La transgenèse au secours de la lutte biologique

AGROBIOLOGIE

La transgenese au secours de • la lutte bioi ogrque Certains microorganismes, interessants pour la lutte biologique contre des parasites ou des maladies des plantes, survivent mal dans le sol. Pour pallier cet inconvenient, des chercheurs ont inuente la « symbiose artificielle ». It s'agit de modifier le genome des plantes a proteger afin que leurs racines produisent des molecules que les bacteries benefiques, elles-memes transgeniques, seront seules

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pouvoir assimiler:

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.es dernieres annees, des traite. •.•. ments phytosanitaires d'un genre nouveau sont apparus dans ks champs: les agents de lutte biologique. Bacteries, champignons, plus rarement insectes, capables de detruire les ravageurs ou les vecteurs des maladies vegerales, sont recrutes pour proreger les recoltes (1, 2). Outre la celebre - mais anecdotique - coccinelle devoranr les pucerons des rosiers, ou la bacterie Bacillus thuringiensis, un insecticide microbien massivement epandu depuis des decennies, les agriculteurs peuvent desormais employer des organismes plus esoteriques. Par exemple Trichoderma sp, un champignon protegeant les arbres des attaques d'un autre champignon nomrne Chondrosterum purpureum, ou les bacreries du genre Streptomyces, qui luttent contre les ravages exerces sur les arbres par Ie champignon Alternaria brassicola.

Lorsque la bacterle Agrobacterium tumefaciens envahit une cellule vegetale (ici de tabac), elle induit chez cette derniere la production d'opines, des molecules qu'elle utilise comme source de carbone et d'azote. Cela lui contsre un avantage selectif important sur Ie reste de la population bacterienne. Ce mecanisme a inspire une nouvelle methode de protection biologique des cultures.

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• Institutdes sciences vegetales, CNRS, av dela Terrasse, bat 23, 91198 Gif-surYvette, France. E-mail: [email protected] •• Department of Crop Sciences, 361 ERML, 1201 W Gregory Drive, University of Illinois, Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801, Etats-Unis. E-mail: [email protected]. edu.

AGROBIOLOGIE Traitements biologiques commercialises en 1989

(1) JW Oaecon etal

(1993) Pest Sci37, 417-426. (2) JHAndrews

Nom Commercial BINAB-T

Agent de contr6le Trichoderma

Organisme clble-plante h6te Chondrosterum purpureum-arbre Verticilium malthousei-champignon de couche Endothia parasitica-chataignier

Compagnie Biolnnovation AB, Toreboda, Suede

Dagger

Pseudomonas fluorescens

Pythium ultimum-coton Rhizoctonia solani-coton

Ecogen, Inc, langhorne, Pennsylvanie, Etats-Unis

Galltrol

Agrobaeterium radiobaeter

Agrobacterium tumefacienscruciteres

AgBio Chern Inc, Orinda, California, Etats-Unis

Mycostop

Streptomyces sp.

Alternaria brassico/a-arbres

Kemira Oy,Vass, Finlande

Norbac 84-C

Agrobaeterium radiobaeter

Agrobaeterium tumefaeiens-arbres

New Bio Products Inc, Corvalis, Californie, Etats-Unis

P.g. suspension

Phlebia gigantea

Heterobasidion annosum-arbres

Ecological labs., ltd, Dover, Royaume-Uni

(1992) AnnRev Phytopathol30, 603-365. (3) JL Mcintyre. JS Press (1991)

The rhilosphere and plantgrowth, OL Keister, PB Cregan (eds). Kluwer Academic Publisher, Betsville, Etats-Unis, pp289-298 (4) GO Bowen

(1991) The rtuzosphere andplant growth, OLKeister. PB Cregan (eds). Kluwer Academic Publisher, Betsville, pp 386-395 (5) PZambrisky (1988) Ann Rev Genet 22,1-30

(Source: d'apres JA Lewis [1991] The rhilosphere andplantgrowth, Kluwer Academic Publisher, Betsville, pp 279-288). La listeexhaustive desproduits commerclaltses figuredans l'lndexphytosanitaire 1998(Ed: Association de coordination technique agricole, 1997).

