Untersuchungen des Aminosäurestoffwechsels mit der Dünnschichtchromatographie zur Differenzierung von Bordetellen- und Alcaligenes-Spezies

Zbl. Bakt. Hyg. A 262, 313-320 (1986)

Untersuchungen des Aminosaurestoffwechsels mit der Diinnschichtchromatographie zur Differenzierung von Bordetellen- und Alcaligenes-Spezies Differentiation of Bordetella and Alcaligenes Species by Means of AminoAcid Metabolism with Evaluation by Thin Layer Chromatography

ERIKA BALKE, HANS-JOACHIM BATZA und ADELHEID SEIPP Institut fur Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere der justus-Liebig-Universitat Gie!Sen (Direktor Prof. Dr. Th. Schlief?er)

Eingegangen am 14. November 1985 . Angenommen am 3. Februar 1986

Summary The amino acid metabolism of Bordetella and Alcaligenes strains was investigated for differentiation purposes. All species investigated reacted differently with a number of amino acids. The genus Bordetella could be differentiated from that of Alcaligenes by its inability to metabolize Llysine, L-arginine and D-histidine. The recently described species Bordetella auium, as well as Achromobacter xylosoxidans (Yabuuchi), considered as Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxidans, presented themselves as independent species too. Bordetella odorans, now assigned to the species Alcaligenes faecalis was indistinguishable from the other strains of Alcaligenes faecalis investigated.

Zusammenfassung Bakterien der Gattungen Bordetella (B.) und Alcaligenes (A.) wurden auf ihren Aminosaure-Stoffwechsel untersucht und die Ergebnisse dunnschichtchrornatographisch ausgewertet. Aufgrund spezifischer enzymatischer Reaktionen gegenuber einer Anzahl Aminosauren konnte ein gekurztes Gattungs- und aile untersuchten Spezies umfassendes Spezies-spezifisches Stoffwechselmuster zusammengestellt werden, das von weiteren Aminosauren getragen wird. Ein Gattungs-spezifischer Stoffwechselunterschied liegt im Unverrnogen der Bordetellen- bzw. der Fahigkeit der Alcaligenes-Spezies begrundet, L-Lysin, L-Arginin und DHistidin metabolisieren zu konnen, Auch die neuerdings zur Spezies B. avium erhobene, B. bronchiseptica-iihnliche Bakteriengruppe und Achromobacter xylosoxidans (Yabuuchi), als A. denitrificans subsp. xylosoxidans eingeordnet, erwiesen sich als eigenstandige Spezies. Entsprechend der neueren taxonomischen Zuordnung von A. odorans zur Spezies A. faecalis, war ihr Stoffwechselmuster mit der auch bisher als A. faecalis gefuhrten Spezies identisch.

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E. Balke, H.-J. Batza und A. Seipp

Einleitung In einer vorhergehenden Arbeit wurden Spezies der Gattung Brucella anhand ihrer Arninosaure-Stoffwechselmuster differenziert (Balke et al., 1977). Ihnen stehen die Gattungen Bordetella (B.) und Alcaligenes (A.) mit den medizinisch interessanten Spezies B. bronchiseptica, B. parapertussis und B. pertussis sowie den neuerdings zur spec. nov. B. avium (Kersters et al., 1984) erhobenen B. bronchisepticaahnlichen Bakterien (Hinz et al., 1978 u. 1983; Pittmann, 1984) nahe. Wahrend die Differenzierung der drei bereits bekannten B.-Spezies mit ublichen Methoden erfolgt, bereitet sie bei A. faecalis und A. denitrificans wegen kaum bekannter spezifischer physiologischer und biochemischer Eigenschaften Schwierigkeiten (Kersters u. De Ley, 1984). Zudem wurde innerhalb der Gattung Alcaligenes der taxonomische Status einiger Spezies geandert. Es erscheint daher sinnvoll, den Arninosaure-Stoffwechsel einiger wichtiger Spezies auch dieser Gattungen zu untersuchen, zumal aus der Literatur hieriiber nur sparliche Daten bekannt sind.

