- Email: [email protected]
Diagnostic rapide des hémoglobinuries nocturnes paroxystiques par agglutination en gel
Rev. Ft. Transfus. H6mobiol., 1993, 36, 135-147
135
MEMOIRE ORIGINAL
Diagnostic rapide des h6moglobinuries nocturnes paroxystiques par agglutination en gel par J.M. N a v e n o t , D. Bernard, Y. Petit-Frioux, M.J. Loirat, J. Guimbreti6re, J.Y. Muller, D. B l a n c h a r d Centre R6gional de Transfusion Sanguine, Nantes.
RESUME Des anticorps monoclonaux dirig~s contre les glycoprot~ines membranaires DAF (antigOne CD55) et MIRL (HRF20 ou antigdne CD59) ont dtd utilis~s pour identifier les populations ~rythrocytaires CD55- et CD59- des patients atteints d'hdmoglobinurie nocturne paroxystique (HNP). Les anticorps NaM16-4D3 (CD55, IgG2a) et NaM77-1E5 (CD59, lgG3) sont faiblement agglutinants et repr~sentent des outils de choix pour la quantification par cytomdtrie en flux indirecte des populations ~rythrocytaires normales (HNPI) et anormales (HNPII et HNPIII) des patients HNP. Les anticorps NaM125-7HlO (CD55) et NaM123-6G12 (CD59), de cIasse IgM ont OtOs~Iectionnds pour Ieur pouvoir agglutinant et permettent de sdparer les cellules HNPI des cellules HNPII et HNPIII par la technique d'agglutination en gel. Une relation directe a ~t~ dtablie entre les ~rythrocytes fluorescents (cytom~trie en flux) et les ~rythrocytes agglutinOs (agglutination en gel) pour des populations DAF+et DAF artificielles et pour une sdrie de patients HNP connus. Ces mdthodes utilisant des anticorps monoclonaux spdcifiques repr~sentent une alternative aux mdthodes classiques d'hdmolyse. Sur la base de l'anaTirds d part : D. Blanchard, CRTS, 34, bd Jean-Monnet, BP 349, 44011 Nantes Cedex 01.
NAVENOT ZM. et coll.
136
lyse de plus de 100 gchantillons dont 12 cas de HNP, nous proposons :1) la caract~risation rapide des ~rythrocytes CD55- et CD59- par agglutination en gel ~ l' aide des anticorps de classe IgM ; 2) la quantification des populations ~rythrocytaires normales et anormales par cytom~trie en flux.
SUMMARY
Specific diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) by gel test agglutination with murine monodonal antibodies Murine monoclonal antibodies (MoAbs) directed against DAF (Decay Accelerating Factor, CD55 antigen) and MIRL (Membrane Inhibitor of Reactive Lysis, CD59 antigen) were used to identify the affected red cells (CD55-/CD59-) of PNH patients. MoAbs NaM16-4D3 (CD55, IgG2a) and NaM77-1E5 (CD59, IgG3) weakly agglutinate red cells and represent powerful tools to quantitate normal (PNHI) and abnormal (PNHII and PNHIII) cells from PNH patients by indirect flow cytometry. MoAbs NaM125-7HlO (CD55) and NaM123-6G12 (CD59), both IgM, were selected for their agglutinating properties and used [or the separation o[ PNHI from PNHII and PNHIII red cells by the gel test technology. From analysis of artificial mixtures of DAF +and DAF cells, a direct relationship was established between fuorescent cells detected by flow cytometry, and erythrocytes agglutinated in microtyping cards. The method was [urther confirmed by analysis o[ ten blood samples from PItN patients and represent an alternative to classical hemolysis tests. On the basis of our experience we propose the [ollowing for the diagnosis of PNH : 1) agglutination test with NaCl microtyping cards using IgM CD55 and CD59 ; 2) flow cytometry analysis for accurate quantitation of CD55-/CD59- red cells.
INTRODUCTION L'H6moglobinurie Nocturne Paroxystique (HNP) ou syndrome de Marchiafava-Micheli est caract6ris6e par une h6molyse intravasculaire intermittente r6sultant d'une hypersensibilit6 des 6rythrocytes ~ l'acti0n h6molytique du compl6ment. La maladie est clonale et affecte les cellules de la moeUe osseuse. EUe peut entrer dans le cadre des my61odysplasies, 6tant susceptible de donner un tableau d'aplasie m6dullaire et d'6voluer vers une leuc6mie aigu~ [6]. Chez les patients coexistent des 6rythrocytes normalement sensibles (HNP-I) et anormalement sensibles h l'action du compl6ment (HNP-II et HNP-III, environ 5 et 20 fois plus sensibles que les 6rythrocytes normaux, respectivement). L'origine du m6canisme mol6culaire de l'h6molyse est attribu6e ~ tree diminution ou une absence d'expression des glycoprot6ines DAF (Decay Accelerating Factor, anti-
DIAGNOSTIC DES H N P PAR AGGLUTINATION EN GEL
137
gbne CD55), MIRL (Membrane Inhibitor of Reactive Lysis, antigbne CD59) et C8 binding protein qui contr61ent en permanence l'activation du compl6ment [14, 15].' Ces glycoprot6ines r6gulatrices sont fix6es ~t la membrane par une liaison glycosyl-phosphatidylinositol (liaison GPI) constitu6e d'tme fraction lipidique ench~ss6e dans la membrane et d'une partie glucidique libe l'acide amin6 C-terminal de la prot6ine par une mol6cule d'6thanolamine [5, 13]. L'enchatnement des diff6rents constituants du lien GPI est sous la d6pendance de plusieurs enzymes dont le fonctionnement est alt6r6 dans les cellules souches des patients HNP. En cons6quence, l'anomalie affecte les diff6rentes cellules du sang p6riph6rique et porte sur une s6rie de prot6ines li6es h la membrane par une liaison GPI [ 15, 19]. Le diagnostic biologique conventionnel des HNP est bas6 sur l'h6molyse des 6rythrocytes en milieu acidifi6 et le test au sucrose [2, 3, 9]. Les anticorps monoclonaux dirig6s contre les glycoprot6ines li6es a la membrane par une liaison GPI, utilis6s en cytom6trie en flux, permettent l'identification des cellules sanguines normales et de confirmer le diagnostic de HNP, surtout lorsque la population 6rythrocytaire anormale est minoritaire [8, 10, 19]. Dans ce travail, nous montrons que des anticorps agglutinants (de nature IgM), dirig6s contre les antigbnes CD55 et CD59, sont utilisables dans une technique simple d'agglutination en gel pour identifier tree population 6rythrocytaire anormale.
M A T E R I E L ET M E T H O D E S
Anticorps m o n o c l o n a u x Les anticorps monoclonaux murins utilis6s ont 6t6 obtenus par fusion de spl6nocytes de souris Balb/c, immtmis6es par trois injections intrap6riton6ales de 2 x 108 6rythrocytes d'adultes sains, avec des cellules my61omateuses de souris SP2/O-Agl4. Les clones hybrides ont 6t6 cultiv6s en milieu s61ectif RPMI/HAT [1]. Les anticorps s6cr6t6s ont ~tb s61ectionn6s par agglutination d'h6maties natives et trait6es par les enzymes prot6olytiques puis caract6ris6s par ,, i m m u n o b l o t t i n g , selon les m6thodes pr6c6demment d6crites [ 12]. Les anticorps NaM 16-4D3 et NaM 125-7H 10 se liant/~ une protbine sensible au traitement h la chymotrypsine des 6rythrocytes (Tabl. I) et reconnaissant une bande de 65-70 kDa de la m e m b r a n e 6rythrocytaire ont 6t6 identifi6s ~t des antiDAF (CD55). Les anticorps NaM77-1E5 et NaM123-6G12 mettent en 6vidence une prot6ine de 20 kDa partiellement sensible au traitement par la trypsine et identifi6e h la glycoprot6ine MIRL. Les anticorps monoclonaux dirig6s contre des glycoprot6ines li6es ~ la membrane par un lien GH ont 6t6 test6s en cytom6trie en flux e t / o u en agglutination avec des 6rythrocytes de malades HNP connus, Les anticorps ont montr6 des images de doubles populations caract6ristiques permettant de confirmer
138
NA VENOT I.M. et coll. Tableau I
Activitd agglutinante des anticorps monoclonaux dirigds contre les glycoprotdines DAF et MIRL. Erythrocytes
NaM16-4D3
Natffs Trait6s trypsine chymotrypsine papa~e neuraminidase
NaM125-7H10
NaM77-1E5
NaM123-6G12
+++~
+++
+++~
4++
+++ +++ +++
+++ + +++
+++ +++ +++ +++
+/+++ +++ +++
T e c h n i q u e t u b e avec i n c u b a t i o n 30 m i n u t e s ~ t e m p 6 r a t u r e a m b i a n t e . (1) Agglutination aprbs addition d'antiglobuline (anti-IgG d e souris).
