Zur Problematik des In-vivo-Einsatzes von Kalium-Jodid und Natrium-Azid als spezifische Triplett-Quencher von Flavinen

Biochem. P hysi ol. Pfl anz en 179, 95- 108 (1984)

Zur Problematik des In-vivo-Einsatzes von Kalium-Jodid und Natrium-Azid als spezifische Triplett-Quencher von Flavinen EKKElI ARD SC HONBOIIl\1

und

ELF RIEDE S CHONB OHl\1

Botanisches InstitutjPhotob iologie der Universitat Marburg, BRD

On the Problems of in-vivo Experiments with Potassium Iodide and Sodium Azide as Specific Quenchers of the Excited Triplet States of Flavins K e y Te r III I nde x: Jlavi n-qucnehers, fJavin -jph yt ochrome-contr olled movements, KI , NaN3 ; Mouqeoi ia spec.

Summary Th e effect of t he Ilavin- quenchers K I and NaN 3 on t he red light- a nd blu e ligh t-con trolled chloroplast movement s has been investigated. The following r esult s were obtained:

1. Blu e light- as well as red ligh t- cont rolled chloroplast movements ar e strongly inhibited by K I and by NaN 3 , res pectively. 2. I n a ll types of chlorop last movements, which have been in vestigat ed in Mouqeoiia (I WLM, CWLM, SL M), t he inhibitory effect of K I is weak ened when exogeneo us ATP (or ADP) but not a t all ITP (or IDP) is applied simultaneously with KI. 3. Both photosyntheti c oxy gen evoluti on an d respiration in darkness get inhibit ed by K I an d by NaN3 , r espectively. 4. KI dissolve d in a qua dest . or in sor bito l (10- 4 M) almos t complete ly loses its severe inhib itory cffect on chloroplast movemen t s, 5. If KI is dissolved in aq ua dest. or in sor bit ol con tai ning CaCl2 (10- 2 1\1), its str ong in hibitory effect upon any light-orie nted chloroplast movem ent is rest ored. If KI is dissolved to geth er wit h MgCI2 , it rest rains chlor oplast movement in t he weak b ut not in the strong light. 6. Some experiment s demo nstra te that t he receptibilit y of the cell for KI is in creased b y additionall y CaCI2 • The a mount of KI pcnetra tin g the cell depends highly on qualiti es and quan t iti es of light.

Zusammenfassung KJ sowie Na.N, hemmen nicht nur die Blaulicht -abhangig e St arklicht bewegung, sond ern auch die Phyto chro m-gest euerte Schwachlicht- Verlageru ng der Chloroplasten. E s lieBen sich kein e Hinw eise find en, daf KJ bzw. NaN3 die Chloroplaste nb ewegung bei Mougeotia als Tripl ett- Quencher von Flavinen (ode r als Quenc her eines a nderen an der Bewegung bet eiligt en Ph ot orezep t ors) hemm en, Dur ch

Abkiirzungen: ADP, a denosine diphosph at e ; ATP adenosine tri phospha t e; B6, cult ur e medium: 1\I XS + earth extract (6 %) ; B8, culture medi um: MXS doubl e conce ntrated + earth extract (8 %); CWLM, weak-l ight chloroplas t move ment und er conti nuous irradiations; F1\IN, flavin monon ucleot ide ; ID P, inosine diph osph at e; ITP , in osine tri phospha te; I WLM, induction type of weak-light chloroplast movcment; MXS, ar tificial nu trient solution after W ARI S, 1953; pol. HR, lin early polarized rcd light ; SLM, strong-light chloroplast movement

96

E. SCHONBOHM und E. SCIIONBOIIM

Zugabe von ATP bzw. ADP, nicht jedoch von IDP, wird die hemmende Wirkung von KJ entweder entscheidend abgeschwacht oder vollstandig aufgehoben. Diese Befunde sprechen fur eine erhebliche Beeinflussung der Energetik der Chloroplastenbewegung durch KJ; in gleicher Weise laBt sich die Wirkung von KJ sowie von NaN 3 auf den 02-Gaswechsel interpretieren. Die hemmende Wirkung von KJ hangt sowohl im Schwach- als auch im Starklicht von gleichzeitig applizierten Ionen (z. B. von Ca++ und(oder Mg++) abo KJ (0,1 M) zeigt, in Sorbit oder in Aqua bidest. gelost, nur noch eine stark verminderte Hemmung der Chloroplastenbewegung. Erste Versuche zur Abhangigkoit der KJ-Aufnahme von aulleron Faktoren haben ergeben, daf z. B. Ca++-Ionen die Jodid-Aufnahme erheblich steigern; die KJ-Aufnahme ist aulierdem stark von der vor wie auch wahrend der KJ-Inkubation herrschenden Lichtqualitdt abhangig, Die Ergebnisse werden diskutiert. Uber weitere Befunde zur KJ- Wirkung bei Mougeotia wird in Kurze berichtet.

