Untersuchungen über die Kutikularwachse in der Gattung Cistus L. (Cistaceae)

Botanisches Institut der Universitat zu K61n, Physiologisch-Chemisches Institut der Universitat Bonn, Bundesrepublik Deutschland

Untersuchungen iiber die Kutikularwachse in der Gattung Cistus L. (Cistaceae) VI. Die Zusammensetzung der Alkene aus Cistus-Petalen und die Lage der Doppelbindung in diesen Alkenen am Beispiel von 3 Cistus-Arten Investigations on Cuticular Waxes in the Genus Cistus L. (Cistaceae) VI. Composition of Alkenes from Cistus Petals and the Position of the Double Bonds in these Alkenes Examplified with 3 Cistus Species PAUL-GERHARD GULZ, EVA AMIGONI, BRIGITTE SCHMITZ und HEINZ EGGE Mit 3 Abbildungen Eingegangen am 11. Januar 1979 . Angenommen am 3. Februar 1979

Summary Alkenes in amount of 4 % to 19 Ofo were isolated from the hydrocarbon fraction of Cistus petals. Odd numbered alkenes with chain lengths from C 23 to C a5 were predominant. All alkenes possess cis configuration. Isomeric monoenes with different positions of the double bonds were observed in most cases. The position of the double bonds could be identified with the aid of combined gas chromatography mass spectrometry of the corresponding diOTMS-derivatives. Prevailing were positions in L19. Alkenes with double bond positions in L11, L14, L15, L110, L111 and L113 were present in lower concentrations. In alkenes with longer chain length the double bonds were found more to the middle of the chain. Key words: Alkene patterns, alkene double bond position, Cistus.

Einleitung Neben einer homologen Reihe von n-Alkanen sind in den Gaschromatogrammen der Kohlenwasserstoff-Fraktionen aus Cistus-Petalen noch weitere Peaks zu erkennen. In einer frliheren Arbeit wurden sie aufgrund ihrer Retentionszeiten als verzweigte Alkane angesprochen (ENGEL und GULZ, 1976), da bei den Blattwachsen der Cis ten verzweigte Alkane eindeutig nachgewiesen werden konnten (KOHLEN und Z. P/lanzenphysiol. Bd. 94. S. 35-43. 1979.

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PAUL-GERHARD GULZ, EVA AMIGONI, BRIGITTE SCHMITZ und HEINZ EGGE

GULZ, 1976). Diinnschichtchromatogramme auf mit AgN0 3 impragnierten Kieselgelplatten gaben jedoch Hinweise auf das Vorliegen von ungesattigten Kohlenwasserstoffen. Alkene sind bei den Petalen aller untersuchten Cistus-Arten zu beobachten und betragen bis zu 19 Ofo der Kohlenwasserstoffe (GULZ et aI., 1979). Bei drei CistusArten, deren Petalen in groGeren Mengen geerntet werden konnten, sollen die Alkene naher beschrieben werden.

Material und Methoden Zur Untersuchung wurden Cistus-Arten herangezogen, die in griiGeren Mengen die Ernte von Petalen ermiiglichten. Es waren dies Cistus ladanifer, Cistus albidus und Cistus incanus. Sie wurden im Garten des Botanischen Institutes der Universitat zu Kiiln aus Wildaufsammlung en herangezogen. Die Ernte der Petalen erfolgte taglich in der Zeit von Mai bis Juni 1977. Von den Petalen (1250-4650 g) wurden mit Chloroform die Epikutikularwachse extrahiert und auf Kieselgelsaulen aufgetrennt (GULZ et ai., 1979). An Kohlenwasserstoffen wurden 360 mg bis 870 mg isoliert. Diinnschichtchromatographie (DC): DC-Fertigplatten Kieselgel 60 (Merck) 20 X 20 cm, Schichtdicke 0,2 mm, wurden mit 0,6 g AgN0 3 in 10 ml Acetonitril bespriiht und 2 Stunden bei 110°C aktiviert. Laufmittel: iso-Octan (GULZ et ai., 1978). Infrarot-Spektrometrie (IR): Perkin-Elmer Infracord 137, Film auf KBr. Gaschromatographie (GC): Hewlett-Packard Modell 5750, Flammenionisationsdetektor. 60 m Glaskapillarsaule OV 101 mit DirekteinlaG. Saulenvordruck: 1,4 kp/cm 2 N2 Temperaturprogramm 220-280 °c, Anstieg 4°C/Min. und 20 Min. isotherm bei 280°C. Hewlett-Packard Integrator, Modell 3380 A. Hydrierung: Palladiumaktivkohle, H 2 • Hydroxylierung: Osmiumtetroxid in Pyridin. Silylierung: N -Methyl-N -trimethy lsil yl trifl uoracetamid (MSTF A) Gaschromatographie - Massenspektrometrie (GC-MS): LKB 9000, 2 m Glassaule mit 3 0/0 SE 30 auf Chromosorb W SE 30 auf Chromosorb W Temperatur: 180-260 °c mit 2° IMin. Ionenquelle: 270°C; Injektionsblock: 250°C Separator: 280 DC; Ionisationsenergie: 20 eV Beschleunigungsspannung: 3,5 KV Fallenstrom: 60 flA

