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Effet des inhibiteurs de groupes SH sur le transport du phosphate chez Chlorella pyrenoidosa
BIOCHIMIE, 1975, 57, 383-390.
Effet des inhibiteurs de groupes SH sur le transport du phosphate chez Chlorella pyrenoidosa. R o b e r t JEANJEAN, A n n i c k HOURMANT (*) et Gaston DUCET ~,~. Laboratoire de Physiologic Celhdaire associ~ an C.N.R.S. (L.A. 8~), Centre Universitaire Marseille-Luminy, 70, route L~on Lachamp, 13288 MarseilIe Cedex 2.
(12-12-1974). Summary. - - The effect of Sulphydryl reagents have been investigated, pCMB inhibits the transport of phosphate in Chlorella pyrenoidosa. This inhibition is imnmediate and does not change as a function of time of incubation. This inhibition affects non starved and starved cells (phosphate omitted), pCMPS and Mersalyl act in the same manner as pCMB. ~Vhen these compounds are used at low concentrations, inhibition of phosphate uptake is observed only in starved cells. The substrate (phosphate) cannot provide protection against this inhibition. NEM inhibits phosphate uptake and this inhibition increases as a function of time of incubation. When the time of incubation is very short (about 15 seconds) the effects seems to be superficial and NEM reacts with S H groups invoL'ed in the transport system. When phosphate is present (for 15 seconds of incubation w i t h NEM) the inhibition is less important than when phosphate is omitted. The substrate protects against NEM, but this protection disappears as the incubation with N E ~ is prolonged. NEM inhibits phosphate uptake in non starved and starved cells, however, it is observed that the inhibition is less important in starved cells than in non starved cells. The authors conclude that two kinds of SH groups might exist in the phosphate transport system, one reacting with pCMB and the other with NEM.
Les grou,pes t h i o l s s e m b l e n t a v o i r u n e g r a n d e i m p o r t a n c e au n i v e a u m e m b r a n a i r e . Aussi, les i n h i b i t e u r s de ces g r o u p e s s o n t c o u r a m m e n t utilis6s d a n s les 6tudes d u t r a n s p o r t de s u b s t a n c e s m i n 6 r a l e s ou o r g a n i q u e s , c o m m e celles de M i t c h e l l [1] p o u r l ' a b s o r p t i o n du p h o s p h a t e c h e z Micrococcus pyogenes, de K e p e s [2] et de K e n n e d y et F o x [3] s u r la p e r m 6 a s e du l a c t o s e c h e z Es~t~erichia colt. P l u s r 6 c e m m e n t , l ' a c t i o n de ces i n h i b i t e u r s a s e r v i de b a s e h route un,e s6rie de t r a v a u x s u r le t r a n s p o r t d u p h o s p h a t e on des a c i d e s d i c a r b o x v l i q u e s ~ t r a v e r s la m e m b r a n e m i t o c h o n , d r i a l e (4,
5,6,7,8]. Nos t r a v a u x s u r l ' a b s o r p t i o n du p h o s p h a t e p a r les e h l o r e l l e s [10, 11, 12] n o u s o n t c o n d u i t s h des 6tudes s i m i l a i r e s q u i s o n t r a p p o r t 6 e s d a n s ce mdmoire. MATERIEL ET METHODES.
Matdriel : Nos e x p 6 r i e n e e s o n t 6t6 f a i t e s s u r Chlorella pyreno'idosa (var. L e f 6 v r e ) , c u l t i v $ e s s e l o n des m 6 t h o d e s d6j~ d 6 c r i t e s [9, 10]. <) A qui toute eorrespondance dolt Stre adressde. (*) Laboratoire de Physiologic Vdgdtale, Facultd des Sciences, Universit6 de" Bretagne Occidentale, 29283 Brest, Cedex.
M~thodes : Les C h l o r e l l e s p r o v e n a n t d ' u n m i l i e u c o m p l e t ( a v e c p h o s p h a t e ) s o n t c e n t r i f u g 6 e s , lav6es, e e n t r i f u g 6 e s de n o u v e a u et r e m i s e s en susp e n s i o n d a n s u n m i l i e u sans p h o s p h a t e (h p H 6,6). Apr6s 5 minutes d'attente, du p h o s p h a t e (K2HPO 4 h la c o n c e n t r a t i o n f i n a l e : 2,5.10 -5 M) m a r q u 6 p a r a2p, est i n j e c t 6 et des p r 6 1 6 v e m e n t s s o n t effectu6s jusqu'A d i x m i n u t e s . Les c i n 6 t i q u e s d'absorption, lin~aires pendant cette p 6 r i o d e , p e r m e t t e n t de d 6 t e r m i n e r les v i t e s s e s de t r a n s p o r t q u i s o n t r a p p o r t 6 e s a u n o m b r e de c e l l u l e s (mesur6 p a r un c o m p t e u r de e e l l u l e s C o u l t e r ) o u h la d e n s i t 6 o p t i q u e des c e l l u l e s ( d 6 t e r m i n 6 e 546 n m a v e c u n S p e c t r o p h o t o m b t r e E p p e n d o r f ) . Ces e x p 6 r i e n e e s o n t l i e u ~ la l u m i 6 r e et h la temperature d e 29"C. Des 6tudes p r b l i m i n a i r e s [10] ont m o n t r 6 q u e des c o m p o s 6 s tels q u e le M e r s a l y l , le p C M B " et le p C M P S " i n h i b a i e n t p r e s q u e i m m 6 d i a t e m e n t le t r a n s p o r t d u p h o s p h a t e c h e z des C h l o r e l l e s p r 6 a l a b l e m e n t c a r e n c 6 s en p h o s p h a t e p e n d a n t q n a t r e h e u r e s . Cette a c t i o n v a r i a i t p e n en f o n c t i o n du t e m p s de c o n t a c t a v e c l ' i n h i b i t e u r , p o u r des t r a i *pCMB : p-Chloromercuri benzoate *pCMPS : p-chloromercuripht!nyl sulfonate *NEM : N-Ethylmaldimide.
~ produits , Sigma
R. Jean jean, A. Hourmant
384
t e m e n t s n ' e x e 6 d a n t pas 8 "h 10 minutes. Dans le pr6sent travail, les contacts c e l l u l e s - i n h i b i t e u r s n ' o n t jamais 6t6 sup6rieurs "~ 10 m i n u t e s et le mSme p r o c e s s u s a 6t6 adopt6 p o u r l'Iodoae6taminde. La d i m i n u t i o n des vitesses de t r a n s p o r t en f o n c t i o n du t e m p s de contact a v e r la NEM* est progressive. Pour arr6ter imm6diatement Faction de cet i n h i b i t e u r , un exc~s de eyst6ine (5 fois plus e o n e e n t r 6 e que la NEM) est inject6 aprbs d i v e r s temps de contact, selon la m O h o d e utilis6e p a r Debise et D u r a n d [7]. Apr6s les t r a i t e m e n t s aux i n h i b i t e u r s , les cellules sont eentrifug6es, lav6es et r e m i s e s en suspension dans un m i l i e u sans p h o s p h a t e , et les vitesses de t r a n s p o r t du p h o s p h a t e sont mesur6es selon le p r o t o c o l e d6fini p r6c6demment. Les r6sultats sont e x p r i m 6 s en activit6 r6sid u d l e p o u r les e x p 6 r i e u c e s r6alis6es avec les compos6s m e r c u r i a u x et en p o u r c e n t a g e d ' i n h i b i tion p o u r celles effeetu6es avec la NEM. Ces deux m o d e s d ' e x p r e s s i o n ont 0 6 utilis6s c a r dans le cas des compos6s m e r c u r i a u x des stimulations sont p a r f o i s observ6es, et ceci n'est ais6lnent e x p r i m 6 q u ' e n t e r m e d ' a e t i v i t 6 r6siduelle. RESULTATS. 1 - - Action du pCMB, pCMPS, Mersalyl et Iodoae6tamide. a) Sur les Chlorelles cultiv6es en pr6sence de phosphate. A faibles doses (inf6rieure ou 6gale h 10 -4 M), seul, le pCMB i n h i b e le t r a n s p o r t du p h o s p h a t e ehez les Chlorelles, landis que p o u r ces m~.mes c o n c e n t r a t i o n s , les autres i n h i b i t e u r s n ' o n t aucun effet e t s e r6v61ent m~me O r e 16gbrement stimulateurs (tableau 1A).
TABLEAU ].
E f f e l de divers inhibiteurs des groupes s u r le transport du p h o s p h a t e par les Chlorelles. A - - Effet des i n h i b i t e u r s sur les cellules non carenc~es en p h o s p h a t e . concentration en moles lnhibiteur 1~4 pCMP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . pCMPS . . . . . . . . . . . . . . . . . Mersalyl . . . . . . . . . . . . . . . . lodoae6tamide . . . . . . . . . . .
BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 3.
73
48
114 120 114
5.10-~ t0-3
--
70
5
58 85 70
et G. D u c e l .
B -Effet des i n h i b i t e u r s sur les eellules carenc6es p e n d a n t 4 h e n p h o s p h a t e .
concentration en moles Inhibiteur
pCMB . . . . . . . . . . . . . . . pCMPS . . . . . . . . . . . . . . Mersalyl . . . . . . . . . . . . . .
