Untersuchungen zur enzymatischen Hydrolyse von Gibberellin-0-glucosiden II. Hydrolysegeschwindigkeiten von Gibberellin-2-0- und Gibberellin-3-0-glucosiden1)

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Biochem. Physiol. Pflanzen 174, 746-751 (1979)

Untersuchungen zur enzymatischen Hydrolyse von Gibberellin-Oglucosiden II. Hydrolysegeschwindigkeiten von Gibberellin-2-0- und Gibberellin3-Otglucosiden1 ) G. SCHNEIDER und W. SCHLIEMANN Institut fiir Biochemie der Pflanzen, Halle (Saale), Forschungszentrum fiir Molekularbiologie und Medizin der Akademie der Wissenschaften der DDR

Investigations on the Enzymatic Hydrolysis of GibberelIin-O-glucosides II. Hydrolysis Rates of GibberelIin-2-0- and GibberelIin-3-0-glucosides Key Term Index: Gibberellin-O-glucoside, enzymatic hydrolysis, cellulase, stereochemistry.

Summary In studying the hydrolysis of seven different ring A glucosides of gibberellins using cellulase we were able to correlate the hydrolysis speed and the stereochemistry of the glucosidic linkage within gibberellin-O-glucosides. Thus, a glucosyl moiety linked equatorially to tbe ring A of gibberellins (3-epi-GAt-3-0-glucoside, GAs-2-0-glucoside) was found to be favoured in hydrolysis. In contrast, GAs-3-0-glucoside and GA7-3-0-glucoside or GAc3-0-glucoside, GA4 -3-0-glucoside, and 16,17-dihydro-GAt-3-0-glucoside with a quasiequatorially 01 an axially arranged glucosyl moiety sbowed a remarkably inhibited hydrolysis.

EinIeitung Von den bisher aus hOheren Pflanzen isolierten sieben Gibberellin-O-glucosiden (SEMBDNER 1974; HEDDEN et al. 1978; YOKOTA et al. 1978) ist der O-Glucosylrest bei sechs dieser biologisch inaktiven Metabolite mit den C-Atomen 2 bzw. 3 im Ring A der Gibberelline verkniipft (vgl. Abb.1, Formell). Beziiglich der enzymatischen Hydrolysierbarkeit dieser Ring-A-Glucoside zu ihren biologisch aktiven Agluca sind auffallende Unterschiede gefunden worden, wobei insbesondere fUr die Gibberellin-3-0-glucoside eine deutlich verringerte Hydrolyserate festgestellt wurde (SCHRAUDOLF 1970; YOKOTA et al. 1971; MULLER et al. 1978). Wenngleich diese Befunde eine Abhangigkeit der Hydrolysierbarkeit der Gibberellin-O-glucoside von strukturellen Unterschieden wahrscheinlich machten, so limitierte jedoch die angewendete Methodik die Aussagen ebenso, wie die beschrankte Verfiigbarkeit eines ausreichenden Spektrums von Vergleichssubstanzen eine Verallgemeinerung der Ergebnisse ausschloB. Durch chemische Synthese ist nunmehr eine Serie von Ring-A-glucosylierten Gibberellinen zuganglich geworden (SCHNEIDER und SCHREIBER 1974; SCHNEIDER et al. 1) Gibberelline - LXXI.

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7

Abb. 1. Strukturformeln der zur enzymatischen Hydrolyse eingesetzen Gibberellin-O-glucoside 1 = GAl-3-0-glucopyranosid, 2 = GA4 -3-0-glucopyranosid, 3 = 16,17-Dihydro-GAl -3-0-glucopyranosid,4 = 3-epi-GAl-3-0-glucopyranosid, I) = GAa-3-0-glucopyranosid, 6 = GA7 -3-0-glucopyranosid, '; = GAs-2-0-glucopyranosid.

