Beeinflussung der dünnschichtchromatographischen remissionsmessung durch arbeitstechnische faktoren

Jowtral of CJwotnatography, 82 (I 973) 85-94 0 Elscvicr Scientific Publishing Company, Amsterdam CHROM.

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Printed in The Ncthctlands

6702

BEEINFLUSSUNG DER D~NNSCHICHTCHROMATOGRAPHISCHEN REMISSIONSMESSUNG DURCH ARBEITSTECHNISCHE FAKTOREN 111. SIMULTANMESSUNG I-I. JORK UtriversitHt dcs Saarlattdes, SaarLWckcrl I I (B. R. D.)

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UND

IHRE

EINFLUSSFAKTOREN

FaclrhercicJr 15, J Pharmakogtrosie

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rrtrd Alralytisclre

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PJ~ytoclrernic, 66

---_

SUMMARY

The irtjuence on reji’cctance nreasurenwnts of thin-layer ckrontatogram .factors. III. Factors influencing sinndtaneous nwasurcments

by technical

Spectrophotometric refjectclnce measurements are often used for the direct determination of thin-layer chromatograms. Since the scattering behaviour of the stationary phase varies as a result of different layer thickness, particle size and packing density, disturbances occur in the baseline pattern in the visible range of the spectrum. Smoothing of the background is possible when the influencing factors are known. This is achieved by simultaneous detection of the reflected and transmitted radiation and by compensation corrections of the reflectance curve. As a result of this simultaneous measurement the detection limit will be improved by a factor of IO to 100, so that nanogram-amounts can also be unambiguously detected both qualitatively and quantitatively. The reproducibility of the total analysis is in the nanogram-range about s = S-70/ Calibration curves through the zero point are obtained.

EINLEITUNG

Zur quantitativen Direktauswertung von Dtinnschichtchromatogrammen haben sich die spektralphotometrischen Messmethoden durchgesetzt. Vorteilhaft hat sich dabei erwiesen, dass das Ausschaben, Eluieren und Einstellen der MessliSsung entftillt, wie es bei den indirekten Auswerteverfahren notwendig ist. Damit werden such die FehlermiSglichkeiten der Transfertechniken ausgeschlossen. Die ben6tigten Substanzmengen liegen im Gegensatz zu Ktivettenmessungen im MikrogrammBereich, so dass die Direktauswertung absorbierender oder fluoreszierender Substanzzonen fiir die Metabolitenforschung, die Spurenanalyse in Kontroll-Laboratorien, die Umweltforschung usw. interessant ist. Bewlhrt haben sich Remissionsmessungen im sichtbaren und ultravioletten Spektralbereich bis zu A = 200 nm1s2. Sie werden weniger stark durch Schichtdickenunterschiede beeinflusst als Transmissionsmessungen3*4. Dennoch treten speziell .bei der Auswertung.im sichtbaren Spektralgebiet Starungen aufgrund unterschiedlicher Streueigenschaften der Schicht auf.

l-i. JORK

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5*10.12~13*26 bzw. Bestimmungen, die Behebung werdcn Zweistrahl-Messungen dem “double-wavelength”-Prinzip arbeiten, empfohlen IJ. Geeigneter crscheinen jedoch Simultanmessungen, weil sie am gleichen Ort mit der gleichen Wellenkinge wird deutlich verbessert. Dadurch kann ausgefiihrt werden 15*16.Die Nachweisgrenze die Direktauswertung farbiger Substanzen in den Nanogramm-Bereich verlagert werden. Zur

nach

STt)RUNGSMt)GLlCHKElTEN

BE1 DER

Als Grenzgesetz fiir Messungen Munk Funktion (I)“*‘“: 1; (I - R)Z ---=s 2R

DIREKTAUSWERTUNG

an lichtstreuenden

Medien

gilt die Kubelka(1)