10-~
10-~
10-3
75 68 80
4O 55 67
8 32 39
(Le noml)re de cellules est voisin de 5.106 eell/ml pour tous les traitements). Les rOsultats sont exprim6s en poureentage par rapport au t6moin (activit6 r~siduelle). C - - Effet des pCMB (10 -4 M) en f o n c t i o n de la densit6 de eellules trait6es. Nombre de cellules par m 1
Activit6 r6siduelle
5,8 10'* 1,16 107 1,70 107
48 65 80
Ces i n h i b i t e u r s sont r6put6s p e u p6n6trants et a v o i r un.e action superficielle. Ceei e x p l i q u e r a i t que dans le cas du pCMB, l ' i n h i b i t i o n est f o n c t i o n du n o m b r e de eellules pr6sentes (tableau 1 C). La p r 6 s e n e e de P h o s p h a t e (2'.10 -3 M) p e n d a n t le t r a i t e m e n t p a r le p,CMB (10 -4 M) ne modifie pas i i n h i b i t i o n ; le P h o s p h a t e n ' a done a u e u n effet p r o t e e t e u r . I1 e n e s t de m6me p o u r le pCMPS, le Mersalyl et l ' I o d o a e 6 t a m i d e utilis6s h fortes doses (10-~ M). b) Sur les cellutes earenc6es en Phosphate. C o n t r a i r e m e n t h ee qui a 6t6 observ6 ehez les cellules normales, les r6sultats du t a b l e a u I B m o n t r e n t qu'h faibles doses, pCMPS et Mersalyl i n h i b e n t le t r a n s p o r t chez Ies Chlorelles pr6alab l e m e n t earene6es en p h o s p h a t e p e n d a n t quatre heures. La sensibilit6 au pCMPS et au Mersalyl se d6velopp.e en f o n c t i o n de la dur6e de la e n t e n t e en p h o s p h a t e (tableau I[ A) tandis que la sensibilit6 au pCMB ne se modifie gubre. Celte sensibilit6 p a r a i t surtout se d 6 v e l o p p e r aprbs d e u x h e u r e s de earenee, c o m m e le m o n t r e la figure 1 p o u r l ' a e t i o n du PCMPS. L ' a b s e n e e de p h o s p h a t e dans le m i l i e u de culture se t r a d u i t p a r une a u g m e n t a t i o n de la vitesse de t r a n s p o r t du p h o s p h a t e qui se stabilise apr6s 4 h 5 heures de earence. Cet a c e r o i s s e m e n t de la vitesse est, selon toute v r a i s e m b l a n c e , li6 ~ une synth6se a c c r u e du systbme de t r a n s p o r t [11],
385
I n h i b i t e u r s de S H et t r a n s p o r t d u p h o s p h a t e . d o n e les g r o u p e s t h i o l s i m p l i q u 6 s d a n s le t r a n s port doivent 6tre plus nombreux ; mats l'inhibit i o n p r o v o q u d e p a r le p C M P S et le M e r s a l y l n e peut expliquer que par un ehangement d'aecessibilit& I n v e r s e m e n t , l o r s q u e d u p h o s p h a t e est a j o u t d h d e s c e l h f i e s c a r e n e d e s 24 h e u r e s , la s e n s i b i l i t 6 a u p C M P S ( t a b l e a u I I B) d i m i n u e . C e c i est c o n e o -
B) Disparition de la sensibilitd au pCMPS (10-', M) des celhdes pr~aIablement carenc~es en phosphate p e n d a n t 2~ heures, aprbs addition de phosphate (5.10-~ M). Temps en heures apr~s l'addition de phosphate
40 74 89 118
Vr
SjSs ~
I00 I
! I I
p.100 p.100 p.100 p.100
A divers temps, les eellules sont traitdes au pCMPS, puis les mesures des vitesses d ' a b s o r p t i o n sont effectudes.
1
I
Activitd rdsiduelle apr~s traitement au pCMPS
I
mitant d'une diminution des vitesses de transport d u p h o s p h a t e q u i p e u t ~tre a t t r i b u d ~t u n e d d g r a dation du systbme de transport eessant 4 h 5 h e u r e s a p r b s l ' a d d i t i o n d e p h o s p h a t e [12!.
I 500 2
II --
A c t i o n d e la N - d t h y l m a l d i m i d e .
L a N E M est g d n d r a l e m e n t c o n s i d d r d e c o m m e u n r d a c t i f c a p a b l e d e p 6 n 6 t r e r d a r t s les c e l l u l e s , c o n trairement aux autres inhibiteurs prdcddemment u t i l i s d s . C e p e n d a n t , il est p o s s i b l e q u e p o u r d e s traitements brefs, Faction de la NEM demeure s u p e r f i c i e l l e . I1 est d o n e n d c e s s a i r e d e c o n t r 6 1 e r a v e c p r 6 c i s i o n la d u r d e d ' a c t i o n d e ce c o m p o s &
50
o~
100
a) I n f l u e n c e d e la d u r d e d e t r a i t e m e n t ~ la NEM. 1
2
4
nurAe
de
L a d u r d e d ' a c t i o n d e la NEM, e o n t r 6 1 d e p a r a d d i t i o n d e c y s t d i n e e n l a r g e e x c b s , a dl~ ~ t u d i ~ e pour des temps infdrieurs h 5 minutes, temps
6
la
carence
en
h,
Fro. 1. - - Influence du PCMPS sur les oitesses d'absorption pendant la carence en phosphate. Courbe 1 : a u g m e n t a t i o n des vitesses d ' a b s o r p t i o n ; courbe 2 : vitesses d ' a b s o r p t i o n apr6s t r a i t e m e n t a n PCMPS ; eourbe 3 : poureentage &'inhibition des vitesses d'absorption, Vr : vitesses d ' a b s o r p t i o n en p r e n a n t 1,es vitesses d ' a b s o r p t i o n des ehlorelles n o n carenedes comme tdmoin.
~I001
! /
T ~ L E A V II. A) Sensibilit~ aux inhibiteurs des groapes thiols en fonetion de la dar~e de carence en phosphate. Durde de la careBce en heures
Iuhibiteur (t0 4 M)
pCMB . . . . . . . . . . . . pCMPS . . . . . . . . . . . Mersalyl . . . . . . . . . .
50
40 110 108
! 1
97 102
85 92
60 81
61 86
Rdsultats exprimds en pourcentages d'activitd rdsiduelle par rapport au tdmoin (~ I00).
BIOCHIMIE, 1975, 57, n ~ 3.
,A I I 2 3 4 Dur~e d e t r a i t e m e r l t
I 5 (ran)
FI6. 2. - - Influence de la durde de traitement & la NEM sur l'inhibition du transport du phosphate. Courbe 1 : C o n c e n t r a t i o n en NEM : 2.10-5 M. Courbe 2 : C o n c e n t r a t i o n en NEM : 5.10-5 M. 28
R. Jean jean, A. H o u r m a n t et G. Ducet.
386
pour lesquels seules des modifications quantitat i r e s se m a n i f e s t e n t s u r la e i n ~ t i q u e d ' e n t r ~ e d u p h o s p h a t e . A p r ~ s 5 m i n u t e s d e c o n t a c t a v e e la NEM, les c o u r b e s d ' a b s o r p t i o n d u p h o s p h a t e e n fonction du temps ne sont plus lin6aires.
m a n i f e s t e d6s le d 6 b u t d u c o n t a c t , elle r e s t e d u m ~ m e o r d r e de g r a n d e u r p e n d a n t les p r e m i 6 r e s s e c o n d e s ( T a b l e a u I I I A ) , p u t s elle a u g m e n t e p r o -
.o 101
.'2
TABLEAU III. A - - A c t i o n de la N E M (h 2.10 -5 M e t 5.10-5 M), en [ o n c t i o n d u t e m p s de t r a i t e m e n t ( d e n s i t d de 7,51,06 c e l l M e s / m l ) . B - - A c t i o n d e la N E M (5.10-5 M) en f o n c t i o n d u t e m p s de t r a i t e m e n t , t r a i t e m e n t effectual avec 2 d e n s i t ~ s de celIules.
5C
Durde de traitement t~ll S~OGgl~es
NEM en M
2 . 1 0 -'~
5.10-~
5
10
t5
61 42
62 2,9
4t~
64
lO7
z~d
Nombre
Dur~e du traitement Densit~ de cellules t 5 mn
5"
~0"
15"
47
4;
501010
Z(T-J
4.10 ~ cellules/ml 1. 410 ~ cellules / ml
A, B : r6suItats exprimfis en activit6 r6siduelle.
/ml
de cellules
Fla. 4. - - Influence de la quantitd de eel/ales sur l'inhibition da transport du phosphate par la NEM (temps de t r a i t e m e n t de 15 s econdes).
gressivement. Nous avons done eonsid6r6 que p e n d a n t ee l a p s d e t e m p s , F a c t i o n d e l a N E M 6 t a i t d e n a t u r e p u r e n l e n t s u p e r f i c i e l l e . P a r la s u i t e , les d i v e r s e s e x p ~ r i e n e e s o n t 6t6 e f f e e t u 6 e s a v e e d e s t r a i t e m e n t s d e l ' o r d r e d e 15 s e c o n d e s .
"2"100
53 .c
100 50,
/.
2 h=
55
~o! 4
5.16' 5 Concentration
en N E M
(M.)
FIa. 3. - - Action d'un lraitement de 15 seeondes it la NEM d dioerses concentrations sur l'inhibition du transport da phosphate.
50
L__ !