Ergebnisse Isolierung und Nachweis von Alkenen Die aus den Petalen isolierten Kohlenwasserstoff-Fraktionen wurden tiber mit AgN0 3 impdignierten Kieselgelplatten praparativ aufgetrennt. Alkane weisen einen rf-Wert von 0,8, Alkene einen von 0,1 auf. Zwischen beiden Werten sind keine weiteren Substanzen zu erkennen. Die Zusammensetzung der Kohlenwasserstoffe wurde aus Gaschromatogrammen der Gesamtfraktion sowie der isolierten Alkene nach ihrer Hydrierung berechnet Z. Pjlanzenphysiol. Ed. 94. S. 35-43. 1979.

Alkene aus Cistus-Petalen

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Table 1: Composition of hydrocarbons, n-alkanes and alkenes = 100 0/0. Species

C. ladani/er

C. albidus

C. incanus

HC in mg HC in Ufo dr. weight Alkenes in Ufo C-No. Alkanes 19-22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34-39 Alkenes 23 25 27 29 31 33 35

597 0.1 5.1

872 0.16 10.8

356 0.16 8.2

+ = < 0.1 Ufo

HC

+

36.3 3.0 42.4 0.6 10.2 0.3 1.9 0.3

+ + + +

0.6 1.0 0.9 1.2 1.1

0.3

+

+

9.3 1.7 38.0 1.8 25.4 0.9 9.4 0.3 2.1

+

+

9.3 1.5 37.0 1.5 27.4 1.0 10.7

+

2.7

0.2

+

+ + +

0.2 1.8 1.4 3.1 4.2 0.3

0.2 0.8 0.6 2.5 3.5 0.5

+

+

= hydrocarbons

und ist in Tabelle 1 wiedergegeben. Die quantitativen Angaben iiber die n-Alkane entsprechen friiheren Befunden im Rahmen der natiirlichen Schwankungsbreiten (GULZ et al., 1979). Die Gaschromatogramme der Alkene weisen auf eine recht komplexe Zusammensetzung hin. 1m wesentlichen sind ungeradzahlige Alkene der Kettenlange C23 bis C 35 zU beobachten. Pro Kohlenstoffzahl sind stets mehrere Peaks zu erkennen, die jedoch nach Hydrierung auf entsprechende n-Alkane zuriickgefiihrt werden konnen. Die Gaschromatogramme lassen also Alkene gleicher Kettenlange, jedoch verschiedener Lage der Doppelbindung vermuten (Fig. 1). Aufgrund der IRSpektren ist den Doppelbindungen der Cistus-Alkene cis-Konfiguration zuzuschreiben, da die fiir eine trans-Konfiguration charakteristische und sehr stark ausgepragte Bande bei der Wellenzahl 970 cm-1 bei den Alkenen der untersuchten Cistus-Arten vollstandig fehIt. Auch die auf eine endstandige Lage der Doppelbindung hindeutenden Banden bei der Wellenzahl 900-940 cm- 1 und 985-995 cm- 1 sind nicht, oder nur auBerst schwach zu beobachten (WILLIAMS und FLEMING, 1975).

z. P/lanzenphysiol. Bd. 94. S. 35-43. 1979.