1977; SCHNEIDER 1978, 1979a, b), die flir vergleichende Untersuchungen zur enzymatischen Spaltbarkeit geeignete Voraussetzungen bietet. Zur quantitativen Erfassung des Hydrolyseverlaufs dieser Glucoside in Gegenwart von Cellulase wurde eine modifizierte Glucoseoxidase-Peroxidase-Reaktion zur Bestimmung der freigesetzten Glucose gewahlt (SCHLIEMANN und SCHNEIDER 1979). An Hand der erhaItenen Ergebnisse sollen Zusammenhange zwischen Hydrolysierbarkeit und chemischer Struktur von Gibberellin-O-glucosiden diskutiert werden. Material und Methoden Gibberellin-O-glucoside Die in Abb. 1 aufgefiihrten Gibberellin-O-glucoside wurden synthetisch dargestellt und ihre p-glucosidische Verkniipfung durch spektroskopische Methoden eindeutig gesichert (SCHNEIDER und SCHREIBER 1974; SCHNEIDER et '11. 1977; SCHNEIDER 1979a, b). Die Feinreinigung der Glucoside erfolgte iiber die Acetate (SCHNEIDER 1979 a) mit anschlieBender DEAE-Sephadex-A 25-Chromatographie (GRABNER et a1. 1976). Enzymatische Hydrolyse und Glucosebestimmung Die enzymatischen Hydrolysen wurden unter Standardbedingungen mit je 100 nmol Glucosid und 100 bzw. 500,ug gereinigter Cellulase in McIlvain-Puffer (pH 3,0) durchgefiihrt. In den nach 30, 60, 120, 240 min bzw. 30, 60, 120, 240, 360 min entnommenen Proben wurde die freigesetzte Glucosemenge mit der Glucoseoxidase-Peroxidase- Methode quantitativ bestimmt. Zur ausfiihrlichen Methode vgl. SCHLIEMANN und SCHNEIDER (1979).

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G.

SCHNEIDER

und W.

Ergebnisse und

SCHLIEMANN

Disku~sion

Aus friiheren Untersuchungen zur enzymatischen Hydrolyse von Gibberellin-Oglucosiden war bekannt, daB verschiedene Enzyme und Enzympraparationen unterschiedliche Spaltungsaktivitaten besitzen, wobei Cellulase sich durch eine vergleichsweise hohe Aktivitat auszeichnet (MULLER et al. 1978). Wie Vorversuche zeigten, konnten die in diesen Arbeiten angewendeten hohen Cellulasekonzentrationen nicht flir vergleichende Messungen des Hydrolyseverlaufs von Ring-A-glucosylierten Gibberellinen benutzt werden (vgl. SCHLIEMANN und SCHNEIDER 1979). Selbst bei 500 {tg Cellulase pro 100 nmol Glucosid war die Initialgeschwindigkeit der Hydrolyse von GAs-2-0-glucosid (Abb. 1, Formel 7) so groB, daB sie methodisch nicht mehr exakt zu bestimmen war. Ein durchgehender Vergleich der Hydrolyse aller in Abb. 1 aufgeflihrten Ring-AGlucoside unter identischen Hydrolysebedingungen war deshalb nur fiir den Ansatz mit 100 {tg Cellulase moglich. Jedoch wurde die Hydrolyse mit 500 {tg Cellulase je 100 nmol Glucosid mit in die Untersuchungen einbezogen, da unter diesen Bedingungen die Differenzierungen der weniger gut spaltbaren Gibberellin-3-0-glucoside klarer sichtbar sind. Mit den beiden ausgewahIten Cellulasekonzentrationen arbeiteten wir unterhalb des Substratsattigungsbereiches und konnten den Initialverlauf der Hydrolyse iiber 2 bis 6 h verfolgen. Die mit Hilfe der Glucoseoxidase-Peroxidase-Reaktion (s. Material und Methoden) flir 7 Ring-A-glucosylierte Gibberelline gefundenen Zeit-Substratumsatz-Beziehungen sind in der Abb. 2 graphisch dargestellt. Abbildung 2a zeigt deutlich, daB sich verschiedene Ring-A-glucosylierte Gibberelline, wie z. B. GA3-3-0-g1ucosid (Abb. 1, Formel 5) und GAs-2-0-glucosid (Formel 7) in ihren Hydrolysegeschwindigkeiten mit Cellulase betrachtlich unterscheiden (vgl. auch YOKOTA et al. 1971; MULLER et al. 1978). Dariiber hinaus fallt beim Vergleich der gemessenen 7 Zeit-Substratumsatz-Kurven der Glucoside 1-7 (Abb. 2a) eine deutliche Gruppierung auf, deren Signifikanz in Abb. 2b noch klarer erkennbar wird. Der Gruppe mit der geringsten Hydrolyserate gehOren die 0-3-Glucoside von GAl (Abb. 1, FormeI1), 16,17-Dihydro-G Al (Formel 3) und GA4 (Formel 2) an. Der Glucosy lrest dieser Glucoside ist mit der axial angeordneten 3p-Hydroxylgruppe verkniipft. Damit kommt es zu einer starken Wechselwirkung mit den axialen 1-H und 5-H, die die freie Zuganglichkeit der 3p-Position behindern diirfte (vgl. Abb.3). Wie Betrachtungen am DreidingModell weiterhin zeigen, kann der elektrophile Angriff des Enzyms nur von der p-Seite in der Weise erfolgen, daB die ebenfalls p-standige 6-Carboxylgruppe einen storenden EinfluB ausiiben konnte. Die Differenzen der Initialgeschwindigkeiten dieser Gruppe fiir die Glucoside 1, 2 und 3 liegen innerhalb der Fehlerbreite. Das bedeutet, daB Unterschiede im C-D-Ring-Bereich, wie z. B. 13-0H oder 13-H (1 bzw. 2) und 17-H2 oder 16-H17 -H3 (Formel 1 bzw. 3) ohne EinfluB auf die Hydrolysegeschwindigkeit dieser Glucoside sind. Dagegen bringt die Einflihrung einer 1,2-Doppelbindung und die damit verbundene Einebnung des Ringes A, wie sie bei den 3-0-Glucosiden von GA3 (Formel 5) und GA7 (Formel 6) gegeben ist, eine bis zu flinffache Erhohung der Hydrolysegeschwindigkeiten

