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Mise en évidence et séparation des constituants protéiniques des α-lipoprotéines du sérum humain
BIOCHIMIE, 1972, 54, 973-979.
Mise en 6vidence et sdparation des constituants protdiniques des -lipoprotdines du sdrum humain. M. AYRAULT-JARRIER, G. LASTRA, D. PASTIER, J. BURDIN et J. POLONOVSKI. Laboratoire de B i o c h i m i e - - Facult~ de Mddecine Saint-Antoine, 27, rue Chaligny - - Paris 12 °. (22/12/1971). Summary. - - HDL apoproteins isolated from human serum are obtained by delipidation at --20°C. These apoproteins are separated in two fractions : a soluble fraction and a fraction forming a gel. These two fractions are differeneiated by their electrophoretic mobility, their amino acid composition and their antigenic characteristics. The fraction forming a gel, very similar to the R-Threonin fraction, does not seem to be formed by only one peptidic chain since it is not homogenous in polyacrylamide gel eleetrophoresis and in immnnoeleetrophoresis.
INTROD UCTION. De r6centes 6tudes de s6paration sur colonnes c h r o m a t o g r a p h i q u e s ont m o n t r 6 l'h6t6rog6n6it6 des p o l y p e p t i d e s de l i p o p r o t 6 i n e s It, 2, 3, 4, 5, 6J. La partie p r o t 6 i n i q u e des a-lipoprot6ines ou HDL (*) (apo HDL) est f a c i l e m e n t o b t e n u e sous forme soluble, l i b r e de lipides, p e r m e t t a n t l'6tude des p o l y p e p t i d e s qui se t r o u v a i e n t associ6es dans les macromol6cules de lipoprot6ine. L'h6t6rog6n6it6 i m m u n o l o g i q u e de ces l i p o p r o t 6 i n e s avait d6jh 6t6 6voqu6e p a r c e r t a i n s auteurs [7, 8, 9], m a i s la c o r r e s p o n d a n c e entre les f r a c t i o n s polyp e p t i d i q u e s isol6es p a r c h r o m a t o g r a p h i e et les caract~res i m m u n o l o g i q u e s des diff6rents polyp e p t i d e s n ' a v a i t pus encore 6t6 montr6e. Dans le travail pr6sent6 ici, nous avons s6par6 deux sons-fractions distinctes de l ' a p o HDL, dont n o u s avons m o n t r 6 les diff6rences i m m u n o l o g i ques.
MATERIEL ET METHODES. 1 °) I s o l emen t des u-lipoprol~ines (HDL). Les s6rums h u m a i n s nous sont f o u r n i s p a r le Centre D6partemental de T r a n s f u s i o n S a n g u i n e de l'H6pital Saint-Antoine. Les l i p o p r o t 6 i n e s de densit6 comprise entre 1,100 et 1,170 sont isol6es apr6s p l u s i e u r s u l t r a c e n t r i f u g a t i o n s f r a c t i o n n 6 e s [10]. Ces fractions d6barrass~es de routes traces de ~-lipoprot6ines et d ' a u t r e s prot6ines du s6rum sont dialys6es 48 h e u r e s contre une solution isoto(*) HDL = high density lipoprotein.
n i q u e de NaC1 ou contre u n e solution de t a m p o n p h o s p h a t e pH 7,16 1/45 M c o n t e n a n t EDTA 10-3 M, et les c o n c e n t r a t i o n s obtenues sont en g6n6ral de 12 h 15 mg de l i p o p r o t 6 i n e s p a r ml de solution. 2 °) Ddlipidation des a-lipoprotdines. Les d61ipidations sont effectu6es p a r la m6thode de H a r d y et G a r d i n e r [11] avec u n m~lange 6thanol-6ther (3-1) h - - 2 0 ° C . 10 volumes de solvant p o u r 1 volume de solution sont utilis6s. La p r o t 6 i n e p r 6 c i p i t e l e n t e m e n t et le c o n t a c t avec le solvant est m a i n t e n u 16 heures. Apr6s centrifugation ~ - - 2 0 ° C , le solvant est 61imin6 et la prot6ine est lav6e 2 fois p a r remise en s u s p e n s i o n darts 10 v o l u m e s du m6me solvant. U n d e r n i e r lavage est alors p r a t i q u 6 avec de l'6ther pur, afin d'61iminer c o m p l 6 t e m e n t l'alcool du pr6cipit6. Le pr6cipit6 est a m e n 6 ~ 4 ° p e n d a n t 10 m i n u t e s puts h 20°C off il est repris p a r u n demi volume de t a m p o n p h o s p h a t e pH 7,16 M/45 ( c o n c e n t r a tion p r o t 6 i n i q u e e n v i r o n 10 m g / m l ) . 3 °) Analyse c h i m i q u e . La quantit6 de p r o t 6 i n e est d6termin6e apr6s u n microdosage d'azote p a r la m6thode de Dumas. Le dosage des oses totaux est f a r p a r la m6thode h l ' o r c i n o ! [12]. La quantit6 de p h o s p h o r e r e s t a n t d a n s la prot6ine d61ipid6e est d6termin6e apr6s m i n 6 r a l i s a t i o n p a r l'acide s u l f u r i q u e et H~O~ 300 ° p a r la m6thode de Fiske et S u b b a r o w [13]. 4 °) Analyse des acides amines. Les h y d r o l y s a t s sont pr6par6s avec HC1 6 N 110 ° p e n d a n t 48 h e u r e s et les acides amin6s dos6s
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M. A y r a u l t - J a r r i e r , G. L a s t r a , D. P a s t i e r , J. B u r d i n et J. P o l o n o v s k i .