Einleitung

Blaues Licht sowie der nahe ultraviolette Bereich des Spektrums induzieren und kontrollieren eine Vielzahl physiologischer Reaktionen (CARLILE 1970; HAUPT und SCHONBOHM 1970; MUNoz und BUTLER 1975; SCHMID 1980). Die Aktionsspektren lassen keinen zweifelsfreien Schluf auf den fiir eine bestimmte Reaktion verantwortlichen Photorezeptor zu. Die Absorptionsspektren von Flavinen bzw. Carotinoiden in cisKonfiguration stimmen in ihrem Verlauf zum Teil recht gut mit den Aktionsspektren vieler Blaulicht-Reaktionen uberein; daher werden Vertreter aus beiden PigmentGruppen als verantwortliche Photorezeptoren von Blaulicht- Reaktionen diskutiert (z. B. COLOMBETTI und LENCI 1980; HAGER 1970; LENCI 1975; SCHMIDT 1980; SONG 1980; SONG und MOORE 1974; SONG et al. 1972). Kalium-Jodid (KJ) wirkt in vitro als ein sehr wirksamer und spezifischer TriplettQuencher von Flavinen (HOLMSTROM 1964; HOLMSTROM und OSTER 1961; SONG und MOORE 1968; SONG und METZLER 1967; WEBER 1950). Entsprechende Eigenschaften werden auch Natrium-Azid (NaNa) zugeschrieben (z. B. LEONG und BRIGGS 1982; SCHMIDT und BUTLER 1976a, b). Mit dem Ziel, die postulierte Beteiligung eines Flavins als verantwortlichen Photorezeptor einer bestimmten physiologischen Blaulicht-Reaktion zu beweisen, wird KJ gehauft auch in vivo eingesetzt (z. B. DIEHN und KINT 1970; KOWALLIK 1968; LENCI et al. 1983; LEONG und BRIGGS 1982; MAYER 1966; MEYER 1969; MIKOLAJCZYK und DIEHN 1975; SCHMIDT et al. 1977; SCHONBOHM 1967, 1969; SCHOLZ 1976; SEITZ 1967, 1970; WIDELL and BJORN 1976; ZENK 1967). Mit dem gleichen Ziel kommt auch Natrium-Azid in vivo zum Einsatz (COLOMBETTI et al. 1982; SHIMIZU et al. 1979; SCHMIDT et al, 1977). In vivo liegen die zu einer markanten Hemmung von Blaulicht-Reaktionen erforderlichen Konzentrationen in der Regel zwischen 0,1 M und 0,01 M KJ, wogegen eine Flavin-Quenchung in vitro durch KJ bereits bei Konzentrationen von < =c 10-4 M KJ erreicht wird (z. B. BERENDS and POSTHUMA 1962; HOLMSTROM und OSTER 1961; SONG und METZLER 1967). Daten iiber die intrazellular erreichte KJ-Konzentration liegen nicht vor, so daf obige Diskrepanz auf KJ-Aufnahme-Problemen beruhen konnte (vgl. jedoch dazu auch LXUGER et al. 1967). KJ ist nicht nur ein wirksamer Flavin-Quencher, sondern entkoppelt auch die oxidative Phosphorylierung (MIDDLEBROOK und SZENT-GYORGYI 1955), wirkt toxisch auf

Wirkung der Flavin-Quencher KI und NaN,

97

die Keimlings-Entwicklung von Triticum und Zea mays (HEWITT und NICKOLAS); dariiber hinaus fiihrt KJ zur Depolymerisierung von Aktin aus Muskeln (GUBA 1950). Dieses relativ breite Wirkungsfeld von KJ zwingt zur Vorsicht, die erfolgreiche Hemmung einer Blaulicht-Reaktion in vivo durch KJ primar unter dem Aspekt einer FlavinQuenchung zu interpretieren (siehe dazu auch KOWALLIK 1968; SCHONBOHM 1967; SEITZ 1970). Bei der Griinalge M ougeotia wird nicht nur die blaulichtabhangige ChloroplastenStarklichtbewegung (SLM: Wirkungsspektren siehe SCHONBOHM 1971), sondern auch die phytochromgesteuerte Schwachlichtbewegung durch KJ ghemmt (SCHONBOHM 1967, 1969; siehe auch Abb. 1, Abb. 2jII, III). Die Chloroplasten-Schwachlichtbewegung, ausgelOst durch eine einzige kurze HelIrot-Induktion, kann auch dann noch durch KJ stark gehemmt werden, wenn man KJ erst nach der HelIrot-Induktion appliziert und KJ damit ausschlieElich wahrend der Reaktionsphase im Dunkeln wirken kann (SCHONBOHl\! 1967; siehe auch Abb. 1 E). Diese Befunde beweisen, daf KJ zumindest die phytochromgesteuerte Schwachlichtbewegung nicht als Quencher (von Flavinen!), sondern als Inhibitor von Folgeprozessen hemmt. Offen ist dabei die Frage, ob KJ in die Mechanik (z. B. im Sinne von GUBA 1950) undjoder in die Energetik der Chloroplastenbewegung hemmend eingreift. Ungeklart ist bisher auch, ob Schwachlicht- und Starklichtbewegung iiber ein und denselben Wirkungsmechanismus durch KJ gehemmt werden. Mit vorliegender Analyse sollte eine Klarung einiger der aufgeworfenen Probleme versucht werden. Dabei wird einerseits die Wirkung von KJ auf die Chloroplastenbewegung im Stark- und Schwachlicht differenziert untersucht, andererseits solI ein moglicher EinfluB von KJ auf den SauerstoffGaswechsel bei M ougeotia gepriift werden.

Material und Methode Als Material diente Mougeotia, "Stamm Tiibingen". Uber die Anzucht der Algen, das Kulturmedium sowie die Methode der Vororientierung der Chloroplasten in eine einheitliche Ausgangsstellung (Profil- bzw. Flachenstellung) wurde wiederholt berichtet. Bei einem Teil der Untersuchungen zur KJ- Wirkung auf die Schwachlichtbewegung (siehe Abb. 8), wurde das Material nicht in die Profilstellung, sondern im offenen Tropfen in die Flachenstellung vororientiert. Diese Praparate wurden erst nach dem iiblichen Losungswechsel mit einern Deckglas abgedeckt und nach einer Dunkelphase von etwa 30 min mit polarisiertem Schwachlicht (Blau oder Hellrot; E-Vektor parallel zur ZellLangsachse sehwingend) unter einem Winkel von 45° sagittal bestrahlt. Der Chloroplast fiihrt unter diesen Versuchsbedingungen innerhalb von 12 bis 15 min im nicht gehemmten Praparat eine inverse Schwachlichtbewegung (Drehung von Flachen- in Profilstellung) durch (siehe dazu SCHONBOHM et al. 1981). Die Sauerstoffmessungen erfolgten polarographisch mittels einer Micro-Clark-Elektrode in Verbindung mit dem "Biologischen SauerstoffmeBgeriit, Modell 53" der Firma Yellow Springs Instruments (YSI). Die 02-Signale wurden verstiirkt und von einem Kompensations-Schreiber (Typ: BD 41 von Kipp & Zonen) kontinuierlich aufgezeichnet (1 m V = 1 % O2), Die Algenwatten wurden in dem thermostatisierten (26 DC) ReaktionsgefaB fixiert gehalten und konnten damit weder wahrend der Sauerstoffmessungen, noch wahrend des Losungsaustausches in ihrer Position verandert werden. Die Versuche iiber den EinfluB von KJ auf die lichtinduzierte Anderung der Chloroplastenverankerung wurden nach der von SCHONBOHM (1972) beschriebenen Methode durchgefiihrt. Soweit nicht

<>

7 Biochem. Phvsiol. Pflanzen, Ed. 179

E.