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PAUL-GERHARD GULZ, EVA AMIGONI, BRIGITTE SCHMITZ

und

HEINZ EGGE

A

8

C33en

I

30 min RT 10 20 Fig. 1: GLe of the hydrocarbon fraction (A) and isolated alkenes (B) from petals of Cistus albidus.

Lage der Doppelbindung in den Alkenen

Zur Bestimmung der Lage der Doppelbindung in den Alkenen wurden diese mit Osmiumtetroxid hydroxyliert und nach Silylierung mit Hilfe der Gaschromatographie, kombiniert mit Massenspektrometrie, analysiert (GiiLZ et aI., 1978). 1m Gegensatz zu den Massenspektren der nativen Alkene zeigen die Di-OTMS-Verbindungen ein auBerordentlich klares Fragmentierungsverhalten, das eine eindeutige Bestimmung der urspriinglichen Lage der Doppelhindung erlaubt. Bei niedriger lonisierungsenergie (20 eV) werden im oberen Massenbereich neben einem sehr schwachen Molekiilion nur 3 Fragmente erhalten: M-15, sowie die Fragmente A und B, die sich zu M addieren (Table 2) (Fig. 2).

z.

Pflanzenphysiol. Bd. 94. S. 35-43. 1979.

Alkene aus Cistus-Petalen

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Table 2: Identified alkenes, important fragments and relative intensities from the mass spectra of their corresponding di-OTMS-derivatives. Fragments of OTMS-derivatives Alkene

A mle

reI. Int.

B mle

0/0

A 1 C 2a A 9 C 2a A 1 C 25 A 9 C 25 A 1 C 27 A 4 C 27 A 5 C 27 A 9 C 27 A 5 C 29 A 9 C 29 A 5 Cal A 9 Cal A 9 C aa Al0 C aa All C a3 A 9 C ss All C a5 A13 C a5

103 215 103 215 103 145 159 215 159 215 159 215 215 229 243 215 243 271

8.0 100.0 4.7 100.0 21.5 85.9 100.0 100.0 85.2 100.0 94.3 100.0 100.0 100.0 86.9 100.0 100.0 91.5

397 285 425 313 453 411 397 341 425 369 453 397 425 411 397 453 425 397

reI. Int.

M-15 reI. Int. mle 0/0

M mle

100.0 92.3 100.0 94.4 100.0 100.0 83.9 95.4 100.0 90.7 100.0 92.7 82.0 84.9 100.0 74.4 95.5 100.0

485 485 513 513 541 541 541 541 569 569 597 597 625 625 625 653 653 653

500 500 528 528 556 556 556 556 584 584 612 612 640 640 640 668 668 668

Ofo

4.7 6.5 5.7 4.9 4.0 4.0 6.0 4.3 6.6 4.5 4.4 4.9 4.3 3.2 3.6 4.7 4.7 4.7

Dieim einzelnen nachgewiesenen Alkene und die ihnen zugrunde liegenden Massenfragmente sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Bei den drei untersuchten Cistus-Arten findet man hei den ungeradzahligen Alkenen der Kettenlange C 2a--C as uberwiegend Monoene mit Lage der Doppelbindung in Position ,19. Von den Alkenen dieser Kettenlangen sind in geringerer Konzentration weitere isomere Alkene nachgewiesen worden. Alkene der Kettenlange C 2S-C 27 weisen Doppelbindungen in Position ,11 auf. Ab C 2.CSl werden bei C. albidus und c. incanus Doppelbindungen in Position ,15 beobachtet. Vorwiegend bei C sa und C S5 treten Positionen in ,111, ,113 und ,110 auf (Table 3). Diskussion

Ungesattigte Kohlenwasserstoffe sind in den verschiedensten Pflanzenorganen beschrieben worden; sie kommen dort meistens nur in gering en Mengen vor (TULLOCH, 1976). Aufgrund der IR-Spektren uberwiegt bei den Alkenen die cis-Konfiguration. Am Beispiel der Rosa damascena wurde folgende Zusammensetzung beschrieben: 95 Ofo cis-Alkene, 2 Ofo trans-Alkene und 3 Ofo Al-Alkene (WOLLRAB, 1968). Die Struktur der Pflanzen alkene ist jedoch nur selten untersucht worden. WOLLRAB hat durch Analyse der Fettsauren, die bei der oxydativen Spaltung der gebiIdeten Ozonide

z.

