Variabilität der generationszeit bei fetalen Zellarten der Ratte

Experimental

VARIABILITAT

Autoradiographische

CeN Research 55 (1969) 176-184

DER

GENERATIONSZEIT

ZELLARTEN

DER

Untersuchungen

nach Dauerinfusion

E.-A. LOBBECKE, Institut

fir

Medizinische

BEI

BRIGITTE

Strahlenkunde

RATTE

SCHULTZE

der Universitiit

FETALEN

mit 3H- Thymidin

und W. MAURER

Wiirzburg,

8700

Wiirzburg,

Deutschland

ZUSAMMENFASSUNG Am 20. Tag der Graviditat erhielten Ratten Dauerinfusionen von 3H-Thymidin. Die Zeitdauer der Infusionen wurde zwischen 3 und 72 Stunden variiert. Fur sieben fetale Zellarten wurde autoradiographisch der Prozentsatz markierter Zellen als Funktion der Infusions-Dauer bestimmt. Die gemessenen zeitlichen Verlaufskurven werden im Zusammenhang mit friiheren autoradiograph&hen Ergebnissen iiber die Generationszeiten und Teilphasen fetaler Zellarten von 20 Tage alten Ratten-Feten diskutiert. Dabei zeigt sich, da13 die fetalen Darmepithelien, die basalen Epithelien der Haut und der Zunge sowie die Parenchymzellen des Knorpels aus Zellpopulationen bestehen, bei denen alle Zellen mit der gleichen Generationszeit proliferieren. Eine deutliche Ausnahme bildet nur der fetale Zungenmuskel. Innerhalb dieser Zellpopulation ist die Generationszeit nicht gleich. Es kann aber nicht entschieden werden, ob eine breite Verteilung der Generationszeiten zwischen ca. einem halben und drei Tagen oder ob eine echte ,,non growth fraction“ von ,,ruhenden“ Zellen vorliegt. In geringerem Ausmage kijrmten solche Verhlltnisse such fur den fetalen Herzmuskel zutreffen.

In der Literatur wurden fur eine grol3e Zahl von Zellarten Werte fiir die Dauer der Generationszeit angegeben. Eine Zusammenfassung dieses Zahlenmaterials findet sich bei Schultze [30]. Meist wurde die Generationszeit aus der Dauer der S-Phase und dem Markierungs-Index berechnet. Bei dieser Art der Berechnung bleibt jedoch die Frage offen, ob jede Zelle innerhalb einer Zellart die gleiche Generationszeit hat, oder ob eine mehr oder weniger grol3e Variationsbreite von Generationszeiten vorliegt. Im letzteren Fall sind die aus der S-Phase und dem Markierungs-Index berechneten Generationszeiten nur Mittelwerte. Besondere Verhlltnisse liegen vor, wenn nicht alle Zellen der Population an der Proliferation teilnehmen, d. h. wenn eine sog. ,,growthfraction“ im Sinne Mendelsohns vorhanden ist. Mendelsohn [17, 181fand bei der Untersuchung einer Reihe von tierischen Tumoren mittels Dauerinfusion von 3H-Thymidin, da0 nur Exptl

Cell

Res 55

zwischen 60 und 90 Y0 aller Tumorzellen an der Proliferation teilnehmen. Auch bei langer Infusionsdauer blieb ein Teil der Zellen nicht markiert. Auch von anderen Autoren wurden solche Verhaltnisse gefunden (Literatur siehe bei Hempel [lo]). Eine Reihe von Arbeiten weist darauf hin, dal3 eine derartige ,,growth-fraction“ nicht nutbei Tumoren sondern such bei Zellarten normaler Tiere vorliegen konnte. In einigen Fallen waren die aus dem Markierungs-Index und der S-Phaseberechneten Generationszeiten erheblich grSDer als die aus dem zeitlichen Abstand von zwei aufeinander folgenden Wellen markierter Mitosen direkt gemessenenGenerationszeiten. Diskrepanzen dieser Art wurden fur die Darmepithelien der Maus [14], die Epithelien des Vormagens [32] und die Leberepithelien von 3 Wochen alten Ratten [25] gefunden. Selbst bei den Zellen des fetalen Zungenmuskels der Ratte fanden sich solche Diskrepanzen