•leur sp6cificit6 (D. Blanchard, B. Karnauch et J.M. Navenot, r6sultats non publi6s). Les classes et sous-dasses des anticorps monoclonaux ont 6t6 d6termin6es par ,, dot blot ,, utilisant des anti-IgM, -IgG1, -IgG2a, -IgG2b et IgG3 de souris produits chez le rat (Sigma).
Cellules sanguines Les 6rythrocytes t6moins ont 6t6 obtenus aupr~s de donneurs sains du CRTS de Nantes. Les pr616vements de malades HNP proviennent des services d'h6matologie des Centres Hospitaliers de Nantes, Saint-Nazaire, Poitiers, Bayonne, Brest et La Roche-sur-Yon. Tousles pr616vements ont 6t6 r6alis6s sur h6parine et achemin6s tr~s rapidement, en moins de 24 heures, au laboratoire. Les 6rythrocytes ont 6t6 lav6s trois lois en tampon phosphate de sodium 10 mM, Nacl 150 mM, pH 7,4 (PBS) avant utilisation.
Traitements enzymatiques des 6rythrocytes Les globules rouges lav6s ont 6t6 trait6s par la trypsine (55U/mg; Serva), la chymotrypsine (43U/mg ; Serva) et la neuraminidase de Vibrio c h o l e r a e (0,1U/ml ; Behringwerke) selon les m6thodes d6crites [11, 18]. Le traitement ~ la papaine a 6t6 rbalis6 selon le protocole d6crit par le fabricant (Diagast, Lille).
Tests d' agglutination Pour la technique d'agglutination directe ou indirecte en tube, 50 ~1 d'une suspension 6rythrocytaire ~ 5 % (v/v) ont 6t6 incub6s 30 minutes /t temp6rature ambiante avec l'anticorps monoclonal (surnageant de culture non dilu6). Le test indirect a 6t6 effectu6 par addition, apr~s lavage, de 50 pl d'anti-IgG (H + L) de souris (anticorps de lapin purifi6 par affinit6, Bioatlantic) dilu6 au 1/30 en PBS.
DIAGNOSTIC DES HNP PAR AGGLUTINATION EN GEL
139
Pour la technique en gel effectu6e avec les barrettes de gel de type NaCl (DiaMed), 50/~l d'une suspension 6rythrocytaire /t 1% en eau physiologique ont 6t6 incub6s avec 25 ~tl d'anticorps pendant 15 minutes 37 °C avant centrifugation 10 minutes fi 70 g. Darts le cas des anticorps de classe IgG, 50 ~l d'antiglobuline de lapin anti-IgG de souris dilu6e au 1/30 ont 6t6 ajout6s aprbs la premibre incubation; la plaque a 6t6 centrifug6e apr~s une nouvelle incubation de 10 minutes h 37 °C.
Cytom6trie en flux indirecte Cinquante ~1 d'nne suspension 6rythrocytaire ~ 10 % (v/v) ont 6t6 incub6s 1 heure ~t temp6rature ambiante avec 200 Ill de surnageant des hybridomes NaM16-4D3 (CD55 dilu6 au 1/50 e) et NaM77-1E5 (CD59 pur) ou 200 pl de PBS pour le t6moin n6gatif. Apr6s trois lavages en PBS, la fixation d'anticorps a 6t6 r6v616e par incubation des cellules pendant 30 minutes ~ 4 °C et h l'obscurit6 avec 100 ~tl d'antiglobuline de lapin FITC (anti-IgG (H + L) de souris, Bioatlantic) dflu6e au 1/100 e. Apr6s un demier lavage en PBS, les 6rythrocytes ont 6t6 remis en suspension et analys6s sur cytombtre en flux Ortho Spectrum III.
RESULTATS Activit6 agglutinante des anticorps monoclonaux Dais la technique tube dassique, les anticorps monoclonaux dirig6s contre le DAF (CD55) agglutinent les 6rythrocytes n o r m a u x natifs, trait6s par la trypsine, la papaine ou la neuraminidase mais n'agglutinent pas les cellules trait6es par la chymotrypsine (Tabl. I). Ces r6sultats sont en accord avec ceux obtenus par d'autres auteurs montrant que la prot6ine DAF associ6e aux antigbnes de groupe sanguin Cromer est sensible au traitement par la chymotrypsine [4]. L'anticorps NaM16-4D3 (IgG2a) agglutine les 6rythrocytes aprbs addition d'antiglobuline (anti-IgG de souris) alors que l'anticorps NaM 125-7H 10 (IgM) provoque l'agglutination en milieu salin. Des r6sultats identiques sont obtenus dans la technique en gel (Fig. 1). Notons que le CD55 de classe IgG donne one agglutination plus franche mais n6cessite une incubation en pr6sence d'antiglobuline. En revanche, les agglutinats obtenus avec le CD55 de classe IgM p6n6trent 16g6rement dans le gel. Les anti-MIRL (CD59) agglutinent les 6rythrocytes normanx non trait6s ou trait6s par les diff6rentes enzymes utilis6es (Tabl. I). L'agglutination des cellules trypsin6es par l'anticorps NaM123-6G12 est cependant trbs faible voire ntdle. La sensibilit6 de la prot6ine MIRL/~ la trypsine est rapport6e par certains auteurs [7]; il est vraisemblable que les anticorps reconnaissent des 6pitopes diff6rents sur la mol6cule. Dans la
140
NAVENOT ].M. et coll.
/~ i/:¸ ~:!~~ ~ ~:::i~: ¸: ~ :
;: ~
~ ~: ~
~:: ii~i~!,i:il
FIG. 1. - Agglutination des 6rythrocytes normau.x p a r les anticurps m o n o c l o n a u x anti-DAF (CD55) et anfi-MIRL (CD59) de classe IgG et IgM_ Les anticorps monoclonaux NaM 125-7H 10 (IgM) et RaM 16-4D3 (IgG2a) dirig6s contre la glycopr0t6ine DAF ainsi que les anticorps NaM123-6G12 (IgM) et NaM77-1E5 (IgG3) dirig6s contre la glycoprot6ine MIRL ont 6t6 ufilis~s dans la technique d'agglutination ell gel (plaque DiaMed NaC1) selon la m6thode d6crite d a m ~ Mat6riel et M6thodes ,,. Les anficorps ont &6 utilis6s sous forme de surnageants de culture aux dilutions suivantes: NaM125-7H10 et NaM77-1E5, dilution 1/1; NaM 16-4D3 et NaM123-6G12, dilution 1/5 et 1/2, respectivement. Pour les anticorps de classe IgG, u n e r6action de Coombs indirecte a 6t6 effectu6e avec u n e antiglobuline (anfi-IgG de souris).
technique en gel, les deux anticorps dorment une agglutination franche ; le CD59 de classe IgG n6cessitant l'addition d'antiglobuline (Fig. I),
Analyse de doubles populations arfificielles Prenant en c o m p t e la sensibilit6 ~ la chymotrypsine de la glycoprot6ine DAF, nous avons pr6par6 des m61anges artificiels d'6rythrocytes DAF + (ceUules non trait6es) et DAF- (cellules chymotrypsin6es). L'analyse par cytom6trie en flux indirecte utilisant l'anticorps NaM 16-4D3 est rapport6e dans le tableau II. Les valeurs obtenues p o u r des m61anges de 5 ~t 100 % de cellules DAF- sont tr6s proches des valeurs th6oriques, attestant de la sensibilit6 de la m6thode c o u r a m m e n t utilis6e darts notre laboratoire p o u r le diagnostic des HNP [8].
DIAGNOSTIC DES HNP PAR AGGLUTINATION EN GEL
141
Tableau II Analyse des doubles populations artificielles DAF + et DAF- par cytom~trie en flux (CMF)indirecte. Erythrocytes trait6s la chymotrypsine
Population n6gative en CMF (%)
0 5 10 20 50 75 90 100
0 5,6 13,4 21,1 52,8 76,1 89,9 98,0
Les tests d'agglutination en gel effectu6s ~ l'aide de l'anticorps NaM125-6G12 (IgM) d6montrent la s6paration franche des 6rythrocytes DAF + et DAF- (Fig. 2). Une tr~s faible proportion des ceUules natives, non trait6es par la chymotrypsine (contr61e 0 %), ne sont pas agglutin6es par l'anticorps. En cons6quence, l'agglutination est not6e + + + / ( + ) pour indiquer une double population 6rythrocytaire avec settlement quelques cellules non agglutin6es. Avec des m61anges de 5 ~ 20 % de cellules DAF-, notre notation arbitraire devient + + + / + montrant qu'une fraction significative de cellules ne sont pas agglutin6es. La m6me notation des agglutinats a 6t6 utilis6e pour des m61anges poss6dant un pourcentage sup6rieur de cenules DAF- (Fig. 2).
FIG 2. - Agglutination en gel de m61anges artificiels d'6rythrocytes DAF + et DAF- par l'anticorps NaM125-7H10 (CD55, d a s s e IgM). Les 6rythrocytes trait6s h la chymotrypsine (DAF) ont 6t6 m61ang6s avec des 6rythrocytes natifs (DAF ÷) selon les proportions indiqu6es. Les profds d'agglutination obtenus apr~s centrifugation sont arbitrairement not6s de + + + / ( + ) h - / + + + + en fonction des cellules agglutin6es et non agglutin6es (voir texte).