98

SCHONBOHM

und E.

SCIIONBOHM

anders angegeben, wurde bei samtlichen Bestrahlungsprogrammen mit monochromatischen lnterferenzfiltern vom Typ AL bzw. DAL gearbeitet.

Ergebnisse

Die Analyse der Energetik der lichtorientierten Chloroplastenbewegungen bei M ou-

geotia fiihrte u. a. zu dem Befund, daf die hemmende Wirkung von Entkopplern der oxidativen bzw. der Photophosphorylierung stark abgeschwacht wird, wenn man die Entkoppler gleichzeitig mit ATP oder ADP appliziert; IDP oder ITP zeigten keine entsprechende Wirkung (SCHONBOHM 1969; SCHONBOHM und SCHONBOHM 1983). Wie die in Abb. 2 dargestellten Befunde demonstrieren, kann die stark hemmende Wirkung von 10-3 M NaN 3 auf die Starklichtbewegung (E) deutlich vermindert werden, wenn Azid gleichzeitig mit ATP appliziert wird (F). Die Wirkung von NaN 3 auf die Schwachlichtbewegung im kontinuierlichen Licht (Abb. 2, II) laBt sich bereits durch eine Verlangerung der Bestrahlungszeit urn 30 min voll kompensieren (M). Auch die Chloroplastenbewegung des Induktionstyps (Abb. 2, III) wird durch NaN 3 erheblich gehemmt (P, Q, R). Die Befunde werden als Argument dafiir angesehen, daf NaN 3 die Chloroplastenbewegungen (SLM, CWLM, IWLM) primar als Hemmstoff der Energetik, dagegen nicht als Triplett-Quencher von Flavinen, hemmt, also unabhangig von den fiir die Orientierungsbewegung verantwortlichen Photorezeptoren. In Einklang mit dieser Interpretation stehen auch unsere Befunde iiber die Wirkung von NaN 3 auf den Sauerstoff-Gaswechsel im Hellrot-Dunkel-Wechsel: sowohl die Sauerstoff-Freisetzung im Hellrot als auch der Sauerstoff-Verbrauch wiihrend der Dunkelperiode kommen durch NaN 3 nahezu vollig zum Erliegen.

I WL M
2 .3<1

M

•

inhibition

A

Iwhite-light! do r k

I

0%

B

k·:::~::·::?:::::r:::/::>-::::(;I]\{:?/t;·):·-;:;~?i:1

69%

c

~.:.:·~::·//:::·'::l/(;})/:dJ

I

33%

o

V":::'/::)i:··t::I):/})~:>:D

I

22%

E

I

m.:::::;·:·\:\:::'·\/:,q

66%

o

I

I]

4 dQ r k

I

20

40

60

80

i

100 min

K I - inc ubQ t ion ( 0.1 M) control medium without KI .3<1 : 5 min red (RG 1: 50\V'm-2 ) [ill

o

Abb.1. Abhiingigkeit der Wirkung von KJ auf die Chloroplastenbewegung im Schwachlicht (Induktionstyp) von der Plazierung der KJ-Inkubationsphasen (punktiert) in den Programmen A-E.

Wirkung der Fla vin-Qu encher K1 und Na.N,

I:SLM e-
o •

2

II.:CWLM
0.1 M KSr 0.1 M Kl

~ ~

m

H(15 'whilelighl :2000 1x) t>

99

ill:IWLM
(l'pol.red.1.5W.m-2 j t>

·30'WL

NoN3

o

A Abb. 2. Hemmunq der Chloroplasienbeuiequnqen I , II , III dur ch KJ bzw. dur ch NaN a unterschiedlicher Konzeut ration ; Abschwiichung der Azidwirkun g dur ch ATP (F) bzw. dur ch Verliingeru ng der Bestrahhmgsdau er (M). Kontrollon: 0.1 ~I KBrink ubiert e Pr aparate (A, G, N). Weitere Deta ils im Text.

Nach .MIDDLEUROOK und SZENT-GYORGYI (1955) ist KJ ein starker Entkoppler der oxidat iven Pho sphorylierung. Im folgenden wird gepriift, ob dur ch die gleichzeitige Applizierung von KJ mit ATP oder ADP sich die Wirkung von KJ auf die ChIoroplast enbewegung im Schwachlicht (Abb. 2 B, H) reduzi eren laBt . Die in Abb. 3 Iiir den Induktionstyp der Schwachlichtbcwegung dargest ellten Befunde demonstri eren, daB eine gleichzeitige Inkubierung der Algen mit KJ und ATP (C), bzw. mit KJ und ADP (D) nicht mehr zu einer starken Hemmung der Chloroplast enbewegung du rch KJ Iuhrt, Ganz ents prcchende Ergebnisse brachten Versuche zur Beeinflu ssung der Schwachlichtbewegung im kon tinuierlichen Hellrot bzw. schwachen Blaulicht (Abb. 4): zusammen mit ADP (C, F) , nicht dagegen zusammen mit IDP (G) appliziert, verliert KJ weitgehend seine stark hemmende Wirkung (Abb. 4, B, E) auf die Schwachlicht bewegung. Diese Ergebni sse st ehen voll mit der Hypothese in Einklang, wonach KJ die Schwachlichtbewegung bei Mougeotia iiber die E nerget ik und nicht iiber den Primarprozef hemmt. Messungen zur Wirkung von KJ auf den Sauerstoffgaswechsel bei .jU ougeotia lieBen erkennen (Abb. 5), daB die Sauerst off-F reiset zung im Licht dur ch KJ bereits kurz na ch erfolgter Applikation st ark gehemmt wird (vgl. in Abb . 5A, b, d mit B, b, d), wogegen die Sauerst off-Aufnahme im Dunkeln erst nach lan gerer KJ-Einwirkung eine signifikan t e Hemmung erkennen laBt (vgl. in Abb, 5, A, a, c mit B, a, c, e). Diese Ergebni sse werd en als Beweis dafur an gesehen, daf KJ bei Mougeotia auf breit er Ba sis in den En er7*

100

E.