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fUr diese Glucoside. Vermutlich ist hier durch die quasiaquatoriale Anordnung des 3-0-Glucosylrestes der Angriff des Enzyms sterisch etwas erleichtert, wenngleich hinsichtlich des raumlichen Molektilaufbaus prinzipiell yo? der gleichen Situation wie bei den 3,B-axialen Glucosiden ausgegangen werden muB und die Hydrolyserate recht niedrig ist. Die nahczu identischen Zeit-Substratumsatz-Kurven flir 6 und 7 bestatigen den in der erst en Gruppe gemachten Befund, daB der i3-Substituent keinen EinfluB auf die enzymatische Spaltbarkeit dieser Glucoside hat. Wie Abb. 2b weiterhin zeigt, resultiert die Dberfiihrung des 3-0-Glucosylrestes von der axialen 3,B-Konfiguration (1) in die aquatoriale 3-iX-Position(3-epi-GAl-3-0-glucosid 4, vgl. Abb. 3) in einer etwa 20fachen ErhOhung der Hydrolysegeschwindigkeit. Darin driickt sich die im Vergleich zum 3-axialen beim 3-aquatorialen Glucosid frei zugangliche

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Inkubationszeit [hJ 2 Abb. 2. Hydrolyseverlauf der Gibberellin-O-glucoside 1-7 mit Cellulase a: Hydrolyseverlauf fur 100 f-lg Cellulase je 100 nmol Glucosid 1-7 (vgl. Material und Methoden); b: Hydrolyseverlauf fur 500 f-lg Cellulase je 100 nmol Glucosid 1-6 (vgl. Material und Methoden). Numerierung der Glucoside wie in Abb. 1. Abb. 3. Stereochemische Grundstrukturen der Gibberelline (raumliche Darstellung). (e) = aquatorial, (a) = axial.