NA V E N O T J.M. et coll.
142
L'utflisation des m61anges artificiels a ainsi permis de fixer le seuil de d6tecfion visuel des 6rythrocytes DAF- aux environs de 5 %. Notons que lorsque les 6rythrocytes DAF- sont majoritaires (au dessus de 75 %), la totalit6 des cellules ne sont pas agglutin6es. I1 est probable que les agglutinats trop petits ne sont pas retenus dans le gel filtrant. Application h l'identification des 6rythrocytes DAF- (CD55-) et MIRL(CD59-) dans les cas de H N P L'analyse des 6rythrocytes de donneurs sains et de patients HNP a 6t6 effectute comparativement par cytomttrie en flux indirecte et agglutination en gel. Avec les 6rythrocytes de donneurs sains, les agglutinats obtenus avec l'anti-DAF sont notts + + + / ( + ) indiquant qu'une trts faible proportion des htmaties ne sont pas agglutintes ; les agglutinats observts avec l'anti-MIRL sont notts + + + + attestant que toutes les cellules sont fortement agglutintes. Dix examens ont 6t6 effectuts sur 9 patients reconnus HNP et, darts tous les cas, une b o n n e corrtlation entre le pourcentage de cellules non fluorescentes et n o n agglutintes a 6t6 observte (Tabl. III). Pour les patients posstdant de 10 ~t 25 % de ceUules DAF- (4 cas), les agglutinats sont intenses et impliquent la majorit6 des 6rythrocytes (agglutination n o t t e + + + / + ) . Une illustration est d o n n t e pour le patient Par. dont 10,6 et 9,6 % des 6rythrocytes n'expriment pas les marqueurs DAF et MIRL, respectivement, c o m m e le montre l'examen par cytomttrie en flux
Tableau HI Analyse comparative par cytomdtrie en flux indirecte et agglutination en gel d'dchantillons de sang de donneurs sains et de patients. Anti-DAF (CD55)
Ttmoins Patients non HNP 3 Patients HNP 4 strie 1 strie 2 strie 3
Anti-MIRL (CD59)
Nombre de cas
Gel t
CMF 2
Nombre de cas
Gel-~
CMF2
40 24 9 5 3 3
+++/(+) +++/(+)
1 pop. 1 pop.
40 18
++ + +/++++/-
1 pop. 1 pop.
+++/+ ++/++ +/+++
10-25 25-50 > 50
5 3 1
+ + +/+ ++/++ +/+++
10-20 20-50 > 50
1) Agglutination en gel obtenue avec les anticorps de dasse IgM: NaM125-7H10 (CD55) et NaM123-6G12. 2) Pourcentage de cellules ntgatives observtes en CMF indirecte avec les anticorps de classe IgG: NaM16-4D3 (CD55) et NaM77-1E5 (CD59). Les valeurs indiqutes correspondent attx ceUules observtes darts la rtgion des cenules non fluorescentes en cas de double population 6rythrocytaire. Les valeurs ne sont pas indiqutes pour les ttmoins et les patients non HNP avec lesquels une settle population ~rythrocytaire est observte. 3) Les patients non HNP provierment des services d'htmatologie du CHR de Nantes off ils sore suivis pour divers syndromes htmolytiques. 4) Les patients HNP sont caracttrists par tree double population 6rythrocytaire avec les marqueurs DAF et MIRL. Ils oat 6t6 arbitrairernent classts en trois stries en fonction de l'importance relative des populations agglutintes et non agglutintes observtes en gel.
DIAGNOSTIC DES HNP PAR AGGLUTINATION EN GEL
143
1716.3. - Analyse des 6rythrocytes d ' t m patient H N P (Par.) p a r cytom6trie en flux et agglutination en gel. Les populations cenulaires observ6es dans le pic 1 (CD55- ou CD59-) et dans le pic 2 (CD55 + ou CD59 +) sont not6es stir les h i s t o g r a m m e s obtenus p a r cytom6trie e n flux indirecte en utilisant les anticorps de classe IgG. Les gels correspondants obtenus avec l'6chantillon de sang contenant environ 10 % d'6rythrocytes CD55 k et CD59- sont repr6sent6s ; 1'agglutination est not6e arbitrairement ++4-/+.
(Fig. 3). Les cellules CD55- et CD59- sont n e t t e m e n t visibles au fond du rnicrotube de gel m o n t r a n t que dans les cas off la population anormale est nettement minoritaire, la m6thode d'agglutination est suffisamment sensible. Pour les patients dont le pourcentage de cellules D A P est de l'ordre de 25 ~ 50 %, les populations agglutin6es et non agglutin6es sont 6quivalentes (3 cas). Les m f m e s r6sultats sont observ6s avec les anti-MIRL utilis6s dans deux cas. Dans leur grande majorit6, les 6rythrocytes ne sont pas agglutin6s lorsque le pourcentage des cellules CD55-/CD59- est de l'ordre, ou sup6rieur ~t, 50 % (Tabl. III). Par exemple, p o u r le patient LP repr6sentatif de cette s6rie, l'analyse par cytom6trie en flux m o n t r e que 50,6 et 54 % des 6rythrocytes sont CD55- et CD59-, respectivement ; le test d'agglutination indique que les populations 6rythrocytaires agglutin6es par le CD55 et le CD59 sont tr6s minoritaires (Fig. 4). I1 apparalt ainsi clairement que les r6sultats obtenus avec des patients HNP poss6dant des doubles populations 6rythrocytaires natureUes concordent avec ceux obtenus par analyse des populations artificielles DAF + et DAF- (Fig. 2). Le test d'agglutination en gel a 6galement 6t6 appliqu6 ~ une s6rie de 24 malades p o u r lesquels u n e x a m e n de l'expression des antig6nes CD55 et CD59 avait 6t6 demand6 par le clinicien. Ces malades pr6sentent des syndromes h6molytiques d'origine diverse et nous sont adress6s pour u n diagnostic diff6rentiel [8]. C o m m e indiqu6 dans le tableau III, l'expression du DAF et du MIRL membranaire, analys6e par cytom6trie en flux
144
N A V E N O T Z M . et coll.
FIG. 4. - Profils obtenus par cytom6trle en flux et agglutination en gel avec un 6chantiUon de sang d'un second patient HNP (LP). Darts cet exemple, environ 50 % des 6rythrocytes n'expriment pas les glycoprot6ines DAF et MIRL. L'agglutination a 6t6 not6e + / + + + (CD55 et CD59) pour le patient LP et + + + / ( + ) (CD55) et + + + + / - (CD59) pour le t6moin.
est normale. En parfait accord, les profils d'agglutination obtenus avec les CD55 et CD59 de classe IgM sont identiques ~ ceux observ6s avec les t6moins, m o n t r a n t que la m6thode d'agglutination est sp6cifique et est applicable darts les cas off le test de Coombs direct est positif (voir discussion).
DIAGNOSTIC DES H N P PAR AGGLUTINATION E N GEL
145
DISCUSSION Les anticorps monoclonaux dirig6s contre les glycoprot6ines membranaires li6es h la membrane par une liaison GPI repr6sentent des outils de choix pour le diagnostic des h6moglobinuries nocturnes paroxystiques [8, 10, 16, 17, 19]. Ces anticorps sont g6n6ralement utilis6s dans des techrdques de cytom6trie en flux et permettent l'analyse des diff6rentes cellules du sang p6riph6rique affect6es dans ce syndrome. Les anti-DAF (CD55) et anti-MIRL (CD59) sont les plus couramment employ6s, du moins pour l'analyse de l'expression de ces marqueurs sur les 6rythrocytes. Au cours d'un travail pr6c6dent [8], nous avons montr6 que l'anticorps NaM16-4D3 (CD55 de classe IgG) permettait un diagnostic rapide des HNP par cytom6trie en flux, l'expression du DAF 6tant abaiss6e en corr61ation avec les tests en milieu acidifi6 et au sucrose positifs. Parall61ement, 48 patients souffrant de divers syndromes h6molytiques avaient 6t6 analys6s ; l'expression du DAF ayant 6t6 trouv6e faiblement abaiss6e darts deux cas sans concordance avec les tests d'h6molyse. Nos travaux tr~s r6cents montrent qu'un abaissernent isol6 du DAF, sans abaissement concomitant du MIRL et du LFA-3 (antig6ne CD58), peut 6tre observ6 chez quelques patients non H N P; le diagnostic de HNP devant 6tre assur6 par l'analyse de l'expression du DAF et du MIRL 6rythrocytaire et granulocytaire (J.M. Navenot, D. Bernard, J.L. Harousseau, J.Y. Muller et D. Blanchard ; manuscrit en pr6paration). L'investigation des polynucl6aires est particuli6rement importante pour les patients r6cemment transfus6s puisque ces cellules ne sont pas quantitativement modifl6es par transfusion de concentr6s globulaires. L'anticorps NaM16-4D3 (CD55) a 6galement 6t6 utilis6 dans un test d'agglutination en flux continu en pr6sence de polybr~ne [8]. Par cette m6thode, une double population 6rythrocytaire a 6t6 not6e dans tousles cas de HNP, corr61ant avec les r6sultats obtenus par cytom6trie en flux. Cependant, l'agglutination 6tait anormale pour 10 des 48 patients non HNP analys6s et le test ne pouvait pas 6tre appliqu6 anx malades avec un test de Coombs positif puisque leurs h6maties 6taient directement agglutin6es en milieu contenant du polybr6ne. Les anticorps monoclonaux de classe IgM permettent de paUier ce problbme technique puisqu'ils permettent tune agglutination en milieu salin. De ce fait, les anticorps NaM125-7H10 (CD55) et NaM123-6GI2 (CD59) ont 6t6 exp6riment6s dans la technique d'agglutination en gel qui permet de visualiser les doubles populations 6rythrocytaires. Dans le travail pr6sent6, 10 6chanfillons de sang provenant de 9 patiems HNP ont 6t6 analys6s comparativement en cytom6trie en flux indirecte, utflisant les CD55 et CD59 de classe IgG faiblemem agglutinants, et en agglutination en gel (plaques NaC1 DiaMed) avec les anticorps de classe IgM. Une bonne corr61ation a 6t6 observ6e entre les deux tests; la qualit6 des ceUules non agglutin6es (estim6e visuellement) 6tant globalement 6quivalente au pourcentage des 6rythrocytes CD55-/CD59-. Les 24 patients non
146
NAVENOT J.M. et coll.