SCHONBOHM

und E.

SCHONBOHM

I W L M l 'rsd

30'

dark

.~

e c lOD 0

IJl

0

cw u 0

c IJl IJl

0

co

<-

0

.s=

u ~

0

2V1 'm- 2

red :

KI

c~o l

KI-

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

-

AOP .,....,.......,

ATP

r:--:-:"

' . '

°i ~(~

l~~'~

Ii

c

8

A

o

Abb.3. Hemmung der Chloroplastenbewegung im Schwachlicht (Induktionstyp) durch KJ (B) und deren Aufhebung durch gleichzeitig mit KJ inkubiertes ATP ( C) beio. ADP (D).

8 100 0 90 0 80 cw 70 0 60 c 50 40 0 30 ca, o <- 20 0

C W L M

c;

contrr l

KI-

AOP

con trol

KI-

IJl

:.:... .

AD P

.

"

"

.'

U

.

.

.

"

' .0

'

.

'

... . o.1 MK I

IJl

' 0 '

•

IJl

x:

10

~ 0

0

u

'

A

8

,

C

15 mincantin. red light (2V/ , m- 2 )

0

E

F

G

15min conlin. bl ue li gh t I 4.3 yt . m- 2 }

Abb. 4. Hemmung der Chloroplastel1bewegul1g im Schwachlicht im kontinuierlichen Hellrot bzu: Blau durch KJ (B bziu. E) sowie deren Auihebunq durch gleichzeihg mit IU appliziertes ADP (C bzu: F), nichtjedoch durch IDP (0).

Wirkung der Flavin-Quencher KI und NaN a

101

%0 2 A:C 0NTRO L:"Bfi'

18 17 16

15

r RED

%0 2 +B : 0.1 MKI in"B6"

16

D RED: 19Y1'm-z •

DARK

15 I

14

I

r

:~

I

e

I

Rid]

RED

•

Abb. o. Beeinflussung von Sauerstoffaufnahme und -abgabe (Ordinate) bei ein und demselben Priiparai durcli Licht und Dunkel. Versuchsmaterial in "B6" ohne (A) sowie mit O,llVI KJ (B) inkubiert.

giestoffwechsel (Atmung und Photosynthese) eingreift. Im Gegensatz zu den Untersuchungen von MIDDLEBROOK und SZENT-GYORGYI an isolierten Ratten-Mitochondrien wird bei Mougeotia vor allem bei zunehmender KJ-Einwirkungsdauer auch die Sauerstoff-Aufnahme erheblich durch KJ gehemmt; das ist ein Ergebnis, das zeigt, daB KJ bei Mougeotia nicht aussehlieBlich als Entkoppler, sondern bei langerer Einwirkungszeit zunehmend auch als Inhibitor der Atmung wirksam wird. Die zyklische Phosphorylierung gilt als wesentlicher Energielieferant der Chloroplastenbewegung im kontinuierlichen kurzwelligen Starklicht (SCHONBOHM und SCHONBOHM 1983). Ob auch die zyklische Photophosphorylierung durch KJ gehemmt wird, kann aus einer Hemmung der Sauerstoff-Frcisetzung durch KJ nicht geschlossen werden. Ubcr die KJ-vYirkung bei der Starklichtbewegung sollen weitere Experimente AufschluB geben: Die Hemmung der Starklichtbewegung durch KJ bleibt aus, wenn es zusammen mit ATP appliziert wird (vgl. in Abb. 6B mit C). Diesel' Befund laBt den SchluB zu, daB KJ auch im Starklicht die Chloroplastenbewcgung iiber die StOrung der Energetik (hier: StOrung del' zyklischen Photophosphorylierung) hemmt.

102

E. SCHONBOHM und E. SCHONBOHM

SLM OJ

100


' "

0 L.-

0.

"0

80

V1 0

0. 0

x:

'

50 40

:.'":.' :

,

"

"

... ..

L.-

0

,

"

C

V1

Al P

0,1MKI

• A1 P

'

. .

20

0,1MKI

" " , ,

,

,

"

u

~ 0

0

A

8

0

C

12 mi n bl ue l i ghl ( 15 VI , m- 2 ) Abb.6. Hemmung der Starkliehtbewegung dureh KJ (B) sowie deren Aufhebung dureh ATP (0).

100 ~ 90 ~ 80


ooMXs oo· NS SORB ITOL : . .'

,

0.

C

~ V1

..

• KI

,

"

70

'

: ,', · KI

50

~ 50

"

.'

. ...

o

:; 40 ~ 30 ~ 20 u ~ 10

"

'"

.. . .

0.

Abb. 7. Abhiingigkeit einer Hemmung der Ohloroplastenbewegung im Siosklichi.

0,1 M KJ (stark punktiert); Inkubationslosungen B6 (B), :VIXS (D), 10-4 M Sorbit ohne (F) bzw. mit CaC12 (H) oder mit MgC1 2 (K). Schwach punktiert: Reaktion in den Inkubationslosungcn ohne KJ.

Wirku ng der Flavin-Qucnch cr KI und Na N3

100 QI

SORBITOL

::: 90

.. :

~

....

o

80

.:: 70

.....