I
I
I
3
L e s r 6 s u l t a t s (fig. 2) m o n t r e n t q u e l ' i n h i b i t i o n e r o l t e n f o n e t i o n d e la d u r g e d u t r a i t e m e n t h l a N E M ; l ' i n h i b i t i o n e s t d ' a u t a n t p l u s f o r t e q u e la c o n c e n t r a t i o n e n N E M est 61ev6e. L ' i n h i b i t i o n se BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 3.
I
I
--3
10
5.10 Concentration
en Phosphate
(M)
Fro. 5. - - E f f e t proteeteur de diffdrentes concentrations en phosphate au coors d'un traitement de 15 secondes d la NEM (5.10-5 M) ois-?t-ois de l'inhibition da transport du phosphate.
I n h i b i t e u r s de S H et t r a n s p o r t d u p h o s p h a t e . b) E f f e t d e d i f f 6 r e n t e s c o n c e n t r a t i o n s
e n NEM.
L e s r 6 s u l t a t s d e la f i g u r e 3 f o n t a p p a r a i t r e q u e , p o u r u n e d u r 6 e d e t r a i t e m e n t d e 15 s e c o n d e s l ' i n h i b i t i o n c r o i t e n f o n c t i o n d e la c o n c e n t r a t i o n e n NEM.
100 Jo am
Q
ss S
+ p
~
I/ / ,
,
53~ 5
1~5
1~ 4
Concentration
e:l
NFM
(M~)
Fro. 6. - - Action de diffdrentes concentrations en NEM sur le transport du phosphate. T r a i t e m e n t s de 15 seeondes h ]a NEM r6alis6s en l'absence ( • -...... • ) ou en pr6senee de p h o s p h a t e (2.10-3M) ( . - - . ) ,
100
s u p e r f i c i e l l e et d o n c m e l n b r a n a i r e p o u r d e s t r a i t e m e n t s de t r 6 s c o u r t e s d u r 6 e s ( t a b l e a u I I I B). d) P r o t e c t i o n p a r le p h o s p h a t e
min6ral.
De n o m b r e u x a u t e u r s [3, 6, 7] o n t m i s e n 6vid e n c e q u e le s u b s t r a t p o u v a i t a v o i r u n effet p r o t e c t e u r v i s - h - v i s d e la NEM. Dans cette optique, du phosphate ~ diverses c o n c e n t r a t i o n s est i n t r o d u i t d a n s le m i l i e u a v a n t u n t r a i t e m e n t d e 15 s e c o n d e s ~ la NEM. L e s r 6 s u l t a t s (fig. 5) m o n t r e n t q u e l ' i n h i b i t i o n d i m i n u e a v e c les c o n c e n t r a t i o n s c r o i s s a n t e s e n p h o s p h a t e atu-delh d e 10 -4 M. A i n s i a p p a r a i t u n e c e r t a i n e p r o t e c t i o n d u s y s t b m e d e t r a n s p o r t p a r le s u b strat.
3)
s" 50
387
De p l u s , la f i g u r e 6 m o n t r e q u e cet effet p r o t e c t e u r se m a n i f e s t e p o u r d e s t r a i t e m e n t s d e 15 s e c o n d e s "~ d i v e r s e s c o n c e n t r a t i o n s e n NEM. L a figure 7 rassemble de tr6s nombreux r6sultats c o n c e r n a n t la p r o t e c t i o n li6e a u p h o s p h a t e . N o u s a v o n s e a l e u l 6 la q u a n t i t 6 d e N E M p r 6 s e n t e p a r c e E u l e d e C h l o r e l l e et les c o u r b e s t r a c 6 e s d o n n e n t u n e b o n n e i d 6 e d e la p r o t e c t i o n e x e r c 6 e p a r le phosphate sur l'inhibition. Cependant, retie protection, nette pour des t e m p s d e c o n t a c t d e 15 s e c o n d e s , d i s p a r a i t p r o -
1 oOOo
• eoe oe • oe * ~ 5O
• •
•
•
•
•
•
•
Fro. 7. - - Sur cette figure est repr6sent6e ['inhibition en fonetion de la q u a n t i t 6 de NEM exprimde en t e n a n t compte de la q u a n t i t 6 de eellules pr6sentes p e n d a n t le t r a i t e m e n t .
2°
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~o • °
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Courbe 1 : T r a i t e m e n t en l'absence de phosphate ;
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14
3.10
de NEM
c) I n f l u e n c e d e la d e n s i t 6 d e c e l l u l e s . A l ' e x e m p l e d e c e q u i est o b s e r v 6 a v e c le p C M B , p o u r u n e c o n c e n t r a t i o n d o n n 6 e e n N E M et u n e d u r 6 e d ' a c t i o n d e 15 s e c o n d e s , l ' i m p o r t a n c e d e l ' i n h i b i t i o n d 6 p e n d d e la d e n s i t 6 d e c e l l u l e s (fig, 4 et t a b l e a u I I I B). L ' i n h i b i t i o n est d ' a u t a n t p l u s m a r q u d e q u e le n o n l b r e d e c e l l u l e s est f a i b l e . Ceci p l a i d e e n f a v e u r d ' u n e a c t i o n e s s e n t i e l l e m e n t
BIOCHIMIE, ~ 1 5 , 57, n ° 3.
I
g r e s s i v e m e n t l o r s q u e la d u r 6 e d e t r a i t e m e n t augm e n t e (fig. 8). L a r e p r 6 s e n t a t i o n s e m i l o g a r i t h m i q u e m o n t r e q u ' e n a b s e n c e de p h o s p h a t e l ' i n h i b i t i o n p a r la N E M est b i p h a s i q u e : h u n e i n h i b i tion quasi instantan6e succbde une inhibition p l u s l e n t e q u i p o u r r a i t 6tre d u p r e m i e r o r d r e . P a r c o n t r e e n p r 6 s e n c e de p h o s p h a t e , l ' i n h i b i t i o n i n s t a n t a n 6 e est b e a u c o u p p l u s f a i b l e , l ' i n h i b i t i o n lente complexe, n'est pas du premier ordre.
R. J e a n jean, A. H o u r m a n t et G. Ducet.
388
e) E t u d e d e l a s e n s i b i l i t ~ fi l a N E M e n f o n c t i o n d e la d u r 6 e d e c a r e n c e e n p h o s p h a t e . Pr6c6demment, nous avons fait 6tat d'un d6veloppement d e l a s e n s i b i l i t 6 a u p G M P S et a u M e r s a l y l e n f o n c t i o n d e la d u r 6 e d e c a r e n c e e n p h o s phate. Nous avons repris cette 6ttrde avec la NEM.
DISCUSSION. a) A c t i o n Pour semble
en surface.
des temps de contact tr~s brefs, la NEM agir uniquement h la s u r f a c e c e l l u l a i r e
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Dur~e de la carence e n h. Fro. 9. I n f l u e n c e de la N E M szzr les v i t e s s e s d'abs o r p t i o n p e n d a n t la carence en p h o s p h a t e . Courbe 1 : augmentation des vitesses d'absorption. Courbe 2 : vitesses d'abs.orption apr~s un traitement h la NEM. Courbe 3 : pourc,entage d'inhibition des vitesses el'absorption. Vr : v i t e s s e s d ' a b s o r p t i o n en p r e n a n t les v i t e s s e s d'absorption des Ch]orelles non carencdes comme t~moin. -
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Fro. 8. I n f l u e n c e de la d u r o c de t r a i t e m e n t & la NEM sur l'inhibition du transport du phosphate. (.- ....... .) T r a i t e m e n t en l ' a b s e n c e de p h o s p h a t e • {" ') T r a i t e m e n t e n pr~s,ence de p h o s p h a t e . E n en,cart, e s t r e p r d s e n t ~ e e n s e m i - ] o g , l ' a c t i v i t 6 r 6 s i d u e l l e d ' a b s o r p t i o n e n f o n c t i o n d u t e m p s de c o n t a c t a v e c la NEM. -
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-5 10 La figure 9 montre que, co.ntrairement aux r6sultats obtenus a v e c le p C M P S et le M e r s a l y l , l'inhibition d6eroit pendant les deux premibres heures de carence en phosphate; au-delb de ce temps, l'inhibition se maintient constante. Ceci se v6rifie pour les diverses concentrations en N E M (fig. 10). BIOCH1MIE, 1975, 57, n ° 3.
-5 5.10 1()4 Concentration on NEM (M)
FIG. 10. - - I n f l u e n c e de la c o n c e n t r a t i o n en N E M s u r l ' i n h i b i t i o n d u t r a n s p o r t d u p h o s p h a t e s u r les c e l l u l e s carenc3es et n o n carenc3es. L e s t r a i t e m e n t s h ]a NEM s o n t de 15 s e c o n d e s . C o u r b e 1 : ( ....... . ) C h l o r e l l e s n o n c a r e n e d e s . Courbe 2 : ("--") Chlorelles carenc~es 2 henres. ( .... ) Chlorelles earenc~es 4 heures.