Variabilitiit

der Generationszeit bei fetalen Zellarten der Ratte

bei der Bestimmung der Generationszeit [34]. Die Autoren schlossen daraus, dal3 am 17. Tage der Embryonalentwicklung nur noch 50% am 19. Tage 25 % und am 21. Tage 5 % aller Zellen des fetalen Zungenmuskels an der Proliferation teilnehmen. Da diese Ergebnisse mit eigenen friiheren Versuchen [31] iiber die Generationszeit fetaler Zellarten der Ratte am 20. Tag der Embryonalentwicklung schwer zu vereinbaren waren, wurde die Frage nach der Schwankungsbreite der Generationszeit dieser fetalen Zellarten mit der Methode der Dauerinfusion von 3H-Thymidin erneut untersucht. Die Methode der Dauerinfusion ist gerade fur die Untersuchung fetaler Zellarten besonders gut geeignet, weil die notwendigen Infusionsdauern wegen der kurzen Generationszeiten fetaler Zellen von 13-40 Stunden relativ kurz sind und nur wenige Tage betragen. Die Ergebnisse zeigen, da13 bei den untersuchten Zellarten von 20 Tage alten Feten der Ratte innerhalb einer fetalen Zellart aller Zellen mit der gleichen Generationszeit an der Proliferation teilnehmen. Eine Ausnahme bildet nur der fetale Zungenmuskel.

METHODISCHES Tiermaterial Als Versuchstiere dienten 12 Wistar-Ratten (170-210 g). Die Tiere wurden unter ktinstlichem Licht-DunkelWechsel und zweimal tlglich 45 Min. UV-Licht bei 23 k I”C gehalten und mit Altromin-Standardnahrung und Wasser ad libidum ernlhrt.

Befruchtungstermin

und Alter der Feten

Der Brunst-Zyklus wurde durch Vaginal-Abstriche bestimmt. Weibliche und mannliche Tiere wurden iiber Nacht zusammengebracht. Fanden sich am folgenden Morgen auf Vaginal-Abstrichen der Tiere die sich im Prooestrus oder Oestrus befanden, Spermien, so wurde der Zeitpunkt 090 Uhr dieses Tages als ,,Befruchtungstermin“ angenommen.

Technik der Dauerinfusion Die Dauerinfusion wurde in Anlehnung an die Technik von Brecher 116, 26, 271 durchgeftihrt. In den hier vorliegenden V&s&hen erzeugt- eine Motor-getriebene Injektionsspritze einen konstanten Wasserstrom von 2 ml/Tag. Das Wasser fliel3t durch einen Kapillarschlauch zu einem fest montierten, frei drehbaren, wasserdichten Kupplungs-Zwischenstiick, das dem Versuchstier freie Beweglichkeit im Glaskafig ermiiglicht, indem eine

177

Kantile unbeschrankte Drehbewegungen zwischen 2 Teflonscheiben ausfiihren kann [7]. Von diesem Zwischenstuck flieBt das Wasser in einem diinnen Katheter in einen Plexiglas-Behalter, dessen Volumen (ca. 10 ml) durch eine frei bewegliche Gummi-Membran iu zwei vollstlndig getrennteRaume geteilt wird.Durch das in den oberenRaum gepumpte Wasser wird die Gummi-Membran ausgedehnt und die im unteren Raum befindliche gH-ThvmidinLiisung wird durch einen diinnen Polyathylen-Katheter in die Schwanzvene der Ratte aedriickt. Der Katheter wird durch die Schwanzvene his in die Beckenvene des Tieres eingefiihrt. Ein iiber den Schwanz geschobenes Plexiglasrohr verhindert, dal3 das Tier sich losbeissen kann. Durch eine spezielle Vorrichtung konnte die Konstanz der 3H-Thymidin-Infusion wlhrend der Infusionsdauer laufend kontrolliert werden. Eine genaue Beschreibung der technischen Versuchsanordnung wird an anderer Stelle erfolgen.

Autoradiographische

Technik

Die Fixierung der Feten erfolgte iiber 3 Tage in Formalin (6 %) - Trichloressigsaure (0,5 %) unter Zusatz von 0,l mg/ml inaktivem Thymidin bei 4°C. Von 3 p dicken Paraffinschnitten wurden unter Verwendung von Stripping-Film AR 10 Autoradiogramme hergestellt. Die Expositionszeiten betrugen 3-28 Tage. Nach dem photographischen ProzeB wurden die Schnitte durch den Film hindurch mit Hamatoxylin-Eosin gefarbt.

VERSUCHE

UND

ERGEBNISSE

Tierversuche Die graviden Ratten erhielten Dauer-Infusionen von 3H-Thymidin (3000 mC/mM, BioResearch Schwarz, Orangeburg, N.Y., USA) und zwar iiber Zeitintervalle von 3, 6, 12, 24, 48 und 72 Stunden. AuBer in zwei Fallen wurden fur jeden Zeitpunkt 2 Tiere genommen. Alle Versuche wurden am 20. Tag der Graviditat durchgeftihrt. Nur die Versuche iiber 48 und 72 Stunden wurden etwas frtiher begonnen und spater beendet und zwar so, da13 der 20. Tag in der Mitte der Versuchsdauer lag. Infundiert wurde physiologische NaCl-Losung mit 1 mC/ml 3H-Thymidin. Die Geschwindigkeit der Infusion betrug 2 ml/Tag entsprechend 2 mC/Tag 3H-Thymidin. Eine Stunde nach Beendigung der Dauerinfusion wurden die Tiere in leichter

&her-Narkose

durch

Dekapitation

und

Entbluten

getotet. Die Feten wurden unmittelbar entnommen und fixiert. Zur Ermittlung des Markierungs-Index der einzelnen Zellarten erhielten 2 gravide Ratten eine einmalige Injektion von 500 PC 3H-Thymidin. Die Entnahme der Exptl

Cell

Kes 55

178

E.-A. Liibbecke et al.