CaCl2 ( lO-LM)

, " .:::

::','

"

" ,

,'.:'.: ".:.' ': '.; ....

U; o

x:

~ 30 ~ 20

. :. "

Mg Cl2 1l0-i M) ,,':

<11

60 0. o 50 :::; 40

103

:

:.....

.:.'.:

.... :

.: -:

u

~ 10

0..

o AS CD EF GH CWLM: 15 min polarized red (1.5W·m- 2 j Abb. 8. A b!liingigkeit einer Hemmunq der Chloroplastenbewegung im S chicuchlichi im koniinu ierlichen He/lrot. 0,1 M KJ (sta rk punktiert), Inkubati onsliisun gen B6 (ll), 10- 4 M Sorbi t ohne (D) bzw. mit CaCl2 (F), oder mit )r gCl2 (H). Schwa eh punkticrt: Reaktion in den Inkubati onstosun gen ohne KJ.

Die Reproduzierbarkeit diesel' Befunde hiingt jedoeh in erheblich em Umfang von del' Ton en-Konzentration des Mediums ab , in dem KJ und ATP gelost werden. 11it abn ehmender Ionenkonzentration nimmt die hemm ende Wirkung von 0,1 ~1 KJ erheblich abo Diese Beobachtung erschwert eine eindeutige Interpretation del' Befunde au s Exp eriment en iiber die Wirkung von KJ auf die lichtorientierten Chloroplastenbewegungen bei Mougeotia; daher soli die Abhangigkeit del' Wirkung von KJ von Tonen des Niihrmediums in einer orientierend en Analyse gepriift werd en.

Die Bedeutung von CaC12 und MgC12 auf die hemmerule Wirkung von KJ Wird KJ in den Nahrlosun gen "B6", "B8" oder in " MXS" gelost, so hemmt es die Chloroplast enbewegung sowohl im Starklicht (z. B. Abb. 7 B, D) als auch im Schwachlicht (Abb. 8 B). Lost man KJ dagegen in 10-4 M Sorbit, so geht seine Hemmwirkung stark zuriick (Abb. 7Fund Abb. 8 D). Ganz entsprechende Befunde erhalt man auch, wenn KJ st att in 10- 4 M Sorbit in Aqua dest, gelOst appliziert wird. Damit stehen moglicherweise extra zellular ablaufende Reaktionen zwischen Sorbit und KJ als Ursache fiir das nahezu vollst iindige Ausbleiben (bzw. st arke Zuriickgehen) del' Hemmung del' Chloroplast enbewegung dutch KJ nieht zur Diskus sion. Das Algenmaterial wurde bei solchen Experimenten mindest ens 4 h VOl' Beginn des eigentlichen Experim ent es aus del' Nahrlosung ("B6" oder ,J IXS" ) entnommen, tiber Kleenex abgelOscht und in 10- 4 ~I Sorbit uberfiihrt. Die Algen blieben in Sorbit iiber mehr ere Wochen voU reaktionsfahi g (siehe dazu au ch die "So rbit ol" -KontroU en del' Abb . 7 und 8).

104

E.

SCHONBOHM

und E.

SCHONBOHM

Bringt man KJ zusammen mit CaCIz (bzw. MgCIz) in 10-4 M Sorbit (oder in Aqua bidest.) in Losung, so tritt sowohl im Stark- (Abb. 7 H) als auch im kontinuierlichen Schwachlicht (Abb. 8F) bei dem mit KJ/CaCI 2 inkubierten Material wieder die bekannte starke Hemmung auf. In der Kombination zusammen mit MgCl2 appliziert, hemmt 0.1 M KJ lediglich die Schwachlichtbewegung (Abb. 8, H), nicht dagegen die Starklichtbewegung (Abb. 7 K). Samtliche KJ-freien Praparate zeigen sowohl im Stark- als auch im Schwachlicht Reaktionswerte nahe des Sattigungsniveaus (Abb. 7E, G und Abb. 8C, E, G). Diese ersten Befunde uber die Abhangigkeit der hemmenden Wirkung von KJ von gleichzeitig angebotenen Ionen (Ca! ! bzw. Mg++) machen eine Vertiefung dieser Analyse dringend erforderlich. Eine erste Interpretation der Ergebnisse soll in der Diskussion versucht werden.

Diskussion Die an Mougeotia erzielten Ergebnisse iiber die Wirkung von KJ zeigen, daB die Chloroplastenbewegung im Stark- wie auch im Schwachlicht gleichermaBen durch KJ gehemmt werden, obgleich lediglich die Starklichtbewegung eine von kurzwelliger Strahlung (Blau/nahes UV) abhangige Reaktion ist. Fur die Schwachlichtbewegung im Hellrot sowie Iur die inverse Schwachlichtbewegung im Blaulicht ist dagegen Phytochrom der ausschlieBliche Photorezeptor. Die Schwachlichtbewegung wird jedoch auch dann stark durch KJ gehemmt, wenn die Applikation erst nach einer einzigen HR-Induktion im Dunkeln erfolgt. Damit ist zumindest Iiir die Hemmung der Schwachlichtbewcgung bei Mougeotia erwiesen, daB KJ weder als Triplett-Quencher eines Flavins (oder eines anderen Photorezeptors ?), noch iiber im Licht freigesetztes Jod im Sinne von KOWALLIK (1968) wirksam wird. Nach einer 30minlitigen Bestrahlung einer KJ-InkubationslOsung mit Blau (40 W/m 2) lief sich spektralphotometrisch Jod nicht nachweisen. Die Befunde iiber die Beeinflussung des Sauerstoff-Gaswechsels in Hellrot- sowie in Dunkel-Phasen durch KJ bestatigen, daB sowohl die Dunkelatmung und damit auch die oxidative Phosphorylierung als auch die Sauerstoff-Entwicklung im Licht durch KJ gehemmt werden. Im Gegensatz zu den Experimenten von MIDDLEBROOK und SZENTGYORGYI (1955) an isolierten Ratten-Mitochondrien, wirkt KJ bei Mougeotia nicht primar im Sinne eines Entkopplers der oxidativen Phosphorylierung (siehe auch SEITZ 1970), sondern als Atmungshemmstoff. Bei der Starklichtbewegung ist es uns bisher noch nicht gelungen, durch eine einzige, kurze Blaulicht-Phase eine sich iiber etwa 20-30 min ausdehnende Starklichtbewegung zu induzieren; das bedeutet jedoch, daB z. Z experimentell keine Chance besteht, den EinfluB von KJ allein auf den Primarprozef (also isoliert von den Foigeprozessen) zu analysieren. Die Starklichtbewegung laBt sich sowohl durch KJ als auch durch Flavine hemmen (Abb.9). Eine gegenseitige Abschwachung ihres Hemmeffektes, bzw, eine Abschwachung der hemmenden Wirkung von KJ lieB sich jedoch durch simultane Applikation von KJ und FMN bzw. Riboflavin (Abb. 9C, D) nicht nachweisen (siehe dagegen SCHMIDT und BUTLER 1976a). Dieses Ergebnis spricht zumindest nicht Iur eine