h l'aide d'un autoanalyseur Technicon par chromatographic sur r~sine ~changeuse d'ions (Chrom o b e a d s A 120). 5 °) Electrophor~se sur acetate de cellulose.
a d j u v a n t d e F r e u n d ( v / v ) . A c h a q u e i n j e c t i o n les a n i m a u x r e c o i v e n t 12 h 14 m g d e p r o t 6 i n e s ; 10 j o u r s a p r 6 s l a d e r n i 6 r e i n j e c t i o n u n e p r i s e d e s a n g p e r m e t d e c o n t r 6 1 e r la f o r m a t i o n d e s a n t i c o r p s ; l ' a n i m a l est a l o r s s a c r i f i 6 .
Les dlectrophor~ses sont faites sur ac6tate de c e l l u l o s e e n t a m p o n b a r b i t u r a t e p H 8,6, f o r c e i o n i q u e 0,05. U n e t e n s i o n d e 10 V / c m est a p p l i qu~e h chaque bande avec une intensit6 de 2 mA par bande de 2 cm. Les bandes sont ensuite c o l o r 6 e s p a r le n o i r a m i d e .
P o u r t e s t e r la p u r e t 6 d e s H D L n o u s e m p l o y o n s un immuns6rum pr6par6 par l'Institut Pasteur, s~rum de cheval anti s6rum humain total (Lot. 742).
6 °) Electrophorbse en gel de polgacrglamide.
A p r 6 s d 6 t i p i d a t i o n le r e n d e m e n t d e s a p o - l i p o p r o t ~ i n e s o b t e n u e s e s t d e 85 h 90 p. c e n t e n v i r o n . L e s p r o t ~ i n e s n o n r 6 c u p 6 r 6 e s o n t ~t6 s o l u b i l i s 6 e s d a n s le s o l v a n t , e n t r a i n d e s p a r les l i p i d e s et elles prdcipitent lorsque nous ramenons la phase organ i q n e d e - - 2 0 0 C h la t e m p e r a t u r e d u l a b o r a t o i r e . Cette prot~ine est soluble darts un tampon basique et se c o m p o r t e e n ~ l e c t r o p h o r e s e c o m m e l ' a p o p r o t 6 i n e n o n e n t r a i n 6 e d a n s le s o l v a n t h - - 2 0 ° C .
L e s 6 1 e c t r o p h o r 6 s e s s o n t f a i t e s s u r gel d e p o l y a c r y l a m i d e s u i v a n t la m ~ t h o d e d e D a v i s [141 d a n s u n a p p a r e i l Q u i c k f i t 8 P E M . L e s gels s o n t p o l y m 6 r i s ~ s e n p r e s e n c e d ' u r 6 e 1 M o u d ' u r d e 8 M. L a c o n c e n t r a t i o n d u gel u t i l i s ~ est s o i t d e 5,5, s o i t d e 10 p. c e n t . L ' ~ l e c t r o p h o r b s e est f a i t e d a n s u n t a m p o n t r i s - g l y c i n e p H 8,3, 4°C, p e n d a n t 90 m i n u t e s avec une intensit6 de 2 mA par tube de 5 × 65 r a m . L e s gels s o n t c o l o r , s p a r le n o i r a m i d e .
RESULTATS.