(61 Y Oessaux et a/ (1993) Phytochemistry34,31-38

agrochimiques. Cela explique sans doute Ie « decollagc » previsiblc de la lutte biologique : Ie marche mondial des biopesticides, qui ne represcnta it que 50 millions de dollars en 1987, devrait atteindre plusieurs milliards au debut du siecle prochain (3). Les agents biologiques deploient des mecanisrnes de lutte tres varies, mais qui aboutissent tous au mernc resultat : modifient-ils l'equilibre des populations rrucr obiennes, avec pour corollaire une diminution marquee de la presence des especes pathogenes et donc de l'incidence de la maladie sur la culture. Certains microorganismes benefiques produisent des antibiotiques diriges contre I'agent pathogene, Des genes gouvernant la synthese d'opines ont d'autres synthetiete lnseres dans Ie genome de plants de lotiers sent des mole(Lotus eornieulatus), ce qui favorise dans la rnizocules appelees sphere de ces derniers la croissance de bacteries siderophores qui consommatrices d'opines.

Puisque les microorganismes utilises sont en general deja presents dans Ie milieu naturel, voire associes aux plantes, on peut considerer la methode comme non polluante en regard de I'utilisation de produits

(7) Composes extremement rares dans tanature, roctopine et ses derives sont egalement presents dans lesmuscles du poulpe (Octopus, d'ou Ie nom d'octopine) et I'hultre

Crassostrea gigas. (8) P Guyon etal

(1992) Malec PlantMicrobe Interact 6, 92-98 (9) AA Lameta etal

(1987) Plant Soil 101 , 267-272 (10) OM Gordon et

al (1997) ApplEnvironMicrobio/62. 3991-3996 (11) J Tempe etal

(1982) CR Acad Sci Se:III Sci Vie 295 413-416 (121 SF Colbert etal (1997) ApplEnviron Microbia/59, 20642070

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chelatent le fer, Ie rendant ainsi indisponible pour les autres microorganismes, d'autres encore entrent en competition avec le vecteur de maladie pour les sites d'entree dans la plante. Ce ne sont que quelques exemples : d'autres mecanismes interviennent probablement, mais restent inconnus a ce jour. La plupart des especes observees utilisent d'ailleurs plusieurs strategies simultanernent, ce qui rend extremement faible la probahilite d'apparition d'une resistance chez l'agenr pathogene. Cependant, si plusieurs microorganismes sont d'ores et deja exploires en tant que rraiternents phytosanitaires (voir tableau), la liste des produits disponibles tarde a s'allonger, En effet, beaucoup d'especes candidates, pourtant pro metteuses lars dexperiences menees in vitro, ont fait preuve d'une efficacite pour Ie moins limitee lors d'essais en champ. En general, leur faible capacite de survie dans Ie milieu nature I les cmpeche d'arteindre des niveaux de population suffisants pour rivaliser avec l'agent pathogene (4). Pour que la protection biologique des cultures devienne pleinement efficace, il faudrait done faciliter l'implantation des organismes de lutte dans I'environncment irnrnediat des plantes, par exemple en leur conferant un avantage selectif sur le reste de la population microbienne. Cette derniere idee provient de l'etude de la galle du collet, une maladie due a la bacterie tell uri que Agrobacterium

tumefaciens

(5). Lors de l'infecrion, ce microorganisme opere une modification generique na turelle en transterant a la cellule vegetale, sur laquelle il se fixe, un fragment d'ADN porteur a la fois des genes responsables de l'apparition des syrnptomes de la maladie (formation d'une tumeur) et des genes codant la synthese de composes particuliers, les opines, sou vent derives d'acides arnines (6,7). A tumefaciens dispose d'enzyrnes lui permettant d'utiliser ces molecules com me sources de carbone et d'azote, ce qui lui confere un important avantage selectif sur les autres bacteries du milieu (8). Nous inspirant de ce mecanisme, no us avons evalue la possibilite de modifier la population microbienne du sol en faveur d'un organisme benefique, en jouant sur la quantite et la nature des nutriments disponibles dans I'environnement irnrnediat de la plante. Une telle operation sera it particulierement efficace dans la population des microarganismes associes aux racines. Ces dernieres constituent, en effet, une surface primordia le d'echanges entre la plante et son environnement. Elies prelevent les nutriments dans Ie sol et y relachent nornbre de composes organiques provenant de la photosynthese, ou de cellules endommagees au cours de la penetration dans Ie sol. La plante crce ainsi une «. zone d'influence », appelee rhizosphere, qui a fait l'objet de recherches particulieres. Cette influence du vegetal sur les microorganismes saprophytes, benefiques (bacteries symbiotiques fixatrices d'azote telles que Rhizobium ou bacteries dites promotrices de croissance relles que Pseudomonas putida, P [luorescens ou Azopsirillum sp) ou deleteres, s'exerce en particulier via la production de nombreux composes carbones.