H N P 6tudi6s paraUblement ont m o n t r 6 u n profil d'agglutination normal, d 6 m o n t r a n t la sp6cificit6 de la m6thode. Par observation visuelle des gels, il est possible de d6celer sans ambiguit6 les cas de H N P p o u r lesquels de l ' o r d r e de 5 / : 10 % des 6rythrocytes sont CD55-/CD59-. Dans les cas de H N P que nous avons 6tudi6s, le p o u r c e n t a g e des ceUules CD55-/CDSgvariant de 10 ~ 60 %, le diagnostic de H N P pouvait 6tre confirm6 p a r ce test simple et rapide d'agglutinafion en gel. Le test p e u t ainsi 6tre utilis6 en routine p o u r les malades dont la maladie de Machiafava-Micheli est 6voqu6e. Dans le cas de positivit6 du test, une cytom6trie en flux utilisant les CD55 et CD59 doit ~tre effectu6e p o u r la quantification des cellules positives et n6gatives. Nous r e c o l n m a n d o n s d'6tendre l'analyse cytom6trique aux polynucl6aires, au moins dans le cas off des transfusions r6centes ont 6t6 effectu6es.
CONCLUSION En d6finifive, l'utilisation d ' a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x dirig6s contre les glycoprot6ines DAF et M I R L p e r m e t u n diagnostic biologique rapide des HNP. Les anticorps NaM125-7H10 (anti-DAF, CD55) et NaM123-6G12 (anti-MIRL, CD59) de classe IgM, s61ecfionn6s p o u r leur capacit6 /: agglutiner les 6rythrocytes n o r m a u x en milieu salin, p e r m e t t e n t l'identification rapide (environ 30 minutes) des 6rythrocytes CD55- et CD59-. Les anticorps NaM16-4D3 (CD55) et NaM77-1E5 (CD59) de classe IgG p e r m e t t e n t quant ~t eux la quantification des ceUules (6rythrocytes et polynucl6aires) n o r m a u x et a n o r m a u x p a r cytom6trie en flux. Ces deux m 6 t h o d e s compl6mentaires repr6sentent lane aide pr6cieuse p o u r le clinicien, en parficulier dans les cas off les clones ceUulaires a n o r m a u x (incapables d ' a s s e m b l e r les c o m p o s a n t s du lien GPI) sont minoritaires.
remercions les praticiens hospitaliers des h6pitaux de Bayonne, Brest, Nantes, Poitiers, La Roche-sur-Yon et Saint-Nazaire, en parficulier le Pr HAROUSSEAU(CHR, Nantes), qui nous ont permis de coUecter les 6chantillons de sang des patients 6tudi6s. REMERCIEMENTS. -- NOLIS
REFERENCES
[1] CAMPBELLA.M. - Monoclonal antibody technology. In : Burdon R.H., Van Knippenberg P.H., Laboratory techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Amsterdaml Elsevier, 1984. [2] CROSBYW.H. - Paroxysmal nocturnal heamoglobinuria. Specific test of disease based on ability of thrombin to activate hemolytic factor. Blood, 1950 5, 843-848. [3] DAClEJ.V. - Diagnostic and mechanism of hemolysis in chronic hemolytic anemia with nocturnal hemoglobinuria. Blood, 1949, 4, 1183-1188.
DIAGNOSTIC DES HNP PAR AGGLUTINATION EN GEL
147
[4] DANIELS G. - Cromer-related antigens. Blood group determinants on Decay-Accelerating factor. Vox Sang, 1989, 56, 205-211. [5] DEEG M.A., HUMPHREY D.R., YAN6 S.H., FERGUSONT.R., REINHOLDV.N., ROSENBERRY T.L. - Glycan components in the glycoinositol phospholipid anchor of h u m a n erythrocyte acetylcholinesterase. 1. Biol. Chem., 1992, 267, 18573-18580. [6] DREYFUS B. - H6moglobinurie nocturne paroxystique. In: Dreyfus B.,
H~matologie, Paris, Flammarion Mddecine Sciences, 1988, 342-350. [7] FLETCHERA., BRYANTJ., YUANF.F. - An N-glycosylated 20 kD protein on the surface of the erythrocyte membrane is expressed on other peripheral blood cells. / n : Chester M.A., Johnson U., L6w B., Messeter L., Samuelsson B., Proceedings of the Second International Workshop and Symposium on Monoclonal antibodies against h u m a n red blood cells and related antigens, Sweden, Lund, 1990, 131. [8] GUIMBRETIERE L., BERNARD D., MAISONNEUVEH., HAROUSSEAUJ.L., GUIMBRETIERE J., MULLER J.Y., BLANCHARD D. - Diagnostic de l'h6moglobinurie nocturne paroxystique : utflisation d ' u n anticorps monoclonal dirig6 contre la glycoprot6ine DAF (Decay Accelerating Factor). Presse M4d., 1993 (sous presse). [9] HAM T.H. - Chronic hemolytic anemia with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. A study of the mechanism of hemolysis in relation to acid-base equilibrium. N. Engl. Z Med., 1937, 217, 915. [10] KAWAKAWIZ., NINOMIYA H., TOMIYAMAJ_, TSUKASA A. - Deficiency of glycosyl-phosphatidylinositol anchored proteins on paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) neutrophils and monocytes: heterogeneous deficiency of decay-accelerating factor (DAF) and CDI6 on PNH neutrophils_ Brit. Y. Haematol., 1990, 74, 508-513. [11] LATRONF., BLANCHARDn., CARTRONJ.P. - Immunochemical characterization of the h u m a n blood cell membrane glycoprotein recognized by the monoclonal antibody 12E7. Biochem. Y., 1987, 247, 757-764. [12] LOIRATM.J., GOURB1LA., FRIOUXY., MULLERJ.Y., BLANCHARDD. - A routine monoclonal antibody directed against the Gerbich 3 blood group antigen. Vox Sang., 1992, 62, 45-48. [13] Low M.G. - Biochemistry of the glycosyl-phosphoinositol membrane protein anchors. Biochem. Y., 1987, 244, 1-13. [14] RossE W.F. - The control of complement activation by the blood cells in paroxysmal hemoglobinuria. Blood, 1986, 67, 268-269. [15] ROSSEW.J. - Phosphatidylinositol-linked proteins and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood, 1990, 75, 1595-1601. [16] RossE W.J., HOFFMANS., CAMPBELLM., BOROWlTZM., MOORE J.O., PARKER C.J. - The erythrocytes in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria of intermediate sensitivity to complement lysis. Brit. J. Haematol., 1991, 79, 99-107. [17] SCHUBERT J., ALVARADO M., UCIECHOWSKI P., ZIELINSKA-SKOWRONEKM., FREUND M., VOGT S., SCHMIDT R.E. - Diagnosis of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria using immtmophenotyping of peripheral blood cells. Brit. J. Haematol., 1991, 79, 487-492. [ 18] TANNERM.J.A., ANSTEED.J., MAWBYW. - A new h u m a n erythrocyte variant (Ph) containing an abnormal sialoglycoprotein. Biochem. Z, 1980, 187, 493-497. [19] VAN DER SellOUT C.E., HUIZlNGA T.W.J., VAN'T VEER-KORTHOF E.T., WIJMANS R., PINKSTERJ., VON DEM BORNE A.E.G_Kr. - Deficiency of glycosyl-phosphatidylinositol-linked m e m b r a n e glycoproteins of leucocytes in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, description of a new diagnostic cytofluorometric assay. Blood, 1990, 76, 1853-1859.