Material und Methode

Chemikalien: Die Aminosauren waren von "p. a" bzw. "reinst" Qualitat und wurden teils von Serva, Heidelberg, teils, wie auch aile ubrigen Substanzen und die Nano-Kieselgel G-60 Platten (Nr. 5641) von Merck, Darmstadt, bezogen. Gewinnung der Organismen: Sie wurden auf Blutagarplatten 24 Std. (B. pertussis 48-72 Std.) bei gezuchtet, in sterilen Zentrifugenrohrchen gesammelt, nach Bestimmung des

3rc

Tabelle 1. Organismen Table 1. Organisms

Bordetella bronchiseptica: 9, 11, 14, 16 (Hund); 2739 (Hund, Kot); 7 (Schwein); 10,4546 (Kaninchen); 635, 2742 (Katze); 15 (Affe); 17, 18 (Rind)!). 40/81 (Pute, Tracheal", = (ATCC 35086) (Putenkuken, Luftsackfibrin); 110/78 (Putenkuken, Lunge); 383/78 (Putenkiiken, Trachea)", Bordetella parapertussis: NCTC 5952/8021. 133978/2, 13673741. Bordetella pertussis: NCTC 10739/80 21. 3838 31. 128396, 128696, 133980/1, 136811 41. Freiburg 85 (Kind)", Alcaligenes faecalis: NCTC 415 = (ATCC 19018); CCM 267; P 4083 (R. B. Rimier, NADC, Ames, Iowa USA) CCM 1052 = ATCC 8750 21. Alcaligenes faecalis, ehem. A. odorans: NCTC 10388; NCTC 10416)81 Alcaligenes denitrificans, subsp. denitrificans: NCTC 8582 = ATCC 15173)2 1. Roche'",

Bordetella avium: 591/77

Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxidans = Achromobacter xylosoxidans: KM 543 (NCTC 10807) (Yabuuchi, 1974)21. 18 71.

=

Herkunft: 1) Stammsammlung un serer Institutes. Fur die uns iiberlassenenbtamrne danken wir: 2) Prof. Dr. K.-H. Hinz, Klinik fur Gefliigel, Hannover; 3) Dr. G. Hollander, Staat!. Medizinal-Untersuchungsamt Osnabriick; 4) Dr. Hoppe, Hygiene-Institut der Universitat Tiibingen: 5) Dr. Rubsamen, Tierhygienisches Institut der Universitat Freiburg i.Br.; 6) Fa. Hoffmann-La-Roche AG, Grenzach-Wyhlen; 7) Prof. Dr. A. Weber, Institut fur Hygiene und Medizinische Mikrobiologie der Universitat Erlangen; 8) Dr. Mutters, Medizinisches Zentrum fur Hygiene u. Medizinische Mikrobiologie der Universitat Marburg.

