Application de la spectrométrie de masse en exploration hormonale

SPECTROMÉTRIE DE MASSE

Application de la spectrométrie de masse en exploration hormonale Jean Fieta,*, Frank Gitona,b, Jérôme Guéchotc

RÉSUMÉ

SUMMARY

La spectrométrie de masse (SM) couplée à la chromatographie en phase gazeuse (GC-MS) ou en phase liquide (LC-MS/MS) est de plus en plus utilisée en hormonologie, particulièrement pour les dosages des stéroïdes. La spécificité et la sensibilité des dosages des stéroïdes par SM sont comparées à celles obtenues couramment par immunologie (radioimmunologie (RIA) et automates d’immunoanalyses). Les principales situations clinicobiologiques au cours desquelles la SM présente des avantages de spécificité ou de sensibilité par rapport aux dosages immunologiques sont les suivantes : le diagnostic de l’hyperplasie congénitale des surrénales à la naissance en particulier chez les prématurés, et plus généralement l’exploration des divers déficits enzymatiques des stéroïdes, le dosage du cortisol urinaire et du cortisol salivaire dans l’exploration du syndrome de Cushing, la détermination de l’aldostérone du plasma (difficile par RIA), celle de la cortisone au cours des syndromes d’excès apparent en minéralocorticoïdes, l’exploration des hyperandrogénies avec leurs diverses étiologies (ovaires polykystiques, syndromes de Cushing, tumeurs endocriniennes, forme non classique de déficit en 21-hydroxylase, idiopathiques), le diagnostic différentiel des états pré-pubères et pubères en pédiatrie. Cependant malgré les avantages réels de la SM par rapport aux dosages immunologiques, une validation rigoureuse des dosages est nécessaire en particulier pour les dosages des stéroïdes isomères qui présentent le même spectre de fragmentation. La SM élargit le domaine d’exercice des biologistes car elle leur donne accès à des dosages, et par conséquent à des pathologies, auparavant réservés à des laboratoires très spécialisés comme les dosages de 21-désoxycortisol, 11-désoxycorticostérone, 11-désoxycortisol, androstènediol, prégnénolone et 17-OH-prégnénolone. Enfin, la mise en œuvre de la SM en conduisant à des résultats plus exacts, permet d’améliorer la comparabilité des résultats entre les laboratoires. GC-MS – LC-MS/MS – stéroïdes – déficits enzymatiques des surrénales – syndrome de Cushing – hypertension endocrinienne – hyperandrogénie – hypogonadisme – ménopause – pédiatrie – vitamines D. a Laboratoire des stéroïdes – INSERM U955 Eq07 Faculté de médecine 8, rue du Général-Sarrail 94010 Créteil cedex b Centre d’investigation biomédicale Hôpital Henri-Mondor- Groupe hospitalier universitaire Sud (AP-HP) 51, av. du Mal de Lattre-de-Tassigny 94010 Créteil cedex c Service de biochimie A Hôpital Saint-Antoine (Hôpitaux universitaires Paris-Est, AP-HP) 184, rue du Faubourg Saint-Antoine 75571 Paris cedex 12

* Correspondance fi[email protected] article reçu le 13 septembre accepté le 13 septembre 2011 © 2011 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés.

Application of mass spectrometry in hormonal exploration Mass spectrometry (MS) coupled with gas- or liquidphase chromatography (LC-MS/MS) is used more and more frequently in hormone biology, particularly for steroid assays. We emphasize the specificity and sensitivity qualities of LC-MS/MS in comparison with assays carried out by radioimmunology (RIA) or by automated immunoanalysis in the investigation of endocrine syndromes. The main biological and clinical situations for which MS improves specificity or accuracy relative to immunologic assay methods are the following: congenital adrenal hyperplasia diagnosis, particularly in premature newborns, and in general, studies of steroid enzym deficiencies, urinary and salivary free cortisol, in Cushing’s syndrome investigation, difficult aldosterone assay, cortisone assay in diagnosis of apparent mineralocorticoid excess syndrome, hyperandrogeny studies with the various etiologies (idiopathic hirsutism, polycystic ovary, 21-hydroxylase deficiency, endocrine tumors, Cushing ‘s syndrome) and the pre- and post-pubertal differential diagnosis. However, in spite of the real advantages of MS compared with immunological assays, rigorous validation of MS assay is necessary during development of the method, especially for assays of steroid isomers, which present the same fragmentation spectrum. We emphasize the interest of MS, which broadens biologists’ area of activity, since it provides them with access to new steroid assays, and, as a consequence, to pathologies previously reserved to very specialized laboratories, for example, for 21-deoxycortisol, 11-deoxycorticosterone, 11-deoxycortisol, androstenediol, pregnenolone and 17-OH-pregnenolone. Finally, by yielding more accurate results, the use of MS should allow improvement in comparison of results among laboratories. GC-MS – LC-MS/MS – specificity – steroid enzymatic deficiency – pediatrics – hyperandrogeny – aldosterone – cortisone.

1. Introduction Les dosages par spectrométrie de masse en hormonologie en 2011 s’adressent essentiellement aux stéroïdes. Dans les années 1970, on a vu apparaître leurs dosages dans les urines par chromatographie en phase gazeuse (CPG) très rapidement associés à un développement REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - DÉCEMBRE 2011 - N°437 //

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Tableau I – Comparaison des qualités et avantages respectifs de la GC-MS et de la LC-MS/MS [5]. Caractéristiques

GC-MS

LC-MS/MS

Petites molécules (MM < 500 Da), stéroïdes non conjugués, prostaglandines, acides organiques, acides gras (les analytes doivent être volatils après dérivation)

Très grande diversité des dosages. Stéroïdes non conjugués et conjugués, acides aminés, acylcarnitines, bases puriques et pyrimidiques, prostaglandines, petits peptides et protéines (liste non limitative)

Moyenne

Plus grande que la GC-MS

Nécessaire

Généralement non nécessaire

Injection seule

Complète

Lente

Rapide

Résolution de la chromatographie

Excellente

Pauvre

Spécificité

Excellente

Excellente

Détection moyenne

Détection excellente

Bonne détection

Détection médiocre

Bonne

Médiocre

Diversité des dosages

Facilité d’utilisation Dérivation Automatisation Vitesse de l’analyse

Dérivés 3-oxo 4-ène Dérivé 3-hydroxy Profils de stéroïdes non ciblés

des dosages plasmatiques par radioimmunologie (RIA). Ainsi, une sémiologie endocrinienne s’est constituée, basée sur des dosages hormonaux plasmatiques mettant en œuvre des étapes de purification préalable par extraction et chromatographie avant l’étape terminale de RIA. Des valeurs « normales » des stéroïdes ont ainsi été décrites. En raison de la difficulté de ces étapes de purification et du savoir-faire nécessaire à leur réalisation, des dosages dits « directs » se sont développés, par RIA ou non isotopiques, sur des plates-formes d’immunoanalyse, avec des résultats souffrant d’un manque de spécificité. Depuis une quinzaine d’années, des spectromètres de masse couplés à la chromatographie en phase gazeuse (GC-MS) ont été mis à la disposition des biologistes. Les résultats obtenus sont reconnus comme exacts et ont servi de référence dans les programmes de contrôle de qualité des dosages de stéroïdes pour les laboratoires de biologie médicale. Parallèlement, les spectromètres de masse couplés à la chromatographie en milieu liquide, dite « haute performance » (CLHP), sont apparus. Ils font actuellement l’objet d’un développement rapide ; pratiquement tous les stéroïdes conjugués ou non peuvent être dosés par cette méthode appelée LC-MS/MS (« liquid chromatography tandem mass spectrometry »), qui associe la CLHP à deux spectromètres de masse en tandem. Nous décrirons très succinctement le principe de fonctionnement des appareils de spectrométrie de masse couplés aux chromatographes. Nous ferons le point sur les applications actuelles (en 2011) et probables de ces méthodes aux différents chapitres de l’exploration hormonale en montrant ce que la spectrométrie de masse peut apporter en matière de diagnostic et de traitement par rapport aux méthodes immunologiques.