I n h i b i t e u r s de S H et t r a n s p o r t du phosph~lte. (influence de la c o n c e n t r a t i o n des cellules sur 1'importance de l ' i n h i b i t i o n , tableau II1, fig. 4), comme cela est p r o b a b l e m e n t le cas avec les i n h i b i t e u r s du type m e r c u r i q u e . Pour des temps d ' i n c u b a t i o n plus longs, la NEM p6n~tre dans les cellules, agit sur d'autres processus cellulaires qui r e t e n t i s s e n t i n d i r e c t e m e n t sur l ' a b s o r p t i o n du phosphate. b) Protection par le substrat. Nous o,bservons une p r o t e c t i o n du systbme de t r a n s p o r t p a r son substrat (phosphate) contre Faction de la NEM, p o u r des t r a i t e m e n t s de br6ves dur6es (fig. 6). Cet effet protecteur, mis en 6videuce darts le t r a n s p o r t du lactose chez Eseherichia colt [3] et plus r d c e m m e n t p o u r le transport du phosphate dans les m i t o c h o n d r i e s [6, 7, 8] peut s ' e x p l i q u e r scion Debise et D u r a n d [7], par une mobilit~ du t r a n s p o r t e u r dans la m e m b r a n e : le phosphate modifiant l ' o r i e n t a t i o n des groupes thiols les r e n d r a i t moths accessibles h la NEM. C e p e n d a n t ces auteurs n ' e x c l u e n t pas u n 6veutuel c h a n g e m e n t de c o n f o r m a t i o n modifiant l'accessibilitd h la NEM. Cette p r o t e c t i o n par le substrat n'est p a s la r6gle g6n6rale et on observe parfois le p h 6 n o m 6 n e inverse d ' u n e s e n s i b i l i s a t i o n ~ l ' i n h i b i t i o n en pr6sence de substrat. Rdccmment, H a g u e n a u e r - Tsapis et Kepes [13] ont m o n t r 6 que dans le transport des Hexoses par E s c h e r i e h i a colt, l ' i n h i b i tion 6tait plus faible q u a n d les cellules avaient subi u n t r a i t e m e n t prdalable p a r l ' i n h i b i t e u r que lorsque inhibiteu,r et substrat 6talent apportds en m~me temps. Ces auteurs s u p p o s e a t que FEnzyme II (impliqude dans le syst6ine de t r a n s p o r t et sensible h la NEM) pr6sente deux 6tats conform a t i o n n e l s . P. V. Vignais et collaborateurs [14] observent que la fixation d'ADP sur le t r a n s p o r teur m i t o c h o n d r i a l pro voque u n d~masquage d ' u n c e r t a i n n o m b r e de groupes SH, et des auteurs a t t r i b u e n t ce ddmasquage h u n c h a n g e m e n t de c o n f o r m a t i o n m e m b r a n a i r e au com-s du transport d'ADP. Ces c h a n g e m e n t s c o n f o r m a t i o n n e l s au cours du t r a n s p o r t p o u r r a i e n t e x p l i q u e r la protection ou la s e n s i b i l i s a t i o n p a r le substrat. Comme par contre, la prdsence de p h o s p h a t e ne modifie pas l ' i n h i b i t i o n provoqu6e p a r le pCMB et le Mersalyl, les groupes thiols rdagissant avec la NEM d o i v e n t ~tre diff6rents de ceux atteints par les co mposds m e r c u r i a u x . L'existence possible de deux types de groupes thiols a d6jh 6td proposde p o u r le syst6me de t r a n s p o r t des acides amin6s p a r certains tissus a n i m a u x [15]. c) I n f l u e n c e de la carence en phosphate. Nos rbsultals m o n t r e n t que le pCMB i n h i b e avec la mbrne intensit6 l ' a b s o r p t i o n du phosphate p o u r
BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 3.
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les ch!orelles issues d ' u n milieu n o r m a l ou p o u r celles issues d ' u n milieu carenc6 en phosphate. Par contre l ' i n h i b i t i o n , par le pCMPS n'est significative qu'apr~s 2 heures de carence du milieu de culture (tableau I[ A) et d i s p a r a i t assez raptd e m e n t apr6s l ' a d d i t i o n de phosphate au m i l i e u carenc6 (tableau I I B ) . Au contraire, l ' i n h i b i t i o n par la NEM d6crolt p e n d a n t les deux premi+res heures de la raise en carence puts se stabilise ensuite. Nous avons montr6 [111 que lors de la carence, l'augmentation de la vitesse de t r a n s p o r t c o r r e s p o n d h u n e a u g m e n t a t i o n du n o m b r e des t r a n s p o r t e u r s p a r cellule et 6galement du h o m b r e de t r a n s p o r t e u r s par unit6 de surface eellulaire. De n o u v e a u x groupes thiols a p p a r a i s s e n t donc en surface, li6s l ' a p p a r i t i o n de n o u v e a u x t r a n s p o r t e u r s et ces groupes r6agissent diff6remment, avec les i n h i b i teurs, de ceux pr6sents sur la surface des chlorelles en croissance sur milieu n o n carenc6. E n particu!ier ces n o u v e a u x groupes thiols semblent avoir une r6activit6 accrue h l'6gard du pCMPS et une r6activit6 plus faible avec la NEM. P o u r essayer de d o n n e r u n e explication a c e s faits, deux hypoth6ses p e u v e n t 6tre 6nonc6es : --Le t r a n s p o r t e u r syntb6tis6 an cours de la carence est diff6rent de celui pr6sent dans les cellules normales. - I1 s'agit d u m(~me type de t r a n s p o r t e n r dont l'accessibilit6 est modifide p a r des r e m a n i e m e n t s m e m b r a n a i r e s li6s ~ la carence en phosphate. Ceci t r a d u i s a n t une certaine h6t6rog6n6it6 memb r a n a i r e comme cela a 6t6 mis en 6vidence sur E s c h e r i c h i a colt [16]. Au cours de la carence, de nouvelles m e m b r a n e s p o u r a i e n t 6tre synthbtis6es et ~tre plus riches en t r a n s p o r t e n r que les a n c i e n n e s et celui-ci dans un e n v i r o n n e m e n t quelque pen modifi6 p o u r r a i t avoir u n e rbactivit6 diffdrente avec les i n h i b i t e u r s de groupes thiols, nos r6sultats ne p e r m e t t e n t pas de choisir parrot ces possibilit6s. Cependant, nos r6sultats i n d i q u e n t que le calcul de Mitchell [1] du n o m b r e des t r a n s p o r t e u r s de phosphate, bas6 sur l ' i n h i b i t i o n p a r le pCMB ne peut 6tre r e t e n u [17~. I1 est c e r t a i n que les i n h i biteurs que nous avons utilis6s r6agissent 6galem e n t avec b e a u c o u p de groupes thiols autres que ceux impliqu6s dans le t r a n s p o r t du phosphate et Gautheron [18] a m o n t r 6 routes les difficultds d ' i n t e r p r 6 t a t i o n du titrage de ces groupes clans les syst6mes m e m b r a n a i r e s . L ' e n s e m b l e des r6sultats acquis diffbre de ceux obtenus chez ChIorella p!lrenoidosa p o u r le transport du sulfate [19]. E n effet, le sulfate prot6ge contre l ' i n h i b i t i o n du t r a n s p o r t p a r le pCMB
It. Jearljean, A. H o u r m a n t et G. Ducet.
390
(10-~ M). De plus, p a r a l l ~ l e m e n t h l ' i n s t a l l a t i o n de la carcnce en sulfate, on observe une augmentation de l ' i n h i b i t i o n par la NEM [20]. Les groupes thiols impliqu6s darts les syst6mes de t r a n s p o r t du phosphate et du sulfate poss~dent done des r~activit6s fort diffbrentes. Des t r a v a u x r6cents o nt 6galement soulign6 le r61e des groupes thiols dans les syst6mes de t r a n s p o r t d ' a n i o n s [21] et de cations [22-23]. Rr}suMg. L'effet des rdactifs des groupes thiols a dt~ dtndi~. Le pCMiB iuhibe le t r a n s p o r t du p h o s p h a t e chez Chtorella pyrenoidosa. Cette inhibition est i m m e d i a t e et ne varie pas en fonction du t e m p s d'incubation. L'inhibition affecte aussi bieo les eellules non carenc6es que certes carene~es en phosphate, Le pCMPS et le Mersalyl agissent de la m~me mani6re. Cependant, q u a n d ces derniers sont utilis~s b~ faihles doses, ils i n h i b e n t le t r a n s p o r t en p h o s p h a t e senlement sur les cellules carencdes. Le s u h s t r a t (phosphate) ne protege pas contre l'effet de ces inhibiteurs. La NEM i n h i b e le t r a n s p o r t du p h o s p h a t e et cette i n h i b i t i o n augmente avee le t e m p s d'incubation. P o u r des t e m p s trgs b r e f s 4'ineubation (de 15 secondes), l'effet semble gtre snperfieie~ et la NEM r6agit avee les groupes SI-I impliqu~s d a n s le t r a n s p o r t . Quand le p h o s p h a t e est prdsent (pour 15 seeondes &incubation), l ' i n h i b i t i o n est m o i n s i m p o r t a n t e que quand, le phosphate est absent. Le s u b s t r a t prot6ge eontre la NEM, mats eette protection disparait q u a n d l'ineubation est prolong@. La NEM inhibe le t r a n s p o r t du phospha~, aussi bien sur les eellules non earen.edes que sur celles earenedes en phosph.ate, eependant, l ' i n h i b i t i o n est m o t h s i m p o r t a n t e p o u r les eellules earenedes. Les a u t e u r s conelt~ent qu'iI p o u r r a i t exister denx sortes de groupes SH impliqu6s dans le syst6me de t r a n s p o r t du phosphate, les uns r6agissant avee le pGMB et les autres a v e c l a NEM.
BIOCHIMIF, 1975, 57, n" 3.