Pjlanzenphysiol. Bd. 94. S. 35-43. 1979.

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PAUL-GERHARD GULZ, EVA AMIGONI, BRIGITTE SCm.nTZ und HEINZ EGGE 9,10-01 -OTMS-NONRCOSRNE

1000

Bl

R1

800 >-

f-

~

If)

z

W

:= GOO f-

w

>

f-

a:

--'

w

a: 400

200

M·lS 400

500

Fig. 2: Mass spectrum of 9, 10-di-OTMS nonacosane.

Table 3: Position of double bonds in Cistus alkenes;

0

=

traces.

C-No.

C. ladanifer

C. albidus

C. incanus

23 2S 27 29 31 33 3S

Ll9,Lll Ll9,Lll Ll9, (Lll)

Ll9,LlI Ll9,LlI Ll9, Lls, (Lll)

Ll9,Lll Ll9, Lll Ll9, Lls, (Lll), (Ll4)

Ll9 Ll9 Ll9

,19, ,1s Ll9, (LlS) Ll9, ,111, (,110)

,19, ,1s Ll9, (LlS)

Ll9, Llll, (LlI0) (,19), (,111), ,113

anfallen, die Lage der Doppelbindung untersucht. Als Untersuchungsobjekte dienten die Bliitenblatter und Friichte der Rosa damascena, da sie Alkene zu 19,7 % bzw. 40,7 % der Kohlenwasserstoffe enthalten. An diesen Alkenen der Kettenlange C IUCal wurde die Doppelbindung iiberwiegend in Position L15 nachgewiesen, bei hoherer C-Zahl auch in L17. In den Friichten wurde neben diesen Positionen auch die von L19 beschrieben. Ferner liegen Befunde von Papaver rhoeas vor, deren cis-Alkene Doppelbindungen in den Position en L17, L19 und L111 aufweisen (STRANSKY und STREIBL, 1969). Z. Pjlanzenphysiol. Bd. 94. S. 35-43. 1979.

Alkene aus Cistus-Petalen

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In den Petalen der Gattung Cistus dominieren cis-Alkene mit einer Doppelbindung in Position ,19. Unter Beriicksichtigung der von KOLATTUKUDY (1976) vorgeschlagenen Biosynthese von gesattigten Kohlenwasserstoffen aus C1s-Fettsauren durch Kettenverlangerung dieser Sauren urn C 2 -Einheiten mit anschlieBender Decarboxylierung diirfte den ,19-Alkenen der Cisten als Vorstufe Fettsauren der Olsaurefamilie mit w9-Position der Doppelbindung zugrundeliegen. Auffallend haufig sind ,15-Isomere. Sie lassen sich moglicherweise auf die Aktivitat eines 2. Enzyms zuriickfiihren, das in erster Linie Myristinsaure umsetzt (BRETT et aI., 1971). Aus den Massenspektren der OTMS-Alkane geht auBerdem hervor, daB die Hauptkomponenten mit Doppelbindung in ,19 mit steigender Kettenlange zunehmend von Isomeren begleitet sind, die sich urn jeweils 14 Masseneinheiten unterscheiden (Fig. 3), also von ,17, ,18, A10, ,111-Alkenen. Wahrend sich von den OTMS-Derivaten der A9-Alkene ohne weiteres reine Massenspektren gewinnen lieBen (Fig. 2) war das bei diesen Nebenkomponenten nicht immer moglich, da sie zum Teil nur in Spuren vorhanden sind und nicht aufzutrennen waren. Das Vorkommen dieser Isomeren lieBe sich zum Teil damit erklaren, daB das Enzym, das die Doppelbindung in ,19-Position in Fettsauren einfiihrt (,19-Desaturase) zwar 1000

RI

800

81

>>
W

>-

::=

600

w > >-

a:

--' w cr::

400

84

82

A2

200

A5

A4

85

83

Fig. 3: Mass spectrum of a mixture of isomeric di-OTMS-nonacosanes. Fragments An' Bn correspond to the following alkenes: At> B I : L19-C 29 ; A 2, B2 : L15-C2o ; A 3, B3: L17-C29 ; A 4 , B4 : L1S-C29 ; A 5, B5: L110-C 29 •