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2. Principes du fonctionnement des spectromètres de masse [1, 2] 2.1. Spectromètres de masse couplés à la chromatographie en phase gazeuse (GC-MS, et GC-MS/MS) La chromatographie sur cet appareillage nécessite une attention spéciale à la préparation de l’échantillon. Après incubation en présence de stéroïdes deutérés (étalons internes), les stéroïdes du plasma sont extraits par un solvant organique. Puis, suit une étape de purification rapide sur colonne de silice, et enfin une étape de dérivation. Cette dernière est effectuée pour les stéroïdes hydroxylés (testostérone, DHT, DHEA, androstènediol, estradiol et estrone essentiellement), à l’aide de chlorure de pentafluorobenzoyle, et pour les stéroïdes non hydroxylés (androstènedione) par le pentafluorobenzylhydroxylamine [3, 4]. La séparation chromatographique est réalisée dans une colonne capillaire (30 m, I.D. 0,25 mm, film 0,15 μm) (DB-17HT, J&W, réf. 122-1831) selon un gradient de température de 190 °C à 310 °C. En sortie de colonne chromatographique, les stéroïdes dérivés sont introduits dans la source du spectromètre de masse où ils sont ionisés. Il s’agit d’une ionisation chimique en présence du gaz méthane. Des électrons produits par un filament ionisent le gaz méthane en produisant certains ions pouvant réagir avec les molécules de stéroïde arrivant dans la source. Dû à la présence d’halogènes sur la molécule, les ions chargés négativement sont dirigés vers l’analyseur quadripolaire. Dans celui-ci, les ions sont séparés en fonction des rapports masse sur charge (m/z). Parmi les 7 stéroïdes suivants que nous dosons journellement (testostérone, DHT, DHEA, androstènediol, estradiol,

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estrone et estrone-sulfate), la GC-MS conduit à des limites de quantification (LOQ) comprises entre 1,5 pg/ml (estradiol) et 40 pg/ml (testostérone) selon les modes de dérivation et d’ionisation rapportés [4]. La GC-MS/MS comprend en fait un quadripôle Q1 suivi d’une chambre de collision, puis d’un quadripôle Q2 en tandem. Les ions séparés dans le premier quadripôle Q1 sont fragmentés dans la chambre de collision, où il se forme des ions fils qui sont séparés dans le deuxième quadripôle Q2. Par rapport à la GC-MS, la spécificité et la sensibilité sont augmentées en GC-MS/MS. Les limites de quantification peuvent être abaissées par un facteur 3 (par exemple, le LOQ de l’estradiol descend à 0,50 pg/ml).

jusqu’à la chambre de collision dans laquelle a lieu une fragmentation en ions fils, qui sont triés par le deuxième quadripôle Q3 en fonction de leur m/z et véhiculés jusqu’au système de détection [1, 2]. Les qualités et avantages respectifs de la GC-MS et de la LC-MS/MS sont rapportés dans le tableau I.

3. Chapitres de l’hormonologie concernés par le développement de la GC-MS et de la LC-MS/MS Sans être exhaustif, nous ferons le point sur les applications récentes de la spectrométrie de masse aux principaux chapitres de l’exploration hormonale et en particulier aux dosages des stéroïdes. La figure 1 rapporte les métabolismes des stéroïdes synthétisés par les glandes endocrines corticosurrénales, gonades et tissus périphériques, et présents dans le sang, la salive et les différents tissus. Ces stéroïdes sont ensuite inactivés en conjugués hydrosolubles éliminés dans les urines. Ces stéroïdes ont comme précurseur la prégnénolone synthétisée à partir du cholestérol. De nombreuses enzymes (hydroxylases, oxydoréductases, etc.) participent à leur transformation en formes actives pour leurs récepteurs tissulaires.

2.2. Spectromètres couplés à la chromatographie liquide haute pression (LC-MS/MS) Les stéroïdes sont extraits du plasma en présence de stéroïdes deutérés. La séparation est effectuée par CLHP sur une colonne C8 ou C18. L’ionisation se fait à pression atmosphérique, soit par électro-nébulisation (ESI « electrospray ionisation »), soit par ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI). Les ions formés sont séparés dans un premier quadripôle Q1, qui conduit les ions parents

Figure 1 – Métabolisme des principaux stéroïdes présents dans le plasma (caractères verticaux), et dans les urines (caractères inclinés), avec les enzymes concernés [5]. ŚŽůĞƐƚĠƌŽů ^ƚZ

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3.1. Hyperplasie congénitale des surrénales 3.1.1. Hyperplasie congénitale des surrénales due à un déficit en 21-hydroxylase L’hyperplasie congénitale des surrénales la plus fréquente est due à un déficit en 21-hydroxylase. Il en résulte une diminution de la synthèse des stéroïdes situés en aval du déficit, le cortisol (sur la voie des glucocorticoïdes) et l’aldostérone (sur la voie des minéralocorticoïdes), ainsi qu’une accumulation des stéroïdes situés en amont du déficit, tels que la 17-OH-progestérone (17-OHP), dont les valeurs élevées dans le sang permettent d’effectuer le diagnostic du déficit. D’autres stéroïdes s’accumulent dans le sang, issus de la transformation de la 17-OHP, tels que le 21-désoxycortisol (21-DF), autre marqueur spécifique du déficit en 21-hydroxylase, ainsi que des androgènes, comme la delta4-androstènedione, transformée en testostérone, et donc responsable du syndrome d’hyperandrogénie présent à la naissance (forme classique du déficit ou forme virilisante pure dont le phénotype peut être retardé dans l’enfance) ou seulement plus tardivement à la puberté ou même à l’âge adulte (forme non classique) [6]. À la naissance, le diagnostic peut être évoqué par une ambiguïté sexuelle en conséquence de l’hyperproduction de testostérone chez le fœtus féminin. De plus, dans les formes classiques, le déficit en minéralocorticoïdes (figure 1) (aggravé par l’augmentation de la 17-OHP) est susceptible de provoquer un syndrome de perte de sel gravissime avec hyperkaliémie, hyponatrémie, et acidose métabolique. Ces stéroïdes ont été dosés par des techniques RIA à partir des années 1970. De même, les critères hormonaux de diagnostic du déficit en 21-hydroxylase ont été établis d’après les valeurs élevées plasmatiques de la 17-OHP de base [7] ou après injection de synacthène [8]. Tous ces stéroïdes ont également été dosés par LC-MS/ MS et l’avantage essentiel de celle-ci sur les RIA, outre sa spécificité, est qu’elle permet le dosage simultané des différents stéroïdes. Ainsi, cortisol, cortisone, 11-désoxycortisol, 21-DF, corticostérone, 17-OHP et 11-désoxycorticostérone sont dosés simultanément par LC-MS/MS sur 0,5 ml de plasma [9]. Les limites de quantification (LOQ) sont voisines de celles obtenues en RIA, sauf pour le 21 DF, dont les LOQ en RIA sont 10 fois plus basses que celles rapportées dans la méthode LC-MS/MS [9, 10]. Ainsi, le profil stéroïdien donné par la LC-MS/MS conduit à plus de données utiles cliniquement que la détermination d’un seul stéroïde et permet d’établir différents rapports entre les stéroïdes en amont et les stéroïdes en aval du déficit enzymatique. Par exemple, le dosage simultané des 7 stéroïdes par LC-MS/MS, rapporté précédemment [9], est utile au diagnostic d’un déficit en 21-hydroxylase et d’un déficit en 11-hydroxylase grâce aux dosages simultanés du 11-désoxycortisol et de la 11-désoxycorticostérone. De plus, ces dosages multiples par LC-MS/MS mettent à la disposition du biologiste des dosages de stéroïdes pour lesquels il n’existe pas de kits commerciaux, comme pour le dosage du 21-DF, qui est considéré comme un marqueur aussi sensible que la 17-OHP pour la détection du déficit en 21-hydroxylase [6]. En outre, la détermination du 21-DF après le test au synacthène est devenue une stratégie d’identification des porteurs hétérozygotes du déficit en

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21-hydroxylase, anomalie génétique, dont la prévalence dans la population générale est de 1/50 pour la forme classique et de 1/16 pour la forme non classique, voire plus élevée dans certains groupes ethniques [6, 11-13].