Table 1. Cell cycle time and duration of the different phases of the cell cycle in fetal cell types of the rat (20th day) (from Wegener, Hollweg & Muurer (1964))

Cell type

S G,+M Hours

T

T-S I. Example for the asymtotic determination of the percentage of labeled cells. 24 h infusion of 3H-TdR; the 4 curves are based on the evaluation of 4 autodiagrams of the basal epithelia in fetal skin with 4 different exposure times; all the sections were taken from the same paraffin block: strindng film AR 10, Kodak London; the numbers (1.6, ?‘:3, 5.3, 2.4 represent the mean grain number/ nucleus for the 4 exposure times. Abscissa: At “1” every nucleus with 1 grain or more was counted as labeled and so on; in this example the curves approached 100% asymptotically; ordinate: percentage of labeled cells. Fig.

Intestine, crypt cells Shin epithelia (basal layer) Tongueepithelium(basa1 layer) Tongue muscle Hibernation gland Certilage, parenchymal cells Heart muscle -

5.6 5.5 5.6 6.8 5.6 7.3 8.0

13.5 2.4 2.4 18.9 23.3 2.1 2.2 32.5 34.7 1.8 40.5 2.5 2.3-6.5 N 42.0 -

7.9 13.4 17.7 25.7 29.1 33.2 34.0

S and G2 + M was determined by the method “percentage of labeled mitosis”; generation time T was calculated from the duration of S and the labeling index; for more

details seethe original publication.

Feten erfolgte nach 40 Minuten, beschrieben.

sonst wie oben

Auswertung der Autoradiogramme

Bei einer Infusionsrate von 2 mC 3H-Thymidin pro 1 Tag zeigten die Kerne der fetalen Zellarten fiir eine Infusionsdauer von 3 Stunden und eine autoradiographische Expositionszeit von 4 Wothen eine Markierung von nur 4-6 KBrnern/ Kern. Nach einer Dauerinfusion von 72 Stunden stieg dieser Wert je nach Zellart auf 15-27 Kiirner/Kern an. Der Nulleffekt der Autoradiogramme betrug 0,1-0,2 Kijrner/Kern und konnte vernachllssigt werden. Die Bestimmung von Hiiufigkeits-Verteilungen der Kornzahl/Kem ergab bei den fetalen Zellarten fiir Dauerinfusion eine erheblich breitere Verteilung als bei Versuchen mit einmaliger Gabe von 3H-Thymidin. Die Wahrscheinlichkeit dafiir, daIj tatstichlich markierte Kerne die Kornzahl Null haben, ist bei Dauerinfusion griil3er als bei einer einmaligen Gabe. Bei einmaliger Gabe von 3H-Thymidin werden die in der S-Phase befindlichen Kerne angenlihert gleich stark markiert. Die Inkorporation ist auf die relativ kurze Verfiigbarkeitszeit des 3H-Thymidin im Organismus von im Mittel ca. 15 Minuten beschrgnkt. Bei einer Dauerinfusion von z. B. 7 Stunden und fiir S =6 Stunden (Tabelle 1) beExptl

Cell Res 55

finden sich dagegen nur wenige Kerne wghrend der ganzen Dauer der Infusion in der S-Phase, was fiir diese Kerne eine optimale Markierung zur Folge hat. Auf der anderen Seite gibt es such solche Kerne, welche erst gegen Ende der Infusion in die S-Phase eintreten oder welche zu Beginn der Infusion die S-Phase gerade verlassen. Die meisten Kerne haben eine Markierung, welche zwischen Null und der optimalen Markierung liegt. Bei Dauerinfusion mu8 deshalb bei der Ermittlung der Zahl der markierten Kerne in erhiihtem MaDe auf die ,,falschen Negativen” geachtet werden. Das geschah in folgender Weise: Die vier Kurven der Fig. 1 beziehen sich auf vier Autoradiogramme des gleichen fetalen Gewebes. Die Expositionszeit dieser Autoradiogramme war aber verschieden groD. Dementsprechend betrug die mittlere Kornzahl/Kern 11,6 bzw. 7,3 bzw. 5,3 bzw. 2,4. Auf jedem der vier Autoradiogramme wurde der Prozentsatz markierter Kerne unter verschiedenen Annahmen ausgezghlt. Dabei wurde ein Kern als ,,markiert“ gezahlt, wenn er markiert war mit (1) 1 Korn und mehr, (2) 2 Kiirner und mehr usw. bis (5) 5 Kiirner und mehr. Die fiir ein Autoradiogramm mit diesen Annahmen erhaltenen Prozentsgtze wurden in Fig. 1 als Ordinate i.iber der jeweiligen ,,Kornzahl und mehr“ (=0 bis 5) aufgetragen. Fiir das am Igngsten exponierte Autoradio-