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G. SCHNEIDER und W. SCJlLIEMANN

O-Verkniipfung aus. Beziiglich der 3-0-Glucoside kann damit eine deutliche Zunahme der Hydrolysierbarkeit fiir den Ubergang von axial -+ quasiaquatorial -+ aquatorial als nachgewiesen gelten. Eine ahnliche Abstufung wird auch bei den Ausbeuten der Synthese dieser Glucoside beobachtet, wobei hier die Unterschiede zwischen axialen und aquatorialen Glucosidausbeuten augenfallig, die Differenzierung fiir axiale und quasiaquatoriale Vertreter weniger signifikant sind (SCHNEIDER 1978, 1979a). Die bei weitem hOchste Hydrolysegeschwindigkeit zeigt jedoch GAs-2-0-glucosid (7, Abb. 2a), ein Befund, der mit der aquatorialen Anordnung des 2-0-Glucosylrestes prinzipiell in Einklang steht. Dagegen fallt sofort der Unterschied zum ebenfalls aquatorial konfigurierten 3-epi-GAl-3-0-glucosid (4) auf, des sen Hydrolyserate geringer als die des GAg-2-0-glucosids (7) ist. Ais Erklarung dafUr korinte diskutiert werden, daB beim GAg-2-0-glucosid die 3-Hydroxygruppe durch einen Nachbargruppeneffekt die Hydrolyse begiinstigt. Auch konnte durch eine mogliche Wasserstoffbriicke zwischen dieser und der 2' -Hydroxygruppe der Glucose eine Fixierung des Glucosylrestes eintreten und damit der enzymatische Angriff erleichtert werden. Da aber die gleichfalls aquatorial konfigurierten Gibberellin-13-0-glucoside (vgl. Abb. 3) vergleichbar hohe Hydrolyseraten wie GAg-2-0-glucosid aufweisen (SCHLIEMANN und SCHNEIDER 1979), obwohl hier keine begiinstigenden Effekte vorhanden sind, ist in dies en Glucosiden eher das strukturelle Optimum zu sehen. 1m FaIle des 3-epi-GAl-3-0-glucosid (4) sind storende Effekte zu postulieren. Einer dieser Effekte besteht wahrscheinlich in der auf der IX-Seite des Molekiils zum O-Glucosylrest benachbarten Lactongruppe (vgl. Abb. 3). Fiir fJ-Glucosidasen ist der urn den Wirkort konkurrierende Effekt von Lactonen bekannt (LEGLER 1975) und sollte fUr Gibberellin-O-glucoside mit Lactonbriicke insgesamt in Betracht gezogen werden. Ein erstes 1ndiz fUr die Richtigkeit einer solchen Annahme kann in dem verstarkten Auftreten von 19,2-lactonumgelagertem GA3 nach Cellulase-Behandlung von GA3-3-0-glucosid gesehen werden (MULLER et al. 1978). Fiir diese Lactonisomerisierung wird eine elektrophile Lactonringoffnung als Intermediares angenommen, die auch durch entsprechenden Enzymangriff hervorgerufen werden konnte. AbschlieBend sei noch darauf hingewiesen, daB mit Ausnahme von GAl-3-0-glucosid (1) (YOKOTA et al. 1978) und GA3-3-0-glucosid (5) (YOKOTA et al. 1971) alle iibrigen nativen Gibberellin-O-glucoside aquatorial verkniipfte O-Glucosylreste aufweisen, und damit infolge der leichten Hydrolysierbarkeit ihrer postulierten Funktion als zeitweilig entaktivierte Metabolite (Depot- und Transportformen) (SEMBDNER 1974) gerecht werden. Hinsichtlich der endogenen nichtaquatorialen Gibherellin-O-glucoside 1 und 5 ist dagegen auf Grund ihrer weitaus schlechteren Hydrolysierbarkeit mit Cellulase entweder das Vorkommen spezifischer Glucosidasen in der Pflanze oder der Status irreversibler Metabolite im Zuge der Entaktivierung freier Gibberelline zu diskutieren. Literatur GRABNER, R., SCHNEIDER, G., und SEMBDNER, G.: Fraktionierung von Gibberellinen, GibiJerellinkonjugaten und anderen Phytohormonen durch DEAE-Sephadex-Chromatographie. J. Chromatog. 121, 110-115 (1976).

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Anschrift der Verfasser: Dr. GERNOT SCHNEIDER und Dr. WILLIBALD SCHLIEMANN, Institut fur Biochemie der Pflanzen der AdW der DDR, DDR - 402 Halle (Saale), Weinberg 3.