3.1.2. Détection néonatale du déficit en 21-hydroxylase Compte tenu de la gravité de l’hyperplasie congénitale des surrénales dans sa forme classique avec perte de sel et déshydratation aiguë dans les semaines qui suivent la naissance, la détection à la naissance du déficit enzymatique en 21-hydroxylase est obligatoire dans certains pays. Cette détection est classiquement réalisée par dosage immunologique de la 17-OHP sur une goutte de sang recueillie sur du papier buvard. Un taux élevé de 17-OHP est en faveur d’un déficit en 21-hydroxylase. Cependant, de nombreux faux positifs, en particulier chez les prématurés, ont été observés [14]. En effet, la 17-OHP chez les prématurés est augmentée par le stress et le retard de la maturation de la 11-hydroxylase. De plus, de nombreux stéroïdes, dont le sulfate de prégnénolone, « croisent » avec l’anticorps anti-17-OHP. La mise en œuvre de la spectrométrie de masse, la GC-MS mais surtout la LC-MS/MS, a résolu ce problème de spécificité. De plus, plusieurs auteurs ont associé au dosage de la 17-OHP, les dosages simultanés du 11-désoxycortisol, de la 17-OH-prégnénolone et de la prégnénolone par LC-MS/MS [15], ou bien plus récemment, les dosages par LC-MS/MS de la delta-4-androstènedione, du cortisol, du 11-désoxycortisol et du 21-désoxycortisol [16]. Les auteurs soulignent que le 21-DF est le stéroïde le plus important pour la détection de l’hyperplasie congénitale des surrénales chez le nouveau-né. D’après ces auteurs, les concentrations du 21-DF dans le déficit en 21-hydroxylase ne chevauchent pas les concentrations de 21-DF trouvées augmentées non spécifiquement chez les prématurés, contrairement à la 17-OHP. Ainsi le dosage couplé et rapide de ces 5 stéroïdes, rendu possible par la mise en œuvre de la LC-MS/MS constitue une amélioration objective du dépistage de l’hyperplasie congénitale des surrénales par déficit en 21-hydroxylase et ceci par rapport au dosage classique isolé de la 17-OHP par RIA ou par TRFIA [16] (figure 2).

3.1.3. Hyperplasie congénitale des surrénales due à un déficit en 11-hydroxylase Le déficit en 11-hydroxylase (figure 1) interrompt la phase finale de la synthèse du cortisol et les stéroïdes situés en amont du déficit s’accumulent. Il en résulte une augmentation des concentrations du 11-désoxycortisol sur la voie des glucocorticoïdes et de la 11-désoxycorticostérone sur la voie des minéralocorticoïdes, son accumulation étant responsable d’une hypertension artérielle. L’accumulation des précurseurs du cortisol, dont la 17-OHP, est à l’origine d’une augmentation des androgènes, dont la delta-4androstènedione et la testostérone responsable d’une hyperandrogénie. Cette anomalie génétique est beaucoup moins fréquente que le déficit en 21-hydroxylase. Les dosages simultanés décrits précédemment par LC-MS/MS : cortisol, cortisone, 11-désoxycortisol, 21-DF, corticostérone, 17-OHP et 11-désoxycorticostérone par LC-MS/MS vont contribuer à distinguer ce déficit en 11-hydroxylase du déficit en 21-hydroxylase [9, 17].

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3.1.4. Hyperplasie congénitale des surrénales par déficit en 3E-ol-déshydrogénase Ce déficit est rare ; d’après la figure 1, tous les stéroïdes de la voie delta 5 en amont du déficit sont augmentés : 17-OH-prégnénolone, prégnénolone, DHEA, DHEA-S, delta-5- androstènediol. Bien qu’à notre connaissance, la LC-MS/MS n’a pas encore été appliquée au diagnostic de ce déficit enzymatique des surrénales, la détermination sensible de la 17-OH-prégnénolone et de la prégnénolone a été réalisée par LC-MS/MS après dérivation sur les fonctions cétone par l’hydroxylamine [18].

Figure 2 – Le dosage du 21-désoxycortisol est plus spécifique que celui de la 17-hydroxyprogestérone pour détecter une hyperplasie congénitale des surrénales par déficit en 21-hydroxylase chez le nouveau-né [16].

3.2. Syndrome de Cushing Le syndrome de Cushing est dû à une exposition prolongée à des niveaux élevés de glucocorticoïdes endogènes ou exogènes. Les symptômes cliniques ne sont pas spécifiques ; ils incluent une obésité tronculaire, une hypertension, des troubles de l’humeur, une fragilité cutanée, une ostéoporose, un diabète et dans certains cas chez la femme une hyperandrogénie. Par conséquent, le dosage du cortisol dans le sang, les urines, la salive, et celui de ses métabolites tétrahydrodérivés (THF), mais également les dosages des androgènes et des minéralocorticoïdes doivent aider au diagnostic positif et étiologique du syndrome de Cushing.

3.2.1. Dosage du cortisol libre urinaire (CLU) Le dosage du CLU constitue l’une des premières lignes diagnostiques. Cependant le dosage par immunoessai, RIA par exemple, lorsqu’il est effectué sans purification préalable, conduit à des résultats très variables, comme il a été montré par plusieurs équipes [19-20]. La dispersion des valeurs du contrôle de qualité du CLU rapportées est très grande : par exemple, 110 à 250 nmol/l, 550 à 1900 nmol/l, 70 à 300 nmol/l (Probioqual, 2010). Les urines contiennent en effet un nombre considérable de métabolites du cortisol qui globalement entraînent des valeurs faussement élevées de CLU [19]. L’introduction d’une extraction de l’urine par le dichlorométhane avant immunoessai contribue à éliminer certaines interférences. Mais ce n’est pas suffisant ; après l’extraction, il faut pratiquer une chromatographie. Cette technique exige un savoir-faire et par conséquent actuellement elle est de moins en moins pratiquée. En revanche, la GC-MS règle ces problèmes d’interférences avec le dosage des métabolites du cortisol, de la cortisone et différents corticoïdes exogènes [21]. La GC-MS possède les qualités de spécificité, d’exactitude et de sensibilité qui en font le « gold standard » pour le dosage du CLU. Cependant, l’étape de dérivation nécessaire rend cette technique maintenant peu adaptée aux dosages de routine d’un LBM. L’application de la LC-MS/MS au dosage du CLU est mieux adaptée au fonctionnement d’un LBM par ses qualités de rapidité, puisque l’étape de dérivation est inutile. Le dosage associé de la cortisone à celui du cortisol présente en outre un intérêt métabolique établi (hypertension endocrinienne) [22]. Le dosage urinaire couplé CLU + cortisone, effectué facilement par LC-MS/MS, constitue une avancée significative dans le domaine du diagnostic, par rapport au dosage isolé du CLU par méthode immunologique [23]. En outre la spécificité du dosage du CLU par LC-MS/MS permet de diagnostiquer des syndromes de Cushing exogènes dus à un traitement par corticoïdes de synthèse.

3.2.2. Dosage du cortisol salivaire Depuis de nombreuses années, le dosage du cortisol salivaire est considéré efficace dans le diagnostic et dans le suivi du syndrome de Cushing [24-26]. Son dosage a été réalisé par RIA et des valeurs de référence ont été proposées. Le cortisol salivaire présente l’avantage sur le cortisol sanguin de ne pas être influencé par les traitements à base d’estrogènes, lesquels, en stimulant la synthèse de CBG (cortico binding protein), augmentent la cortisolémie. Le cortisol salivaire a une signification similaire à celle du cortisol libre plasmatique. Il existe en outre un intérêt important du cortisol salivaire à minuit, car cette valeur est la plus sensible pour établir le diagnostic de Cushing, plus que la valeur à 8 heures du matin, le dosage salivaire évite l’hospitalisation avec la prise de sang à minuit. Cortisol salivaire et cortisol libre circulant sont corrélés. En outre, le REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - DÉCEMBRE 2011 - N°437 //

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prélèvement de salive est facilement réalisé par le patient et il sera facilement répété au cours du suivi du traitement du syndrome de Cushing. Cependant, le dosage du cortisol salivaire peut être faussé analytiquement, car la salive contient une proportion élevée de cortisone (environ 3 à 4 fois plus que de cortisol, métabolite du cortisol par l’action d’une 11E-OH déshydrogénase de type 2 (11E-HSD2) de la parotide, ce qui exige, lors du dosage RIA, un anticorps anti-cortisol spécifique qui ne « croise » pas avec la cortisone [27]. Cette difficulté de dosage a probablement jeté une certaine suspicion sur l’intérêt du dosage salivaire. Cette suspicion est levée par la mise à la disposition des biologistes de dosages du cortisol salivaire par spectrométrie de masse et en particulier par LC-MS/MS [27]. Les valeurs normales salivaires du cortisol et de la cortisone par cette dernière sont respectivement de 2,4 ± 1,9 ng/ml et 10,0 ± 3,4 ng/ml entre 8 et 10 h. En outre, la cortisone salivaire provenant de l’oxydation du cortisol libre du plasma par la 11E-HSD2, la quantité de cortisone formée dans les glandes salivaires est en relation directe avec la concentration de cortisol libre plasmatique fournie à la glande parotide. Le dosage de la cortisone effectué par LC-MS/MS apparaît ainsi comme un nouvel outil d’exploration de l’axe hypothalamus-hypophyso-surrénalien [27].

cours de l’insuffisance rénale avancée, taux élevés de 17-OHP dans les blocs en 21-hydroxylase) par le biais de concentrations anormalement élevées de stéroïdes endogènes croisant avec les anticorps anti-cortisol, vont entraîner des cortisolémies faussement élevées [31]. Le dosage du cortisol plasmatique par spectrométrie de masse lève ces incertitudes, et met le biologiste à l’abri de ces erreurs ; il constitue donc un gage de qualité.