Vuriabilitiit

der Generationszeit

gramm mit einer mittleren Kornzahl/Kern von 11,6 verliiuft die Kurve in Fig. 1 fast genau horizontal. Bei den Abzissenwerten 1 und 2 betrug der Prozentsatz 100 %. Beim Abzissenwert 5 ist er nur geringfiigig auf 97 % abgefallen. Das bedeutet, daB bei kleinen Abzissenwerten die Zahl der fllschlicherweise als nicht-markiert gezlhlten Kerne vernachl%ssigbar ist. Bei den Kurven der kiirzer exponierten Autoradiogramme des gleichen Gewebes mit einer mittleren Kornzahl/Kern von 7,3 und 5,3 wird such beim Abzissenwert 1 der wahre Prozentsatz 100% noch nicht vollst&rdig erreicht. Das bedeutet, dab wenige Kerne mit 0 Kornern/Kern tatsachlich markiert sind. Allerdings ist die Markierung so gering, dal3 es wahrend der Expositionszeit nicht zur Bildung eines latenten Bildes und zur Ausbildung eines Silberkornes kommt. Das kann nach Fig. 1 durch eine Extrapolation der Kurven nach Null hin beriicksichtigt werden. Die Extrapolation zum Abzissenwert 0 ftihrt nach Fig. 1 fur mittlere Kornzahlen von 7,3 und 5,3 zwanglos zu dem richtigen Wert 100 %. Der Unterschied der Prozentsatze fiir die AbzissenWerte 1 Korn und mehr und 0 ist dann gering. Es wurden deshalb nur Autoradiogramme mit 5 KGrnern/Kern und mehr ausgewertet. Auf diesem Wege wurden die ProzentsZitze markierter Kerne fur Infusions-Dauern bis zu 1 Tag bestimmt. Oberhalb von 1 Tag waren die mittleren Kornzahlen/Kern so groD, da13 sich immer horizontale Kurven wie etwa fiir ,,11,7“ in Fig. 1 ergaben. ERGEBNISSE Prozentsatz markierter Kerne als Funktion der Infusions-Dauer fiir die untersuch ten fetalen Zellarten

Fig. 2 gibt den zeitlichen Verlauf des Prozentsatzes der markierten Kerne als Funktion der Infusionsdauer wieder und zwar fi.ir 7 verschiedene fetale Zellarten der Ratte. Fur jeden Messpunkt (Kreise) wurden 500 bis 1000 Kerne auf 3 Autoradiogrammen von Folgeschnitten ausgezghlt. Die 6 bzw. 3 Kreise pro MeDpunkt entsprechen jeweils 3 Feten von 2 bzw. 1 Mutter-

bei fetalen Zellarten

O-ill 1 03 6 12 e

24

-036

24

48

I

I2

179

72

I

10 L. i7*oo-e-&-ro/E I 50 On F.92.jTh. 3/ OL 1 8 3 6 12

der Ratte

48

72

80

-ooc-

48

72

II 24

Fig. 2. Percentage of labeled cells as a function of infusion time for various fetal cell types of the rat (20th day) after continuous infusion of SH-thymidine. (The values for T-S are taken from table 1). a, gut epithelial cells: b, skin epithelial cells basal layer; c, tongue epithelial cells basal layer; d, cartilage parenchyme; e, heart muscle; f, tongue muscle; g, hibernation gland. Abscissa: Time, h; ordinates: %.

tieren. Bei 3 und 72 Stunden wurden 6 bzw. 3 Feten eines Tieres untersucht. Die Streuung der einzelnen Messungen ergibt sich aus Fig. 2. Ftir Exptl

Cell

Res 55

180

E.-A. Liibbecke et al.

die Zeit Null wurde als Ordinaten-Wert der Merkierungs-Index aus Versuchen mit einmaliger Gabe von 3H-Thymidin und Tiitung nach 40 Minuten genommen.