Differenzierung von Bordetellen- und Alcaligenes-Spezies

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Feuchtgewichtes in steriler 0,01 molll Phosphat-gepufferter physiol. Naf.l-Losung mittels Riittlers (Fa. Heidolph) suspendiert (in ca. 30 mUO,2 g Feuchtgewicht), abzentrifugiert (10 000 x g, 2,5 Min.) und der Oberstand verworfen. Fur den Enzymtest wurde eine 1%ige Bakteriensuspension in obigem Medium hergestellt: und eine Halfte fur den Ansatz der Kontrollwerte 20 Min. im kochenden Wasserbad erhitzt. Enzymtest: Sterile Zentrifugenrohrchen (5 mm x 6 em) fur Test- und Kontrollwerte enthielten je 10 ~I = 0,1 ~Mol einer in sterilem bidest. Wasser gelosten Aminosaure als Enzymsubstrat und 200 ~I der unmittelbar vor dem Test gewonnenen Bakteriensuspension. Mit einer Alu-Folie abgedeckt, wurden die Rohrchen in einer feuchten Kammer 16 Std. bei 37°C unter leicht schaukelnder Bewegung inkubiert und die Bakterien danach scharf abzentrifugiert (10000 x g, 30 Min.). Der klare Uberstand wurde sofort diinnschichrchromatographisch untersucht. Dunnschichtcbromatographie: Sie wurde auf Nano-Kieselgel G-60 Platten eindimensional in horizontaler FlieBrichtung (Camag, HPTLC Linearkammer) und Laufmittel-damptgesattigter Atmosphare (Laufstrecke 5 em) durchgefiihrt, Ais Laufmittel diente ein n-ButanolEisessig-Wasser-Gemisch (20: 5: 5). Fur Test- und Kontrollwerte wurden je 1 ~I (HamiltonSpritze) des klaren Inkubationsmediums und fur einen rnitgefiihrten Standard der entsprechenden Aminosaure 0,1 ~I (= 1 nMo!) in 5 mm Abstand von der Kante auf die Platte aufgetragen. Urn gut ablesbare Ergebnisse zu erhalten mufsten jedoch bei ~-Alanin 8 ~I, bzw. dem Standard 0,4 ~I, bei L- und D-Asparagin 6 bzw. 0,3 ~I, bei L- und D-Prolin 10 bzw. 0,5 ~I, bei L- und D-Cystin, Hydroxyprolin und L- und D-Tryptophan 4 bzw. 0,2 ~I und L-aAminobuttersaure 5 bzw. 0,3 ~I aufgetragen werden. Mengen bis zu 1 ~I wurden als eine Dosis, daniber hinaus diese mehrmals aufgetragen, dazwischen getrocknet. Die Aminosauren wurden durch intensives Bespnihen mit dem Ninhydrin-Reagenz (1%ig (!) in Aceton + 2 % Eisessig) und Erhitzen (einige Minuten auf 120 oq , L-Hydroxyprolin mit dem Ninhydrin-Isatin-Triathanolamin-Reagenz (135 mg: 65 mg: 1 ml) und wie zuvor Erhitzen (Kolor, 1957) und ~-Alanin mit dem von Larsen et al. (1960) beschriebenen Verfahren nachgewiesen (Trockene Chromatogramme wurden mit einer Losung aus 0,25 g Cu(N0 3h·3 H 20 und 2,0 g wasserfreiem Natriumacetat in 100 ml abs. Methanol bespniht, dann 2 Min. auf ca. 70°C erhitzt, anschlieBend mit 0,2%iger Ninhydrinlosung in Aceton bespruht und wieder erhitzt).

Ergebnisse Die Untersuchungen wurden im Prinzip nach der von uns bereits beschriebenen Methode durchgefuhrt (Balke et al., 1977). Alle Ergebnisse sind in Tab. 2 zusammengestellt. Die im Inkubationsmedium des enzymatischen Tests vorhandene Aminosaurernenge und das auf die DC-Platten aufgetragene Volumen waren so gewahlt, daB eine Stoffwechsel-bedingte geringfugige Abnahme der Aminosaure-Konzentration zu einer augenscheinlich schwacheren Farbintensitat des Testwertes gegenuber dem Kontrollwert

fuhrt. Den Stoffwechselleistungen der Tab. 21iegen l estiindige enzymatische Inkubationen zugrunde, weil Ergebnisse kurzerer Reaktionszeiten (4 u. 8 Std.) nicht immer deutlich abies bar waren. Die enzymatischen Leistungen eines Bakterienstammes wurden fur jede Aminosaure, beginnend mit der Anzuchtung der Bakterien, im allgemeinen 3 bis 4mal gepruft, Da diese Ergebnisse, wie auch die Stoffwechselleistungen aller zu einer Spezies gehorenden Starnme mit der gleichen Aminosaure untereinander identisch waren, konnten sie in jeweils einer Spalte der betreffenden Spezies in Tab. 2 zusammengefaBt wiedergegeben