3.2.4. Dosages simultanés de plusieurs stéroïdes aidant au diagnostic étiologique d’un syndrome de Cushing Les dosages simultanés dans le sang de plusieurs précurseurs du cortisol (figure 1), tels que le 11-désoxycortisol, la 17-OHP, de minéralocorticoïdes comme la 11-désoxycorticostérone et d’androgènes comme la testostérone et la delta-4-androstènedione, peuvent participer au diagnostic des tumeurs malignes des corticosurrénales. Les concentrations plasmatiques de ces divers stéroïdes sont fréquemment augmentées dans les corticosurrénalomes. La LC-MS/MS permet la réalisation de ces dosages simultanés sur un volume réduit de plasma (1 ml) [9].

3.3. Hypertensions endocriniennes 3.2.3. Dosages simultanés du cortisol total, cortisol libre du plasma, cortisone, 11-désoxycortisol, et dexaméthasone dans le plasma, les urines et la salive Ces dosages simultanés nécessitent une séparation par CLHP (C18 1,7 μm, 2,1 mm × 50 mm) avant LC-MS/MS, avec un temps de dosage de quelques minutes [28]. L’intérêt du dosage simultané du 11 désoxycortisol et du cortisol réside dans l’appréciation du test à la métopirone et dans la surveillance de la compliance du patient à la prise de métopirone, puisque la cortisolémie doit s’abaisser à des concentrations de moins de 50 ng/ml, 12 heures après la prise de métopirone pour déclencher une réponse hypophysaire et une sécrétion d’ACTH. Il a été également rapporté qu’au cours du test de freinage à la dexaméthasone (DXM ; pratiqué pour orienter le diagnostic étiologique d’un syndrome de Cushing), les concentrations plasmatiques de DXM variaient selon les sujets (et ceci en fonction de la métabolisation variable de la DXM d’un sujet à l’autre) et, par conséquent, pouvaient fausser l’interprétation du test. Il a donc été proposé d’effectuer le dosage de la DXM au cours du test pour améliorer le diagnostic du syndrome de Cushing [29]. Ce dosage associé de la DXM à celui de la cortisolémie, facilement réalisé par LC-MS/MS, constitue donc une avancée dans l’interprétation du test à la DXM au cours de l’exploration d’un syndrome de Cushing [30]. Les qualités de spécificité de dosage du cortisol plasmatique par LC-MS/MS constituent un gage de qualité et de sécurité par rapport au dosage immunologique. Bien que dans la majorité des cas, les méthodes immunologiques de dosage du cortisol plasmatique, dites « directes », par RIA ou sur les plates-formes d’immunoanalyse donnent des résultats acceptables, elles ne mettent pas à l’abri de réactions croisées de l’anticorps anti-cortisol avec des corticoïdes médicaments tels que la prednisolone, la prednisone et la méthylprednisolone. En outre, certaines situations cliniques (accumulation de divers stéroïdes au

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Nous rapportons ici 4 étiologies d’hypertension artérielle (HTA) endocrinienne pour lesquelles les dosages par spectrométrie de masse présentent une avancée par rapport aux dosages immunologiques.

3.3.1. L’hyperaldostéronisme primaire L’hyperaldostéronisme primaire est une forme fréquente (5 %), mais curable d’HTA. Le dosage correct de l’aldostérone plasmatique est indispensable à son diagnostic. Les dosages immunologiques ont une spécificité insuffisante, ce qui explique une dispersion importante des valeurs trouvées dans les enquêtes de contrôle de qualité [32]. Ceci conduit à établir des valeurs de référence différentes pour chaque kit de dosage, d’où la nécessité de développer des méthodes de dosage plus exactes. La SM en donne la possibilité ; la GC/MS est considérée comme la méthode de référence [33], cependant cette méthode exige une dérivation qui augmente le temps de l’analyse. La LC-MS/MS semble plus adaptée aux besoins des LBM moins spécialisés [34-36]. Ces méthodes sont spécifiques et sensibles avec des LOQ comprises entre 10 et 20 pg/ml.

3.3.2. Hypertension due à un déficit en 17-hydroxylase Cette HTA rare est le résultat de l’accumulation de stéroïdes minéralocorticoïdes, (11-désoxycorticostérone, corticostérone) par l’absence congénitale de 17-hydroxylase (figure 1). Le profil stéroïdien trouvé chez les patients atteints consiste en une augmentation très importante de la progestérone, de la prégnénolone et des minéralocorticoïdes. Associées à ces augmentations, des diminutions très importantes des stéroïdes 17-hydroxylés (17-OHP, 11-désoxycortisol et cortisol) sont observées, ainsi que celles des androgènes et des estrogènes. Le profil stéroïdien plasmatique et urinaire obtenu par LC-MS/MS ou GC-MS [37] sera donc caractéristique.

SPECTROMÉTRIE DE MASSE

3.3.3. Hypertension par déficit en 11E-hydroxystéroïde-déshydrogénase (11E-OHSD) Deux enzymes assurent un équilibre entre le cortisol et la cortisone : les 11E-OHSDs de type 1 et type 2. La 11E-OHSD2 est présente au niveau du rein, des parotides et du côlon. Elle catalyse l’oxydation du cortisol en cortisone et donc l’inactive. Inversement, la 11E-OHSD1, de plus large diffusion, réduit la cortisone inactive en cortisol actif. Au niveau du rein, l’aldostérone, en se fixant sur les récepteurs minéralocorticoïdes, participe aux échanges ioniques et réabsorbe le Na+. Le cortisol présente également une affinité pour les récepteurs minéralocorticoïdes ; ainsi, présent en concentration 1 000 fois plus élevée que l’aldostérone, il est capable de jouer le même rôle que l’aldostérone sur les récepteurs minéralocorticoïdes. Cependant, la 11E-OHSD2, en fonctionnement normal, inactive le cortisol en cortisone et par conséquent, protège l’action spécifique de l’aldostérone. Chez certains sujets, la 11E-OHSD2 est inactive. Il en résulte une persistance anormale de l’action du cortisol sur les récepteurs minéralocorticoïdes rénaux entraînant une réabsorption anormalement élevée du Na+. Cette anomalie génétique de la 11E-OHSD2 est responsable d’un syndrome d’excès apparent en minéralocorticoïdes (AME) avec une HTA maligne [38]. La prise de réglisse en quantités excessives provoque une HTA due à l’action inhibitrice de la glycyrrhizine sur la 11E-OHSD2. Un déficit en 11E-OHSD2 a également été rendu responsable d’HTA essentielle [39]. Le diagnostic de l’AME fait appel au dosage couplé du cortisol et de la cortisone dans le sang et dans les urines [40] et au dosage des métabolites urinaires hydrogénés du cortisol et de la cortisone : THF et THE [41]. Les dosages du cortisol et de la cortisone réalisés antérieurement par RIA dans le sang et les urines, ainsi que les dérivés THF et THE, dosés dans les urines par simple CPG, bénéficient dorénavant de la spectrométrie de masse [30, 42-43]. Dans l’AME, on observe une diminution de la cortisone dans le sang et un rapport cortisol/cortisone augmenté. De même dans les urines, où le rapport des métabolites du cortisol et de la cortisone (THF/THE) est augmenté (normales 1 à  2 ; AME 10 à 50) [41].