TABLEAU II. 7 °) Immuno~lectroph~se. L e s i m m u n o ~ l e c t r o p h o r 6 s e s s o n t f a i t e s s u r agar o s e h 1 p. c e n t s e l o n la t e c h n i q u e d e G r a b a r et S c h e i d e g g e r El51. Le t a m p o n d ' 6 1 e c t r o p h o r ~ s e est u n t a m p o n b a r b i t u r a t e p H 8,6 F 0,05 a l o r s q u e l ' a g a r o s e est p r 6 p a r ~ d a n s u n t a m p o n b a r b i t u r a t e de mbme pH mais de force ionique plus faible F 0,025. L a t e n s i o n a p p l i q u ~ e h la l a m e d ' a g a r o s e est d e 8 V / e r a a v e c n n e i n t e n s i t 6 d e 4 m A p a r l a m e , la m i g r a t i o n d u r e 60 m i n u t e s . L e s i m m u n o d i f f u s i o n s s o n t a u s s i r 6 a l i s ~ e s darts l ' a g a r o s e h 1 p. c e n t [16] a v e c u n e a d a p t a t i o n p o u r la d i s p o s i t i o n d e s c u v e t t e s off l ' o n d ~ p o s e les f r a c t i o n s h O u d i e r et les i m m u n s 6 r u m s . 8 °) Preparation des immuns~rums. Les immuns6rums utilis6s sont des s6rums de lapin anti-apo-HDL totale, pr6par6s dans notre laboratoire. Les lapins re~oivent une injection tousles 15 j o u r s d ' u n m 6 1 a n g e d e p r o t 6 i n e qTABLEAU I.
Composition des constituants de l'aP correspondant & 100 mg de prot~ines et des 2 sons-fractions soluble et gdlifide. P Prot6ines . . . . . . . . . . . . . Phospholipides . . . . . . . . Oses . . . . . . . . . . . . . . . . .
~xPs
xPG
100 mg 34 mg / 60 mg 1 , 3 mg 0 , 9 mg 0 , 4 rng 1 , 2 mg [0,78 m g 10,43 mg
Ces r6sultats sont des m o y e n n e s de 6 exp6riences.
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Composition en nombre de tool. d'acides amines pour 1 000 tool. d'acides amines totaux.
Aeide aspartique . . . . . . Thr~onine . . . . . . . . . . . . S6rine . . . . . . . . . . . . . . . Acide glutamique . . . . . Proline . . . . . . . . . . . . . . . Glycocolle . . . . . . . . . . . . Alanine . . . . . . . . . . . . . . Valine . . . . . . . . . . . . . . . Mgthionine . . . . . . . . . . . lso'eueine . . . . . . . . . . . . Leucine . . . . . . . . . . . . . . Tyrosine . . . . . . . . . . . . . Ph6nylalanine . . . . . . . . Lysine . . . . . . . . . . . . . . . Histidine . . . . . . . . . . . . . Arginine . . . . . . . . . . . . .
cop
aPG
~Ps
84 49 57 174 64 50 75 65 10
87 44 59 188
75 64 44 146
44
46
45 77 53 13 2 149 32 28 98 2O 64
59 52 85 15 14 136 45 52 103 12 51
8
136 31 33 91 16 53
Ces analyses ne t i e n n e n t pas eompte du t r y p t o p h a n e n o n dos6, ni de la eystdine qui est p r a t i q u e m e n t a b s e n t e (il n ' a pas dt6 f a r d ' o x y d a t i o n p e r f o r m i q u e a v a n t l ' h y d r o l y s e de la protdine).
L a d 6 1 i p i d a t i o n 6 1 i m i n e e s s e n t i e l l e m e n t le c h o l e s t e r o l , les g l y c ~ r i d e s et 98 h 99 p. c e n t d e s p h o s pholipides. E n v i r o n 0,1 m g d e p h o s p h o l i p i d e s p o u r 10 m g d e p r o t ~ i n e s n ' o n t p a s 6t6 e x t r a i t s . Ces p h o s p h o l i p i d e s p e u v e n t ~ t r e n ~ a n m o i n s d 6 t a c h ~ s p a r le m 6 1 a n g e m ~ t h y l a l - m 6 t h a n o l et d e s 1 6 c i t h i n e s o n t ~t6 i d e n t i f i 6 e s c o m m e c o m p o s 6 s m a j e u r s p a r c h r o matographic en couches minces.
Hdtdrogdnditd des a-lipoprotdines.