Darin bedeuten : R = absoluter Remissionsgrad der Untersuchungssubstanz; s = Streukoeffizient; Is = Absorptionskoeflizient: a = aufgetragene Substanzmenge: * V = Schichtvolumen von a; F = Zonenfltiche auf dem Chromatogramm; cl = Schichtdicke der stationtiren Phase; E = molarer dekadischer Extinktionskoeffizient. Nach Gleichung 2 ist die chromatographierte Substanzmenge a der remittierten Messstrahlung direkt proportional, wenn die FleckflSiche F, die Schichtdicke d, der Streukoefizient s und der Extinktionskoefizient E konstant sind. Dabei wird vorausgesetzt, dass keine eingestrahlte Energie durch die stationlire Phase hindurchtritt und so der Remissionsmessung verloren geht. Nach Fig. 1 ist diese Forderung im ultravioletten Spektralbereich hinreichend erfiillt. Im sichtbaren Spektralgebiet muss dagegen mit Stiirungen gerechnet werden. Da sich die Schichtdicke, die KorngriSssenverteilung und die Packungsdichte der stationiiren Phase 6rtlich iindern”*lg, ist such der Energieverlust durch Transmission iSrtlich unterschiedlich. Folglich kann such der Basislinienverlauf bei einer Registrierung in diesem Spektralbereich nicht starungsfrei sein. Die Fehler, die aufgrund des unterschiedlichen Streuverhaltens der stationtiren Phase auftreten, lassen sich durch Simultanmessungen beheben. PRINZIP DER

SIMULTANMESSUNG

Bei der Rcgistrierung einer substanzfreien Chromatogrammbahn f$illt auf, dass die Remissionskurve (R-Kurve) und die Transmissionskurve (T-Kurve) gegerfsinr~ig verlaufcnl*‘“. Nimmt die Streuung der Messstrahlung aufgrund einer griisseren

BEElNFLUSSUNG

DER DC-REMISSIONSMESSUNG.

87

111.

J-J-L h

tnml

400

Fig, 1. Spcktralc Kicsclgcl-Schicht.

Abhlingigkcit

des Quotienten

Schichtdickc/Wcllcnllngc

fllr tine

180 /drn dicke

Schichtdicke oder Packungsdichte der Sorbcnspartikelchen zu (Fig. 2), so vergrbssert sich der Remissionsgrad, wtihrend der transmittierte Strahlungsanteil abnimmt und umgekehrt. Dagegen’ Wdern sich sowohl Remissions- als such Transmissionssignal in gleichern Sinne wenn die #nderung durch Absorption oder such Fluoreszenz der zu messenden Substanz verursacht wird. Arbeitet man gleichzeitig mit je einem Empfinger im R- und T-Kanal (Simultanmessung), so addieren sich die “Substanzsigsich die “Untergrundsignale” z. T. aufheben. Eine vollstlndige nale”, wlhrend Kompensation wird erhalten, wenn das Spannungsverhtiltnis F,/FT aus dem Rund T-Kanal optimal gewtihlt wird (Fig. 3).

DC- schicht

Remission

Tmnsmission

Fig, 2. Schcmatische

Dnrstellung

dcr Simultanmcssung:

Einzclhciten

s. Text.

I-I. JORK

(6) (5)

(4)

(3)

(2)

(7)

Oertitcrauschen (b) Fig, 3. Rcgistrierung cincr 180 /tm dickcn Kicselgcl-Schicht in Remission, Transmission und simultancr Messanordnung: Messwellcnllngc 500 nm. (a) Mikroaufnamc cincr schlecht gcstrichcncn Kicsclgcl-Schicht: VergrosserunR lo-fach. tb) Absorption+Ortskurvcn der gleichcn Chromatogrammbahn. 1, Rcmissionskurve: 2. Transmissionskurvc: 3. simultane Registricrungen FJFT = 100/75: 4, F,JFr = loo/SO;5, F,JFr = lCO/33:6, FdFt = 100/25:7. Gertitcrauschcn bei FdFr = lOO/ZS.

EINFLUSSGRGSSEN s ist von der Wellenl%nge und der TeilchengriSsse des Der StreukoefEzient Sorbens abhtingig 20. Andert sich die MesswellenlBnge, so Sindert sich such das Streuverhalten der Schicht und damit das optimale FR/FT-Verhgltnis. Im Bereich zwischen 700 und 450 nm ist diese Anderung vernachhissigbar gering. Je nach Hersteller, Charge und Schicktdicke liegt der empirisch gefundene F,/F=-Wert zwischen 2.5 und 35 Unterhalb von 1 = 450 nm wird eine optimale Korrektur der R-Kurve mit geringeren FT-Werten erreicht. Ab il = 350 nm ist wegen der steigenden Absorption der stationaren Phase einc Basislinienkorrektur nicht mehr notwendig. Zu den gleichen Ergebnissen ftihrten Untersuchungen mit Kieselguhr- und Polyamid-Schichten (Fig. 4). Bei Cellulose als station~rer Phase ist der Kurvenverlauf flacher, bei Aluminiumoxid-Schichten steiler.