DISKUSSION Zu Beginn einer Dauerinfusion von 3H-Thymidin werden zun&hst alle in der S-Phase befindlichen Kerne markiert. Nach einer Infusionsdauer von G 1 + M + G2 = T-S haben such alle iibrigen Kerne die S-Phase erreicht. Nach T-S sollten also 100 % der Kerne markiert sein. Das gilt aber nur unter der Voraussetzung, da13 alle Kerne einer Zell-Population die gleiche Generationszeit und gleiche Teil-Phasen haben. Vor einer solchen Diskussion des zeitlichen Verlaufes des Prozentsatzes markierter Kerne (Fig. 2) zusammen mit den nach anderen Versuchen erhaltenen Zeiten fiir T und S (Tabelle 1) muD gezeigt werden, da13 durch die Dauerinfusion der notwendigen groDen Aktivitaten von 3H-Thymidin die Generationszeiten und Teil-Phasen nicht geandert werden. Eine solche Anderung kann (1) durch Strahleneffekte infolge der Infusion grober 3H-Thymidin-Aktivit&en, und (2) auf rein chemischem Wege durch die Applikation der damit verbundenen Gabe relativ grol3er Thymidin-Mengen eintreten. Strahlenejjekte Bei Dauerinfusionen von 3H-Thymidin kiinnen Strahleneffekte auf zwei Wegen zustande kommen: 1. kbnnen Strahleneffekte auftreten bei Kernen, welche 3H-Thymidin inkorporiert haben; 2. fiihrt das im Organismus vorhandene freie 3H-Thymidin und seine Abbauprodukte zu einer Ganzkiirper-Bestrahlung. Bei einer Dauerinfusion von 2 mC/Tag betrlgt die GanzkGrperDosis nach 1 Tag selbst bei Vernachlgssigung der 3H-Ausscheidung im Mittel nur 0,9 rep. Weiterhin kann man abschgtzen, da13 die Konzentration der 3H-Aktivit%t von freiem Thymidin und seinen Abbauprodukten mindestens 20 ma1 kleiner ist als die mittlere Konzentration der 3H-Aktivit% in markierten Kernen. StrahlenExptl

Cell

Res 55

effekte sind also in erster Linie bei den markierten Kernen zu erwarten. Die Bedingungen hinsichtlich einer Strahlenschadigung bei Dauerinfusion sind noch am ehesten mit den Bedingungen zu vergleichen, wie sie bei Zellkulturen in 3H-Thymidin-haltigem Medium vorliegen. Ein Vergleich der 3HThymidin-Konzentrationen, welche bei Zellkulturen zu Strahlenschgden fiihren, mit der 3H-Thymidin-Konzentration bei Dauerinfusion kann deshalb zu einer Abschatzung miiglicher StrahlenschSiden bei Dauerinfusion verwandt werden: Es ist bekannt, da13 die mittlere Verftigbarkeitszeit von freiem 3H-Thymidin bei Ratte und Maus sehr kurz und zwar ca. 15 Minuten ( = 0,Ol Tag) ist. Bei einer Dauerinfusion von 2 mC/Tag (=lO ,uCjg pro Tag) wird dann die dauernd vorhandene Konzentration von freiem 3H-Thymidin einen Wert haben von 10 &/g/Tag x 0,Ol Tag =O,l PC/g Korpergewicht. Nach Wegener et al. [31] ist die Konzentration des freien Thymidins im Feten 5-10 ma1 kleiner als im mutterlichen Organismus der Ratte. Im Feten betrHgt demnach die Konzentration des freien 3H-Thymidins nur O,Ol-0,02 ,uC/g. Inwieweit sind die Zellkulturen unter diesen VerhBltnissen Strahlenschaden beobachtet worden? Nach Painter et al. [21], Painter und Drew [20] und Drew und Painter [5, 61 treten in HeLaZellkulturen bei 1,25-&O PC 3H-Thymidin pro ml Medium die ersten Wachstumshemmungen nach 24 Stunden auf. Zu diesem Zeitpunkt wurden cytologische Anomalien allerdings schon bei so geringen Dosen wie 0,02 &/ml beobachtet. Bei der Untersuchung der Uberlebensrate von Lymphocyten fand Osgood [19] nach Inkubation tiber 72 Stunden in 1 PC/ml 3HThymidin keine Abnahme der Zellzahl, erst nach 190 Stunden fiel diese auf 25 y0 ab. Die bei Dauerinfusion im Feten vorhandene Konzentration von 3H-Thymidin liegt damit an der unteren Grenze der Konzentrationen, fiir welche bei anderen Zellarten erstmals Strahlensch&den beobachtet wurden. Ein direkter Vergleich der hier beschriebenen Dauerinfusionsversuche mit Untersuchungen

