Trennung multipler Enzymformen durch isoelektrische Fokussierung in ultradünnen Polyacrylamidgelschichten auf Polyesterfolie

Biochem. Physiol. Pflanzen 180, 407-411 (1985)

Kurze Mitteilung

Trennung multipler Enzymformen durch isoelektrische Fokussierung in ultradiinnen Polyacrylamidgelschichten auf Polyesterfolie KLAUS PEISKER St.-Elisabeth-Krankenhaus, Klinisch-Chemische Laborabteilung, Halle, DDR

Separation of Multiple Enzyme Forms by Isoelectric Focusing in Ultrathin Polyacrylamide Gels on Polyester Films Key Term Index: multiple enzyme forms, ultrathinlayer isoelectric focusing; Hordeum vulgare

Summary Multiple forms of barley leaf enzymes (peroxydase, superoxid dis mutase, esterase, acid phosphatase, and leucin aminopeptidase) were determined using ultrathinlayer isoelectric focusing in 0,18 mm thick polyacrylamide gels on polyester films. The ultrathinlayer isoelectric focusing turns out to be an excellent method for the separation of isoenzymes. The precision of the methods used allows statistical plots of the results. Staining procedures were adapted to other conditions in ultrathin gels.

Fur die Auftrennung multipler Enzvmformen werden eine Vielzahl methodischer Varianten beschrieben (OHLENSCHLAGER et al. 1980), die von der einfachen Papierelektrophorese bis hin zur Differenzierung in Gradientengelen reichen. Die isoelektrische Fokussierung, ein weiteres sehr leistungsfahiges Trennverfahren £iir Proteine beniitigt zum Aufbau des pH-Gradienten teure Ampholyte, deren Preis die Anwendung der IEF begrenzt. Erst die Einfuhrung ultradiinner Schichten (GORG et al. 1979; PEISKER 1985; RADOLA 1980a, 1980 b) ermiiglicht aufgrund des minimalen Substanzbedarfs eine kostengunstige Durchfiihrung dieses hocheffektiven Trennverfahrens. Der Einsatz der billigeren Servalyt-T-Typen an stelle analysenreiner Substanzen erbringt bei etwa gleiehen Trennleistungen (PEISKER 1985; RADOLA 1980b) zusatzliche Einsparungen. Weitere Vorteile der UDIEF bestehen im sehr geringen Probenbedarf, einer schiirferen Bandenausbildung und in der wesentlichen Verkiirzung von Fixier-, Farbe- und Trockenzeiten. Auf einer Platte oder Folie lassen sich nebeneinander eine groJ3e Zahl von Proben unter identischen Bedingungen analysieren. Damit wird ein unmittelbarer Vergleich von Proben miteinander oder mit Referenzsubstanzen miiglich. Abkiirzungen: TEF, isoelektrische Fokussierung; JNT, Jodnitrot3trazoliumchlorid, LAP, Leucinaminopeptidase; PMS, Phenazinmethosuifat; POD, Peroxydase; SOD, Superoxid Dismutase; SP, saure Phosphatase; UDIEF, Ultradiinnschicht isoelektrische Fokussierung

408

K. PEISKER

Die Bedingungen fiir die Enzymtrennung und -visulaisierung im R6hrchen oder in dicken Schichten sind oft nicht auf die ultradiinnen Schichten iibertragbar und miissen entsprechend angepaBt werden. Die mit der Schere vorzerkleinerten Gerstenblatter werden in der Kalte mit Seesand und einem Tris-Maleat-Puffer pH = 7,4 (vgl. Wissenschaftl. Tabellen) homogenisiert, 30 min zur besseren Extraktion im Kiihlschrank aufbewahrt und anschlieBend 1 min bei ~~800 x g zentrifugiert. Der Uberstand laBt sich durch ein modifiziertes Korbsiebverfahren (PEISKER 1984) auf 1/10 des Ausgangsvol urn ens einengen und weitestgehend von stiirenden niedermolekularen Substanzen befreien. Die Trennung der Proteine erfolgt bei 10°C in einer Flachbettelektrophoresekammer yon Pharmacia mit dem Gleichspannungsregler Typ 4209 yom VEE Statron als Hochspannungsquelle. Densitogramme werden mit dem Eiscript II von Hirschmann aufgenommen. Ultradiinne Gele werden nach einer einfachen Klapptechnik (PEISKER 1985; R~DOLA 1980a) hergestellt. Polyesterfolien (Gel-Fix) sind von Serva, Chemikalien von Serva, Reanal oder dem Arzneimittelwerk Dresden. Die gelbeschichteten Folien werden mit n-Nonan auf den Kiihlblock aufgezogen. Ais Strombrucken finden "Electrode strips" von Pharmaeia, als Anolyt eine 0,73 m Phosphorsaure und als Katholyt eine 0,51 m Ethylendiaminliisung Verwendung. Mit der bei PEISKER 1985 aufgefiihrten Spannungsfiihrung lassen sich sehr gute Trennergebnisse erzielen. N ach der Trennung erfolgt die sofortige Weiterverarbeitung der Elektrophoresen. AbschlieBend werden die Zymogramme bzw. die mit Servablau R angeiarbten Proteintrennungen mit einem "Universalgemisch" (Wasser: Methanol: Eisessig wie 5: 4: 1) entfarbt und dann luftgetrocknet. So lassen sich farblich und mechanisch stabile Folien erhalten, die belie big abheftbar sind. Die im folgenden vorgestellten Methoden sind das Resultat von Optimierungsversuchen. Nachweis der Proteine. Sie werden mit einer 20%igen Trichloressigsaure iiber eine halbe Stunde fixi'ert und 30 min in einer gesattigten Liisung von Servablau R in "Universalgemisch" gefiirbt. Entfarbung und Trocknung erfolgen wie beschrieben. Anfiirbung der multiplen POD-Form en. Dies wird in Anlehnung an SCHMIDT et al. (1979, 1984) und SCHRAUWEN (1966) sowie BiiTTXER (1983) durchgefiihrt:

110 mg Guajacol, 40 mg Benzidin und 20 mg Manganchloird in 10 ml 20%iger Essigsaure geliist und mit 10 ml Wasser verdunnt, werden in 140 ml 0,2 m Natriumacetatlosung gegeben. Nach dem Zupipettieren von 100 III Perhydrol (30%ig) wird 5 min inkubiert. Entfarben des Untergrundes, Trocknung und Dokumentation schlieBen sich an. Tabelle 1. Anfiirbemethoden (iir einige Enzyme Esterase

saure Phosphatase

Leucinaminopeptidase

Tris-l\faleat-Puffer

Tris-Maleat-Puffer 6,2 1 Leucinnaphthylamid 50 in 2 ml Aceton (50%ig) 40 mg MnCl 2 Fast Black K,40 30 min " Universalgemisch"

Puffer pH-Wert Vorinkubationszeit in min Substrat

Tris-l\Ialeat-Puffer 69 1 Naphthylacetat

mg/lOO ml

30 in 2 ml Aceton

50

Zusatze Farbsatz, mg/100 ml Inkubationszeit Entfarbung

Fast Blue B,100 30 min "U niversalgemisch"

Fast Blue B,100 30 min " Universalgemisch"

,~

"9 0,_ 1 N aphthylphosphat

Trcnnung multipler Enzymformcn

409

Anfiirbung dcr multiplen Superoxid Dismutasc-Formell. Dies wird in Anlehnung an JAASKA und J .uSKA (198~) und SCHULZ (1980) durchgefiihrt. Die Elektrophoresen werden 1 min in Tris-Maleat-Puffer pH 8,G eingelegt und kommen dann fiir ~O min in eine Liisung von 60 mg J~T und 6 mg PMS in 100 ml des gleirhen Puffers. Narh griindlie hem Abspiilen wird dann ~O min mit einer Liisung von ~O mg NADH2 in 100 ml Puffer inkubiert. Die multiplen SOD-Formen erscheinen als helle Banden auf rotviolettem Untergrund. Eine Behandlung mit "Universalgemisch" schlieBt sich an. Die Anfiirbemethoden fiir die Esterase, saure Phosphatase und LAP sind in Tabelle 1 aufgefiihrt, hierbei erfolgt eine methodisehe Anlehnung an GiiHG et al. (1979) und SCH~IIDT et a!. (1979, 1984). Fiir die Probenauftragung wird Zelluloseacetatfolie ausgewahlt. 1m Gegensatz zu den sonst empfohlen3n Applikationsmiiglichkeiten halt diese Folie Partikel zllfiick, die bei der kurzen Zentrifugationszeit nieht vollstandig sedimentieren und zu erhebliehen Stiirungen fiihren kiinnen. Eine strichfiirmige Probenauftragung zeigt bessere Trennergebnisse als die Applikation in Tropfenform. Yon groBer Bedeutung ist auch die Wahl der Auftragstelle. Einerseits fiihren untersehiedliche Applikationsorte z. T. zu viillig versehiedenen Zymogrammen, andererseits miissen Intcrferenzen der am Auftragungsort evtl. entstehenden Artefakte mit anderen Randen vermieden werden. Die hier vorgestellten Verfahren basieren auf del' Verwendung von Inkubationsliisungen. Inkubationszeiten, pH- Werte, Substrat- und Farbsalzkonzentrationen sind in einer Reihe von Vorversue hen so auf die Bedingungen im ultradiinnen Gel abgestimmt worden, daB eine miigliehst optimale Anfiirbung einzelner Enzymbanden erreicht win!. Sandwich-Verfahren (H6FEL~LlXX 1983) zeigen fiir die untersuehten Enzyme keine bessJren Ergebnisse, sind aber mit hiiherem Arbeitsaufwand verbunden. Die ultradiinnen Gele diirfen nieht zu lange vorinkubiert werden, weils es sonst zur Extraktion von Prot~in8n llnd Bandcnverbreiterungen kommt.