Tableau II – Testostérone chez la femme: comparaison GC-MS/analyseurs (moyennes et coefficients de corrélation avec GC-MS sur 55 sérums) [47]. Moyennes et coefficients de corrélation avec GC-MS sur 55 sérums. GC-MS

0,63 ng/ml

Architect Abbott

1 ng/ml et 0,80

ACS180 Siemens

1,23 ng/ml et 0,84

Immuno 1 Siemens

0,80 ng/ml et 0,68

Vidas bioMérieux

0,63 ng/ml et 0,75

Immulite 2000

1,58 ng/ml et 0,57

Vitros ECI Ortho Diagnostics

0,63 ng/ml et 0,76

Autodelfia Perkin Elmer

1,46 ng/ml et 0,78

Elecsys 2010 Roche Diagnostics

0,46 ng/ml et 0,72

RIA Immunotech Beckman

0,78 ng/ml et 0,78

RIA count-a-count Siemens

0,80 ng/ml et 0,80

Tableau III – Étendues des normales de la testostérone circulante selon l’analyseur ng/ml (nmol/l) [47]. Architect Abbott

0,15-0,70 (0,52-2,43)

ACS180 Siemens

0,14-0,80 (0,50-2,6)

Immuno 1 Siemens

0,08-0,83 (0,28-2,88)

Vidas bioMérieux

0,10-0,90 (0,35-3,12)-

Immulite 2000

0,49-1,20 (1,70-4,16)

Vitros ECI Ortho Diagnostics

0,06-0,83 (0,19-2,67)

Autodelfia Perkin Elmer

ND-1,05 (ND-3,7)

Elecsys 2010 Roche Diagnostics

0,06-0,84 (0,22-2,9)

RIA Immunotech Beckman

0,07-0,65 (0,24-2,25)

RIA count-a-count Siemens

0,04-0,79 (0,14-2,77)

RIA ou TR-FIA, extraction + chromatographie sur Celite® : 0,10-0,60 (0,34-2,08)

3.3.4. Hypertension due à un phéochromocytome Les dérivés méthoxylés des catécholamines libres du plasma semblent les meilleurs marqueurs pour exclure ou confirmer un phéochromocytome et leurs dosages devraient être le premier test à effectuer pour le diagnostic de la tumeur [44]. Une méthode de dosage par LC-MS/MS après extraction en phase solide (SPE) « on line » a été rapportée, méthode à la fois très sensible et plus facile d’utilisation que celle par CLHP avec détection électrochimique [45-46].

3.4. Hyperandrogénie chez la femme L’hyperandrogénie est un syndrome aux causes multiples, dont le diagnostic d’abord clinique est conforté par des dosages d’androgènes dans le sang et les urines. C’est l’expression de maladies le plus souvent peu sévères (syndrome des ovaires polykystiques (1re cause), hirsutisme idiopathique), mais qui peuvent avoir un retentissement majeur sur la fertilité. Il est toujours nécessaire d’éliminer une étiologie tumorale. Le rôle du dosage des androgènes est capital ; quel est l’intérêt de la spectrométrie de masse dans ce domaine ?

3.4.1. La testostérone chez la femme Le dosage de la testostérone réalisé sur des plates-formes analytiques automatisées se fait par des méthodes immunologiques directes (sans étape d’extraction ou de chromatographie préalable). Dans ce cas, le résultat repose uniquement sur la spécificité des anticorps mis en jeu. Globalement, selon de nombreuses études, le dosage direct conduit à des erreurs par excès ; nous citerons une étude qui a comparé les résultats de la testostéronémie chez la femme, réalisés par plusieurs réactifs immunologiques et ceux obtenus par GC-MS [47], tous les résultats par immunologie ont été trouvés supérieurs à ceux obtenus par GC-MS (tableaux II et III). D’ailleurs, les valeurs normales limites supérieures proposées dans les kits de dosage de la testostérone sont bien supérieures à celles communément admises en pratiquant une méthode immunologique incluant une étape de chromatographie préalable au dosage immunologique proprement dit. En effet les concentrations limites supérieures normales de la testostéronémie chez la femme ne dépassent pas 0,60 ng/ml [48]. REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - DÉCEMBRE 2011 - N°437 //

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Les biologistes doivent disposer de méthodes de dosage aussi exactes que possible. Des valeurs inexactes trop élevées de testostérone peuvent évoquer une tumeur surrénalienne ou ovarienne et déclencher à tort des investigations inutiles. Une étude comparative récente du dosage de la testostérone chez la femme par méthode immunologique automatisée, par RIA après chromatographie sur des petites colonnes de Celite® faciles d’utilisation [49] et par GC-MS [4] a montré que la concordance avec la méthode GC-MS était très bonne avec la méthode RIA, modérée avec la méthode Dxl 800®, modérée par la méthode Immulite® et bonne pour la méthode Cobas [50]. La plupart des écarts sont de fausses hypertestostéronémies ; l’utilisation de méthodes non recommandées peut conduire à une erreur de classification des hyperandrogénies qui se traduit par une perte de chance pour une partie des patientes. La LC-MS/MS, appliquée récemment au dosage de la testostéronémie chez la femme normale au cours du cycle menstruel, a conduit à des concentrations moyennes de 0,15 ng/ml (phase folliculaire précoce), 0,22 ng/ml (pic d’ovulation) et 0,18 ng/ml pendant la phase lutéale, et 0,11 ng/ml chez la femme ménopausée [51].

3.4.2. Androgènes surrénaliens et hyperandrogénies L’exploration des hyperandrogénies nécessite les dosages des androgènes surrénaliens, delta-4-androstènedione et DHEA. Ces dosages effectués simultanément à ceux de la testostérone sont fort utiles au diagnostic des hyperandrogénies [48]. Puisqu’il est possible de réaliser simultanément les dosages de plusieurs stéroïdes par LC-MS/MS, il serait judicieux d’effectuer par cette technologie les dosages simultanés des stéroïdes suivants : delta-4-androstènedione, DHEA, 17-OH-prégnénolone, 17-OHP, testostérone, 21-DF, 11-désoxycortisol et 11E-hydroxyandrostènedione, qui permettraient de confirmer le diagnostic des hyperandrogénies et d’orienter le diagnostic étiologique [48]. En effet, ces dosages simultanés feront aisément le diagnostic différentiel entre une hyperandrogénie due à un syndrome des ovaires polykystiques et celle due à une forme de révélation tardive de déficit en 21-hydroxylase (forme non classique) ; ces deux étiologies d’hyperandrogénie ont des traits cliniques souvent similaires. Les dosages multiples et simultanés de 10 stéroïdes par LC-MS/MS (corticostérone, déoxycorticostérone, progestérone, 17-OHP, 11-désoxycortisol, 21-DF, delta-4-androstènedione, testostérone, dihydrotestostérone et cortisol), voire de 12 stéroïdes, vont ainsi contribuer au diagnostic étiologique des hyperandrogénies [35, 52]. Des valeurs de références de ces différents stéroïdes ont été rapportées récemment chez l’adulte et l’enfant [53]. La GC-MS permet également de doser ces androgènes surrénaliens avec une sensibilité équivalente [3].

3.5. Hypogonadisme chez l’homme Chez l’homme normal, la testostérone plasmatique dosée par une méthode directe (sans chromatographie) ne diffère pratiquement pas des résultats de dosages par spectrométrie de masse. En revanche, il a été montré que pour des concentrations < 2 ng/ml, les dosages directs par RIA étaient très inexacts [54]. Les dosages de testostérone chez l’homme effectués sur des plates-formes d’immunoanalyse manquent particulièrement d’exactitude dans

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les valeurs basses [55]. L’hypogonadisme chez l’homme, qui se définit tout d’abord cliniquement par une asthénie, une diminution de la force musculaire, une diminution de la libido, une impuissance, est confirmé par la biologie, c’est-à-dire par un abaissement de la testostérone totale et surtout de la testostérone bio-disponible [56]. La spectrométrie de masse permettant d’atteindre des limites de détection < 0,05 ng/ml présente une sensibilité suffisante pour étudier la testostérone chez l’homme hypogonade et chez l’homme au cours des traitements androgénosuppresseurs dans le cancer de la prostate [57], ce qui n’est pas le cas avec les immunodosages, puisque les concentrations cibles visées sont de 0,50 ng/ml après traitement par les analogues du LHRH et de 0,14 ng/ml après traitement par orchidectomie. Des sensibilités même plus importantes obtenues par LC-MS/MS (LOQ 10 à 20 pg/ml) ont été publiées [18]. Par rapport aux immunodosages, les dosages par LC-MS/MS de la testostéronémie (et d’autres stéroïdes) dans une population « normale » doivent conduire à des déterminations de valeurs de références. Sur une population de 503 hommes normaux cliniquement et avec des bilans biologiques normaux, les concentrations de la testostérone totale et de la testostérone bio-disponible ont été déterminées par GC-MS [4] avec un LOQ pour la testostérone totale de 40 pg/ml. Dans cette étude, le 5e percentile de la testostérone totale dans la population d’âges compris entre 20 et 74 ans était de 2,7 ng/ml (9,33 nmol/l) avec une médiane à 4,7 ng/ml (16,4 nmol/l) et la diminution de la testostérone totale en fonction de l’âge était à la limite de la significativité. En revanche, il a été observé une diminution significative de la testostérone bio-disponible avec l’âge : le 5e percentile de la testostérone bio-disponible était de 1,13 ng/ml (3,95 nmol/l) entre 20 et 40 ans (n = 142 sujets) et de 0,65 ng/ml (2,25 nmol/l) entre 60 et 74 ans (n = 126). Un avantage de la spectrométrie de masse dans le cadre de l’hypogonadisme par rapport aux immunodosages est qu’elle a permis de doser simultanément plusieurs stéroïdes d’intérêt, la testostérone, la DHT et l’androstènediol [4] montrant ainsi que l’androstènediol (stéroïde de concentration élevée dans le plasma, mais difficile à doser par RIA), est en compétition avec la liaison de la testostérone à sa molécule porteuse, la SHBG. Des taux élevés d’androstènediol contribuent à augmenter la testostérone bio-disponible et inversement. La LC-MS/MS est suffisamment sensible et exacte pour doser la testostérone dans la salive au cours de l’exploration de l’hypogonadisme chez l’homme [58], le dosage couplé testostérone + DHT a également été rapporté [59]. Le dosage de la DHT est en effet fréquemment demandé dans les études pharmacocinétiques au cours de traitement par la testostérone, afin de s’assurer que la conversion de la testostérone en DHT n’est pas excessive et que la somme testostérone + DHT est maintenue dans des limites physiologiques chez l’homme. La DHT est l’androgène principal dans le tissu prostatique et peut stimuler la prostate plus que la testostérone. La DHT est utilisée dans le diagnostic des déficits en 5D-réductase et dans la surveillance du traitement de l’hyperplasie bénigne de la prostate par les inhibiteurs de la 5D-réductase. L’apport de la LC-MS/MS et de la GC-MS dans le dosage de la DHT est très significatif. Ce dosage est en effet sensible