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werden. Geringfiigige Schwankungen in den Reaktionen sind in der Legende zu Tab. 2 vermerkt. Dem differenzierten Stoffwechselverhalten der hier untersuchten Spezies zufolge gelang es, ein gekiirztes Gattungs- und aile untersuchten Spezies einschlielsendes Speziesspezifisches Aminosaure-Stoffwechselrnuster in Tab. 3 zusammenzustellen, das von weiteren Aminosauren getragen wird. So lassen sich anstelle der in dieser Tabelle aufgefiihrten Arninosauren fur L-Citrullin L-Cystein, Db-n-Aminoadipinsaure oder LCysteinsaure, fiir L-Phen ylalanin D-Phenylalanin oder D-Tyrosin, fiir D-Methionin LHistidin, L-Ornithin oder D-Tryptophan, fiir L-Lysin L-Arginin oder D-Histidin einsetzen. In wenigen Fallen schwankt die enzymatische Aktivitat bei diesen Aminosauren gegeniiber den entsprechenden in Tab. 3 aufgezeichneten Bewertungssymbolen zwischen ++ und +. Nur das Reaktionsschema mit D-Arg inin, D-Lysin und D-Ornithin wird von keiner weiteren Aminosaure erbracht. Die Gattungs-spezifischen Reaktionen der Bordetella- bzw. Alcaligenes-Spezies ergeben sich aus dem Unverrnogen bzw . der Fahigkeit, L-Lysin, L-Arginin und D-Histidin abzubauen. Beachtenswert am Stoffwechselverhalten ist, daR die bisher als B.-ahnlich bzw. B. bronchiseptica-ahnlich bezeichneten Bakterien (Hinz et al., 19 78 , 1981 u. 1983) nach Untersuchungen von Kersters et al, (198 4) zur Spezies B. avium erhoben - sich auch im Aminosaure-Stoffwechsel durch mehrere spezifische Reaktionen (L-H istidin, L-Ornithin, D-Tryptophan und D-Methionin) als eine eigene, von B. bronchiseptica abzugrenzende Spezies darstellen. Ebenfalls konnte die von Kersters u. De Ley (1984) als A. denitrificans subsp. xylosoxidans ernpfohlene Art = spec. nov. Achromobacter xylosoxidans (Yabuuchi u. Yano, 1974 ) aufgrund ihre s unterschiedlichen Verhaltens gegeniiber D-Arginin und DOrnithin als eigenstandige Subspezies von A. denitrificans subsp. denitrificans (Ruger u. Tan, 1983 ) abgegrenzt werden.

Tabelle 2. Untersuchungsergebnisse zum Aminosaurestoffwechsel von Bordetellen- und Alcaligenes-Stammen mit diinnschichtchromatographischer Auswertung. Es bedeutet, Arninosaure wurde bei den meist 3- bis 4fachen Untersuchungen iibereinstimmend: + + vollstandig metabolisiert, kein Farbfleck beim Testwert zu erkennen; + teilweise metabolisiert, Farbfleck des Tesrwertes gegeniiber dem Kontrollwert schwacher ausgebildet; - nicht metabolisiert, Farbfleck des Test- und Kontrollwertes gleich intensiv (s. auch Abb. 1 u. 2 in Balke et al., 1977). Stehen zwei Bewertungssymbole an der gleichen Stelle, so zeigte jeder der untersuchten Stamme im Verlaufe der Mehrfachbe stimmungen sowohl eine als + + oder + bzw. + oder - bewertete Reaktion . Von den in der Tabelle angegebenen Stoffwechselleistungen weichen ab: 1) Stamm CeM 1052 +, ++, ++; 2) Stamm NCT C 8582 +, +, +; 3) Stamm 18 +, +, +; 4) Stamm 591/ 77 ++, ++, ++; 5) Stamm 591/77 ++, ++, ++; 6) Stamm 136737 ++, ++ , ++; 7) Stamm KM 543 +, +, +; 8) Stamm Roche ++, + +, ++ ; 9) Stamm 59 1/77 +, +, + + ; 10) Stamm NCTC 415 +, +, -. Table 2. Results of amino acid metaboli sm of Bordetella and Alcaligenes strains by thin .layer chromatographical evaluation . Amino acids were metabolized: + + completely, no test sample spot; + partiall y, difference in color intensity compared to control value; - not metabolized, no difference in color intensity compared to control value.