Abb. 1. Zymogramme del' a, SOD; b, Esterase; c, LAP; d, SP; c, POD

410

K. PEISKER

Die Folien sind im Gegensatz zum Glas als Tragermaterial nicht nur wesentlich besser aufzubewahren, sonder auch viel vorteilhafter mit einem Densitometer auszuwerten. Besonders interessierende Bereiche konnen einfach ausgeschnitten und dann desitometriert werden.

Die statistische Auswertung von jeweils 3 Wiederholungen (3 Mischproben aus je 10 gleichbehandelten Gerstenpflanzen) ergibt fur die vorgestellten Trenn- und Nachweisverfahren Variationskoeffizienten von 3-10 %. Als MeBgroBen werden die relativen Peakhohen einzelner Banden verwendet. Wie die Abbildung 1a-e verdeutlicht, erweisen sich die hier vorgestellten Methoden der Auftrennung und Anfarbung multipler Enzymformen als sehr leistungsfahig. Filr die einzelnen Enzyme lassen sich cine Vielzahl scharfer und gut reproduzierbarer Banden erkennen. Fur die LAP (Abb. lc) und die SP (Abb. ld) ist der Einsatz von Ampholyten mit einem engeren pH-Bereich anzuraten, z. B. 0-8. Die aufgezahlten Vorteile der UDIEF auf Polyesterfolie empfehlen diese Technik als Methode der Wahl bei der Auftrenl1ung multipler Enzymformen.

Literatur BUTT"t;R, R.: Die Variabilitat der Peroxydase-Isoenzymspektren der Apfelsorte "Golden Delicious" und verschiedener Apfelunterlagen im Hinbliek allf eine Pfropfunvertraglichkeits-Friihdiagnose. Arch. Gartenbau 31, 35-46 (1983). GORG, A., et al.: Ultradiinnsehicht-isoelektrisehe Fokussierung uml Ultradiinnschicht-Elektrophorese in Polyaerylamidgel auf Folien. Labor-Mell. 2, 32-40 (1979). HOFELMANX, M., et al.: Ultrathin-layer Agar-gels: A novel print Technique for ultrathin layer isoelectric focusing of enzymes. Anal. Bioehem. 128, 217 -222 (1983). JAASKA, VILVE, and JAASKA, v.: Isoenzymes of superoxide dis mutase in barley. Biochem. Physiol. Pflanzen 177, 375-386 (1982). OHLENSCIlLAGER, G., BEIWEI(, I., und DEPNEH, W.: Synopsis der Elektrophorcsetechniken. G IT- Verlag Ernst Giebeler, Darmstadt 1980. PEISKEH, K.: :\lethodische Untersuchungen znr SDS-Elektrophorese von Harnproteinen. Z. med. Labor.-Diagn. 2;;, 372-377 (1984). PEISKEI(, K.: Die isoelektrisehe Fokussierung (IEF) von Urinproteinen in ultradiinnen (0,18 mm) Polyacrylamidgelen. Z. med. Labor.-Diagn. 26, 28-33 (1985). RADOLA, B. J.: Ultrathin-layer isoelectrie focusing in 50-100 flm polyacrylamide gels on silanized glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980a). RADOLA, B. .T.: Von der Diinnschicht zur Ultradiinnschicht: Nostalgie und Fortschritt der isoelektrischen Fokussierung in Gelen. DESAGA-Report S. 3-9 (1980b). ScmnDT, .T. C., et al.: Verfahren zur Fraktionierung von Isoenzymen am Beispiel Avena. Tag.-Ber. Akad. Landwirtsch.- Wissensch. DDR 168, 265-273 (1979). SCHMIDT, J. C., et al.: Isoenzyme als biochemisehe lIarkerfaktoren fiir Roggenchromosomen. Bio('hem. Physiol. Pflanzen 179, 197-210 (1984). SCHRAUWE:>f, J. A. M.: Naehweis von Enzymen nach elektrophoretischer Trennung an Polyaerylamid-Sanlchen. .T. Chromatogr. 23, 177-180 (1966).

Trennung multipler Enzymformen

411

SCHULZ, H.: Aktivitii.tsbestimmung der Superoxid-Dismutase-Isoenzyme von Pinus sylvestris Nadeln im Polyacrylamidgel. Biochem. Physiol. Pflanzen 178, 249-261 (1983). Wissenschaftliche Tabellen Geigy, Teilband Hamatologie und Humangenetik, 8. Auflage, Basel 1979, S.61.

Eingegangen am 10. September 1984; revidierte Form akzeptiert am 18. Dezember 1984 Anschrift des Verfassers: Dr. K. PEISKElt, St.-Elisabeth-Krankenhaus, Klinisch-chemis!'he Laborabteilung, DDR - 4020 Halle (Saale), ~lauerstra6e 5-10.