SPECTROMÉTRIE DE MASSE

(LOQ 10 pg/ml) et spécifique ; il devrait remplacer celui réalisé par RIA. En effet, même après purification du sérum par extraction suivie d’une chromatographie sur Celite®, le dosage RIA de la DHT conduit à des résultats 10 à 20 % supérieurs à ceux obtenus par GC-MS (données personnelles). Une méthode extrêmement sensible avec un LOQ de 1 pg/ml pour la testostérone et la DHT permettant les dosages dans les tissus, en particulier dans la prostate, a été rapportée. Cependant, elle demande une dérivation par l’acide picolinique.

3.6. Les estrogènes chez la femme adulte (en dehors de la ménopause) et chez l’homme Chez la femme adulte, les estrogènes sont responsables du maintien d’une féminisation et d’une fonction de reproduction normale. Dans les deux sexes, une carence estrogénique est associée à une ostéoporose, soit un risque accru de fractures, des maladies cardiovasculaires et neurologiques, ainsi que la dégradation des fonctions cognitives. Aussi, la détermination exacte des concentrations des estrogènes est indispensable pour apprécier au mieux ces conditions pathologiques. Dans ces cas, les dosages par GC-MS ou LC-MS/MS, après dérivation par le chlorure de dansyl, méthodes sensibles et exactes, sont à préférer aux techniques RIA. Les méthodes de dosages par spectrométrie de masse des hormones sexuelles sont également à préférer aux méthodes immunologiques dans la réalisation des études épidémiologiques des cancers hormono-dépendants [60].

3.7. Ménopause et traitement par les anti-aromatases À la ménopause, l’arrêt du fonctionnement des ovaires est associé à une diminution drastique de l’estradiol (E2) plasmatique. Ces faibles concentrations en E2 sont alors le produit d’une synthèse périphérique (surtout dans le tissu adipeux) à partir de précurseurs androgéniques, comme l’androstènedione, dont la sécrétion par les surrénales persiste après la ménopause. L’androstènedione est donc aromatisée en estrone par une aromatase, et l’estrone formée est réduite en estradiol par une 17E-hydroxystéroïdedéshydrogénase. Estrone et estradiol sont en partie sulfatées par des sulfotransférases en sulfate d’estrone très majoritaire par rapport au sulfate d’estradiol. Ces sulfates sont inversement hydrolysés par des sulfatases dans les formes non conjuguées correspondantes. Ces estrogènes se dosent classiquement par des méthodes immunologiques ; il existe en effet de nombreux réactifs du commerce pour doser l’estradiol dans le plasma. Cependant la majorité de ces méthodes n’apportent pas une sécurité absolue de spécificité, car il s’agit de méthodes de dosage « directes » [61]. Les dosages de l’estrone sont peu commerciaux ; il s’agit de méthodes RIA qui demandent des volumes non négligeables de prélèvement chez l’homme (1,5 à 2 ml de plasma). Le dosage du sulfate d’estrone est également effectué par RIA ; cependant le kit de dosage commercial conduit à des résultats erronés et considérablement plus élevés que ceux obtenus par GC-MS ou LC-MS/MS [62]. Là encore, la spectrométrie

de masse va permettre au biologiste d’avoir accès à des dosages spécialisés de qualité apportant la spécificité nécessaire à ces dosages. La GC-MS est plus sensible pour le dosage de l’estradiol que la LC-MS/MS. Les limites de quantification sont de 1,5 pg/ml pour la GC-MS et 0,5 pg/ml pour la GC-MS/MS. Cependant, des auteurs ont récemment rapporté une méthode de LC-MS/MS donnant une limite de détection de 2 pg/ml pour E2 et de 1 pg/ml pour E1 sans dérivation [63]. Cette limite de détection serait même plus basse en dérivant l’estradiol par le chlorure de dansyl. La conséquence de ces dosages par spectrométrie de masse est un abaissement des valeurs normales d’estradiol et d’estrone chez les femmes ménopausées. Les concentrations moyennes d’estradiol du plasma dans les premières années de la ménopause sont de 4,9 pg/ml, puis elles diminuent après 5 ans de ménopause à 1,3 pg/ml. Des concentrations moyennes d’estrone ont été trouvées à 39,8 pg/ml et 35 pg/ml [51]. Forme de stockage des estrogènes, le sulfate d’estrone, quantitativement l’estrogène circulant le plus important du plasma, peut être dosé par LC-MS/MS [3] ou par GC-MS/MS après solvolyse [62]. Là encore, la spectrométrie de masse permet d’avoir accès à une meilleure spécificité de dosage et d’élargir la diversité des estrogènes dosables dans les milieux biologiques, ce que les dosages immunologiques ne peuvent pas faire aisément. Nous noterons que la grande sensibilité de la GC-MS/MS pour le dosage d’estradiol permet d’atteindre des concentrations limites de 0,5 pg/ ml de plasma que l’on observe au cours du traitement des cancers du sein par les anti-aromatases [64].

3.8. Pédiatrie Le dosage de stéroïdes par spectrométrie de masse apporte la spécificité et la sensibilité particulièrement nécessaires en pédiatrie [65]. En effet, elle permet de corriger les erreurs sur le dosage de la 17-OHP effectué par immunologie sur une goutte de sang total. De même, le syndrome de Cushing, bien que rare chez l’enfant, va bénéficier de dosage exact du CLU par LC-MS/MS, car les dosages immunologiques sont souvent surestimés par suite de l’interférence de nombreux métabolites. Il est important d’avoir des dosages très sensibles et fiables, en particulier pour les dosages de testostérone et d’estradiol [66-68], ce que n’apporte pas la plupart des kits d’immunoanalyse disponibles, qui sont essentiellement validés pour des dosages chez l’adulte. Ainsi, pour différencier un état pré-pubère d’une sécrétion pubère chez le garçon, il est nécessaire d’avoir un dosage fiable de testostérone ; de même, pour le diagnostic d’un hypogonadisme dans l’adolescence avec des taux subnormaux de testostérone [66]. Les concentrations d’estradiol sont très basses pendant l’enfance. Il est donc important d’avoir là aussi des dosages très sensibles et fiables, en particulier pour différencier un état pré-pubère d’un début physiologique de sécrétion pubère chez la jeune fille ou pour faciliter le diagnostic de plusieurs états pathologiques pédiatriques, dont la puberté précoce centrale, et également le contrôle de son traitement par les analogues du GnRH [66]. Les dosages de stéroïdes effectués chez l’enfant et le nouveau-né doivent bénéficier des qualités de sensibilité obtenues par la spectrométrie de masse. Cependant, il est nécessaire de disposer de valeurs REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - DÉCEMBRE 2011 - N°437 //

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de références soigneusement établies tenant compte de l’âge, du sexe, du stade de Tanner, et avec des prélèvements effectués tôt dans la matinée pour tenir compte des variations nycthémérales [15, 29]. Par leurs qualités de spécificité et de sensibilité, la GC-MS et la LC-MS/MS permettent d’établir des profils stéroïdiens sur des petits volumes de sang, ce qui est particulièrement intéressant dans le diagnostic des déficits enzymatiques. Les qualités de sensibilité de la spectrométrie de masse donnent accès aux dosages de stéroïdes salivaires dont les concentrations sont beaucoup plus basses que dans le plasma. Malgré la faisabilité de certains de ces dosages par RIA [24, 68], plusieurs auteurs ont rapporté des dosages par LC-MS/MS des stéroïdes suivants : testostérone, DHEA, 17-OHP, aldostérone vitamine D3 [69-72]. Ces dosages salivaires sont applicables en pédiatrie. Cependant, pour rendre service en clinique, les valeurs de références de ces stéroïdes salivaires devront être soigneusement établies.