Variabilittit

der Generationszeit

anderer Autoren tiber das Auftreten von StrahlenschSiden nach einmaliger Gabe von 3HThymidin ist nicht miiglich. Ausgehend von der Kornzahl/Kern bei Dauerinfusion kann man aber die Frage stellen, welche einmalige Gabe von SH-Thymidin an eine normale Ratte unter sonst vergleichbaren Verhaltnissen zu der gleithen Kornzahl/Kern ftihrt wie bei Dauerinfusion. Wenn in beiden Fallen die Kornzahlen/ Kern gleich sind, sind aus ahnliche Strahleneffekte zu erwarten. Bei Dauerinfusion von 2 mC/Tag fand sich tiber den fetalen Zellarten nach 24 Stunden im Mittel eine Kornzahl/Kern von 15 (28 Tage Exposion). Auf der anderen Seite zeigten friihere Versuche mit 3H-Thymidin an normalen Ratten und Mliusen, da13 bei Gabe von 0,3 PC/g die Kornzahl/Kern gleichfalls im Mittel 15 betragt (28 Tage Exposition). Bei einmaliger Gabe von 0,3 PC/g Ratte oder Maus ist also die Markierung der Kerne und damit die StrahlendosisLeistung genau so groD wie fur die Kerne der fetalen Zellarten nach 1 Tag Dauerinfusion. Die Frage lautet nun, ob bei dieser ,,einmaligen Equivalent-Dosis“ nach der Literatur Strahlenschlden zu erwarten sind. Bei Untersuchungen tiber die bekanntlich strahlenempfindliche Spermatogenese fanden Kisieleski et al. [12] erst oberhalb einer einmaligen Gabe von 10,O PC “-Thymidin pro g Maus nach 6 Tagen eine statistisch signifikante Abnahme der Spermatocyten. Johnson und Cronkite [l l] beobachteten 4 Tage nach Gabe von 0,5 PC/g Maus eine relative Abnahme der Zahl der Spermatocyten bezogen auf die Zahl der Sertoli-Zellen. Auch Samuels und Kisieleski [28] und Samuels et al. [29] fanden 1 Woche nach Gabe von 1,0 PC/g Maus eine beginnende Abnahme der Spermatocyten. Nach Grisham [9] ftihren 3H-Thymidin-Dosen von mehr als 1 pC/g bei jungen Ratten nach Teilhepatektomie innerhalb von 72 Stunden zu einer Hemmung der Regeneration. Post und Hoffman [23] beobachteten bei den Leberkernen von 3 Wochen alten Ratten eine Verschiebung zu hoheren PloidieStufen nach Dosen von 2,0 PC/g, sowie eine Verlangerung der Gl-Phase [24]. Cronkite et al. 12 - 691819

bei fetalen Zellarten

der Ratte

Table 2. Mitotic

index as a function time; mitotic index at time 0 = 100 %

181

of infusion

Rat fetus

Hours of continuous infusion, % 0 24 48 72

Intestine, epithelia Skin, basal epithelia

100 100

93 97

5:

39 52

[3] fanden nach einmaliger Injektion von 5-25 PC/g in markierten Lymphocyten bis zu 10 % pyknotische Kerne, wlhrend 3H-ThymidinDosen von O,OS/O,l PC/g von diesen Autoren als nicht schldigend beurteilt werden. Koburg und Maurer [ 131 fanden 12 Stunden nach Gabe von 5 PC/g Maus eine deutliche Abnahme des Mitose-Index der Darmepithelien. Ein Vergleich dieser Werte mit der oben angegebenen ,,Aquivalent-Dosis“ fur einmalige 3H-Thymidin-Gabe zeigt, da8 bei den hier beschriebenen Dauerinfusionen zumindest innerhalb der ersten Tage Strahlenschaden unwahrscheinlich sind. Erst nach 2-3 Tagen machte sich ein Strahleneffekt bemerkbar, wie MitoseZahlungen ergaben. Der Mitose-Index des fetalen Diinndarmepithels sowie such der Basalzellen der fetalen Haut zeigten einen geringen Abfall nach 2 Tagen und nahm nach 3 Tagen auf 40 % bzw. 52 % ab (Tabelle 2). Die Konstanz des Mitose-Index wahrend der ersten 24 Stunden spricht dafiir, da13 die Proliferation wahrend dieser Zeit nicht durch Strahlenschaden beeinfluBt wird. Nach Fig. 2 sind bei den meisten fetalen Zellarten nach l-2 Tagen 100% der Zellen markiert. Nur wiihrend dieses Zeitintervalls sind miigliche Strahleneffekte auf den Kurvenverlauf von Interesse. Der Wert 100 % kann durch Strahleneffekte nicht mehr geandert werden. Bei Versuchen mit Dauerinfusion von 3HThymidin beobachtet man, da13 die Kornzahlenf Kern trotz der groBen applizierten 3H-ThymidinDosen relativ klein sind. Bei einmaliger Gabe der gleichen 3H-Aktivitat wie bei Dauerinfusion erhalt man griY3ere Kornzahlen/Kern. Das hangt damit zusammen, da8 sich die Kerne nur Exptl

Cell

Res 5.5

182

E.-A. Liibbecke et al.

wahrend eines Teils der Dauerinfusion in der S-Phase befinden. Innerhalb der Phasen G2+ M + Gl hat das Angebot von “H-Thymidin keine VergroBerung der Markierung der Kerne zur Folge.