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Effet des inhibiteurs de groupes SH sur le transport du phosphate chez Chlorella pyrenoidosa. R o b e r t JEANJEAN, A n n i c k HOURMANT (*) et Gaston DUCET ~,~. Laboratoire de Physiologic Celhdaire associ~ an C.N.R.S. (L.A. 8~), Centre Universitaire Marseille-Luminy, 70, route L~on Lachamp, 13288 MarseilIe Cedex 2.
(12-12-1974). Summary. - - The effect of Sulphydryl reagents have been investigated, pCMB inhibits the transport of phosphate in Chlorella pyrenoidosa. This inhibition is imnmediate and does not change as a function of time of incubation. This inhibition affects non starved and starved cells (phosphate omitted), pCMPS and Mersalyl act in the same manner as pCMB. ~Vhen these compounds are used at low concentrations, inhibition of phosphate uptake is observed only in starved cells. The substrate (phosphate) cannot provide protection against this inhibition. NEM inhibits phosphate uptake and this inhibition increases as a function of time of incubation. When the time of incubation is very short (about 15 seconds) the effects seems to be superficial and NEM reacts with S H groups invoL'ed in the transport system. When phosphate is present (for 15 seconds of incubation w i t h NEM) the inhibition is less important than when phosphate is omitted. The substrate protects against NEM, but this protection disappears as the incubation with N E ~ is prolonged. NEM inhibits phosphate uptake in non starved and starved cells, however, it is observed that the inhibition is less important in starved cells than in non starved cells. The authors conclude that two kinds of SH groups might exist in the phosphate transport system, one reacting with pCMB and the other with NEM.
Les grou,pes t h i o l s s e m b l e n t a v o i r u n e g r a n d e i m p o r t a n c e au n i v e a u m e m b r a n a i r e . Aussi, les i n h i b i t e u r s de ces g r o u p e s s o n t c o u r a m m e n t utilis6s d a n s les 6tudes d u t r a n s p o r t de s u b s t a n c e s m i n 6 r a l e s ou o r g a n i q u e s , c o m m e celles de M i t c h e l l [1] p o u r l ' a b s o r p t i o n du p h o s p h a t e c h e z Micrococcus pyogenes, de K e p e s [2] et de K e n n e d y et F o x [3] s u r la p e r m 6 a s e du l a c t o s e c h e z Es~t~erichia colt. P l u s r 6 c e m m e n t , l ' a c t i o n de ces i n h i b i t e u r s a s e r v i de b a s e h route un,e s6rie de t r a v a u x s u r le t r a n s p o r t d u p h o s p h a t e on des a c i d e s d i c a r b o x v l i q u e s ~ t r a v e r s la m e m b r a n e m i t o c h o n , d r i a l e (4,
5,6,7,8]. Nos t r a v a u x s u r l ' a b s o r p t i o n du p h o s p h a t e p a r les e h l o r e l l e s [10, 11, 12] n o u s o n t c o n d u i t s h des 6tudes s i m i l a i r e s q u i s o n t r a p p o r t 6 e s d a n s ce mdmoire. MATERIEL ET METHODES.
Matdriel : Nos e x p 6 r i e n e e s o n t 6t6 f a i t e s s u r Chlorella pyreno'idosa (var. L e f 6 v r e ) , c u l t i v $ e s s e l o n des m 6 t h o d e s d6j~ d 6 c r i t e s [9, 10]. <) A qui toute eorrespondance dolt Stre adressde. (*) Laboratoire de Physiologic Vdgdtale, Facultd des Sciences, Universit6 de" Bretagne Occidentale, 29283 Brest, Cedex.
M~thodes : Les C h l o r e l l e s p r o v e n a n t d ' u n m i l i e u c o m p l e t ( a v e c p h o s p h a t e ) s o n t c e n t r i f u g 6 e s , lav6es, e e n t r i f u g 6 e s de n o u v e a u et r e m i s e s en susp e n s i o n d a n s u n m i l i e u sans p h o s p h a t e (h p H 6,6). Apr6s 5 minutes d'attente, du p h o s p h a t e (K2HPO 4 h la c o n c e n t r a t i o n f i n a l e : 2,5.10 -5 M) m a r q u 6 p a r a2p, est i n j e c t 6 et des p r 6 1 6 v e m e n t s s o n t effectu6s jusqu'A d i x m i n u t e s . Les c i n 6 t i q u e s d'absorption, lin~aires pendant cette p 6 r i o d e , p e r m e t t e n t de d 6 t e r m i n e r les v i t e s s e s de t r a n s p o r t q u i s o n t r a p p o r t 6 e s a u n o m b r e de c e l l u l e s (mesur6 p a r un c o m p t e u r de e e l l u l e s C o u l t e r ) o u h la d e n s i t 6 o p t i q u e des c e l l u l e s ( d 6 t e r m i n 6 e 546 n m a v e c u n S p e c t r o p h o t o m b t r e E p p e n d o r f ) . Ces e x p 6 r i e n e e s o n t l i e u ~ la l u m i 6 r e et h la temperature d e 29"C. Des 6tudes p r b l i m i n a i r e s [10] ont m o n t r 6 q u e des c o m p o s 6 s tels q u e le M e r s a l y l , le p C M B " et le p C M P S " i n h i b a i e n t p r e s q u e i m m 6 d i a t e m e n t le t r a n s p o r t d u p h o s p h a t e c h e z des C h l o r e l l e s p r 6 a l a b l e m e n t c a r e n c 6 s en p h o s p h a t e p e n d a n t q n a t r e h e u r e s . Cette a c t i o n v a r i a i t p e n en f o n c t i o n du t e m p s de c o n t a c t a v e c l ' i n h i b i t e u r , p o u r des t r a i *pCMB : p-Chloromercuri benzoate *pCMPS : p-chloromercuripht!nyl sulfonate *NEM : N-Ethylmaldimide.
~ produits , Sigma
R. Jean jean, A. Hourmant
384
t e m e n t s n ' e x e 6 d a n t pas 8 "h 10 minutes. Dans le pr6sent travail, les contacts c e l l u l e s - i n h i b i t e u r s n ' o n t jamais 6t6 sup6rieurs "~ 10 m i n u t e s et le mSme p r o c e s s u s a 6t6 adopt6 p o u r l'Iodoae6taminde. La d i m i n u t i o n des vitesses de t r a n s p o r t en f o n c t i o n du t e m p s de contact a v e r la NEM* est progressive. Pour arr6ter imm6diatement Faction de cet i n h i b i t e u r , un exc~s de eyst6ine (5 fois plus e o n e e n t r 6 e que la NEM) est inject6 aprbs d i v e r s temps de contact, selon la m O h o d e utilis6e p a r Debise et D u r a n d [7]. Apr6s les t r a i t e m e n t s aux i n h i b i t e u r s , les cellules sont eentrifug6es, lav6es et r e m i s e s en suspension dans un m i l i e u sans p h o s p h a t e , et les vitesses de t r a n s p o r t du p h o s p h a t e sont mesur6es selon le p r o t o c o l e d6fini p r6c6demment. Les r6sultats sont e x p r i m 6 s en activit6 r6sid u d l e p o u r les e x p 6 r i e u c e s r6alis6es avec les compos6s m e r c u r i a u x et en p o u r c e n t a g e d ' i n h i b i tion p o u r celles effeetu6es avec la NEM. Ces deux m o d e s d ' e x p r e s s i o n ont 0 6 utilis6s c a r dans le cas des compos6s m e r c u r i a u x des stimulations sont p a r f o i s observ6es, et ceci n'est ais6lnent e x p r i m 6 q u ' e n t e r m e d ' a e t i v i t 6 r6siduelle. RESULTATS. 1 - - Action du pCMB, pCMPS, Mersalyl et Iodoae6tamide. a) Sur les Chlorelles cultiv6es en pr6sence de phosphate. A faibles doses (inf6rieure ou 6gale h 10 -4 M), seul, le pCMB i n h i b e le t r a n s p o r t du p h o s p h a t e ehez les Chlorelles, landis que p o u r ces m~.mes c o n c e n t r a t i o n s , les autres i n h i b i t e u r s n ' o n t aucun effet e t s e r6v61ent m~me O r e 16gbrement stimulateurs (tableau 1A).
TABLEAU ].
E f f e l de divers inhibiteurs des groupes s u r le transport du p h o s p h a t e par les Chlorelles. A - - Effet des i n h i b i t e u r s sur les cellules non carenc~es en p h o s p h a t e . concentration en moles lnhibiteur 1~4 pCMP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . pCMPS . . . . . . . . . . . . . . . . . Mersalyl . . . . . . . . . . . . . . . . lodoae6tamide . . . . . . . . . . .
BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 3.
73
48
114 120 114
5.10-~ t0-3
--
70
5
58 85 70
et G. D u c e l .
B -Effet des i n h i b i t e u r s sur les eellules carenc6es p e n d a n t 4 h e n p h o s p h a t e .
concentration en moles Inhibiteur
pCMB . . . . . . . . . . . . . . . pCMPS . . . . . . . . . . . . . . Mersalyl . . . . . . . . . . . . . .