Sckich f diclccnabhiingigi~ei,

Bei den in Fig. 4 dargestellten Kurven wurden Dtinnschichtchromatographie (DC)-Platten zur Messung eingesetzt, wie sie iiblicherweise zur Chromatographie verwandt werden. Die Schichtdicke des Sorbens war unterschiedlich. Da dickere

BEEINFLUSSUNG

DER DC-REMISSIONSMESSUNG.

89

111.

6Aluminium oxid 25Oum 4-

Polyamid 140pm

2-

Kieselgel 240um Kieselguhr 210um Cellulose 65um

I 300

400

I

500

I

600

I

h (nm)

Fig. 4. Abhilngigkeit des ftir die Basisliniengllttung Itinge bei 5 vcrschiedenen stationfiren Phasen.

optimalen

I;,JpT-Wcrtcs

von dcr Messwcllen-

Schichten ein homogeneres Streuverhalten ftir die Messstrahlung besitzen als dtinnere, werden zur Basislinienkorrektur kleinere F,-Werte beniitigt als bei dtinneren station&en Phasen. Der Zahlenwert des Quotienten Fu/FT ist hier grosser (z, B. 5 statt 3). Bei Schichtdickendifferenzen von =Ir 10% ist die &nderung der FR/FT-Werte in einem Wellenllngenbereich zwischen 700 und 450 nm unerheblich. Das bedeutet, dass eine optimale Basislinienghittung mit einem .konstanten FR/FT-Wert erreicht wird. Bei ktirzerwelliger Messstrahlung nimmt der Einfluss der Schichtdicke zungchst zu. Unter 1 = 400 nm steigt dann die Absorption der Schicht so an, dass ein Einfluss der Schichtdicke ab 1 = 350 nm nicht mehr festgestellt werden kann und damit eine Korrektur iiberfliissig wird. Fig. 5 zeigt die entsprechendcn Kurvenztige fur Kieselgel-Schichten. Korngriissenabhdngiglceit Zur Untersuchung des Korngrosseneinflusses wurden gleich dicke DC-Platten (d = lGO-170,um) mit unterschiedlicher Partikelgrosse hergestellt. Nach Fig. G liegt der FR/FT-Wert ftir kleinkernigere Kieselgelschichten (Korngriisse IO-30 pm) deutlich hoher als fur stationgre Phasen, die sich aus 30-6Oprn grossen Partikelchen aufbauen. Bei geringercr Korngriisse tritt weniger Strahlungsenergie durch die DCPlatte hindurch. Infolgedessen sind die StiSrungen, die auf Differenzen im Streuverhalten zurtickzuftihren sind, geringer. Die zur Basislinienkorrektur eingesetzte “Gegenspannung” kann also kleiner sein.

I-l. JORK

90

x 350

nm

450

nm

550nm 650nm

I

I

50

100

200

150

SchichtdickeCum)

Fig. 5. Spckttalc QUANTITATIVE

Abhlngigkcit

des F,{/FT-Wcrtcs

dcr stationiircn Phase.

von dcr Schichtdickc

MESSUNGEN

Zur Registrierung der Chromatogrammzonen wird bei Verwendung des Simultanansatzes* das als optimal erkannte F,/F,-Verh8ltnis eingestellt. Damit wird die durch Streuung verursachte Untergrundstruktur eliminiert. Damit wird such eine Ordinatenspreizung bei der Registrierung von Nanogramm-Mengen sinnvoll. Auf diese Weise IHsst sich eine weitcre Optimierung der Nachweisgrenze urn etwsl tin bis zwei Zehnerpotenzen etreichen. Diese Ordinatenspreizung kann ebenfalls mit Hilfe des Spreizungszusatzes durch Umschaltung des Schreibermessbereichs vorgenommen werden. Bei zehnmaliger Registrierung der gleichen Chromatogrammzone (Sudanrot G, 40 ng: Peakfltiche, 5300 mmZ; Schreibervollausschlag, 2 mV) war die crreichte Reprod uzierbarkeit besser als s = =t: I .6x,. Da die Fehler von der Volumendosierung

1 650

Wellenl tinge (n m)

Fig. 6. Spektrale l

Hcrstcller:

Abhiingigkeit

des Fl,/FT-Wertcs

Fe. Carl Zeiss. Obcrkochcn,

von dcr Korngriisse:

B.R.D.

