the numerous other amino-acid-free mutants which have been obtained, the strains used here are almost the only ones which involve the glutamic or aspartic acid metabolism. This work has been supported by the Institut pour l'Encouragement de la Recherche Scientifique dans l'Industrie et 1'Agriculture, the Institut Belge d'Alimentation et de Nutrition and the Centre de Brasserie et Malterie. REFERENCES I E. GALE, in W E R K M A N A N D WILSON,Bacterial Physiology, Academic Press, New York, 1951, p. 453. 2 H. P. BRO~UIST AND E. E. SNELL, J. Biol. Chem., I8o (~949) 59. 3 j. T, HOLDEN, R. B. WILDMAN AND E. E. SNELL, J. Biol. Chem., I91 (I951) 559. J. M. WlAME hr,lD R. STORCK, Biochim. Biophys. Acta, io (1953) 268. 5 j . 1vii.WIAME, Biochim. Biophys. Acta, 7 (1951) 478. 6 H. h . KREBS, S. GUEIN AND L. V. E. EGGLESTON,Biochem. J., 5I (1952) 614. J. M. WIAME AND S. BOURGEOIS, in press. Received March 3rd, 1953
DIE WASSER-GLYZERIN-EXTRAHIERTE ZELLE ALS MODELL DER ZELLMOTILITAT von
HARTMUT H O F F M A N N - B E R L I N G
Institut /¢~v Virus/orschung, Heidelberg (Deutschland) Werden Gewebekulturen bei niedriger Temperatur in einer 45 %igen Glyzerinl6sung yon p H ~ 7 und einer Ionenst~rke yon o.14/~ extrahiert, so Stirb~ die Zelle ab, doch bleiben die unl6slichen Strukturen erhalten. Zell- und Kernform, Nukleolen~ Chromosomen und Teilungsspindel sind unver~ndert, wenn die Riickfiihrung der ZeUen in rein w~ssrige L6sungen schrittweise erfolgt; Mitochondrien runden sich dagegen ab. Es wird so Bin Modell der ZeUe erhalten, das dem sog. FasermodeU des Muskels1 /~hnlich ist. Modelle aus Zellen in Teilungsruhe, die mindestens einige Tage extrahiert sind, kontrahieren sich auf ATP-Zusatz zu einer Kugel. Die Verkiirzung eriolgt dabei nieht frei, sondern gegen den schwer abschatzbaren Widerstand des Fibrinkoagulums im Kulturmedium. Nach einer nur wenige Stunden dauernden Extraktion ist die Verkiirzung geringer. Die Kontraktion ist bei 37 ° C nach knapp io min, bei 2o ° C nach 35 min abgeschlossen. Bei zo ° betr~gt die Halbwertzeit etwa 7 rain. 1.5 × lO-s M Mg'" beschleunigt die Kontraktion; io -z M Monojodacetat ist indifferent; eine lO rain dauernde Vorbehandlung mit io -4 M Salyrgan hebt dagegen die Kontraktion auf. Die Salyrganwirkung ist auf Cystein reversibel. Auswaschen des ATP 1/isst die Zell~ in jedem Stadium der Bewegung sofort ¢[starren. Pyrophosphat bis zu lO-2 M, Trimetaphosphat und sog. Hexametaphosphat bis 5 × IO-S sind wirkungslos. Bei i n der Anaphase der Kernteilung extrahierten Zellen wandern die Chromosomens/itze unter ATP auseinander. ZeUkontraktion wurde erzielt an Fibroblasten aus Amnion, Sclera, Leber, Mitz, Subcutangewebe, S k e l e t t - U n d 'Herzmuskel, Osteoblasten (Huhn), lymph0granulomat6sem Lymphknoten (Mensch) sowie Epitlielzellen aus Retina und Epidermis (Huhn) und in der Kultur iiberlebenden ZeUen aus Ehrlich-Ascitestumor der Maus. ModeUe aus Epithelze]fen sind nur beweglich, wenn sic nicht im Verband liegen. Die Zahl der vorausgegangenen Passagen des betreffenden Gewebestammes ist ohne Einffuss. Anaphasebewegungen wurden bisher nur an Zelllnodellen aus Ske!ettmuskel- und Sclerafibroblasten gesucht und gefunden. LITERATUR 1 Vgl. z . B . A . SZENT-GY~RGYI, Chewlistlvy o/Mu.~cu~ar Contrition, New York, 1951. H. H. W E B E R U N D H. PORTZEHL, Adv. Prof. Chem., 7 (1952) 161, und E~gebn. Physiol., 47 (1952) 369. Eingegangen den 9. M/~Lrz 1953