3.9. Les vitamines D Il existe deux formes de vitamine D. Une forme d’origine végétale, activée par l’irradiation UV de l’ergostérol, c’est la vitamine D2 ou ergocalciférol, et une forme d’origine endogène ou alimentaire animale, qui dérive de l’irradiation UV dans le derme du 7-déshydrocholestérol, isomérisé en cholécalciférol ou vitamine D3. Ces vitamines D sont hydroxylées en 25-hydroxy-vitamine D, 25-OHD2 et 25-OHD3. Ces 25-OHD2 et 25-OHD3 sont hydroxylés au niveau du rein en 1,25-dihydroxyvitamines D2 et D3 qui sont les vitamines actives. On considère que ces vitamines doivent être présentes dans le plasma à une concentration minimale de 50 à 75 nmol/L [73] pour jouer pleinement leurs différents rôles physiologiques, en particulier sur le métabolisme de l’os. Le dosage de la vitamine D est réalisé essentiellement par des méthodes immunologiques, RIA et méthodes immunologiques dites froides. Depuis le développement de la LC-MS/MS, de très nombreuses publications rapportent le dosage des vitamines D par cette technique ; comme pour les autres stéroïdes, il est important de savoir quel est l’apport de cette nouvelle technologie sur ces dosages. L’un des buts des dosages de vitamine D est l’évaluation des concentrations de la vitamine D dans le plasma. Des concentrations < 25 nmol/L indiquent un déficit sévère. La sensibilité fonctionnelle pour les immunodosages ou la limite de quantification dans les méthodes CLHP et LC-MS/MS devront être < 25 nmol/L. Les sensibilités fonctionnelles des immunodosages automatisés sont inférieures à 17,5 nmol/L. Les limites de quantification pour la LC-MS/MS sont inférieures à 5 nmol/L et < 8 nmol/L pour respectivement la 25-OHD3 et la 25-OHD2 avec un volume d’échantillon de 200 μL. La RIA et la LC-MS/MS apparaissent les méthodes les plus sensibles, mais toutes les méthodes ont une sensibilité suffisante pour détecter un déficit sévère en vitamine D. Concernant la spécificité, la LC-MS/MS présente l’intérêt de doser spécifiquement la 25-OHD2 et la 25-OHD3 et des métabolites de ces stéroïdes. En revanche, certains immunoessais ont, soit la même affinité pour la D2 et la D3, soit ne reconnaissent que la 25-OHD3 et pas du tout la 25-OHD2. Comme la demande du clinicien est de connaître le niveau de vitamine D, D2 ou D3, pour envisager une

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éventuelle supplémentation, il semble nécessaire de choisir une technique de dosage de la vitamine D qui mesure les deux formes 25-OHD2 et 25-OHD3 conjointement. En pratique, la spectrométrie de masse deviendra probablement la méthode de référence de dosage des 25-OHD2 et 25-OHD3. Des différences importantes de résultats de dosages de la vitamine D par immunologie ont été observées. Il faut noter que plusieurs métabolites de la vitamine D3, 24,25-OHD2 croisent à 100 % avec les anticorps anti-25-OHD2 et 25-OHD3. Cependant, ces croisements n’auraient pas de conséquences pour le diagnostic clinique. Il faut noter que la LC-MS/MS a une potentialité très grande dans la mesure où elle peut doser les métabolites de la vitamine D, ce qui peut être intéressant en recherche. Chez l’enfant, la présence d’un épimère dosable de la vitamine D, la 3-epi-25-hydroxyvitamin D3, a été mise en évidence par GCMS. En outre, la grande sensibilité et spécificité de cette technique laisse espérer que même le dosage de la 1,25-OHD3, métabolite présent à des concentrations de l’ordre de quelques pg/ml dans le plasma, sera à sa portée. Des résultats de dosage par LC-MS/MS de la 1,25-OHD3 après dérivation par le 4-phényl-1,2,4-triazoline-3,5-dione (PTAD) et augmentation de l’ionisation par l’addition de méthylamine à la phase mobile ont été rapportés [72].

4. Validation des dosages par spectrométrie de masse Les méthodes de dosages par GC-MS ou LC-MS/MS sont considérées comme des « gold standard ». Cette attribution est-elle justifiée ? Une étude visant à comparer les résultats par spectrométrie de masse de la testostérone par LC-MS/MS dans 8 laboratoires a abouti à la constatation d’un biais moyen de -11,4 % à +19,2 % pour des testostérones supérieures à 1 ng/ml. Cependant, toutes les méthodes de dosages par spectrométrie de masse n’étaient pas toutes identiques [74]. Le développement d’une nouvelle technique impose une validation analytique stricte portant sur la fidélité (précisions intra- et inter-essais), la justesse (ou l’exactitude), la spécificité, la sensibilité et la linéarité. Nous insisterons sur la sensibilité et l’exactitude de la méthode développée.

4.1. Comment améliorer la sensibilité et l’exactitude de la méthode développée ? 4.1.1. Problèmes de sensibilité Beaucoup d’analytes circulent dans le plasma à des concentrations micromolaires, voire sub-micromolaires ; c’est le cas des estrogènes chez l’enfant pré-pubère, chez l’homme et chez la femme ménopausée, des androgènes chez la femme, de la 1,25-OHvitD, des catécholamines, des cytokines, des hormones peptidiques. Malgré l’amélioration en quelques années de la sensibilité des meilleurs appareillages de spectrométrie de masse, de 10 à 20 fois sur des solutions pures de l’analyte, l’amélioration de la sensibilité des dosages dans le plasma n’a été que de 2 à 6 fois. Ceci est dû à l’effet matrice qui augmente le bruit de fond, ou à des interférences qui diminuent le pic de l’analyte, en particulier par diminution de son ionisation.

SPECTROMÉTRIE DE MASSE

4.1.1.1. Phénomène d’augmentation/suppression d’ion Ce phénomène survient plus souvent dans l’ionisation par électro-nébulisation (ESI), que lors de l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) [75]. Cette « augmentation/ suppression » est plus fréquente si l’échantillon contient des concentrations élevées de composés basiques (en mode positif) ou de composés acides (en mode négatif), qui sont élués dans la même fenêtre de temps que l’analyte, ou de composés qui ont des masses moléculaires voisines. Dans ces conditions, une perte importante du signal survient. Ainsi, toute étape de développement de méthodes de dosage par LC-MS/MS doit impérativement impliquer une étape d’évaluation de l’augmentation/suppression d’ion. Pour diminuer ce phénomène, il est important de rendre le prélèvement aussi « propre » que possible par exemple une extraction en phase solide (SPE). Il est également important d’optimiser la chromatographie pour éliminer les pics interférents et d’augmenter ainsi la sensibilité [76-77]. 4.1.1.2. Optimisation d’ionisation spécifique La dérivation de l’analyte avant dosage proprement dit est un moyen efficace pour améliorer spécifiquement l’ionisation de l’analyte et par conséquent la sensibilité du dosage. Elle est obligatoire en GC-MS, mais souvent non indispensable en LC-MS/MS, excepté pour les hormones dont les concentrations sont extrêmement basses, comme les estrogènes au cours de la ménopause, ou la 1,25-OHvitD. Ainsi, la dérivation par le chlorure de dansyl augmente la sensibilité du dosage des estradiol et estrone de 6 à 10 fois [78]. De même, la dérivation par les triazoline-diones augmente l’ionisation des dérivés de la vitamine D et est appliquée au dosage de la 1,25-OHvitD. L’extraction initiale de l’analyte par immuno-affinité est un moyen efficace pour supprimer l’ion suppression, diminuer les interférences spécifiques et non-spécifiques et augmenter, de ce fait, le rapport signal/ bruit de fond, donc la sensibilité du dosage. Ce procédé est utilisé par exemple pour les dosages de la PTH et de la 1,25-OHvitD, analytes dont les concentrations dans les milieux biologiques sont très faibles. La GC-MS/MS, par une volatilisation complète de l’analyte dans la source portée à haute température, permet une augmentation très importante de la sensibilité. Cette dernière se quantifie par la limite de détection (LOD avec un rapport S/N > 5) et par la limite de quantification (LOQ avec un rapport S/N > 10).