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Differenzierung von Bordetellen- und Alcaligenes-Spezies Alcaligenes

Bordetella

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Aminosauren

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Alanin ~-Alanin

a-Aminoadipinsaure u-Aminoburrersaure Asparagin

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D L, D L L

D Citrullin

L

Cysteinsaure Cystathionin Cystein Cystin

L

L, D

a-E-Diaminopimelinsiiure Glutamin Glycin Homoserin Lanthionin Leucin

L,D L L

D L, D L

L, D L, D L

D Isoleucin

L

L,D Methionin

L

D Prolin

L

D Hydroxyprolin Serin Taurin Threonin Valin Asparaginsaure

Glutaminsiiure Arginin Histidin Lysin Ornithin

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L, D

Tryptophan

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Tabelle 3. Aminosaure-Stoffwechselmuster zur Gattungs- und Spezies-Differenzierung von Bordetellen- und Alcaligenes-Stammen. (Weitere im Sinne des Schemas spezifisch reagierende Aminosauren im Text aufgefiihrt) Bewertungssymbole: Aminosaure wird: + + vollstandig, + teilweise, - nicht metabolisiert. Table 3. Pattern of amino acid metabolism for differentiation of genera and species of Bordetella and Alcaligenes strains. Evaluation: Amino acid is metabolized: ++ completely, + partially, - not.

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parapertussis pertussis

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(aeealis [aecalis, ehem. odorans

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denitri(ieans subsp. denitri(ieans

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denitri(ieans subsp. xylos- '" oxidans = Aehromobacter xylosoxidans (Yabuuchi)

Die untersuchten Typstamme NCTC 10416 und NCTC 10388, zuvor als A. odorans beschrieben und von Kersters u. De Ley (1984) jetzt A. [aecalis zugeordnet, wiesen ein mit der Spezies A. (aeealis identisches Aminosaure-Stoffwechselmuster auf. Eine sehr schwache, nicht immer positive Reaktion mit D-Ornithin wurde insgesamt als negativ bewertet.

Diskussion Untersuchungen zum Arninosaure-Stoffwechsel sind bereits von Rowatt (1955) an je einem B. bronehiseptiea- (8752), B. parapertussis- (C 691) und B. pertussis-Stamm (M 2400) und von Meyer u. Cameron (1957) an je einem B. pertussis- und B. broncbiseptiea-Stamm mit der papierchromatographischen bzw. der arbeitsaufwendigen rnanometrischen Warburg-Methode durchgefuhrt worden. Die von beiden Arbeitsgruppen ermittelten Stoffwechselleistungen stimmen mit entsprechenden Ergebnissen unserer Spezies iiberein. Eine Ausnahme machen nur L-Histidin, das von B. bronehiseptiea Stamm 8752 nicht umgesetzt wird und Glycin, das von dem von Meyer u. Cameron untersuch-