Wirkung der Flavin-Quencher KI und NaN,

~100

.-

--..... 90

105

S L M

CD ...

12 min blue: lS\¥·m- 2

0

Cl.

80

C

.- 70 VI

-; 60 0

~50

~ 40

0

~ U

~

30

20 ..... 10

.::E

:.'

-

c:

c

> o

w

....

::E.

0

4

10-1 MKI

·IX

~

:z: :0'. w

. '.


.->c: 0

~

:z:

o .c

::E LL.

:z: ::E

:z:

LL.

LL.

IX

';'%

::E

,c

C'l%

::E

::E

0

.c

C'l I

::E

o

0

u

"

A

H

Abb.9. Keine gegenseitige Absehwiiehung der Wirkung von J(J (B) und von Flavinen (F, G) dureh deren simuliane Applikation (0, D, E) bei der Starkliehtbewegung.

Hemmung der Starklichtbewegung durch KJ im Sinne einer Wirkung als TriplettQuencher von Flavinen. Es liiBt sich jedoch sowohl bei den Schwachlichtbewegungen (IWLM, CWLM) als auch bei der Starklichtbewegung (SLM) die hemmende Wirkung von KJ stark zuriickdrangen, wenn ATP oder ADP (nicht jedoch IDP!) gleichzeitig mit KJ appliziert werden. Wenn auch der Aufnahme-Modus von ATP in die Zelle noch unbekannt und die Aufnahme noch umstritten ist (z. B. LUTTGE et al. 1974), sehen wir auf Grund der Fulls des vorliegenden Datenmaterials (NIP: positive Wirkung, ITP: ohne erkennbare Wirkung! Siehe auch SCHONBOHM und SCHONBOHM 1983 a) z. Z. keinen AnlaB, an der spezifischen Wirkung von ATP und ADP bei obigen Experimenten zu zweifeln. KJ hemmt nach diesen Ergebnissen die Chloroplastenbewegung im Stark- wie im Schwachlicht durch Storung der Zellenergetik. Befunde aus ersten eigenen Untersuchungen iiber die Beeinflussung der lichtinduzierten Chloroplastenverankerung bei Mougeotia durch KJ (SCHONBOHM und SCHONBOHM 1983b) schlielien eine Storung der Actomyosin-Filamentbildung durch KJ nicht aus (vgl. GlJBA 1950). Von besonderer Bedeutung fur die Interpretation von Befunden aus den zahlreichen In-vivo-Experimenten mit KJ sind jene Ergebnisse an Mougeotia, die zeigen, daB die hem men de Wirkung von 0.1 M KJ auf die Chloroplastenbewegung weitgehend ausbleibt, wenn KJ statt in Nahrlosungen (B6, B8, MXS) in Aqua bidest. oder in einer Sorbitlosung appliziert wird. KJ (0,1 M), in Sorbit oder Aqua bidest. gelost, hemmt jedoch die Starklichtbewegung wieder, wenn es zusammen mit CaC1 2 appliziert wird; bei der Schwachlichtbewegung kann CaC1 2 mit der entsprechenden Wirkung auch durch MgC1 2 ersetzt werden. Erste orientierende Versuche zur Frage der KJ-Aufnahme zeigen ein-

106

E. SCIIONBOHM und E. SCHONBOJIM

deutig, daB die Mougeotia-Zcllc aus einer Kd-Sorbit-Losung wesentlich weniger KJ aufnimmt ais aus einer CaCI2 enthaltenden Kd-Sorbit-Losung. AuBerdem ist die KJAufnahme bei Mouqeoiia auch stark von der Lichtqualitat abhiingig: vor allem im Dunkeln, jedoch auch im Dunkeirot , wird wesentlich mehr KJ in die Zelle aufgenommen als im Hellrot oder im Blaulicht. Diese Befunde bedeuten jedoch , daB bereits die Licht- bzw. Dunkelbedingungen wahrend der Vor-Inkubationsphase oder auch wahrend der Reaktion spha sen selbst das AusmaB einer KJ-Wirkung auf die eigentlichen Reaktionen sehr entscheidend bestimmen konn en; diese Tatsache erschwert die Interpretation von Untcrschieden in der KJ- Wirkung zwischen Blaulicht- und Dunkelreaktionen (z. B. PhototropismusjGeotropismus). Uber wcIche Photorezeptoren die KJ-Aufnahme bei Jv[ougeotin beeinflufit werd en kann , und welche Rolle verschiedene Ionen im KJ-Aufnahrneprozef spielen, sollen weiterc Untersuchungen klaren. Es wird in Kiirze dariiber berichtet (siehe SCHONBOHM und SCHONBOHM 1983b). Die vorliegenden Befunde geben keinen Hinweis darauf, daB die ChIoroplastenbewegun gen bei 2\;1ougeotia durch K;r tiber dessen Funktion als Triplett-Quencher von Flavinen gehemmt werden; sie sprech en vielmehr Iur eine Hemmung der Chloroplastenbewegung tiber eine Storung der Zellenergetik, wobei zusatzlich cine negative Beeinflussung der Bildung von Actornyosin-Filament en nicht auszuschlieBen ist. Unser Dank gilt Frau G. LUCK E fiir zuv erl iissige te chnis che Assist enz. Herrn H. BECKER danken wir filr das Anfertigen der Zeichnungen . Besonderer Dank gilt der Deutsehen Forschungsgem einschaft fiir eine Sach beihilfe.