10-~
10-~
10-3
75 68 80
4O 55 67
8 32 39
(Le noml)re de cellules est voisin de 5.106 eell/ml pour tous les traitements). Les rOsultats sont exprim6s en poureentage par rapport au t6moin (activit6 r~siduelle). C - - Effet des pCMB (10 -4 M) en f o n c t i o n de la densit6 de eellules trait6es. Nombre de cellules par m 1
Activit6 r6siduelle
5,8 10'* 1,16 107 1,70 107
48 65 80
Ces i n h i b i t e u r s sont r6put6s p e u p6n6trants et a v o i r un.e action superficielle. Ceei e x p l i q u e r a i t que dans le cas du pCMB, l ' i n h i b i t i o n est f o n c t i o n du n o m b r e de eellules pr6sentes (tableau 1 C). La p r 6 s e n e e de P h o s p h a t e (2'.10 -3 M) p e n d a n t le t r a i t e m e n t p a r le p,CMB (10 -4 M) ne modifie pas i i n h i b i t i o n ; le P h o s p h a t e n ' a done a u e u n effet p r o t e e t e u r . I1 e n e s t de m6me p o u r le pCMPS, le Mersalyl et l ' I o d o a e 6 t a m i d e utilis6s h fortes doses (10-~ M). b) Sur les cellutes earenc6es en Phosphate. C o n t r a i r e m e n t h ee qui a 6t6 observ6 ehez les cellules normales, les r6sultats du t a b l e a u I B m o n t r e n t qu'h faibles doses, pCMPS et Mersalyl i n h i b e n t le t r a n s p o r t chez Ies Chlorelles pr6alab l e m e n t earene6es en p h o s p h a t e p e n d a n t quatre heures. La sensibilit6 au pCMPS et au Mersalyl se d6velopp.e en f o n c t i o n de la dur6e de la e n t e n t e en p h o s p h a t e (tableau I[ A) tandis que la sensibilit6 au pCMB ne se modifie gubre. Celte sensibilit6 p a r a i t surtout se d 6 v e l o p p e r aprbs d e u x h e u r e s de earenee, c o m m e le m o n t r e la figure 1 p o u r l ' a e t i o n du PCMPS. L ' a b s e n e e de p h o s p h a t e dans le m i l i e u de culture se t r a d u i t p a r une a u g m e n t a t i o n de la vitesse de t r a n s p o r t du p h o s p h a t e qui se stabilise apr6s 4 h 5 heures de earence. Cet a c e r o i s s e m e n t de la vitesse est, selon toute v r a i s e m b l a n c e , li6 ~ une synth6se a c c r u e du systbme de t r a n s p o r t [11],
385
I n h i b i t e u r s de S H et t r a n s p o r t d u p h o s p h a t e . d o n e les g r o u p e s t h i o l s i m p l i q u 6 s d a n s le t r a n s port doivent 6tre plus nombreux ; mats l'inhibit i o n p r o v o q u d e p a r le p C M P S et le M e r s a l y l n e peut expliquer que par un ehangement d'aecessibilit& I n v e r s e m e n t , l o r s q u e d u p h o s p h a t e est a j o u t d h d e s c e l h f i e s c a r e n e d e s 24 h e u r e s , la s e n s i b i l i t 6 a u p C M P S ( t a b l e a u I I B) d i m i n u e . C e c i est c o n e o -
B) Disparition de la sensibilitd au pCMPS (10-', M) des celhdes pr~aIablement carenc~es en phosphate p e n d a n t 2~ heures, aprbs addition de phosphate (5.10-~ M). Temps en heures apr~s l'addition de phosphate
40 74 89 118
Vr
SjSs ~
I00 I
! I I
p.100 p.100 p.100 p.100
A divers temps, les eellules sont traitdes au pCMPS, puis les mesures des vitesses d ' a b s o r p t i o n sont effectudes.
1
I
Activitd rdsiduelle apr~s traitement au pCMPS
I
mitant d'une diminution des vitesses de transport d u p h o s p h a t e q u i p e u t ~tre a t t r i b u d ~t u n e d d g r a dation du systbme de transport eessant 4 h 5 h e u r e s a p r b s l ' a d d i t i o n d e p h o s p h a t e [12!.
I 500 2
II --
A c t i o n d e la N - d t h y l m a l d i m i d e .
L a N E M est g d n d r a l e m e n t c o n s i d d r d e c o m m e u n r d a c t i f c a p a b l e d e p 6 n 6 t r e r d a r t s les c e l l u l e s , c o n trairement aux autres inhibiteurs prdcddemment u t i l i s d s . C e p e n d a n t , il est p o s s i b l e q u e p o u r d e s traitements brefs, Faction de la NEM demeure s u p e r f i c i e l l e . I1 est d o n e n d c e s s a i r e d e c o n t r 6 1 e r a v e c p r 6 c i s i o n la d u r d e d ' a c t i o n d e ce c o m p o s &
50
o~
100
a) I n f l u e n c e d e la d u r d e d e t r a i t e m e n t ~ la NEM. 1
2
4
nurAe
de
L a d u r d e d ' a c t i o n d e la NEM, e o n t r 6 1 d e p a r a d d i t i o n d e c y s t d i n e e n l a r g e e x c b s , a dl~ ~ t u d i ~ e pour des temps infdrieurs h 5 minutes, temps
6
la
carence
en
h,
Fro. 1. - - Influence du PCMPS sur les oitesses d'absorption pendant la carence en phosphate. Courbe 1 : a u g m e n t a t i o n des vitesses d ' a b s o r p t i o n ; courbe 2 : vitesses d ' a b s o r p t i o n apr6s t r a i t e m e n t a n PCMPS ; eourbe 3 : poureentage &'inhibition des vitesses d'absorption, Vr : vitesses d ' a b s o r p t i o n en p r e n a n t 1,es vitesses d ' a b s o r p t i o n des ehlorelles n o n carenedes comme tdmoin.
~I001
! /
T ~ L E A V II. A) Sensibilit~ aux inhibiteurs des groapes thiols en fonetion de la dar~e de carence en phosphate. Durde de la careBce en heures
Iuhibiteur (t0 4 M)
pCMB . . . . . . . . . . . . pCMPS . . . . . . . . . . . Mersalyl . . . . . . . . . .
50
40 110 108
! 1
97 102
85 92
60 81
61 86
Rdsultats exprimds en pourcentages d'activitd rdsiduelle par rapport au tdmoin (~ I00).
BIOCHIMIE, 1975, 57, n ~ 3.
,A I I 2 3 4 Dur~e d e t r a i t e m e r l t
I 5 (ran)
FI6. 2. - - Influence de la durde de traitement & la NEM sur l'inhibition du transport du phosphate. Courbe 1 : C o n c e n t r a t i o n en NEM : 2.10-5 M. Courbe 2 : C o n c e n t r a t i o n en NEM : 5.10-5 M. 28
R. Jean jean, A. H o u r m a n t et G. Ducet.
386
pour lesquels seules des modifications quantitat i r e s se m a n i f e s t e n t s u r la e i n ~ t i q u e d ' e n t r ~ e d u p h o s p h a t e . A p r ~ s 5 m i n u t e s d e c o n t a c t a v e e la NEM, les c o u r b e s d ' a b s o r p t i o n d u p h o s p h a t e e n fonction du temps ne sont plus lin6aires.
m a n i f e s t e d6s le d 6 b u t d u c o n t a c t , elle r e s t e d u m ~ m e o r d r e de g r a n d e u r p e n d a n t les p r e m i 6 r e s s e c o n d e s ( T a b l e a u I I I A ) , p u t s elle a u g m e n t e p r o -
.o 101
.'2
TABLEAU III. A - - A c t i o n de la N E M (h 2.10 -5 M e t 5.10-5 M), en [ o n c t i o n d u t e m p s de t r a i t e m e n t ( d e n s i t d de 7,51,06 c e l l M e s / m l ) . B - - A c t i o n d e la N E M (5.10-5 M) en f o n c t i o n d u t e m p s de t r a i t e m e n t , t r a i t e m e n t effectual avec 2 d e n s i t ~ s de celIules.
5C
Durde de traitement t~ll S~OGgl~es
NEM en M
2 . 1 0 -'~
5.10-~
5
10
t5
61 42
62 2,9
4t~
64
lO7
z~d
Nombre
Dur~e du traitement Densit~ de cellules t 5 mn
5"
~0"
15"
47
4;
501010
Z(T-J
4.10 ~ cellules/ml 1. 410 ~ cellules / ml
A, B : r6suItats exprimfis en activit6 r6siduelle.
/ml
de cellules
Fla. 4. - - Influence de la quantitd de eel/ales sur l'inhibition da transport du phosphate par la NEM (temps de t r a i t e m e n t de 15 s econdes).
gressivement. Nous avons done eonsid6r6 que p e n d a n t ee l a p s d e t e m p s , F a c t i o n d e l a N E M 6 t a i t d e n a t u r e p u r e n l e n t s u p e r f i c i e l l e . P a r la s u i t e , les d i v e r s e s e x p ~ r i e n e e s o n t 6t6 e f f e e t u 6 e s a v e e d e s t r a i t e m e n t s d e l ' o r d r e d e 15 s e c o n d e s .
"2"100
53 .c
100 50,
/.
2 h=
55
~o! 4
5.16' 5 Concentration
en N E M
(M.)
FIa. 3. - - Action d'un lraitement de 15 seeondes it la NEM d dioerses concentrations sur l'inhibition du transport da phosphate.
50
L__ !
I
I
I
3
L e s r 6 s u l t a t s (fig. 2) m o n t r e n t q u e l ' i n h i b i t i o n e r o l t e n f o n e t i o n d e la d u r g e d u t r a i t e m e n t h l a N E M ; l ' i n h i b i t i o n e s t d ' a u t a n t p l u s f o r t e q u e la c o n c e n t r a t i o n e n N E M est 61ev6e. L ' i n h i b i t i o n se BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 3.