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Laboratoire de Microbiologie du Centre d'Enseignement et de Recherches des Industries alimentaires, et Laboratoire de Biochimie des Microorganismes de l' Universitd Libre, Bruxelles (Belgique)
I n s p i t e of n u m e r o u s e n z y m i c s t u d i e s related to t r a n s a m i n a t i o n , t h e r e are o n l y few r e p o r t s on t h i s t y p e of reaction, s t u d i e d w i t h living o r g a n i s m s (see GALR1), available for a general discussion. I t h a s been s h o w n , however, t h a t a m i n o - a c i d - f r e e m u t a n t s of m i c r o - o r g a n i s m s supplied w i t h v i t a m i n B e are able to grow on t h e c o r r e s p o n d i n g ketoacid~, s. T h i s fact s u p p o r t s t h e idea t h a t t r a n s a m i n a t i o n r e a c t i o n s are i n v o l v e d in t h e s e bacteria. A m o r e direct d e m o n s t r a t i o n w o u l d be given if b o t h t h e a m i n o acid d o n o r of - N H 2 a n d t h e ketoacid acceptor were n e c e s s a r y for growth. A n o p p o r t u n i t y for s u c h a d e m o n s t r a t i o n h a s been given b y a c o m p a r a t i v e s t u d y of t w o p a r e n t s t r a i n s of Bac. subtilis, t h e s t r a i n s M 2- a n d $1-. I n a p r e v i o u s work w i t h t h e s t r a i n $1 -*, it h a s been s h o w n t h a t t h i s b a c t e r i u m n e e d s for its g r o w t h one of t h e following a m i n o acids: L - g l u t a m i c acid, L-arginine, L-ornithine, L-proline or L-aspartic acid. T h i s b a c t e r i u m is u n a b l e to u s e NH4+, e v e n p a r t i a l l y (as i n d i c a t e d b y t h e sign (--)). W i t h t h e s t r a i n M~-, a s p a r t i c acid alone is u n a b l e to s u p p o r t n o r m a l g r o w t h , which, h o w e v e r , is possible in t h e s i m u l t a n e o u s presence of a s p a r t i c acid p l u s citric acid, or a s p a r t i c acid p l u s a - k e t o g l u t a r i c acid (Fig. i). Citric acid or k e t o g l u t a r i c acid h a v e no effect on t h e s t r a i n S I - (Fig. 2). T h i s c o n s t i t u t e s a direct proof of t h e b i o s y n t h e t i c a c t i v i t y of t h e aspartic glutamic transamination. 1.1
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Fig. I. G r o w t h c u r v e s of Bac. sub. M s- a t 35 ° in a m e d i u m c o n t a i n i n g glycerol M/Io, m i n e r a l salts 4 a n d s u p p l e m e n t e d w i t h : i. × - - × - - × g l u t a m i c acid M / 2 o o ; 2 . 0 - - 0 - - O a s p a r t i c acid M / 2 o o a n d citric acid M / 2 0 o ; 3. -I- -- Jr- -- -F a s p a r t i c acid M/2oo a n d a - k e t o g l u t a r i c acid; 4. 0 - - 0 - - 0 a s p a r t i c acid.
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Fig. 2. G r o w t h c u r v e s of Bac. sub. S 1- a t 35 ° in a m e d i u m c o n t a i n i n g glycerol M / i o , m i n e r a l salts 4 a n d s n p p l e m e n t e d w i t h : i. O - - O - - O a s p a r t i c acid M / 2 o o ; 2. x - - X - - × aspar~c acid M/2oo a n d a - k e t o g l u t a r i c acid M / 2 b o ; 3. & - - A - - & a s p a r t i c acid M / 2 o o a n d .citric acid M/2oo.