Literatur BEH ENDS, W., and PO S TH U~[ A , J.: J. Phys. Chem. 66, 2547ff. (1962); Zit . na ch Holmstrom 1964. C.\RLILE, M. J.: Th e photorespon ses of fun gi. In: Photobiology of Microor ganisms pp. 309 -344; P. HALLD AL (ed.). Wiley-Interscience, London-New York-Syndney-Toronto 1970. CO[,Q~IBETT I, G., HADER, D. P., LENCI, F. , and QUA GLIA, ?oL: Phototax is in E uglena gracilis : Eff ect of Sodium Azid and Triphen ylm ethyl Phosphonium Ion on the photosensory transduction chain. Curre nt MicrobioI. 7, 281- 284 (1982). COLO MBETTI, G., and LENCI, F.: Id entifications and spe ctroscopic charact eriza tion of photoreceptor pigm ents. In: Photoreception and Sens ory Transduction in Aneur al Organisms. LENCI, F. , and CO LO MBETTI, G. (eds.). pp . 173-188. Pl enum Press, New York and London 1980. DI EHN, B., and KINI, B.: Th e fla vin nature of the photoreceptor mol ecule for phototaxis in Euglena. Physiol. Chem. & Physics 2, 483-488 (1970). GUllA , F.: Effect of halogen ions on F-a ctin. Nature (London) 165, 439 (1950). HAGER, A.: Ausbildung von Maxima im Absorptionsspektrum von Carotinoiden im Bereich um 370 nrn ; Fol gen fiir die Interpret ation bestimmter Wirkungsspektren. Pl anta 91, 38-53 (1970). H AUPT, W., and SCHONBOHM , E. : Light-oriented chloroplast mov ements. In: Photobiology of Microorganisms pp. 283-307; P. HAI.LDAL (ed.). Wiley-Interscience, London-New York-S ydneyToronto 1970. H EWI TT, E. J. , and NICKOLAS, D. J. D.: Cations and Anions : Inhibitions a nd intera ctions in met abolism and in enzym e acti vity. In : Met abolic Inhibitors. H OCIISTER, R. M., and QUASTEL, J. H. (eds.) , Vol. 2, pp. 311- 436, Academic Pr ess, New York-London 1963. H OLMS TR 6~I, B.: Th e mechani sms of th e photoredu ction of riboflavin. Arkiv for Komi 22, 329 -346 (1964). H OL~I S T R 6 ~I , B., and OSTER , G.: J. Ann. Chern. Soc. 83 , 1867 (1961). Ziti ert nach Holmstrom, 1964

Wirkung del' Flavin-Quencher KI und Na.N,

107

KOWALLIK, W.: Uber die Wirkung von Kaliumjodid auf die lichtstimulierte endogene Atmung von Algen. Planta 79, 122-127 (1968). L,\CGER, P., LESS LAUER, W., MARTI, E., and RICHTER, J.: Electrical properties of biomolecular phospholipid membranes. Biochim. Biophys. Acta 135, 20-32 (1967). LENCI, F.: Photochemistry of flavins. In: Biophysics of Photoreceptors and Photobehaviour of Microorganisms pp. 164-178; G. COLOMBETTI (ed.) Lito Felici - Pisa 1975. LENCI, F., COLOMBETTI, G., and HADER, D.-P.: Primary events in the sensory transduction of the negative phototaxis in flagellate, Euglena gracilis. in the press (1983). LEOXG, T. Y., and BRIGGs, W. R.: Evidence from studies with Acifluorfen for participation of a flavin-cytochrome complex in blue light photoreception for phototropism of oat coleoptiles. Plant Physiol. 70, 875-881 (1982). LiTTTGE, U., SCHOCH, E. V., and BALL, E.: Can externally applied ATP supply energy to active ion uptake mechanisms of intact plant cells? Aust. J. Plant Physiol. 1, 211-220 (1974). ~IA VER, F.: Lichtinduzierte Chloroplasten-Verlagerungen bei Selaginella martensii. Untersuchungen ZUT Identifizierung des Photoreceptors durch Anwendung von Quencher-Substanzen. Z. Pflanzenphysiol. 55, 65-70 (1966). MEVER, A. M.: Versuche zur 1. positiven und zur negativen phototropischen Kriimmung del' Avenakoleoptile. Z. Pflanzenphysiol. 60, 418-433 (1969). MIDDLEBROOK, M., and SZENT-GVORGVI, A.: The action of iodide on oxidative phosphorylation. Biochim, Biophys. Acta 18, 407-410 (1955). MIKOLAJCZVK, E., and DIEHN, B.: The effect of potassium iodide on photophobic responses in Euglena: Evidence for two photoreceptor pigments. Photochem. Photobiol. 22, 269-271 (1975). MUNOZ, V., and BUTLER, W. L.: Photoreceptor pigment for blue light in Neurospora crassa. Plant Physiol. 55, 421-426 (1975). SCIIl\HD, G. H.: Photoregulation von Flavinenzymen dUTCh Blaulicht. Ber. Deutsch. Bot. Ges. 83, 399-415 (1970). SCHMIDT, W.: Physiological Bluelight Reception. In: Structure and Bonding 41, 01-44; J. D. DuNITZ; J. B. GOODENOUGH; P. HEMMERICH; J. A. lEERS; C. K. JORGENSEN; J. B. NEILANDS; D. REINEN; R. J. P. WILLIAMS (eds.). Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1980. SCIIl\HDT, W., and BUTLER, W. L.: Light-induced absorbance changes in cell-free extracts of Neurospora crassa. Photochem. Photo bioI. 24, 77-80 (1976a). SCHMIDT, W., and BUTLER, W. L.: Flavin-mediated photoreactions in artificial systems: A possible model for the blue-light photoreceptor pigment in living systems. Photochem. PhotobioI. 24, 7-175 (1976b). SCIDIIDT, W., HART, J., FILNER, P., and POFF, K. L.: Specific inhibition of phototropism in corn seedlings. Plant Physiol. 60, 736-738 (1977). SCHiixBOHM, E.: Die Hemmung del' positiven und negativen Phototaxis des Mougeotia-Chloroplasten dUTCh Jodid-Ionen. Z. Pflanzenphysiol. 56, 366-374 (1967). SCHONBOIIM, E.: Untersuchungen iiber den EinfluB von Photosynthesehemmstoffen und Halogeniden auf die Starklicht- und Schwachlichtbewegung des Chloroplasten von Mougeotia spec.: Z. Pflanzenphysiol. 60, 255-269 (1969). SCHOXBOHM, E.: Untersuchungen zum Photoreceptor-Problem beirn tonischen Blaulicht-Effekt del' Starkliehtbewegung des Mougeotia-Chloroplasten. Z. Pflanzenphysiol. 66, 20-33 (1971). SCHiiNBOHM, E.: Die Wirkung von SH-Bloekern sowie von Licht und Dunkel auf die Verankerung del' JIougeotia-Chloroplasten im cytoplasmatischen Wandbelag. Z. Pflanzenphysiol. 66, 113-132 (1972). SCHiiNBOIIM, E., und SCHONBOIIM, E.: Die Bedeutung del' Photosysteme I und II sowie del' oxidativen Phosphorylierung fiir die lichtorientierte Bewegung des Mougeotia-Chloroplasten. Bioehem. Physiol. Pflanzen 178, 157-176 (1983 a). SCIIijXBOHM, E., and SCHONBOHM, E.: Multiple effects of the flavin quencher potassium iodide on light- and dark-processes in the green alga Mougeotia. The blue light syndrom II, H. SENGER (cd.) in the press. Springer Verlag, Heidelberg-Berlin-New York 1983 b.