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FIG. 1. - - Electrophor~ses des lipoprot~ines sur cellogel : aLP, uP, aP~, aPs. Electrophor~se : tampon barbiturate pH 8,6 F 0,05, 14 V/cm, 2,5 mA, 1 h. Coloration : noir amide.
L ' a P ( a p o H D L ) est solubi]is6e d a n s un t a m p o n p h o s p h a t e 1 / 4 5 M F 0,05, c e t t e p r o t 6 i n e est i m m 6 d i a t e m e n t soluble q u e l l e que soit la v a l e u r du p H de ce t a m p o n .
F o r m a t i o n d'un gel. La p r o t 6 i n e (aP) d i s s o u t e d a n s le t a m p o n p h o s p h a t e se r 6 i n s o l u b i l i s e p a r t i e l l e m e n t au b o u t de I h e u r e en f o r m a n t au s e i n de la s o l u t i o n u n gel. On laisse ce gel se f o r m e r de 4 h 10 h e u r e s ; u n e fois le gel form6, les t u b e s p e u v e n t 6tre s o i t laiss6s h la t e m p 6 r a t u r e d u l a b o r a t o i r e , soit c o n s e r v 6 s au f r o i d s a n s q u e ce gel se solubilise. Ce gel se f o r m e q u e l que soit le p H de la s o l u t i o n t a m p o n e n t r e 5,29 et 9,18. Si n o u s a j o u t o n s de la s o u d e 0,1 M p o u r 61ever le p H v e r s 11, la s o l u b i l i s a t i o n d u gel est i m m 6 d i a t e et i r r 6 v e r s i b l e , c a r m 6 m e en r a m e nallt e n s u i t e le p H h 7 il n ' y a p l u s f o r m a t i o n de ce gcl. P a r c e n t r i f u g a t i o n h 4 000 t / r a i n on s 6 p a r e la f r a c t i o n s u r n a g e a n t e , le gel est a l o r s lay6 3 fois
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+ FI(L 2 . . - - Electrophor6ses des apoprotfines sur gel d'acrylamide 5,5 p. cent en ur6e 1 M. A : aP~ (50 i~g) B : aP (50 .Ixg) C : aPs (20 ug). Electrophor6se : tampon tris glyeine pH 8,3, 23 V / c m 2 mA, 1 h. Coloration : noir amide. a v e c le t a m p o n p h o s p h a t e p H 7,16 afin d ' 6 1 i m i n e r le m i e u x p o s s i b l e la f r a c t i o n s u r n a g e a n t e . Cc gel a i n s i isol6 est a l o r s s o l u b i l i s 6 darts le t a m p o n p h o s p h a t e p H 7,16 a d d i t i o n n 6 d ' u n e q u a n t i t 6 m i n i m u m de N a O H N / 1 0 (pH ~ 11). Les 2 sousf r a c t i o n s o b t e n u e s (if) s o l u b l e (aPs) et aP g61ifi6e (ctPc;) s o n t c o m p a r 6 e s e n t r e elles et c o m p a r 6 e s h l ' a p o H D L totale. Le d o s a g e d ' a z o t e n o u s a p e r m i s de d 6 t e r m i n e r le p o u r c e n t a g e de c h a c u n e des f r a c t i o n s p a r r a p p o r t h l ' a P ( t a b l e a u I). N o u s a v o n s d 6 t e r m i n 6 la q u a n t i t 6 de p h o s p h o l i p i d e s et d ' o s e s t o t a u x de c h a c u n e des f r a c t i o n s et n o u s a v o n s c o n s t a t 6 q u e la f r a c t i o n g61ifi6e, p l u s i m p o r t a n t e q u e la f r a c t i o n s o l u b l e p u i s q u ' e l l e e n t r a i n e en m o y e n n e 60 p. c e n t d e p r o t 6 i n e s (12 e x p 6 r i e n c e s ) , c o n t i e n t p r o portionnellement m o i n s de p h o s p h o l i p i d e s et d'oses. Les d o n n 6 e s s u r les a c i d e s a m i n 6 s t o t a u x de c h a c u n e des f r a c t i o n s s o n t p o r t ~ e s s u r le ta-
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M. Ayrault-Jarrier, G. Lastra, D. Pastier, J. Burdin et J. Polonovski.
b l e a u II. N o u s n o t o n s u n t a u x p l u s 61ev~ d e leuc i n e , h i s t i d i n e et a r g i n i n e d a n s l a p r o t 6 i n e g61i-
t 6 i n e t o t a l e et u n e t e n e u r p l u s f a i b l e d e s a c i d e s amin6s diacides.