135
MEMOIRE ORIGINAL
Diagnostic rapide des h6moglobinuries nocturnes paroxystiques par agglutination en gel par J.M. N a v e n o t , D. Bernard, Y. Petit-Frioux, M.J. Loirat, J. Guimbreti6re, J.Y. Muller, D. B l a n c h a r d Centre R6gional de Transfusion Sanguine, Nantes.
RESUME Des anticorps monoclonaux dirig~s contre les glycoprot~ines membranaires DAF (antigOne CD55) et MIRL (HRF20 ou antigdne CD59) ont dtd utilis~s pour identifier les populations ~rythrocytaires CD55- et CD59- des patients atteints d'hdmoglobinurie nocturne paroxystique (HNP). Les anticorps NaM16-4D3 (CD55, IgG2a) et NaM77-1E5 (CD59, lgG3) sont faiblement agglutinants et repr~sentent des outils de choix pour la quantification par cytomdtrie en flux indirecte des populations ~rythrocytaires normales (HNPI) et anormales (HNPII et HNPIII) des patients HNP. Les anticorps NaM125-7HlO (CD55) et NaM123-6G12 (CD59), de cIasse IgM ont OtOs~Iectionnds pour Ieur pouvoir agglutinant et permettent de sdparer les cellules HNPI des cellules HNPII et HNPIII par la technique d'agglutination en gel. Une relation directe a ~t~ dtablie entre les ~rythrocytes fluorescents (cytom~trie en flux) et les ~rythrocytes agglutinOs (agglutination en gel) pour des populations DAF+et DAF artificielles et pour une sdrie de patients HNP connus. Ces mdthodes utilisant des anticorps monoclonaux spdcifiques repr~sentent une alternative aux mdthodes classiques d'hdmolyse. Sur la base de l'anaTirds d part : D. Blanchard, CRTS, 34, bd Jean-Monnet, BP 349, 44011 Nantes Cedex 01.
NAVENOT ZM. et coll.
136
lyse de plus de 100 gchantillons dont 12 cas de HNP, nous proposons :1) la caract~risation rapide des ~rythrocytes CD55- et CD59- par agglutination en gel ~ l' aide des anticorps de classe IgM ; 2) la quantification des populations ~rythrocytaires normales et anormales par cytom~trie en flux.
SUMMARY
Specific diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) by gel test agglutination with murine monodonal antibodies Murine monoclonal antibodies (MoAbs) directed against DAF (Decay Accelerating Factor, CD55 antigen) and MIRL (Membrane Inhibitor of Reactive Lysis, CD59 antigen) were used to identify the affected red cells (CD55-/CD59-) of PNH patients. MoAbs NaM16-4D3 (CD55, IgG2a) and NaM77-1E5 (CD59, IgG3) weakly agglutinate red cells and represent powerful tools to quantitate normal (PNHI) and abnormal (PNHII and PNHIII) cells from PNH patients by indirect flow cytometry. MoAbs NaM125-7HlO (CD55) and NaM123-6G12 (CD59), both IgM, were selected for their agglutinating properties and used [or the separation o[ PNHI from PNHII and PNHIII red cells by the gel test technology. From analysis of artificial mixtures of DAF +and DAF cells, a direct relationship was established between fuorescent cells detected by flow cytometry, and erythrocytes agglutinated in microtyping cards. The method was [urther confirmed by analysis o[ ten blood samples from PItN patients and represent an alternative to classical hemolysis tests. On the basis of our experience we propose the [ollowing for the diagnosis of PNH : 1) agglutination test with NaCl microtyping cards using IgM CD55 and CD59 ; 2) flow cytometry analysis for accurate quantitation of CD55-/CD59- red cells.
INTRODUCTION L'H6moglobinurie Nocturne Paroxystique (HNP) ou syndrome de Marchiafava-Micheli est caract6ris6e par une h6molyse intravasculaire intermittente r6sultant d'une hypersensibilit6 des 6rythrocytes ~ l'acti0n h6molytique du compl6ment. La maladie est clonale et affecte les cellules de la moeUe osseuse. EUe peut entrer dans le cadre des my61odysplasies, 6tant susceptible de donner un tableau d'aplasie m6dullaire et d'6voluer vers une leuc6mie aigu~ [6]. Chez les patients coexistent des 6rythrocytes normalement sensibles (HNP-I) et anormalement sensibles h l'action du compl6ment (HNP-II et HNP-III, environ 5 et 20 fois plus sensibles que les 6rythrocytes normaux, respectivement). L'origine du m6canisme mol6culaire de l'h6molyse est attribu6e ~ tree diminution ou une absence d'expression des glycoprot6ines DAF (Decay Accelerating Factor, anti-
DIAGNOSTIC DES H N P PAR AGGLUTINATION EN GEL
137
gbne CD55), MIRL (Membrane Inhibitor of Reactive Lysis, antigbne CD59) et C8 binding protein qui contr61ent en permanence l'activation du compl6ment [14, 15].' Ces glycoprot6ines r6gulatrices sont fix6es ~t la membrane par une liaison glycosyl-phosphatidylinositol (liaison GPI) constitu6e d'tme fraction lipidique ench~ss6e dans la membrane et d'une partie glucidique libe l'acide amin6 C-terminal de la prot6ine par une mol6cule d'6thanolamine [5, 13]. L'enchatnement des diff6rents constituants du lien GPI est sous la d6pendance de plusieurs enzymes dont le fonctionnement est alt6r6 dans les cellules souches des patients HNP. En cons6quence, l'anomalie affecte les diff6rentes cellules du sang p6riph6rique et porte sur une s6rie de prot6ines li6es h la membrane par une liaison GPI [ 15, 19]. Le diagnostic biologique conventionnel des HNP est bas6 sur l'h6molyse des 6rythrocytes en milieu acidifi6 et le test au sucrose [2, 3, 9]. Les anticorps monoclonaux dirig6s contre les glycoprot6ines li6es a la membrane par une liaison GPI, utilis6s en cytom6trie en flux, permettent l'identification des cellules sanguines normales et de confirmer le diagnostic de HNP, surtout lorsque la population 6rythrocytaire anormale est minoritaire [8, 10, 19]. Dans ce travail, nous montrons que des anticorps agglutinants (de nature IgM), dirig6s contre les antigbnes CD55 et CD59, sont utilisables dans une technique simple d'agglutination en gel pour identifier tree population 6rythrocytaire anormale.
M A T E R I E L ET M E T H O D E S
Anticorps m o n o c l o n a u x Les anticorps monoclonaux murins utilis6s ont 6t6 obtenus par fusion de spl6nocytes de souris Balb/c, immtmis6es par trois injections intrap6riton6ales de 2 x 108 6rythrocytes d'adultes sains, avec des cellules my61omateuses de souris SP2/O-Agl4. Les clones hybrides ont 6t6 cultiv6s en milieu s61ectif RPMI/HAT [1]. Les anticorps s6cr6t6s ont ~tb s61ectionn6s par agglutination d'h6maties natives et trait6es par les enzymes prot6olytiques puis caract6ris6s par ,, i m m u n o b l o t t i n g , selon les m6thodes pr6c6demment d6crites [ 12]. Les anticorps NaM 16-4D3 et NaM 125-7H 10 se liant/~ une protbine sensible au traitement h la chymotrypsine des 6rythrocytes (Tabl. I) et reconnaissant une bande de 65-70 kDa de la m e m b r a n e 6rythrocytaire ont 6t6 identifi6s ~t des antiDAF (CD55). Les anticorps NaM77-1E5 et NaM123-6G12 mettent en 6vidence une prot6ine de 20 kDa partiellement sensible au traitement par la trypsine et identifi6e h la glycoprot6ine MIRL. Les anticorps monoclonaux dirig6s contre des glycoprot6ines li6es ~ la membrane par un lien GH ont 6t6 test6s en cytom6trie en flux e t / o u en agglutination avec des 6rythrocytes de malades HNP connus, Les anticorps ont montr6 des images de doubles populations caract6ristiques permettant de confirmer
138
NA VENOT I.M. et coll. Tableau I
Activitd agglutinante des anticorps monoclonaux dirigds contre les glycoprotdines DAF et MIRL. Erythrocytes
NaM16-4D3
Natffs Trait6s trypsine chymotrypsine papa~e neuraminidase
NaM125-7H10
NaM77-1E5
NaM123-6G12
+++~
+++
+++~
4++
+++ +++ +++
+++ + +++
+++ +++ +++ +++
+/+++ +++ +++
T e c h n i q u e t u b e avec i n c u b a t i o n 30 m i n u t e s ~ t e m p 6 r a t u r e a m b i a n t e . (1) Agglutination aprbs addition d'antiglobuline (anti-IgG d e souris).
•leur sp6cificit6 (D. Blanchard, B. Karnauch et J.M. Navenot, r6sultats non publi6s). Les classes et sous-dasses des anticorps monoclonaux ont 6t6 d6termin6es par ,, dot blot ,, utilisant des anti-IgM, -IgG1, -IgG2a, -IgG2b et IgG3 de souris produits chez le rat (Sigma).