> Modifier la mic:rollore Avec une population microbienne dense et entretenanr d'erroites relations trophiques avec la plante, la rhizosphere constitue donc un lieu d'experience tout indique. Pourquoi ne pas tenter d'y modifier la microflare en ajoutant dans le sol un ou plusieurs substrars nouveaux favorisant la croissance de bacteries prealablement choisies ? Plusieurs resultats experimentaux ont ouvert la voie, suggeranr que notre proposition ctait realisable. Ainsi, la colonisation des legumineuses par des bacteries du genre Rhizobium se rraduit par la production de molecules specifiques de l'in-

teraction : les fla vonoides - un signa I de reconnaissance synrhetise par l.i plante - et les rhizopines - sources carbonees produites par les bacterics ayant deja penetre dans les racines (9. 10, 11). Le mecanisme decouvert chez A tumefaciens n'est donc pas unique dans la nature. En 1993, Stephen Colbert, qui travaillait alors a I'universite de Californie (Berkeley, [tatsUnis), a monrre que l'apporr volontaire d'un substrat nutritif specifique d'une souche bacterienne modifie profondernent I'equilibre micro bien (12). II a introduit deux souches differentes de Pseudomonas [iuorescens, l'une consommant du salycilate er l'autre incapable de l'uriliser, dans un meme sol experimental. En amendant la parcelle avec ce produit, il a multiplie par cent la population des bacteries capables de l'assimiler, De tels resultats montrent que I'on peut effectivement controler la population microbienne de la rhizosphere en jouant sur la disponibilite de molecules sources de carbone.

> Symbiose arlilicielle Cependant la methode utili see par S Colbert ne saurait conferer une protection durable aux cultures: la selection des microorganismes est en effet ponctuelle, lirnitee a la periode d'apport du nutriment. C'est pourquoi nous avons opte pour une tout autre voie : modifier generiquernenr la plante pour qu'elle produise elle-merne le ou les substrats de croissance specifiques des bacteries, Cette methode presente plusieurs avantages. Ces molecules, devenues des composants des exsudats racinaires, sont presentes rout au long de la croissance de la plante et non plus uniquernent lars d'un apport initial. Ensuite, la pression de selection est limitee a la rhizosphere, sans affecter le sol environnant. Enfin, la presence de ces composes dans la rhizosphere s'obtienr au cour relativement modeste de la modification generique du vegetal. Nous avons choisi de demonrrer la faisabilite de la methode en utilisant precisernent les opines, dont les voies de synthese dans la plante sont connues. Puisqu'on connait egalement les voies du catabolisme bacterien des opines, on peut fort bien imaginer l'ingenierie genetique des deux partenaires (planre er microorganisme), pour crcer ce que nous appelons une « symbiose artificielle »,

PHASE I • LEPOINT SUR.... ~7 MAl 1998 • LE VESINET (I'ARIS)