-,

IO-30jcm;

CII, 3040

/lrn.

I-l. JORK

92 APPARATIVE

AUSRtkiTUNG

Zur Messung wurde das Zeiss Chromatogramm Spcktralphotometer verwandt, das bereits fur Remissions- und Transmissionsmessungen ausgelegt ist. Zusgtzlich wurde ein zweiter Photomultiplier und der neu entwickelte Simultanansatz ben6tigt; in dem das Faktorenverhliltnis der Spannungen aus dem R- und T-Kanal innerhalb bestimmter Grenzen stufenlos eingestellt werden kann, Die Signale beider Kan!ile werden zusammengefilhrt und als tin gemeinsames Endsignal dem Anzeigeg&it zugeleitet und in gewohnter Weise weiter verarbeitet. DISKUSSION

DER

ERGEBNISSE

Bei den bisherigen Remissions- und Transmissionsmessungen an Diinnschichtchromatogramrnen traten im sichtbaren Spektralbereich dadurch Sttirungen auf, dass die Schichtdicke oder Packungsdichte nicht homogen warenIP und sich infolgedessen die Streueigenschaften der station&en Phase in Abhsngigkeit vom Ort Inderten. Diese StiSrrmgen lassen sich durch simultane Remissionsund Transmissionsmessungen bei gleicher Wellenltinge und am gleichen Ort beseitigen. Das Verfahren bietet wesentliche Vorteile gegeniiber anderen Versuchen der Eliminierung der genannten Stiirungen, z-13.durch Zweistrahl- oder Zweiwellenllngen-Messungen. Mit dem ZM&~s~~uh/vet$+hrut~wurden Mess- und Vergleichssignal an verschiedenen Orten der Schicht gemessen. Urn Sttirungen, die durch Streueffekte verursacht sind, zu eliminieren, ist aber Voraussetzung, dass an beiden Orten die gleiche Stiirung auftritt. Dies ist oft nicht der Fall. Eine Basisliniengltittung ist dann nicht miiglich. Beim Zweiwe//enkingenverfuhren wurden Mess- und Vergleichssignal am gleichen Or& gemessen. Voraussetzung fi,lr eine Basislinicnkorrektur ist, dass die Nesswellenl2inge im Absorptionsmaximum der zu untersuchenden Verbindung, die Vergleichswellenltinge aber ausserhalb des Absorptionsbereiches liegen muss. Da die Absorptionsbanden de1 adsorbierten Substanzen verhtiltnism%ssig breit sind, liegen die beiden MesswellenIiingen 50 bis 100 nm auseinander. Unstimmigkeiten bei der Kompensation der Untergrundstruktur treten in diesem Fall dadurch auf, dass das Streuverhalten der Schicht, die Empfindlichkeit des Empftingers, die VerstSirkung des Photostromes usw. fiir beide M’esswellenltingen verschieden sind. Ausserdem miissen bei dieser Art der Messung jeweils zwei Wellenltingen fiir jede zu messende Substanz vor der eigentlichen Messung festgelegt werden. Bei der Simultanmessung werden dagegen die Messergebnisse bei der gleichen Wellenllnge am gleichen Ort der DC-Platte und zwar in Transmission und Remission ermittelt. Dabei werden Peakfltichen erhalten, die grlisser sind als bei Remissionsmessungen allein. Die Untergrundstruktur der Basislinie ist deutlich verringert, so dass die Nachweisgrenze urn den Faktor IO-100 gesenkt werden kann. Es kirnnen nun also such quantitative Bestimmungen von Nanogramm-Mengen durchgefiihrt werden. Die erhaltenen Eichgeraden verlaufen durch den Nullpunkt, weil in diesem Mengenbereich die Peakfltiche der Absorptions-Orts-Kurve in guter Ntiherung der’ Fltiche der k/s-Kurve aus der Kubelka-Munk Funktion entspricht. Zur FlSichenermittlung lassen sich besser als bisher Integratoren einsetzen, weil die Basislinienstruktur bis auf das minimale Geriiterauschen verringert wurde (Fig. 9). Die Gliittung des Untergrundes wird von dem Spannungsverhlltnis FR/FT

BEEINFLUSSIJNG

Wellenlijnge:550nm,

DER

DC-REMISSIONSMESSUNG.