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Stearinsaure als Substrat bevorzugt, aber auch Fettsauren akzeptiert, die um 1 bis 4 C-Atome kiirzer oder langer sind als Stearinsaure (JOHNSON et aI., 1969). Nicht erklart wird hierdurch die Biosynthese der A1-Alkene, die bei hoheren Pflanzen auch von WOLLRAB (1967, 1968) wiederholt beschrieben worden sind. Da w1-Fettsauren in hoheren Pflanzen so gut wie unbekannt sind, erhebt sich die Frage, ob die A1-Alkene nicht im Rahmen der Decarboxylierung der hoheren Fettsauren zu Alkenen gebildet werden. Dariiber hinaus kommen bei allen 3 untersuchten Cistus-Arten zwei Verbindungen mit zwei in Vinylstellung angeordneten Doppelbindungen vor. In den Massenspektren der entsprechenden OTMS-Derivate sind folgende charakteristische Fragmente vorhanden:

Die Kombination dieser drei Fragmente ist vom Tetra-OTMS-Derivat der Linolsaure her bekannt. Sie treten dort mit einer sehr ahnlichen Intensitatsverteilung auf (MURAWSKI et aI., 1971). Basispeak ist m/e = 301. Neben m/e = 391 und m/e = 173 sowie einigen weniger intensiven Bruchstiicken enthalt das eine Massenspektrum ein Fragment bei m/e = 469, das andere bei m/e = 497 mit jeweils einer Intensitat von 70 % des Basispeaks. Die Differenz von 28 amu lafh vermuten, daB es sich um Isomere handelt. Eine exakte Identifizierung des Restes x lassen die Massenspektren allerdings nicht zu. Frau ELKE LATZA sei fur ihre sehr umsichtige und selbstandige Mitarbeit gedankt.

Literatur BRETT, D., D. HOWLING, L. J. MORRIS, and A. T. JAMES: Arch. Biochem. Biophys. 143, 535 (1971). ENGEL, R. und P.-G. GULZ: Z. Pflanzenphysiol. 79,401 (1976). GULZ, P.-G., P. PROKSCH und D. SCHWARZ: Z. Pflanzenphysiol. 92, 341 (1979). GULZ, P.-G., P. FAXEL, G. B. FEIGE, B. SCHMITZ und H. EGGE: Z. Pflanzenphysiol. 89, 159 (1978). JOHNSON, A. R., A. C. FOGERTY, J. A. PEARSON, F. S. SHENSTONE, and A. M. BERSTEN: Lipids 4, 265 (1969). KOHLEN, L. und P.-G. GULZ: Z. Pflanzenphysiol. 77, 99 (1976). KOLATTUKUDY, P. E., R. CROTEAU, and J. S. BRUCKNER: Biochemistry of Plant Waxes. In: P. E. KOLATTUKUDY (Ed.): Chemistry and Biochemistry of Natural Waxes, p. 289. Elsevier 1976. MURAWSKI, U., H. EGGE und F. ZILLIKEN: Z. Naturforsch. 26 b, 1241 (1971). STRANSKY, K. and M. STREIBL: Collection Czechoslov. Chern. Commun. 34, 103 (1969).

z.

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Alkene aus Cistus-Petalen

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TULLOCH, A. P.: Chemistry of Waxes of Higher Plants. In: P. E. KOLATTUKUDY (Ed.): Chemistry and Biochemistry of Natural Waxes, p. 235. Elsevier 1976. WILLIAMS, D. H. und ]. FLEMING: Spektroskopische Methoden zur StrukturaufkHirung. Georg Thieme Verlag, 1975. WOLLRAB, V.: Collection Czechoslov. Chern. Commun. 32, 1304 (1967). - Collection Czechoslov. Chern. Commun. 33, 1584 (1968). Dr. P.-G. GiiLz, Botanisches Institut der Universitat zu Koln, GyrhofstraBe 15, D-5000 Koln 41. Prof. Dr. H. EGGE, Physiologisch-Chemisches Institut der Universitat Bonn, NuBallee 11, D-5300 Bonn.

z.

Pjlanzenphysiol. Bd. 94. S. 35-43. 1979.