+ Fro. 3. - - Electrophor6ses des apoprotdines en gel d ' a e r y l a m i d e en ur~e 8 M. LAeS t u b e s de droite sont en gel d ' a c r y l a m i d e 10 p. cent. : a P (50 Ilzg) B : ctP¢ (50 Iv,g) C : u p s (40 ~xg). Les tubes de gauche sont en gel d ' a c r y l a m i d e 5,5 p. cent. A' : a P s (30 ~tg) B : aPQ (50 teg) C ' : a P (40 ~zg). Electrophor6se : t a m p o n tris glycine pH 8,3, 23 V/cm, 2 mA, 1 h. C o l o r a t i o n : n o i r amide. fiable qui ne contient pratiquement pas l'isoleuc i n e t a n d i s q u e la p r o t 6 i n e s o l u b l e a u n e q u a n t i t 6 d ' i s o l e u c i n e b e a u c o u p p l u s 61ev6e q u e la p r o -
A
B FIG. 4. - - Immuno61ectrophor6se d'(xLP (5~ ttg). A : Coloration de la lame au noir soudan. B : Coloration de la lame au noir amide. L ' i m l n u n s d r u m utilis6 est u n sdrum a n t i apo HDL. Electrophor6se : t a m p o n b a r b i t u r a t e pH 8,6 1~ 0,05, 8 V/cm, 4 mA, 1 h. Diffusion : 48 h h 4°C.
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Ettzde dlectrophordtique. Si n o u s c o m p a r o n s la m o b i l i t 6 d e n o s f r a c t i o n s s u r c e l l o g e l d a n s u n t a m p o n p H 8,6 (fig. 1), n o u s constatons que l'aP a deux bandes de mobilit6 trbs diff6rente de celle de l'a-lipoprot6ine native ; l'une reste sur la ligne de d6part, l'autre a une m o b i l i t 6 6 q u i v a l e n t e a u x ~x2 g l o b u l i n e s . N o u s a v o n s c o i n p a r 6 les m o b i l i t 6 s 6 1 e c t r o p h o r 6 t i q u e s d e n o s d e u x s o u s - f r a c t i o n s : l ' a P G c o r r e s p o n d ~ la f r a c t i o n a P r a p i d e t a n d i s q u e l ' a P s c o r r e s p o n d 5 la f r a c t i o n se d 6 p l a c a n t p e u s u r le s u p p o r t . L e s 6 1 e c t r o p h o r b s e s s u r gel d ' a c r y l a m i d e 5,5 p. c e n t u r 6 e 1 ~ t a m p o n p H 8,3 (fig. 2) n o u s p e r mettent de mettre en 6vidence 7 bandes colorables au noir amide dans l'aP. Les 3 bandes pr6s e n t e s d a r t s l ' a P G se t r o u v e n t p a r m i l e s b a n d e s l e s p l u s l e n t e s d e I'ctP. L e s 4 b a n d e s d e la f r a c t i o n uP s sont au contraire plus sp6cifiquement local i s 6 e s p a r m i les p l u s r a p i d e s . L a p r 6 s e n c e d ' u n si grand hombre de bandes peut s'expliquer par l ' e x i s t e n c e d e p l u s i e u r s c h a i n e s a s s o c i 6 e s d a r t s les m o l 6 c u l e s d ' a L P q u i se d i s s o c i e n t a p r b s d 6 1 i p i d a t i o n . Mais il est p r o b a b l e q u ' e l l e s c o r r e s p o n d e n t
H~tdrogdnditd des u-lipoprotdines. e n c o r e h des a s s o c i a t i o n s p l u r i c a t 6 n a i r e s . A p r 6 s t r a i t e m e n t p a r l ' u r 6 e 8 M n o u s o b t e n o n s u n e s6par a t i o n t o t a l e m e n t d i f f S r e n t e . Si les 6 1 e c t r o p h o r 6 s e s s o n t faites sur gel d ' a c r y l a m i d e h 10 p. c e n t ex. t a m p o n t r i s u r 6 e 8 M (fig. 3), l ' a P totale p r 6 s e n t e 2 b a n d e s tr6s i m p o r t a n t e s de m o b i l i t 6 s p e u diff6r e n t e s c o r r e s p o n d a n t /~ des c h a i n e s p r o t ~ i n i q u e s de p o i d s m o l 6 c u l a i r e s tr6s p r o c h e s et au m o t h s 3 b a n d e s fines m o n t r a n t l ' e x i s t e n c e de c h a i n e s
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Immunodlectrophorbse. T o u t e s les i m m u n o 6 1 e c t r o p h o r ~ s e s o u t ~t6 faites a v e c des i m m u n s 6 r u m s s p 6 c i f i q u e s a n t i a p o H D L t o t a l e p r 6 p a r 6 s darts n o t r e l a b o r a t o i r e . L ' u L P (fig. 4) m o n t r e un c o m p o s 6 m a j e u r d o n t la l i g n e de p r 6 c i p i t a t i o n se c o l o r e f o r t e m e n t p a r le n o i r s o u d a n c o l o r a n t des l i p i d e s et u n e l i g n e de p r 6 c i p i t a t i o n en a r r i 6 r e q u i ne se c o l o r e p a s au n o i r s o u d a n , m a t s q u i est en c o n t i n u i t 6 p a r t i e l l e a v e c la l i g n e p r i n c i p a l e de I'~P.