Differenzierung von Bordetellen- und Alcaligenes-Spezies

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ten B. pertussis-Stamm ebenfalls nicht abgebaut wird. Ubereinstimmend entsprechen auch den von Meyer u. Cameron gemessenen hohen bzw. niedrigen Q02N-Werten hohen bzw. schwacheren von uns beobachteten Stoffwechselleistungen. Die von Kersters et al. (1984) zur Klassifizierung von B. avium veroffentlichten Daten iiber den Umsatz von Arninosauren als Kohlenstoffquelle fur Wachstumstests lassen, methodisch bedingt, einen strengen Vergleich mit unseren Ergebnissen nicht zu. Es ist jedoch festzustellen, daf wegen der groReren Empfindlichkeit unserer Methode weitere Aminosauren als metabolisierbar erkannt wurden. Die zuvor mit der gleichen Methode untersuchten Brucellen (Balke et al., 1977) lassen sich Gattungs-spezifisch von Bordetellen und Alcaligenes abgrenzen, da sie LCitrullin unter den Versuchsbedingungen nicht metabolisieren (eine Ausnahme macht nur Brucella melitensis, Biotyp 1, Stamm 16, der aber, entgegen den Gattungen dieser Arbeit, kein L-Prolin umzusetzen vermag). Die Untersuchungen dieser Arbeit fiihrten zu gut reproduzierbaren Ergebnissen. Nur wenige Aminosauren sind erforderlich, um ein Gattungs- und Spezies-spezifisches Stoffwechselmuster von medizinisch relevanten Bakterien der Gattungen Bordetella und Alcaligenes zu erhalten. 1st die Cattungszugehorigkeit bereits bekannt, so laRt sich das Differenzierungsschema sogar auf jeweils nur fiinf zu iiberprufende Aminosauren weiter reduzieren (Das mit in das Stoffwechselmuster der Tab. 3 aufgenommene LAlanin tragt zwar nicht zur Differenzierung bei, sollte aber bei Untersuchungen mitgefiihrt werden, um sicherzustellen, daf die Bakterien zu entsprechenden Stoffwechselleistungen fahig sind). Zudem reicht die Bakterienmenge einer flachig bewachsenen Blutagarplatte im allgemeinen gut aus « 40 mg Feuchtgewicht erforderlich), um samtliche Stoffwechselwerte der Tab. 3 zu bestimmen. Bei Bevorratung von Aminosaure- und Pufferlosungen stellt sich die Methode deshalb auch unter Beriicksichtigung des geringen Arbeitsaufwandes als Erganzung bzw. Alternative zu den im Routinelabor benutzten Differenzierungsverfahren von Bordetella- und Alcaligenes-Spezies dar. Literatur 1. Balke, E., A. Weber und B. Fronk: Unteruchungen des Aminosaurestoffwechsels mit der Dunnschichtchromatographie zur Differenzierung von Brucellen. Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt, Orig. A 237 (1977) 523-529 2. Hinz, K.-H., G. Glunder, and H. Luders: Acute respiratory disease in turkey poults caused by Bordetella bronchiseptica-like bacteria. Vet. Rec. 103 (1978) 262-263 3. Hinz, K. H., G. Korthas, H. Luders, B. Stiburek, G. Gliinder, H. E. Brotzeit, and Th. Redmann: Positive immunization of turkey poults against turkey coryza (Bordetellosis) by vaccination of parent breeders. Avian Path. 10 (1981) 441--447 4. Hinz, K.-H., G. Glunder, and K.]. Romer: A comparative study of avian Bordetella-like strains, Bordetella bronchiseptica, Alcaligenes faecalis and other related nonfermentable bacteria. Avian Path. 12 (1983) 263-276 5. Kersters, K., K.-H. Hinz, A. Hertle, P. Segers, A. Lievens, O. Siegmann, and]. De Ley: Bardetella avium sp. nov. isolated from respiratory tracts of turkeys and other birds. Int. J. system. Bact. 34 (1984),56-70 6. Kersters, K. and]. De Ley: Genus Alcaligenes. In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. I, N. R. Krieg (Ed.). Williams and Wilkins, Baltimore-London (1984) 7. Kolar, M. G. and H. R. Roberts: A new reagent for detection of hydroxyproline on paper chromatograms. Arch. Biochem. Biophys. 70 (1957) 620-622 23 Zhl. Bakt. Hyg. A 262/3

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E. Balke, H:-J. Batza und A. Seipp

8. Larsen, P. O. and A. Kjaer: Paper chromatograph ic differentiation between a-m onoamino acids and other ninhydrine-pos itive substances. Biochim. Biophys. Acta 38 (1960) 148-150 9. Meyer, M. E. and H. S. Cameron: Species metabolic patterns in morphologic ally similar gram negative pathogens. J. Bact. 73 (1957) 159-1 61 10. Pittmann, M.: Genus Bordetella. In: Bergey's Manu al of Systematic Bacteriology, Vol. I. N. R. Krieg (Ed.). Williams and Wilkins, Baltimore-Lond on (1984) 11. Rowatt, E.: Amino acid metabolism in the genus Bordetella. J. gen. Microbiol. 13 (1955) 552- 560 12. Ruger, H.-J. and T. L. Tan: Separation of Alcaligenes denitrificans sp. nov. nom. rev. from Alcaligenes faecalis on the basis of DNA base comp osition. DNA homol ogy and nitrate reduct ion. Int. J. system. Bact. 33 (1983) 85-89 13. Yabuuchi, E., l. Yano, S. Goto, E. Tanimura, T. Ito, and A. Ohyama: Description 'o f Achromobacter xylosoxidans Yabuuchi and Ohyama (1971) lnt. J. system. Bact. 24 (1974) 470-477 Dr. Erika Balke, Dr. Hans-joachim Bdtza, Adelheid Seipp, Institut fur Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere der justus-Liebig-Un iversitat GieBen, Frankfurter Str. 89, 0-6300 GieBen