I n c o n n e c t i o n w i t h o t h e r r e s u l t s f r o m this l a b o r a t o r y , t h i s o b s e r v a t i o n leads to o t h e r conclusions. I t w a s d e m o n s t r a t e d , b y t h e m e t h o d of s i m u l t a n e o u s a d a p t a t i o n s, t h a t L-arginine, L-ornithine a n d L-proline replace s t o i c h i o m e t r i c a l l y L-glutamic acid f o r m e d b y t h e i r p r e v i o u s conversion in t h e cells into t h i s a m i n o acid. I t was, however, impossible to m a k e certain t h a t a s p a r t i c acid is also u s e d t h r o u g h L - g l u t a m i c acid. T h e p r e s e n t e x p e r i m e n t s h o w s clearly t h a t t h i s is t h e case, a n d gives a clear d e m o n s t r a t i o n of t h e c e n t r a l role of g l u t a m i c acid in t h e n i t r o g e n m e t a b o l i s m of t h e cell. All t h e n i t r o g e n of t h e cell arises f r o m g l u t a m i c acid; t h e o t h e r c o m p o n e n t s w h i c h replace g l u t a m i c acid d o so a f t e r e n z y m i c a d a p t a t i o n ; in t h e case of a s p a r t i c acid, a - k e t o g l u t a r i c acid is n e e d e d as
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NH t acceptor. From the necessity of either u-ketoglutaric o r citric acid, in the presence of aspartic acid, to support growth, one may conclude t h a t the tricarboxylic acid cycle (without an obligatory energetic role) has a synthetic activity in the metabolism of this micro-organism. This hypothesis. which was first suggested by KRESSe, is also in agreement with other experiments reported elsewherd. It is worth while noting that, in contrast to the numerous other amino-acid-free mutants which have been obtained, the strains used here are almost the only ones which involve the glutamic or aspartic acid metabolism. This work has been supported by the Institut pour l'Encouragement de la Recherche Scientifique dans l'Industrie et 1'Agriculture, the Institut Belge d'Alimentation et de Nutrition and the Centre de Brasserie et Malterie. REFERENCES I E. GALE, in W E R K M A N A N D WILSON,Bacterial Physiology, Academic Press, New York, 1951, p. 453. 2 H. P. BRO~UIST AND E. E. SNELL, J. Biol. Chem., I8o (~949) 59. 3 j. T, HOLDEN, R. B. WILDMAN AND E. E. SNELL, J. Biol. Chem., I91 (I951) 559. J. M. WlAME hr,lD R. STORCK, Biochim. Biophys. Acta, io (1953) 268. 5 j . 1vii.WIAME, Biochim. Biophys. Acta, 7 (1951) 478. 6 H. h . KREBS, S. GUEIN AND L. V. E. EGGLESTON,Biochem. J., 5I (1952) 614. J. M. WIAME AND S. BOURGEOIS, in press. Received March 3rd, 1953
DIE WASSER-GLYZERIN-EXTRAHIERTE ZELLE ALS MODELL DER ZELLMOTILITAT von
HARTMUT H O F F M A N N - B E R L I N G
Institut /¢~v Virus/orschung, Heidelberg (Deutschland) Werden Gewebekulturen bei niedriger Temperatur in einer 45 %igen Glyzerinl6sung yon p H ~ 7 und einer Ionenst~rke yon o.14/~ extrahiert, so Stirb~ die Zelle ab, doch bleiben die unl6slichen Strukturen erhalten. Zell- und Kernform, Nukleolen~ Chromosomen und Teilungsspindel sind unver~ndert, wenn die Riickfiihrung der ZeUen in rein w~ssrige L6sungen schrittweise erfolgt; Mitochondrien runden sich dagegen ab. Es wird so Bin Modell der ZeUe erhalten, das dem sog. FasermodeU des Muskels1 /~hnlich ist. Modelle aus Zellen in Teilungsruhe, die mindestens einige Tage extrahiert sind, kontrahieren sich auf ATP-Zusatz zu einer Kugel. Die Verkiirzung eriolgt dabei nieht frei, sondern gegen den schwer abschatzbaren Widerstand des Fibrinkoagulums im Kulturmedium. Nach einer nur wenige Stunden dauernden Extraktion ist die Verkiirzung geringer. Die Kontraktion ist bei 37 ° C nach knapp io min, bei 2o ° C nach 35 min abgeschlossen. Bei zo ° betr~gt die Halbwertzeit etwa 7 rain. 1.5 × lO-s M Mg'" beschleunigt die Kontraktion; io -z M Monojodacetat ist indifferent; eine lO rain dauernde Vorbehandlung mit io -4 M Salyrgan hebt dagegen die Kontraktion auf. Die Salyrganwirkung ist auf Cystein reversibel. Auswaschen des ATP 1/isst die Zell~ in jedem Stadium der Bewegung sofort ¢[starren. Pyrophosphat bis zu lO-2 M, Trimetaphosphat und sog. Hexametaphosphat bis 5 × IO-S sind wirkungslos. Bei i n der Anaphase der Kernteilung extrahierten Zellen wandern die Chromosomens/itze unter ATP auseinander. ZeUkontraktion wurde erzielt an Fibroblasten aus Amnion, Sclera, Leber, Mitz, Subcutangewebe, S k e l e t t - U n d 'Herzmuskel, Osteoblasten (Huhn), lymph0granulomat6sem Lymphknoten (Mensch) sowie Epitlielzellen aus Retina und Epidermis (Huhn) und in der Kultur iiberlebenden ZeUen aus Ehrlich-Ascitestumor der Maus. ModeUe aus Epithelze]fen sind nur beweglich, wenn sic nicht im Verband liegen. Die Zahl der vorausgegangenen Passagen des betreffenden Gewebestammes ist ohne Einffuss. Anaphasebewegungen wurden bisher nur an Zelllnodellen aus Ske!ettmuskel- und Sclerafibroblasten gesucht und gefunden. LITERATUR 1 Vgl. z . B . A . SZENT-GY~RGYI, Chewlistlvy o/Mu.~cu~ar Contrition, New York, 1951. H. H. W E B E R U N D H. PORTZEHL, Adv. Prof. Chem., 7 (1952) 161, und E~gebn. Physiol., 47 (1952) 369. Eingegangen den 9. M/~Lrz 1953