Cellules sanguines Les 6rythrocytes t6moins ont 6t6 obtenus aupr~s de donneurs sains du CRTS de Nantes. Les pr616vements de malades HNP proviennent des services d'h6matologie des Centres Hospitaliers de Nantes, Saint-Nazaire, Poitiers, Bayonne, Brest et La Roche-sur-Yon. Tousles pr616vements ont 6t6 r6alis6s sur h6parine et achemin6s tr~s rapidement, en moins de 24 heures, au laboratoire. Les 6rythrocytes ont 6t6 lav6s trois lois en tampon phosphate de sodium 10 mM, Nacl 150 mM, pH 7,4 (PBS) avant utilisation.
Traitements enzymatiques des 6rythrocytes Les globules rouges lav6s ont 6t6 trait6s par la trypsine (55U/mg; Serva), la chymotrypsine (43U/mg ; Serva) et la neuraminidase de Vibrio c h o l e r a e (0,1U/ml ; Behringwerke) selon les m6thodes d6crites [11, 18]. Le traitement ~ la papaine a 6t6 rbalis6 selon le protocole d6crit par le fabricant (Diagast, Lille).
Tests d' agglutination Pour la technique d'agglutination directe ou indirecte en tube, 50 ~1 d'une suspension 6rythrocytaire ~ 5 % (v/v) ont 6t6 incub6s 30 minutes /t temp6rature ambiante avec l'anticorps monoclonal (surnageant de culture non dilu6). Le test indirect a 6t6 effectu6 par addition, apr~s lavage, de 50 pl d'anti-IgG (H + L) de souris (anticorps de lapin purifi6 par affinit6, Bioatlantic) dilu6 au 1/30 en PBS.
DIAGNOSTIC DES HNP PAR AGGLUTINATION EN GEL
139
Pour la technique en gel effectu6e avec les barrettes de gel de type NaCl (DiaMed), 50/~l d'une suspension 6rythrocytaire /t 1% en eau physiologique ont 6t6 incub6s avec 25 ~tl d'anticorps pendant 15 minutes 37 °C avant centrifugation 10 minutes fi 70 g. Darts le cas des anticorps de classe IgG, 50 ~l d'antiglobuline de lapin anti-IgG de souris dilu6e au 1/30 ont 6t6 ajout6s aprbs la premibre incubation; la plaque a 6t6 centrifug6e apr~s une nouvelle incubation de 10 minutes h 37 °C.
Cytom6trie en flux indirecte Cinquante ~1 d'nne suspension 6rythrocytaire ~ 10 % (v/v) ont 6t6 incub6s 1 heure ~t temp6rature ambiante avec 200 Ill de surnageant des hybridomes NaM16-4D3 (CD55 dilu6 au 1/50 e) et NaM77-1E5 (CD59 pur) ou 200 pl de PBS pour le t6moin n6gatif. Apr6s trois lavages en PBS, la fixation d'anticorps a 6t6 r6v616e par incubation des cellules pendant 30 minutes ~ 4 °C et h l'obscurit6 avec 100 ~tl d'antiglobuline de lapin FITC (anti-IgG (H + L) de souris, Bioatlantic) dflu6e au 1/100 e. Apr6s un demier lavage en PBS, les 6rythrocytes ont 6t6 remis en suspension et analys6s sur cytombtre en flux Ortho Spectrum III.
RESULTATS Activit6 agglutinante des anticorps monoclonaux Dais la technique tube dassique, les anticorps monoclonaux dirig6s contre le DAF (CD55) agglutinent les 6rythrocytes n o r m a u x natifs, trait6s par la trypsine, la papaine ou la neuraminidase mais n'agglutinent pas les cellules trait6es par la chymotrypsine (Tabl. I). Ces r6sultats sont en accord avec ceux obtenus par d'autres auteurs montrant que la prot6ine DAF associ6e aux antigbnes de groupe sanguin Cromer est sensible au traitement par la chymotrypsine [4]. L'anticorps NaM16-4D3 (IgG2a) agglutine les 6rythrocytes aprbs addition d'antiglobuline (anti-IgG de souris) alors que l'anticorps NaM 125-7H 10 (IgM) provoque l'agglutination en milieu salin. Des r6sultats identiques sont obtenus dans la technique en gel (Fig. 1). Notons que le CD55 de classe IgG donne one agglutination plus franche mais n6cessite une incubation en pr6sence d'antiglobuline. En revanche, les agglutinats obtenus avec le CD55 de classe IgM p6n6trent 16g6rement dans le gel. Les anti-MIRL (CD59) agglutinent les 6rythrocytes normanx non trait6s ou trait6s par les diff6rentes enzymes utilis6es (Tabl. I). L'agglutination des cellules trypsin6es par l'anticorps NaM123-6G12 est cependant trbs faible voire ntdle. La sensibilit6 de la prot6ine MIRL/~ la trypsine est rapport6e par certains auteurs [7]; il est vraisemblable que les anticorps reconnaissent des 6pitopes diff6rents sur la mol6cule. Dans la
140
NAVENOT ].M. et coll.
/~ i/:¸ ~:!~~ ~ ~:::i~: ¸: ~ :
;: ~
~ ~: ~
~:: ii~i~!,i:il
FIG. 1. - Agglutination des 6rythrocytes normau.x p a r les anticurps m o n o c l o n a u x anti-DAF (CD55) et anfi-MIRL (CD59) de classe IgG et IgM_ Les anticorps monoclonaux NaM 125-7H 10 (IgM) et RaM 16-4D3 (IgG2a) dirig6s contre la glycopr0t6ine DAF ainsi que les anticorps NaM123-6G12 (IgM) et NaM77-1E5 (IgG3) dirig6s contre la glycoprot6ine MIRL ont 6t6 ufilis~s dans la technique d'agglutination ell gel (plaque DiaMed NaC1) selon la m6thode d6crite d a m ~ Mat6riel et M6thodes ,,. Les anficorps ont &6 utilis6s sous forme de surnageants de culture aux dilutions suivantes: NaM125-7H10 et NaM77-1E5, dilution 1/1; NaM 16-4D3 et NaM123-6G12, dilution 1/5 et 1/2, respectivement. Pour les anticorps de classe IgG, u n e r6action de Coombs indirecte a 6t6 effectu6e avec u n e antiglobuline (anfi-IgG de souris).
technique en gel, les deux anticorps dorment une agglutination franche ; le CD59 de classe IgG n6cessitant l'addition d'antiglobuline (Fig. I),
Analyse de doubles populations arfificielles Prenant en c o m p t e la sensibilit6 ~ la chymotrypsine de la glycoprot6ine DAF, nous avons pr6par6 des m61anges artificiels d'6rythrocytes DAF + (ceUules non trait6es) et DAF- (cellules chymotrypsin6es). L'analyse par cytom6trie en flux indirecte utilisant l'anticorps NaM 16-4D3 est rapport6e dans le tableau II. Les valeurs obtenues p o u r des m61anges de 5 ~t 100 % de cellules DAF- sont tr6s proches des valeurs th6oriques, attestant de la sensibilit6 de la m6thode c o u r a m m e n t utilis6e darts notre laboratoire p o u r le diagnostic des HNP [8].
DIAGNOSTIC DES HNP PAR AGGLUTINATION EN GEL
141
Tableau II Analyse des doubles populations artificielles DAF + et DAF- par cytom~trie en flux (CMF)indirecte. Erythrocytes trait6s la chymotrypsine
Population n6gative en CMF (%)
0 5 10 20 50 75 90 100
0 5,6 13,4 21,1 52,8 76,1 89,9 98,0
Les tests d'agglutination en gel effectu6s ~ l'aide de l'anticorps NaM125-6G12 (IgM) d6montrent la s6paration franche des 6rythrocytes DAF + et DAF- (Fig. 2). Une tr~s faible proportion des ceUules natives, non trait6es par la chymotrypsine (contr61e 0 %), ne sont pas agglutin6es par l'anticorps. En cons6quence, l'agglutination est not6e + + + / ( + ) pour indiquer une double population 6rythrocytaire avec settlement quelques cellules non agglutin6es. Avec des m61anges de 5 ~ 20 % de cellules DAF-, notre notation arbitraire devient + + + / + montrant qu'une fraction significative de cellules ne sont pas agglutin6es. La m6me notation des agglutinats a 6t6 utilis6e pour des m61anges poss6dant un pourcentage sup6rieur de cenules DAF- (Fig. 2).
FIG 2. - Agglutination en gel de m61anges artificiels d'6rythrocytes DAF + et DAF- par l'anticorps NaM125-7H10 (CD55, d a s s e IgM). Les 6rythrocytes trait6s h la chymotrypsine (DAF) ont 6t6 m61ang6s avec des 6rythrocytes natifs (DAF ÷) selon les proportions indiqu6es. Les profds d'agglutination obtenus apr~s centrifugation sont arbitrairement not6s de + + + / ( + ) h - / + + + + en fonction des cellules agglutin6es et non agglutin6es (voir texte).