108

E. SCHONBOH)f und E. ScnONBOH)!, Wirkung der Fl avin-Quencher KI und NaN 3

SCUO NB OIBf, E. , SCHOKBOH)f, E. , und LUCKE, G.: Die E nts te h ung sy mmet rischer und asy mmetrischer Ph yto chrom-Gradienten bei MOl/geotia und deren Bedeu tung fiir die Chloroplaste nori entierung i m Stark- und Sch wachlicht. Ber. Deutsch. Bot. Ges. 92, 297-304 (1979). Sc not.z, A.: Lich torientierte Chlor oplas t enbew egung bei Ho rmi diu m [laccidum : Verschiedene Meth oden der Lichtrichtungsp erception und die wirk samen Pi gm ente. Z. Pfl anz enphysiol. 77, 422-436 (1976). SEITZ, K.: Eine Anal yse der fiir die lichtabhangigen Bewegun gen des Chloroplas ten vera nt wortlichen Ph otorezeptorsyst eme bei Vallisneria sp iralis ssp. iorta. Z. Pflanz enphysiol. ;;7, 96-104 (1967). SEITZ, K.: Zur Frage der Jodid-Wirkung auf die Star klicht- Bewegung der Chloroplaste n von FallisIl eria spirolis ssp. tortu, Z. Pfl anz enphysiol. 62, 63-69 (1970). SHIMIZU, ~I., E GASHIHA, T. , a nd TAKA II.UIA, U.: Inactivation of Neurospora crassa conidia by singlet molecular oxygen genera t ed by a photosensitized rea ction. J . Bacte ri ol. 138, 293-296 (1979). SONG, P. S.: Spect roscopic and photochemical characte rizat ion of flavoproteins and corote nopro t eins as blu e light photoreceptors. In : Th e Blue Light Syndr om. (SENGE R, H., ed.) Springer, BerlinH eid elb erg-New York 1980. SONG, P. S., and METZLER, D. E. : Ph ot ochemical degradation of Ilavins - IV. Studies of the a na erobic photolysis of riboflavin. Ph ot ochem . Photobiol. 6, 691-709 (1967). SONG, P. S., and MOORE, T. A.: Mechan ism of the photodephosphorylation of Menadiol Diphosphate. A mod el for bioquantum conversi on..J. Am. Chern. Soc. 90, 6507 (1968). SONG, P . S., and ;\IOORE, T. A.: On the pho tore ceptor pigment for ph ot otropi sm and phototaxis: Is a carot enoid the most lik ely can did ate ? Photochem. Photobiol. 19, 435- 441 (1974). SONG , P . S., MOO RE, T. A., and SUN, lII.: In : Th e che mist ry of plant pigm ents. Chicheste r , c.o. (cd.) , pp . 33-74. Acad emi c Press, New York 1972. WARIS, H.: Th e significa nce for algae of chelat ing substance s in t he nutrien t solutions. Ph ysiol . Plant. 6, 538- 543 (1953). WEllER, G.: Fluorescence of rib oflavin and flavin-adenine din ucleotide. Biochem. J. 47, 114- 121 (1950). WIDELL, S., and BJORK, L. 0 . : Ligh t- in du ced absorption changes in etiolat ed coleoptiles . Ph ysiol. Pl an t. 36, 305-309 (1976). ZENK, 111. H.: Unters uch ung en zum Ph ototropismus der Avella.Koleoptil e: I: Photooxid ati on en in viv o. Z. Pflanzenphysiol. ;;6, 57-69 (1967).

Einqeqanqen a m 5. April 1983 ; akzepliert a m 27. Juni 1983 Anschr iff der Verfasser : E KKEIiAllD und ELFRIED E SCHONBO UM, Botanisehes In stitut /Photobiologie der Universit at Marhurg , Auf den Lahnberge n, D - 3550 Marburg 1.