I
I
--3
10
5.10 Concentration
en Phosphate
(M)
Fro. 5. - - E f f e t proteeteur de diffdrentes concentrations en phosphate au coors d'un traitement de 15 secondes d la NEM (5.10-5 M) ois-?t-ois de l'inhibition da transport du phosphate.
I n h i b i t e u r s de S H et t r a n s p o r t d u p h o s p h a t e . b) E f f e t d e d i f f 6 r e n t e s c o n c e n t r a t i o n s
e n NEM.
L e s r 6 s u l t a t s d e la f i g u r e 3 f o n t a p p a r a i t r e q u e , p o u r u n e d u r 6 e d e t r a i t e m e n t d e 15 s e c o n d e s l ' i n h i b i t i o n c r o i t e n f o n c t i o n d e la c o n c e n t r a t i o n e n NEM.
100 Jo am
Q
ss S
+ p
~
I/ / ,
,
53~ 5
1~5
1~ 4
Concentration
e:l
NFM
(M~)
Fro. 6. - - Action de diffdrentes concentrations en NEM sur le transport du phosphate. T r a i t e m e n t s de 15 seeondes h ]a NEM r6alis6s en l'absence ( • -...... • ) ou en pr6senee de p h o s p h a t e (2.10-3M) ( . - - . ) ,
100
s u p e r f i c i e l l e et d o n c m e l n b r a n a i r e p o u r d e s t r a i t e m e n t s de t r 6 s c o u r t e s d u r 6 e s ( t a b l e a u I I I B). d) P r o t e c t i o n p a r le p h o s p h a t e
min6ral.
De n o m b r e u x a u t e u r s [3, 6, 7] o n t m i s e n 6vid e n c e q u e le s u b s t r a t p o u v a i t a v o i r u n effet p r o t e c t e u r v i s - h - v i s d e la NEM. Dans cette optique, du phosphate ~ diverses c o n c e n t r a t i o n s est i n t r o d u i t d a n s le m i l i e u a v a n t u n t r a i t e m e n t d e 15 s e c o n d e s ~ la NEM. L e s r 6 s u l t a t s (fig. 5) m o n t r e n t q u e l ' i n h i b i t i o n d i m i n u e a v e c les c o n c e n t r a t i o n s c r o i s s a n t e s e n p h o s p h a t e atu-delh d e 10 -4 M. A i n s i a p p a r a i t u n e c e r t a i n e p r o t e c t i o n d u s y s t b m e d e t r a n s p o r t p a r le s u b strat.
3)
s" 50
387
De p l u s , la f i g u r e 6 m o n t r e q u e cet effet p r o t e c t e u r se m a n i f e s t e p o u r d e s t r a i t e m e n t s d e 15 s e c o n d e s "~ d i v e r s e s c o n c e n t r a t i o n s e n NEM. L a figure 7 rassemble de tr6s nombreux r6sultats c o n c e r n a n t la p r o t e c t i o n li6e a u p h o s p h a t e . N o u s a v o n s e a l e u l 6 la q u a n t i t 6 d e N E M p r 6 s e n t e p a r c e E u l e d e C h l o r e l l e et les c o u r b e s t r a c 6 e s d o n n e n t u n e b o n n e i d 6 e d e la p r o t e c t i o n e x e r c 6 e p a r le phosphate sur l'inhibition. Cependant, retie protection, nette pour des t e m p s d e c o n t a c t d e 15 s e c o n d e s , d i s p a r a i t p r o -
1 oOOo
• eoe oe • oe * ~ 5O
• •
•
•
•
•
•
•
Fro. 7. - - Sur cette figure est repr6sent6e ['inhibition en fonetion de la q u a n t i t 6 de NEM exprimde en t e n a n t compte de la q u a n t i t 6 de eellules pr6sentes p e n d a n t le t r a i t e m e n t .
2°
o
~o • °
oo
o
o
Courbe 1 : T r a i t e m e n t en l'absence de phosphate ;
o
Courbe 2 : T r a i t e m e n t en pr6sence de phosphate. _15 10
a _14 10 Quantit6
i -14 .10
-
14
3.10
de NEM
c) I n f l u e n c e d e la d e n s i t 6 d e c e l l u l e s . A l ' e x e m p l e d e c e q u i est o b s e r v 6 a v e c le p C M B , p o u r u n e c o n c e n t r a t i o n d o n n 6 e e n N E M et u n e d u r 6 e d ' a c t i o n d e 15 s e c o n d e s , l ' i m p o r t a n c e d e l ' i n h i b i t i o n d 6 p e n d d e la d e n s i t 6 d e c e l l u l e s (fig, 4 et t a b l e a u I I I B). L ' i n h i b i t i o n est d ' a u t a n t p l u s m a r q u d e q u e le n o n l b r e d e c e l l u l e s est f a i b l e . Ceci p l a i d e e n f a v e u r d ' u n e a c t i o n e s s e n t i e l l e m e n t
BIOCHIMIE, ~ 1 5 , 57, n ° 3.
I
g r e s s i v e m e n t l o r s q u e la d u r 6 e d e t r a i t e m e n t augm e n t e (fig. 8). L a r e p r 6 s e n t a t i o n s e m i l o g a r i t h m i q u e m o n t r e q u ' e n a b s e n c e de p h o s p h a t e l ' i n h i b i t i o n p a r la N E M est b i p h a s i q u e : h u n e i n h i b i tion quasi instantan6e succbde une inhibition p l u s l e n t e q u i p o u r r a i t 6tre d u p r e m i e r o r d r e . P a r c o n t r e e n p r 6 s e n c e de p h o s p h a t e , l ' i n h i b i t i o n i n s t a n t a n 6 e est b e a u c o u p p l u s f a i b l e , l ' i n h i b i t i o n lente complexe, n'est pas du premier ordre.
R. J e a n jean, A. H o u r m a n t et G. Ducet.
388
e) E t u d e d e l a s e n s i b i l i t ~ fi l a N E M e n f o n c t i o n d e la d u r 6 e d e c a r e n c e e n p h o s p h a t e . Pr6c6demment, nous avons fait 6tat d'un d6veloppement d e l a s e n s i b i l i t 6 a u p G M P S et a u M e r s a l y l e n f o n c t i o n d e la d u r 6 e d e c a r e n c e e n p h o s phate. Nous avons repris cette 6ttrde avec la NEM.
DISCUSSION. a) A c t i o n Pour semble
en surface.
des temps de contact tr~s brefs, la NEM agir uniquement h la s u r f a c e c e l l u l a i r e
Mr
lOO •b /
100 ,,
T, ,®
50
~
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2
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0o
1o I
i
1
2
4
i
i
6
Dur~e de la carence e n h. Fro. 9. I n f l u e n c e de la N E M szzr les v i t e s s e s d'abs o r p t i o n p e n d a n t la carence en p h o s p h a t e . Courbe 1 : augmentation des vitesses d'absorption. Courbe 2 : vitesses d'abs.orption apr~s un traitement h la NEM. Courbe 3 : pourc,entage d'inhibition des vitesses el'absorption. Vr : v i t e s s e s d ' a b s o r p t i o n en p r e n a n t les v i t e s s e s d'absorption des Ch]orelles non carencdes comme t~moin. -
1
3
temps
en
5
100I
c
mn
Fro. 8. I n f l u e n c e de la d u r o c de t r a i t e m e n t & la NEM sur l'inhibition du transport du phosphate. (.- ....... .) T r a i t e m e n t en l ' a b s e n c e de p h o s p h a t e • {" ') T r a i t e m e n t e n pr~s,ence de p h o s p h a t e . E n en,cart, e s t r e p r d s e n t ~ e e n s e m i - ] o g , l ' a c t i v i t 6 r 6 s i d u e l l e d ' a b s o r p t i o n e n f o n c t i o n d u t e m p s de c o n t a c t a v e c la NEM. -
'7
-
-
ss
50
/?J
-5 10 La figure 9 montre que, co.ntrairement aux r6sultats obtenus a v e c le p C M P S et le M e r s a l y l , l'inhibition d6eroit pendant les deux premibres heures de carence en phosphate; au-delb de ce temps, l'inhibition se maintient constante. Ceci se v6rifie pour les diverses concentrations en N E M (fig. 10). BIOCH1MIE, 1975, 57, n ° 3.
-5 5.10 1()4 Concentration on NEM (M)
FIG. 10. - - I n f l u e n c e de la c o n c e n t r a t i o n en N E M s u r l ' i n h i b i t i o n d u t r a n s p o r t d u p h o s p h a t e s u r les c e l l u l e s carenc3es et n o n carenc3es. L e s t r a i t e m e n t s h ]a NEM s o n t de 15 s e c o n d e s . C o u r b e 1 : ( ....... . ) C h l o r e l l e s n o n c a r e n e d e s . Courbe 2 : ("--") Chlorelles carenc~es 2 henres. ( .... ) Chlorelles earenc~es 4 heures.