NA V E N O T J.M. et coll.
142
L'utflisation des m61anges artificiels a ainsi permis de fixer le seuil de d6tecfion visuel des 6rythrocytes DAF- aux environs de 5 %. Notons que lorsque les 6rythrocytes DAF- sont majoritaires (au dessus de 75 %), la totalit6 des cellules ne sont pas agglutin6es. I1 est probable que les agglutinats trop petits ne sont pas retenus dans le gel filtrant. Application h l'identification des 6rythrocytes DAF- (CD55-) et MIRL(CD59-) dans les cas de H N P L'analyse des 6rythrocytes de donneurs sains et de patients HNP a 6t6 effectute comparativement par cytomttrie en flux indirecte et agglutination en gel. Avec les 6rythrocytes de donneurs sains, les agglutinats obtenus avec l'anti-DAF sont notts + + + / ( + ) indiquant qu'une trts faible proportion des htmaties ne sont pas agglutintes ; les agglutinats observts avec l'anti-MIRL sont notts + + + + attestant que toutes les cellules sont fortement agglutintes. Dix examens ont 6t6 effectuts sur 9 patients reconnus HNP et, darts tous les cas, une b o n n e corrtlation entre le pourcentage de cellules non fluorescentes et n o n agglutintes a 6t6 observte (Tabl. III). Pour les patients posstdant de 10 ~t 25 % de ceUules DAF- (4 cas), les agglutinats sont intenses et impliquent la majorit6 des 6rythrocytes (agglutination n o t t e + + + / + ) . Une illustration est d o n n t e pour le patient Par. dont 10,6 et 9,6 % des 6rythrocytes n'expriment pas les marqueurs DAF et MIRL, respectivement, c o m m e le montre l'examen par cytomttrie en flux
Tableau HI Analyse comparative par cytomdtrie en flux indirecte et agglutination en gel d'dchantillons de sang de donneurs sains et de patients. Anti-DAF (CD55)
Ttmoins Patients non HNP 3 Patients HNP 4 strie 1 strie 2 strie 3
Anti-MIRL (CD59)
Nombre de cas
Gel t
CMF 2
Nombre de cas
Gel-~
CMF2
40 24 9 5 3 3
+++/(+) +++/(+)
1 pop. 1 pop.
40 18
++ + +/++++/-
1 pop. 1 pop.
+++/+ ++/++ +/+++
10-25 25-50 > 50
5 3 1
+ + +/+ ++/++ +/+++
10-20 20-50 > 50
1) Agglutination en gel obtenue avec les anticorps de dasse IgM: NaM125-7H10 (CD55) et NaM123-6G12. 2) Pourcentage de cellules ntgatives observtes en CMF indirecte avec les anticorps de classe IgG: NaM16-4D3 (CD55) et NaM77-1E5 (CD59). Les valeurs indiqutes correspondent attx ceUules observtes darts la rtgion des cenules non fluorescentes en cas de double population 6rythrocytaire. Les valeurs ne sont pas indiqutes pour les ttmoins et les patients non HNP avec lesquels une settle population ~rythrocytaire est observte. 3) Les patients non HNP provierment des services d'htmatologie du CHR de Nantes off ils sore suivis pour divers syndromes htmolytiques. 4) Les patients HNP sont caracttrists par tree double population 6rythrocytaire avec les marqueurs DAF et MIRL. Ils oat 6t6 arbitrairernent classts en trois stries en fonction de l'importance relative des populations agglutintes et non agglutintes observtes en gel.
DIAGNOSTIC DES HNP PAR AGGLUTINATION EN GEL
143
1716.3. - Analyse des 6rythrocytes d ' t m patient H N P (Par.) p a r cytom6trie en flux et agglutination en gel. Les populations cenulaires observ6es dans le pic 1 (CD55- ou CD59-) et dans le pic 2 (CD55 + ou CD59 +) sont not6es stir les h i s t o g r a m m e s obtenus p a r cytom6trie e n flux indirecte en utilisant les anticorps de classe IgG. Les gels correspondants obtenus avec l'6chantillon de sang contenant environ 10 % d'6rythrocytes CD55 k et CD59- sont repr6sent6s ; 1'agglutination est not6e arbitrairement ++4-/+.
(Fig. 3). Les cellules CD55- et CD59- sont n e t t e m e n t visibles au fond du rnicrotube de gel m o n t r a n t que dans les cas off la population anormale est nettement minoritaire, la m6thode d'agglutination est suffisamment sensible. Pour les patients dont le pourcentage de cellules D A P est de l'ordre de 25 ~ 50 %, les populations agglutin6es et non agglutin6es sont 6quivalentes (3 cas). Les m f m e s r6sultats sont observ6s avec les anti-MIRL utilis6s dans deux cas. Dans leur grande majorit6, les 6rythrocytes ne sont pas agglutin6s lorsque le pourcentage des cellules CD55-/CD59- est de l'ordre, ou sup6rieur ~t, 50 % (Tabl. III). Par exemple, p o u r le patient LP repr6sentatif de cette s6rie, l'analyse par cytom6trie en flux m o n t r e que 50,6 et 54 % des 6rythrocytes sont CD55- et CD59-, respectivement ; le test d'agglutination indique que les populations 6rythrocytaires agglutin6es par le CD55 et le CD59 sont tr6s minoritaires (Fig. 4). I1 apparalt ainsi clairement que les r6sultats obtenus avec des patients HNP poss6dant des doubles populations 6rythrocytaires natureUes concordent avec ceux obtenus par analyse des populations artificielles DAF + et DAF- (Fig. 2). Le test d'agglutination en gel a 6galement 6t6 appliqu6 ~ une s6rie de 24 malades p o u r lesquels u n e x a m e n de l'expression des antig6nes CD55 et CD59 avait 6t6 demand6 par le clinicien. Ces malades pr6sentent des syndromes h6molytiques d'origine diverse et nous sont adress6s pour u n diagnostic diff6rentiel [8]. C o m m e indiqu6 dans le tableau III, l'expression du DAF et du MIRL membranaire, analys6e par cytom6trie en flux
144
N A V E N O T Z M . et coll.
FIG. 4. - Profils obtenus par cytom6trle en flux et agglutination en gel avec un 6chantiUon de sang d'un second patient HNP (LP). Darts cet exemple, environ 50 % des 6rythrocytes n'expriment pas les glycoprot6ines DAF et MIRL. L'agglutination a 6t6 not6e + / + + + (CD55 et CD59) pour le patient LP et + + + / ( + ) (CD55) et + + + + / - (CD59) pour le t6moin.
est normale. En parfait accord, les profils d'agglutination obtenus avec les CD55 et CD59 de classe IgM sont identiques ~ ceux observ6s avec les t6moins, m o n t r a n t que la m6thode d'agglutination est sp6cifique et est applicable darts les cas off le test de Coombs direct est positif (voir discussion).
DIAGNOSTIC DES H N P PAR AGGLUTINATION E N GEL
145
DISCUSSION Les anticorps monoclonaux dirig6s contre les glycoprot6ines membranaires li6es h la membrane par une liaison GPI repr6sentent des outils de choix pour le diagnostic des h6moglobinuries nocturnes paroxystiques [8, 10, 16, 17, 19]. Ces anticorps sont g6n6ralement utilis6s dans des techrdques de cytom6trie en flux et permettent l'analyse des diff6rentes cellules du sang p6riph6rique affect6es dans ce syndrome. Les anti-DAF (CD55) et anti-MIRL (CD59) sont les plus couramment employ6s, du moins pour l'analyse de l'expression de ces marqueurs sur les 6rythrocytes. Au cours d'un travail pr6c6dent [8], nous avons montr6 que l'anticorps NaM16-4D3 (CD55 de classe IgG) permettait un diagnostic rapide des HNP par cytom6trie en flux, l'expression du DAF 6tant abaiss6e en corr61ation avec les tests en milieu acidifi6 et au sucrose positifs. Parall61ement, 48 patients souffrant de divers syndromes h6molytiques avaient 6t6 analys6s ; l'expression du DAF ayant 6t6 trouv6e faiblement abaiss6e darts deux cas sans concordance avec les tests d'h6molyse. Nos travaux tr~s r6cents montrent qu'un abaissernent isol6 du DAF, sans abaissement concomitant du MIRL et du LFA-3 (antig6ne CD58), peut 6tre observ6 chez quelques patients non H N P; le diagnostic de HNP devant 6tre assur6 par l'analyse de l'expression du DAF et du MIRL 6rythrocytaire et granulocytaire (J.M. Navenot, D. Bernard, J.L. Harousseau, J.Y. Muller et D. Blanchard ; manuscrit en pr6paration). L'investigation des polynucl6aires est particuli6rement importante pour les patients r6cemment transfus6s puisque ces cellules ne sont pas quantitativement modifl6es par transfusion de concentr6s globulaires. L'anticorps NaM16-4D3 (CD55) a 6galement 6t6 utilis6 dans un test d'agglutination en flux continu en pr6sence de polybr~ne [8]. Par cette m6thode, une double population 6rythrocytaire a 6t6 not6e dans tousles cas de HNP, corr61ant avec les r6sultats obtenus par cytom6trie en flux. Cependant, l'agglutination 6tait anormale pour 10 des 48 patients non HNP analys6s et le test ne pouvait pas 6tre appliqu6 anx malades avec un test de Coombs positif puisque leurs h6maties 6taient directement agglutin6es en milieu contenant du polybr6ne. Les anticorps monoclonaux de classe IgM permettent de paUier ce problbme technique puisqu'ils permettent tune agglutination en milieu salin. De ce fait, les anticorps NaM125-7H10 (CD55) et NaM123-6GI2 (CD59) ont 6t6 exp6riment6s dans la technique d'agglutination en gel qui permet de visualiser les doubles populations 6rythrocytaires. Dans le travail pr6sent6, 10 6chanfillons de sang provenant de 9 patiems HNP ont 6t6 analys6s comparativement en cytom6trie en flux indirecte, utflisant les CD55 et CD59 de classe IgG faiblemem agglutinants, et en agglutination en gel (plaques NaC1 DiaMed) avec les anticorps de classe IgM. Une bonne corr61ation a 6t6 observ6e entre les deux tests; la qualit6 des ceUules non agglutin6es (estim6e visuellement) 6tant globalement 6quivalente au pourcentage des 6rythrocytes CD55-/CD59-. Les 24 patients non
146
NAVENOT J.M. et coll.