EinfluJ von rein chemischen Thymidin-Effekten Nach Greulich et al. [8] fi.ihrt eine einmalige Gabe von 10 pg Thymidin pro Maus (0,s pg/g) zu einer Zunahme des Mitose-Index des Duodenalepithels. Barr [2] ftihrte auf Grund von ahnlichen Versuchen mit HeLa-Zellen diese Erhiihung des Mitose-Index auf eine Verlgngerung der Metaphase zuriick (siehe hierzu such

mAndererseits hemmt Thymidin den Eintritt von Zellen aus der Gl- in die S-Phase, ein PhHnomen das zur Synchronisierung von Zellkulturen benutzt wird. Allerdings tritt dieser Hemmeffekt erst bei sehr groDen Thymidin-Konzentrationen von 400 pg/ml auf [4]. Bei 200 pg/ml sind Chromosomen-Aberrationen in Zellkulturen (Chinesischer Hamster) beobachtet worden [33]. Bei Thymidin-Konzentrationen von 20 pg/ml fanden Painter et al. [22] eine beginnende Wachstumshemmung bei HeLa-Zellen. Eine Konzentration von 200 pg/ml fi.ihrte zu einer Wachstumshemmung von 70 %. Verglichen mit diesen Thymidin-Mengen sind die bei den Dauerinfusionen von “H-Thymidin applizierten Thymidin-Mengen sehr vie1 kleiner; es wurden pro Tag 0,s pg Thymidin pro g Ratte infundiert. Wegen der sehr kurzen mittleren Lebensdauer von freiem Thymidin im Organismus (ca. 15 Min.) ist dann die dauernd vorhandene Konzentration des freien Thymidins sehr klein und zwar angenahert = 0,s pg Thymidin/g/Tag x 0,Ol Tag = 0,008 pg/g Kiirpergewicht. Infolge der begrenzten Permeabilitgt der Placenta ftir freies Thymidin [31] ist die Thymidin-Konzentration im Feten ca. 5-7 ma1 geringer. Das zeigt, da13 ein EinfluB der infundierten Thymidin-Mengen auf den Ablauf der Proliferation der fetalen Zellen ausgeschlossen werden kann. Exptl

Cell

Res 55

Diskussion des zeitlichen Verlaufes des Prozentsatzes markierter Zellen (Fig. 2). Schwankungsbreite der Generationszeiten der fetalen Zellarten Fetale Zellarten ohne Schwankungen der Generationszeit (Fig. 2, a-d). Bei den Epithelien des Darmes, der Haut, der Zunge und des Knorpels stimmt der Zeitpunkt, bei dem erstmalig 100% aller Zellen markiert sind, mit den eingezeichneten Werten fur T-S (Tabelle 1) gut tiberein. Das entspricht genau dem, was zu erwarten ist, wenn bei den vier fetalen Zellarten keine oder nur geringe Schwankungen der Generationszeiten innerhalb einer Zellart vorliegen. Offenbar gelten die Generationszeiten und Teilphasen, die in Tabelle 1 aus S und dem MarkierungsIndex berechnet wurden, fur alle Zellen einer Zellart. Beim Vorliegen von Schwankungen der Generationszeit w%re bei T-S ein kleinerer Prozentsatz als 100 % zu erwarten. Wenn die Generationszeiten und Teilphasen bestimmte Werte haben, ist eine theoretische Berechnung des Kurvenverlaufs zwischen den Zeitpunkten 0 und T-S miiglich, vorausgesetzt die Art des Wachstums der fetalen Zellarten bei 20 Tage alten Feten ist bekannt. Bei steadystate-Wachstum, bei dem eine der Tochterzellen die Population nach der Mitose verlaBt, w&e ein linearer Anstieg der Kurven, angefangen beim Markierungs-Index zur Zeit 0 bis zur Zeit T-S, zu erwarten. Bei exponentiellem Wachsturn, das bei 20 Tage alten Feten noch angenghert vorliegen diirfte, treten zum Zeitpunkt G2+M (Tabelle l), d. h. nach 2-2,5 Stunden Mitosen markierter Kerne auf, wobei die beiden neu entstehenden markierten Kerne in der Population bleiden. Das hat eine Ausbuchtung der Kurven nach oben zur Folge, die in Fig. 2 deutlich erkennbar ist. Eine Berechnung des Kurvenverlaufs mit den Werten der Tabelle 1 und bei Annahme von rein exponentiellem Wachstum lieferte Kurven, welche den wesentlichen Verlauf der Kurven angenahert wiedergaben. tjbrige fetale Zellarten (Fig. 2, e-g). Beim fetalen Herzmuskel (Fig. 2e) ist bei T-S =34 Stunden der Prozentsatz markierter Zellen noch etwas kleiner als lOOoh. Dieser Wert wird erst