4.1.2. Problèmes de spécificité Les isomères des 21-désoxycortisol, 11-désoxycortisol et corticostérone, d’une part, et des 11-désoxycorticostérone et 17-hydroxyprosgestérone, d’autre part, présentent une fragmentation identique. Les mêmes ions parents à la sortie du premier quadripôle et les mêmes ions fils sont produits à la sortie du troisième quadripôle (figure 3). Le dosage de ces isomères exige par conséquent qu’ils soient correctement séparés par chromatographie avant d’être introduits dans le spectromètre de masse [9]. En outre, lors du développement du dosage des 7 stéroïdes (cortisol, cortisone, 11-désoxycortisol, 21-désoxycortisol, corticostérone, 17-hydroxyprogestérone et 11-désoxycorticostérone), la spécificité sera contrôlée par injection des différents stéroïdes suivants susceptibles d’interférer : prednisolone, 6D-méthyl-prednisolone, prednisone, dexaméthasone,

Figure 3 – Spectres de fragmentation de la 17-hydroxyprogestérone et de la 11-désoxycorticostérone.

Les spectres sont identiques (97 et 109). Les temps de rétention sont heureusement différents (17-hydroxyprogestérone : 13.5 min ; 11-désoxycortisostérone : 12.9 min) [9].

aldostérone, cortisol-21-glucuronide, cortisol-21-sulfate, 5D-dihydrocortisol, 20D-dihydrocortisol, 6E-hydroxycortisol, 5D-tétrahydrocortisol, 5D-tétrahydro-11-désoxycortisol, bêtaméthasone, triamcinolone, dihydrotestostérone, progestérone, fludrocortisone, 5E-tétrahydrocortisone, prégnénolone et androstènediol [9]. De même, les stéroïdes conjugués exposés à des températures élevées dans la source d’ionisation peuvent s’hydrolyser en stéroïdes libres et augmenter artificiellement les concentrations des stéroïdes non conjugués mesurées, tout du moins lorsque les stéroïdes conjugués et non conjugués n’ont pas été séparés dans l’étape chromatographique. La détermination des valeurs de référence des stéroïdes obtenues par GC-MS ou LC-MS/MS doit faire partie de la validation lors du développement d’une nouvelle méthode, de même que leur confrontation aux valeurs de références publiées avec les meilleures méthodes de dosages immunologiques, celles qui sont rapportées dans les précis d’endocrinologie. Il faut également s’assurer que la sensibilité est suffisante pour déterminer les valeurs basses, en confrontant les LOQ avec les limites de référence les plus basses susceptibles d’être trouvées [79]. Un certain nombre de valeurs de référence en pédiatrie et chez l’adulte obtenues par LC-MS/MS commencent à être rapportées [53, 80]. REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - DÉCEMBRE 2011 - N°437 //

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5. Spectrométrie de masse : recherches et futurs 5.1. Applications de la spectrométrie de masse en recherche Au cours des 30 dernières années, la plupart des avancées dans le domaine du métabolisme des stéroïdes ont été réalisées grâce à la GC-MS appliquée aux dosages des métabolites des stéroïdes dans les urines [5]. Maintenant, la LC-MS/MS, plus pratique d’utilisation, et la GC-MS, vont contribuer à décrypter le métabolisme des stéroïdes dans des milieux inhabituels, tels que le liquide folliculaire au cours des inductions d’ovulation et au cours du syndrome des ovaires polykystiques, mais également dans les tissus des cancers hormono dépendants (métabolome).

5.2. Le futur possible des dosages par LC-MS/MS en endocrinologie Après avoir donné des résultats incontestables pour le dosage des molécules de faible poids moléculaire et des stéroïdes en particulier, on peut prévoir que dans les années futures la LC-MS/MS apportera des avancées intéressantes en endocrinologie dans le domaine des peptides/protéines. Nous rapportons quelques travaux récents dans ce domaine [75].

5.2.1. Dosage de la PTH Le dosage de la PTH 1-84 se fait par immunocapture suivie d’une digestion trypsique et dosage par LC-MS/ MS du fragment peptidique « 1-13 »  libéré par l’hydrolyse enzymatique. Cette méthode donne des résultats précis et exacts en comparaison avec les dosages immunologiques.

5.2.2. Dosage de la thyroglobuline La thyroglobuline, marqueur du cancer de la thyroïde, est dosée couramment par immunologie. Cependant, 20 % de ces patients présentent des auto-anticorps anti-thyroglobuline qui peuvent interférer avec le dosage de ce marqueur, causant des faux positifs. L’enrichissement du sérum par immuno-affinité de peptides trypsiques de la thyroglobuline captés par des anticorps polyclonaux anti-peptides est utilisé de concert avec la LC-MS/ MS. Les fragments trypsiques de la thyroglobuline sont captés par des anticorps spécifiques anti-fragment. Cette méthodologie permet d’atteindre une sensibilité de 0,1 ng/ml.

5.2.3. Dosage des angiotensines I et II par LC-MS/MS Le dosage de l’angiotensine II par LC-MS/MS peut remplacer avantageusement la mesure de l’activité rénine plasmatique avec dosage de l’angiotensine I. Ce dosage de l’angiotensine II par LC-MS/MS se fait après une extraction en phase solide (SPE). Le LOQ est de 20 pg/ml.

6. Conclusions On assiste à une véritable explosion du nombre de publications décrivant des dosages par LC-MS/MS de petites molécules d’intérêt en hormonologie, en particulier de stéroïdes.

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La plupart de ces dosages de stéroïdes sont effectués, soit dans des laboratoires de radioimmunologie très spécialisés par des techniques « maisons », soit sur des plates-formes d’immunoanalyse à haut débit. Maintenant, la spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide à haute performance donnant accès à une vaste gamme de dosages de molécules d’intérêt en hormonologie va élargir les domaines d’exercice des biologistes. En outre, les améliorations technologiques vont rendre les techniques de plus en plus performantes (extraction « on line », chromatographie multiplex, augmentation du rendement de l’ionisation) en terme de qualité et de débit. En bref, qu’apportent la GC-MS et surtout la LC-MS/MS en exploration hormonale ? Ces techniques mettent à la disposition des biologistes des dosages peu accessibles jusqu’à maintenant par immunologie, car il n’existe pas toujours de kits commerciaux. Il s’agit par exemple de dosages des stéroïdes suivants : 11-désoxycorticostérone, 11 désoxycortisol, 21 désoxycortisol, androstènediol, sulfate d’estrone, prégnénolone, 17-OH prégnénolone, effectués jusqu’à maintenant dans des laboratoires spécialisés qui disposaient des anticorps correspondants. Ces techniques permettent d’avoir accès à des dosages dans des milieux inhabituels, comme la salive, dans laquelle les concentrations des stéroïdes sont beaucoup plus basses que dans le plasma. Ces techniques donnent une meilleure exactitude des dosages en s’affranchissant des réactions croisées des anticorps anti-stéroïdes, dont les effets peuvent être difficiles à supprimer, même par la mise en œuvre d’une chromatographie sur Celite® avant immunodosage (exemple du dosage de la DHT). Ces techniques permettent des dosages multiples effectués simultanément conduisant à un pouvoir diagnostique accru par rapport à des dosages isolés. Cependant, il y a nécessité de déterminer des valeurs de références chez les sujets « normaux » (en bonne santé, en tenant compte de l’âge et du sexe), en particulier en pédiatrie et au cours de la ménopause. La plus grande exactitude associée à ces techniques doit conduire à une plus grande standardisation des dosages et à une meilleure interprétation quel que soit le laboratoire concerné, les résultats étant ainsi moins laboratoire dépendant. De plus, il faut avoir conscience de la rigueur nécessaire au développement de ces techniques, au niveau de leur validation initiale et au niveau de leur utilisation journalière. En particulier dans le domaine des stéroïdes pour lequel une culture acquise par la confrontation des résultats avec la clinique est plus que jamais nécessaire. Mes remerciements à mes collègues et anciens collègues de l’hôpital Saint-Louis, au Dr Yves Tavet (Pasteur-Cerba), au Pr Yves Le-Bouc (Hôpital Trousseau), au Pr Sophie Christin-Maitre (Hôpital Saint-Antoine), au Pr Groussin (Hôpital Cochin).

Déclaration d’intérêts : l’auteur déclare ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article.

SPECTROMÉTRIE DE MASSE

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// REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - DÉCEMBRE 2011 - N°437

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