Objectifs Exposer les derniers proqresacquis dans Ie domainede la synthese de peptides, de pseudopeptides et peptidornirnetiques, de peptides modifies. Presenter les strategies de production chimique de banques de peptides. Introduire les methodes de synthese de mimes non peptidiques. Aborder les problernes de biodisponibilite et ciblage de peptides. IIlustrer largement l'interet des sondes peptidiques dans differents domaines de la biologie et la rnededne en couvrant des applications allant des aspects tres fondamentaux jusqu'aumedicament. Public Chercheurs, rnedecins, thesards, inqenleurs travaillant dans Ie domaine de la pharmacologie, I'immunologie, les maladies infectieuses, les neurosciences, et interesses par I'utilisation des peptideset mimes peptidiques dans leurchamp d'application. Conferences en anglais ou en trancais. Nombre maximum de participants: 60 Programme Nouveaux conceptsen chimie phase solide : basesde la chimie des peptides ; syntheses paralleles ; banques combinatoires. Peptides modifies et peptido-rnirnetiques : lipopeptides et glycopeptides ; pseudopeptides et autres peptidomlrnetiques ; rnodelisation de peptides; peptldornirnetiques non peptidiques. Peptides et mimes peptidiques a proprietes immunologiques : aspects dynamiques de I'interaction antiqene-anticorps ; diagnostic et vaccins synthetiques a I'aide de pseudopeptides ; immunomodulation de la reponse Iymphocytaire T a I'aide d'analogues peptidiques ; biodisponibilite et ciblage des peptides.Peptides comme agents therapeutiques : mimes non peptidiques comme medicaments. Avec la participation de : G.L. Amidon (Ann Arbor, USA), J.A. Boutin (Suresne, France), I.L. Fauchere (Suresne, France), C. Granier (Montpellier, France), H. Gras (Lille, France), J.G. Guillet (Paris, France), I. Hoebeke (Strasbourg, France),j. Martinez (Montpellier, France), S. Muller (Strasbourg, France), C. Rubin-Carrez (Vitry-surSeine, France), I. Schneider-Mergener (Berlin, Allemagne), M. Van Regenmortel (Strasbourg, France) PHASE" • MAITRISE TECHNIQUE.3 lOURS ENOCT08RE1998

Programme Montpellier (3 jours) : Technique Spot: Logiciel Multipeps et rnultisynthese manuelle ; automate ASP22 ; synthese conventionnelle et combinatoire ; protocoles de revelation de la liaison aux peptides. et / ou Strasbourg (3 [ours) : Synthese multiple de peptides. Chimie et synthese de liaisons pseudopeptidiques ; mesure de l'affinite de I'interaction anticorps-peptides/pseudopeptides. Selection Les stagiaires (12 maximum) seront selectionnes parmi les participants de la phase I. Renseignements et inscription: Ateliers de formation INSERM

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INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE

Date limite d'inscription : 9 mars 1998 BIOFUTUR 174 • Janvier 1998 27

AGROBIOL.OGIE

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nismes a fortement augmente de 100 a 5 000 fois - autour des racines des plants transgeniques (13). Leur nombre s'est stabilise a un niveau correspondant, semble-t-il, ala capacite d'accueil maximale de la rhizosphere pour ces especes, puisque la population totale de chacun des trois groupes observes est demeuree comparable a celie entourant les plants temoins. La culture de plantes rransgeniques produisant une opine affecte done specifiquement les souches bacteriennes catabolisant cette molecule. Cette etude constitue, a notre connaissance , la premiere demonstration experirnentale de l'impact de la culture de plantes transgeniques sur leur environnement microbien.

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8 > Application ala ::;

'i protection des plantes

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... ~ Que conclure de ces resultats "" quant a l'application d'une telle © c