Gertiterauschen:

ILL

:.. _:: :, :_::. ‘: 1;. WI L.

93

. : Z”’. *.: 1,~ ;

Fig. 9. Registricrung lost-Schiclrt.

der Basislinicnglilttung durclr Simultanmcswng an eincr 80 l&m dickcn CelluFaktorenverhiiltnis: I;;c/J$ = 100/45; zwcifnchc Ordinatensprcizung.

bestimmt. Dieser Quotient ist von der Schichtdicke, der KorngriSsse (Porenweite) des Sorbens und der Messwellenl%nge abhlngig. Je gr6sser die Schichtdicke einer DC-Platte und je kleiner die PartikelgriSsse des Sorbens ist, urn so geringer ist der Transmissionsanteil der zur Basislinienkorrektur ben6tigt wird. Es ist darum zu begriissen, dass einige Hersteller von Sorbentien das KorngriSssenintervall ihrer Erzeugnisse verkleinert haben und fiir DC fast nur noch Schichtmaterialien empfehlen, deren TeilchengriSsse zwischen 10 und 25 ,um liegt. Auch die Messwellenllnge spielt fiir die Griisse der Korrekturfaktoren eine Rolle. Im Bereich zwischen 700 und 450nm tindert sich der Quotient. nur minimal. Zu kiirzeren Wellenliingen hin nehmen das Streuvermbgen der Schicht und die Absorption so zu, dass immer weniger Strahlungsenergie in den Transmissionskanal eintritt. Damit entfgllt fiir Wellenltingen unter 350 nm die Notwendigkeit einer Basislinienkorrektur. Die Simuleanmessung ist also ein Messprinzip, das ohne grasseren apparat,iven Aufwand dort eingeseezt werden kann, wo Messfehler aufgrund eines inkonstanten Streuvcrhaltens der stationlren Phase auflreten. Durch die Gkittung der Untergrundstrukeur wird eine Steigerung der Nachweisempfindlichkeit und der quantitativen Auswertung erzielt, die iiber die bisherigen Meglichkeiten bei der Direktauswertung weit hinausgeht. DANK

Die vorliegenden Untersuchungen wurden im Rahmen des SFB 52 “Analytik” durchgefiihrt und somit von der Deutschen Forschungsgemeinschaft grossziigig gefiirdert. Mein Dank gilt Frtiulein Renate Klein fiir die gewissenhafte und zuverEissige Mitarbeit.

94

H. JORK

ZUSAMMENFASSUNG

Zur Direktauswertung von Diinnschichtchromatogrammen werden htiufig spektralphotometrische Remissionsmessungen eingesetzt. Dn das Streuverhalten der stationiiren Phase aufgrund unterschiedlicher Schichtdicke, Korngr6sse und Packungsdichte wechselt, treten im sichtbaren Spektralbereich SWungen im Basislinienverlauf auf, Eine Gltittung der Untergrundstruktur ist durch gleichzeitige Erfassung der zuriickgestrahlten und hindurcllgelassenen Messstrahlung und kompensierende Korrektur der Retnissionskurve maglich. Durch diese Simultanmessung wird die Nachweisgrenze urn den Faktor 10 bis 100 verbessert, so dass such Nanogramm-Mengen eindeutig erkannt und quantitativ erfasst werden k6nnen. Die Reproduzierbarkeit der gesamten Analyse liegt im Nanogramm-Bereich bei s = f 5-7 %. Es werden Eichgeraden erhalten, die durch den Nullpunkt verlaufen. LITERATUR 1 2 3 4 5 G 7 8 9 10 11 12 13 14 15

IG

17 18

19 20 21 22 23 24 25 26

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