VariabilitLit

der Generationszeit

bei 48 Stunden oder einige Stunden friiher erreicht. Bei dieser Zellart lieferte die Methode der markierter Mitosen (siehe Kurve bei [31]) ftir S einen relativ ungenauen Wert. Das gleiche gilt dann fur die aus S und dem MarkierungsIndex berechnete Generationszeit. Auch lagen bei dieser Zellart im Gegensatz zu 12 anderen untersuchten Zellarten griigere Schwankungen von G2 + M zwischen 2,3 und 6,5 Stunden vor. Bei der Winterschlafdriise (Fig. 2g) steigt die Kurve relativ schnell an und erreicht bereits bei 12 Stunden 95 %. Aber such bei 48 und 72 Stunden wurden immer noch nicht-markierte Kerne beobachtet. Es kann keine Erkhirung dafi.ir ge@eben werden, warum die Kurve schon zu einem vie1 friiheren Zeitpunkt als dem T-S nach Tabelle 1 einen Wert von praktisch 100 % erreicht. Der Grund kann nicht in einer Ungenauigkeit der Werte fiir S und T gesucht werden. Die Kurve des Prozentsatzes markierter Mitosen fiihrt nach [3 l] eindeutig zu einem Wert S = 5,6 Stunden. Daraus ergab sich zusammen mit dem Markierungs-Index fi.ir steady-state-Wachstum T = 39,4 Stunden und fiir exponentielles Wachsturn 30,O Stunden. T-S ist dann im Mittel = 29,l Stunden. Die auffallige Diskrepanz mit der gemessenen Kurve ist ungeklsrt. Der Zungenmuskel (Fig. 2j) verhHlt sich deutlich anders als die tibrigen fetalen Zellarten. Bei T-S =26,9 Stunden sind erst 75 % der Kerne markiert, und such bei 48 Stunden und selbst bei 72 Stunden sind noch nicht alle Kerne markiert. Es sollen zwei mijgliche Deutungen dieses Kurvenverlaufs diskutiert werden: 1. Fall: Es kann ein breites Band von Generationszeiten zwischen etwa einem halben und drei Tagen vorliegen. 2. Fall: Es kann eine ,,growth fraction“ von nur 50% vorliegen. Der Rest der Zellen wiirde dann ,,ruhen“ oder eine sehr vie1 grijgere Generationszeit haben. Leider kann zwischen diesen beiden Fallen nicht unterschieden werden. Da bei fetalen Zellarten ein angenahert exponentielles Wachsturn vorliegen diirfte, ist in beiden Fgllen ein allmghlicher Anstieg der Kurve des Zungenmuskels auf 100% zu erwarten. Bei einer Streuung der Generationszeiten

bei jetalen Zellarten

der Ratte

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(1. Fall) ist das unmittelbar verstandlich. Bei einer growth fraction (2. Fall) von z. B. 50% wiirde zunachst nur die Hllfte der Kerne markiert sein. Die Zahl dieser Kerne nimmt aber bei exponentiellem Wachstum - relativ - dauernd zu und damit such der Prozentsatz der markierten Kerne. Auch die Zahl der Zellen der ,,non growth fraction“ kann sich mit der Zeit vermehren, weil proliferierende Zellen zu ,,ruhenden“ werden. Diese neuen ,,ruhenden“ Zellen sind aber im Gegensatz zu den anfgnglich vorhandenen markiert. Auch in diesem Fall ist also ein allmshlicher Anstieg der Kurve auf 100% zu erwarten. Anders liegen die Verhaltnisse bei steadystate-Wachstum. Beim Vorliegen einer ,,growth fraction” wiirde der Prozentsatz einen gewissen Wert erreichen und dann weiterhin horizontal verlaufen, wahrend bei einer Streuung der Generationszeiten - genau wie bei exponentiellem Wachstum - ein allmahlicher Anstieg auf 100 Y0 zu erwarten ist. Zhinkin und Andreeva [34] fanden bei der Bestimmung der Generationszeit des fetalen Zungenmuskels bei 14-21 Tage alten Feten der Ratte Diskrepanzen zwischen den aus S und dem Markierungs-Index berechneten Generationszeiten und den aus dem zeitlichen Abstand zweier Wellen markierter Mitosen ermittelten. Sie schliel3en daraus, da13 u. a. am 20. Tag eine growth fraction von nur 10 y0 vorliegt. Zunachst mug hierzu gesagt werden, da13 dieser SchluB nicht die einzige Deutungsmbglichkeit der beobachteten Diskrepanzen ist. Diese kbnnen genau so gut durch grol3e Schwankungen der Generationszeit erklart werden. Auch ist der SchluD auf eine growth fraction von 10 % am 20. Tag mit dem Kurvenverlauf in Fig. 2j nicht vertrfiglich. Wenn tatsachlich eine growth fraction vorliegt, so sollte diese mindestens 50 % betragen.

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Eingegangen am 10. MLrz 1969

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