strategic a la phytoprotection ? II convient de souligner que si la faba) dont elles colonisent res racines, ou plus preclsernent modification des populations les nodosites fixatrices d'azote dont elles induisent la formicrobiennes semble considerable, mation. De rnaniere generale, la zone entourant les racines, elle reste modeste en regard du dite rhizosphere, est Ie lieu de nombreux echanqes bouleversement observe lors de la moleculalres entre la plante et la rnlcrotlore tellurique. rotation des cultures (14, 15). Par ailleurs, l'extrerne specificite de l'eHet observe - ce qui est vrai pour une opine donnee, done un Le premier pas consistait cependant transgene donne, ne l'est plus pour un a dernontrer que la production d'opines par une plante transgenique autre transgene - oblige a rechercher peut modifier la population microprecisement Ie substrat qui correspond (13) POger etal bienne de sa rhizosphere. A l'aide de au microorganisme dont on souhaite (1997) Nature Biofavoriser la croissance. Or les especes plasmides d' Agrobacterium rhizotechno/15, 369-372 connues pour leur capacite a Iutter genes, nous avons introduit des contre les agents parhogenes ne catagenes codant une opine - la manno(14) A Clays-Joserand et a/(1995) bolisent pas forcement les opines, et ne pine, la nopaline ou la cucumopine App/ Environ Microsont pas toujours naturellement preselon les lots -, dans Ie genome de bio/61,1745-1749. sentes dans la rhizosphere, plantules de lotier (Lotus corniculaA ce stade, le genie genetique des A ce stade de l'experimentation, tus). (15) X Latour etal bacteries cibles pourrait intervenir. la nature des microorganismes cibles (1996) App/ Environ Microbio/62, 2449Utilisant un modele similaire au importait peu. Aussi nous avons 2456 notre, Michael Savka et Stephen choisi d'observer trois types de bacFarrand, de l'universite d'Illinois terics naturellement presentes dans la (16) MA Svaka, SF (Urbana-Champaign, Etats-Unis), rhizosphere, et que nous pourrions Farrand (1997) Naont effecrue la premiere transformature Biotechno/15, aisernenr cultiver et denornbrer en 363-368. tion generique conjointe d'une plante laboratoire : Pseudomonas [luoreset d'une bacterie associees (16). lis cens, identifiable sous lumiere ultra(17) CKuhlrneier et ont introduit dans une souche de violctte, et les populations de bacrea/(1987) Ann Rev Pseudomonas fluorescens des genes sporulees et thermotolerantes, ries Plant Physio/38, 211-257. lui permettant de cataboliser quatre facilement detectables. opines, l'acide mannopinique, la En situation norrnale, les individus mannopine, l'acide agropinique et capables d'assirniler les opines sont l'agropine, puis ont inocule cette rares. La production de ces molesouche - ou P fluorescens ternoin cules par Ies lotiers modifies allaitautour des racines de plants de elle faire apparaitre et croitre des tabac, eux-memes modifies pour souches utilisatrices ? Comme attenproduire ces molecules. Resultat : du, la population de tels microorgaLes bacteries fixatrices d'azote du genre Rhizobium vivent en syrnbiose avec certaines legumineuses (ici la Uwe, Vicia

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dans la rhizosphere des plants transgeniques, la bacterie modifiee atteint des niveaux de population netternent plus imporrants que la souche incapable d'utiliser les opines. II est done possible non seulement de favoriser une souche deja presente dans la rhizosphere, comrne nous l'avons nons-memes montre, mais d'y introduire un organisrne nouveau, pour peu qu'on I'air modifie de facon a Ie rendre capable d'uriliser une molecule produite par la plante transgenique. La strategie dite de « symbiose artificielle ", c' est -a -dire la «fa brication " de couples plante-agent de protection, est done techniquernenr possible et viable en termes d'ecologic microbienne. Nous travaillons ainsi actuellement a la mise au point de couples transgeniques plantePseudomonas fluorescens afin de lutter contre certaines maladies fongiques. Differenrs obstacles restent cependant a surmonter avant d'envisager la commercialisation de tels produits . Premierement, la localisation de la production des substrats de croissance bacrerienne dans la plante doit erre plus specifique - par exernplc, Iimiree aux tissus racinaires si l'on souhaite installer un agent de lutte biologique dans la rhizosphere -, afin de diminuer au maximum la pression de selection sur les populations naturelies. Cctte specificite est desorrnais possible, car differents prornoteurs de genes ayant une expression lirnitee a certains organes vegetaux ont ete identifies (17). II faut, par ailleurs, s'assurer que les plantes transgeniques ne disserninent pas les genes determinant les voies de synthese des substrats carbones vers des plantes sauvages. En effet, si ces dernieres se mertaient elles aussi a produire ces molecules, cela creerait une pression de selection importante et difficilement controlable sur les populations bacreriennes et pourrait conduire, in fine, a la perte de la specificite du substrat. De plus, il faudra absolurnent prouver l'innocuite pour l'Homme et pour les animaux de la molecule nouvellement synthetisee par la plante. Resteront alors a determiner, parmi les traiternents possibles, ceux qui seronr effie aces et techniquement viables en conditions reelles de culture. Et lorsqu'ils seront identifies, il faudra evaluer la rentabilite de ces traitements en regard de leur interet ecologique, une appreciation tout autant politique qu'economique, qui pourrait fort bien echapper aux scientifiques.