H N P 6tudi6s paraUblement ont m o n t r 6 u n profil d'agglutination normal, d 6 m o n t r a n t la sp6cificit6 de la m6thode. Par observation visuelle des gels, il est possible de d6celer sans ambiguit6 les cas de H N P p o u r lesquels de l ' o r d r e de 5 / : 10 % des 6rythrocytes sont CD55-/CD59-. Dans les cas de H N P que nous avons 6tudi6s, le p o u r c e n t a g e des ceUules CD55-/CDSgvariant de 10 ~ 60 %, le diagnostic de H N P pouvait 6tre confirm6 p a r ce test simple et rapide d'agglutinafion en gel. Le test p e u t ainsi 6tre utilis6 en routine p o u r les malades dont la maladie de Machiafava-Micheli est 6voqu6e. Dans le cas de positivit6 du test, une cytom6trie en flux utilisant les CD55 et CD59 doit ~tre effectu6e p o u r la quantification des cellules positives et n6gatives. Nous r e c o l n m a n d o n s d'6tendre l'analyse cytom6trique aux polynucl6aires, au moins dans le cas off des transfusions r6centes ont 6t6 effectu6es.
CONCLUSION En d6finifive, l'utilisation d ' a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x dirig6s contre les glycoprot6ines DAF et M I R L p e r m e t u n diagnostic biologique rapide des HNP. Les anticorps NaM125-7H10 (anti-DAF, CD55) et NaM123-6G12 (anti-MIRL, CD59) de classe IgM, s61ecfionn6s p o u r leur capacit6 /: agglutiner les 6rythrocytes n o r m a u x en milieu salin, p e r m e t t e n t l'identification rapide (environ 30 minutes) des 6rythrocytes CD55- et CD59-. Les anticorps NaM16-4D3 (CD55) et NaM77-1E5 (CD59) de classe IgG p e r m e t t e n t quant ~t eux la quantification des ceUules (6rythrocytes et polynucl6aires) n o r m a u x et a n o r m a u x p a r cytom6trie en flux. Ces deux m 6 t h o d e s compl6mentaires repr6sentent lane aide pr6cieuse p o u r le clinicien, en parficulier dans les cas off les clones ceUulaires a n o r m a u x (incapables d ' a s s e m b l e r les c o m p o s a n t s du lien GPI) sont minoritaires.
remercions les praticiens hospitaliers des h6pitaux de Bayonne, Brest, Nantes, Poitiers, La Roche-sur-Yon et Saint-Nazaire, en parficulier le Pr HAROUSSEAU(CHR, Nantes), qui nous ont permis de coUecter les 6chantillons de sang des patients 6tudi6s. REMERCIEMENTS. -- NOLIS
REFERENCES
[1] CAMPBELLA.M. - Monoclonal antibody technology. In : Burdon R.H., Van Knippenberg P.H., Laboratory techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Amsterdaml Elsevier, 1984. [2] CROSBYW.H. - Paroxysmal nocturnal heamoglobinuria. Specific test of disease based on ability of thrombin to activate hemolytic factor. Blood, 1950 5, 843-848. [3] DAClEJ.V. - Diagnostic and mechanism of hemolysis in chronic hemolytic anemia with nocturnal hemoglobinuria. Blood, 1949, 4, 1183-1188.
DIAGNOSTIC DES HNP PAR AGGLUTINATION EN GEL
147
[4] DANIELS G. - Cromer-related antigens. Blood group determinants on Decay-Accelerating factor. Vox Sang, 1989, 56, 205-211. [5] DEEG M.A., HUMPHREY D.R., YAN6 S.H., FERGUSONT.R., REINHOLDV.N., ROSENBERRY T.L. - Glycan components in the glycoinositol phospholipid anchor of h u m a n erythrocyte acetylcholinesterase. 1. Biol. Chem., 1992, 267, 18573-18580. [6] DREYFUS B. - H6moglobinurie nocturne paroxystique. In: Dreyfus B.,
H~matologie, Paris, Flammarion Mddecine Sciences, 1988, 342-350. [7] FLETCHERA., BRYANTJ., YUANF.F. - An N-glycosylated 20 kD protein on the surface of the erythrocyte membrane is expressed on other peripheral blood cells. / n : Chester M.A., Johnson U., L6w B., Messeter L., Samuelsson B., Proceedings of the Second International Workshop and Symposium on Monoclonal antibodies against h u m a n red blood cells and related antigens, Sweden, Lund, 1990, 131. [8] GUIMBRETIERE L., BERNARD D., MAISONNEUVEH., HAROUSSEAUJ.L., GUIMBRETIERE J., MULLER J.Y., BLANCHARD D. - Diagnostic de l'h6moglobinurie nocturne paroxystique : utflisation d ' u n anticorps monoclonal dirig6 contre la glycoprot6ine DAF (Decay Accelerating Factor). Presse M4d., 1993 (sous presse). [9] HAM T.H. - Chronic hemolytic anemia with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. A study of the mechanism of hemolysis in relation to acid-base equilibrium. N. Engl. Z Med., 1937, 217, 915. [10] KAWAKAWIZ., NINOMIYA H., TOMIYAMAJ_, TSUKASA A. - Deficiency of glycosyl-phosphatidylinositol anchored proteins on paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) neutrophils and monocytes: heterogeneous deficiency of decay-accelerating factor (DAF) and CDI6 on PNH neutrophils_ Brit. Y. Haematol., 1990, 74, 508-513. [11] LATRONF., BLANCHARDn., CARTRONJ.P. - Immunochemical characterization of the h u m a n blood cell membrane glycoprotein recognized by the monoclonal antibody 12E7. Biochem. Y., 1987, 247, 757-764. [12] LOIRATM.J., GOURB1LA., FRIOUXY., MULLERJ.Y., BLANCHARDD. - A routine monoclonal antibody directed against the Gerbich 3 blood group antigen. Vox Sang., 1992, 62, 45-48. [13] Low M.G. - Biochemistry of the glycosyl-phosphoinositol membrane protein anchors. Biochem. Y., 1987, 244, 1-13. [14] RossE W.F. - The control of complement activation by the blood cells in paroxysmal hemoglobinuria. Blood, 1986, 67, 268-269. [15] ROSSEW.J. - Phosphatidylinositol-linked proteins and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood, 1990, 75, 1595-1601. [16] RossE W.J., HOFFMANS., CAMPBELLM., BOROWlTZM., MOORE J.O., PARKER C.J. - The erythrocytes in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria of intermediate sensitivity to complement lysis. Brit. J. Haematol., 1991, 79, 99-107. [17] SCHUBERT J., ALVARADO M., UCIECHOWSKI P., ZIELINSKA-SKOWRONEKM., FREUND M., VOGT S., SCHMIDT R.E. - Diagnosis of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria using immtmophenotyping of peripheral blood cells. Brit. J. Haematol., 1991, 79, 487-492. [ 18] TANNERM.J.A., ANSTEED.J., MAWBYW. - A new h u m a n erythrocyte variant (Ph) containing an abnormal sialoglycoprotein. Biochem. Z, 1980, 187, 493-497. [19] VAN DER SellOUT C.E., HUIZlNGA T.W.J., VAN'T VEER-KORTHOF E.T., WIJMANS R., PINKSTERJ., VON DEM BORNE A.E.G_Kr. - Deficiency of glycosyl-phosphatidylinositol-linked m e m b r a n e glycoproteins of leucocytes in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, description of a new diagnostic cytofluorometric assay. Blood, 1990, 76, 1853-1859.