I n h i b i t e u r s de S H et t r a n s p o r t du phosph~lte. (influence de la c o n c e n t r a t i o n des cellules sur 1'importance de l ' i n h i b i t i o n , tableau II1, fig. 4), comme cela est p r o b a b l e m e n t le cas avec les i n h i b i t e u r s du type m e r c u r i q u e . Pour des temps d ' i n c u b a t i o n plus longs, la NEM p6n~tre dans les cellules, agit sur d'autres processus cellulaires qui r e t e n t i s s e n t i n d i r e c t e m e n t sur l ' a b s o r p t i o n du phosphate. b) Protection par le substrat. Nous o,bservons une p r o t e c t i o n du systbme de t r a n s p o r t p a r son substrat (phosphate) contre Faction de la NEM, p o u r des t r a i t e m e n t s de br6ves dur6es (fig. 6). Cet effet protecteur, mis en 6videuce darts le t r a n s p o r t du lactose chez Eseherichia colt [3] et plus r d c e m m e n t p o u r le transport du phosphate dans les m i t o c h o n d r i e s [6, 7, 8] peut s ' e x p l i q u e r scion Debise et D u r a n d [7], par une mobilit~ du t r a n s p o r t e u r dans la m e m b r a n e : le phosphate modifiant l ' o r i e n t a t i o n des groupes thiols les r e n d r a i t moths accessibles h la NEM. C e p e n d a n t ces auteurs n ' e x c l u e n t pas u n 6veutuel c h a n g e m e n t de c o n f o r m a t i o n modifiant l'accessibilitd h la NEM. Cette p r o t e c t i o n par le substrat n'est p a s la r6gle g6n6rale et on observe parfois le p h 6 n o m 6 n e inverse d ' u n e s e n s i b i l i s a t i o n ~ l ' i n h i b i t i o n en pr6sence de substrat. Rdccmment, H a g u e n a u e r - Tsapis et Kepes [13] ont m o n t r 6 que dans le transport des Hexoses par E s c h e r i e h i a colt, l ' i n h i b i tion 6tait plus faible q u a n d les cellules avaient subi u n t r a i t e m e n t prdalable p a r l ' i n h i b i t e u r que lorsque inhibiteu,r et substrat 6talent apportds en m~me temps. Ces auteurs s u p p o s e a t que FEnzyme II (impliqude dans le syst6ine de t r a n s p o r t et sensible h la NEM) pr6sente deux 6tats conform a t i o n n e l s . P. V. Vignais et collaborateurs [14] observent que la fixation d'ADP sur le t r a n s p o r teur m i t o c h o n d r i a l pro voque u n d~masquage d ' u n c e r t a i n n o m b r e de groupes SH, et des auteurs a t t r i b u e n t ce ddmasquage h u n c h a n g e m e n t de c o n f o r m a t i o n m e m b r a n a i r e au com-s du transport d'ADP. Ces c h a n g e m e n t s c o n f o r m a t i o n n e l s au cours du t r a n s p o r t p o u r r a i e n t e x p l i q u e r la protection ou la s e n s i b i l i s a t i o n p a r le substrat. Comme par contre, la prdsence de p h o s p h a t e ne modifie pas l ' i n h i b i t i o n provoqu6e p a r le pCMB et le Mersalyl, les groupes thiols rdagissant avec la NEM d o i v e n t ~tre diff6rents de ceux atteints par les co mposds m e r c u r i a u x . L'existence possible de deux types de groupes thiols a d6jh 6td proposde p o u r le syst6me de t r a n s p o r t des acides amin6s p a r certains tissus a n i m a u x [15]. c) I n f l u e n c e de la carence en phosphate. Nos rbsultals m o n t r e n t que le pCMB i n h i b e avec la mbrne intensit6 l ' a b s o r p t i o n du phosphate p o u r
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les ch!orelles issues d ' u n milieu n o r m a l ou p o u r celles issues d ' u n milieu carenc6 en phosphate. Par contre l ' i n h i b i t i o n , par le pCMPS n'est significative qu'apr~s 2 heures de carence du milieu de culture (tableau I[ A) et d i s p a r a i t assez raptd e m e n t apr6s l ' a d d i t i o n de phosphate au m i l i e u carenc6 (tableau I I B ) . Au contraire, l ' i n h i b i t i o n par la NEM d6crolt p e n d a n t les deux premi+res heures de la raise en carence puts se stabilise ensuite. Nous avons montr6 [111 que lors de la carence, l'augmentation de la vitesse de t r a n s p o r t c o r r e s p o n d h u n e a u g m e n t a t i o n du n o m b r e des t r a n s p o r t e u r s p a r cellule et 6galement du h o m b r e de t r a n s p o r t e u r s par unit6 de surface eellulaire. De n o u v e a u x groupes thiols a p p a r a i s s e n t donc en surface, li6s l ' a p p a r i t i o n de n o u v e a u x t r a n s p o r t e u r s et ces groupes r6agissent diff6remment, avec les i n h i b i teurs, de ceux pr6sents sur la surface des chlorelles en croissance sur milieu n o n carenc6. E n particu!ier ces n o u v e a u x groupes thiols semblent avoir une r6activit6 accrue h l'6gard du pCMPS et une r6activit6 plus faible avec la NEM. P o u r essayer de d o n n e r u n e explication a c e s faits, deux hypoth6ses p e u v e n t 6tre 6nonc6es : --Le t r a n s p o r t e u r syntb6tis6 an cours de la carence est diff6rent de celui pr6sent dans les cellules normales. - I1 s'agit d u m(~me type de t r a n s p o r t e n r dont l'accessibilit6 est modifide p a r des r e m a n i e m e n t s m e m b r a n a i r e s li6s ~ la carence en phosphate. Ceci t r a d u i s a n t une certaine h6t6rog6n6it6 memb r a n a i r e comme cela a 6t6 mis en 6vidence sur E s c h e r i c h i a colt [16]. Au cours de la carence, de nouvelles m e m b r a n e s p o u r a i e n t 6tre synthbtis6es et ~tre plus riches en t r a n s p o r t e n r que les a n c i e n n e s et celui-ci dans un e n v i r o n n e m e n t quelque pen modifi6 p o u r r a i t avoir u n e rbactivit6 diffdrente avec les i n h i b i t e u r s de groupes thiols, nos r6sultats ne p e r m e t t e n t pas de choisir parrot ces possibilit6s. Cependant, nos r6sultats i n d i q u e n t que le calcul de Mitchell [1] du n o m b r e des t r a n s p o r t e u r s de phosphate, bas6 sur l ' i n h i b i t i o n p a r le pCMB ne peut 6tre r e t e n u [17~. I1 est c e r t a i n que les i n h i biteurs que nous avons utilis6s r6agissent 6galem e n t avec b e a u c o u p de groupes thiols autres que ceux impliqu6s dans le t r a n s p o r t du phosphate et Gautheron [18] a m o n t r 6 routes les difficultds d ' i n t e r p r 6 t a t i o n du titrage de ces groupes clans les syst6mes m e m b r a n a i r e s . L ' e n s e m b l e des r6sultats acquis diffbre de ceux obtenus chez ChIorella p!lrenoidosa p o u r le transport du sulfate [19]. E n effet, le sulfate prot6ge contre l ' i n h i b i t i o n du t r a n s p o r t p a r le pCMB
It. Jearljean, A. H o u r m a n t et G. Ducet.
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(10-~ M). De plus, p a r a l l ~ l e m e n t h l ' i n s t a l l a t i o n de la carcnce en sulfate, on observe une augmentation de l ' i n h i b i t i o n par la NEM [20]. Les groupes thiols impliqu6s darts les syst6mes de t r a n s p o r t du phosphate et du sulfate poss~dent done des r~activit6s fort diffbrentes. Des t r a v a u x r6cents o nt 6galement soulign6 le r61e des groupes thiols dans les syst6mes de t r a n s p o r t d ' a n i o n s [21] et de cations [22-23]. Rr}suMg. L'effet des rdactifs des groupes thiols a dt~ dtndi~. Le pCMiB iuhibe le t r a n s p o r t du p h o s p h a t e chez Chtorella pyrenoidosa. Cette inhibition est i m m e d i a t e et ne varie pas en fonction du t e m p s d'incubation. L'inhibition affecte aussi bieo les eellules non carenc6es que certes carene~es en phosphate, Le pCMPS et le Mersalyl agissent de la m~me mani6re. Cependant, q u a n d ces derniers sont utilis~s b~ faihles doses, ils i n h i b e n t le t r a n s p o r t en p h o s p h a t e senlement sur les cellules carencdes. Le s u h s t r a t (phosphate) ne protege pas contre l'effet de ces inhibiteurs. La NEM i n h i b e le t r a n s p o r t du p h o s p h a t e et cette i n h i b i t i o n augmente avee le t e m p s d'incubation. P o u r des t e m p s trgs b r e f s 4'ineubation (de 15 secondes), l'effet semble gtre snperfieie~ et la NEM r6agit avee les groupes SI-I impliqu~s d a n s le t r a n s p o r t . Quand le p h o s p h a t e est prdsent (pour 15 seeondes &incubation), l ' i n h i b i t i o n est m o i n s i m p o r t a n t e que quand, le phosphate est absent. Le s u b s t r a t prot6ge eontre la NEM, mats eette protection disparait q u a n d l'ineubation est prolong@. La NEM inhibe le t r a n s p o r t du phospha~, aussi bien sur les eellules non earen.edes que sur celles earenedes en phosph.ate, eependant, l ' i n h i b i t i o n est m o t h s i m p o r t a n t e p o u r les eellules earenedes. Les a u t e u r s conelt~ent qu'iI p o u r r a i t exister denx sortes de groupes SH impliqu6s dans le syst6me de t r a n s p o r t du phosphate, les uns r6agissant avee le pGMB et les autres a v e c l a NEM.
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