L'uP one contient pas tousles a n t i g 6 n e s de I~gLP, c e c i est m o n t r ~ p a r la c o n t i n u i t 6 p a r t i e l l e de la l i g n e de I ' u L P a v e c les l i g n e s de I'uP o. L ' a P s c o n t i e n t au m o t h s 2 p r o t 6 i n e s i m m u n o l o g i q u e merit d i f f 6 r e n t e s de I'uP o et 2 p r o t 6 i n e s m i n e u r e s d o n t les l i g n e s de p r 6 c i p i t a t i o n s o n t en c o n t i n u i % a v e c celles de I'aP G. I1 y a doric b i e n au m o t h s •
D
Fro. 5. - - Immunodlectrophor6se. A : aLP (80 Ixg) B : uP (150 Ilxg) C : aPG (120 itxg) D : uPs (90 Ilxg). L'immuns6rum utilis6 est un sfrum anti apo HDL. M~mes conditions techniques que la figure 4. Coloration : noir amide.
p r o t 6 i n i q u e s de p o i d s m o l ~ c u l a i r e p l u s faible. L ' a P G ne d o n n e q u ' u n e b a n d e p r i n c i p a l e c o r r e s p o n d a n t h u n e des b a n d e s i m p o r t a n t e s de I'uP. P o u r l ' a P s n o u s r e t r o u v o n s toutes les b a n d e s de l'aP. Si n o u s u t i l i s o n s u n gel d ' a c r y l a m i d e m o t h s c o n c e n t r 6 h 5,5 p. c e n t en t a m p o n t r i s u r 6 e 8 M (fig. 3), la d i s s o c i a t i o n des b a n d e s est p l u s n e t t e : l ' a P n o u s m o n t r e 3 b a n d e s p r i n c i p a l e s au l i e u de 2. L'ctP G d o n n e aussi 2 b a n d e s tr6s r a p p r o c h 6 e s au lieu de I (en gel d ' a c r y l a m i d e h 4 p. cent, ces 2 b a n d e s s o n t e n c o r e m i e u x s6par6es), t a n d i s q u e
BIOCHIMIE, 1972,
l ' u P s n'a q u e 2 b a n d e s i m p o r t a n t e s c o r r e s p o n d a n t h la m o b i l i t 6 des 2 b a n d e s i m p o r t a n t e s les p l u s a n i o n i q u e s de l ' e P .
L ' u P (fig. 5) m o n t r e 3 l i g n e s de p r 6 c i p i t a t i o n d o n t u n e est tr6s p r 6 s de la c u v e t t e de l ' i m m u n . . s6rum. L ' a P c m o n t r e 2 l i g n e s de p r 6 c i p i t a t i o n c o r r e s p o n d a n t a u x 2 l i g n e s de l ' a P situ6es les p l u s p r 6 s de la c u v e t t e de l ' i m m u n s 6 r u m . L ' u P s m o n t r e 3 l i g n e s de p r 6 c i p i t a t i o n . P a r l ' i m m u n o d i f f u s i o n (fig. 6) on p e n t m o n t r e r q u e t o u s l e s a r c s des f r a c t i o n s d61ipid6es s o n t en c o n t i n u i t 6 a v e c I ' u L P native.
B
:••'
54, n ° 7.
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Fro. 6. - - Immunodiffusion. De gauche h droite aLP (50 Itxg), uPG (60 .ttg), aLP (50 Ilxg), uPs (50 '.lxg), ctPo (60 ,Ixg), uLP (50 ilxg). L'immuns6rum utilis6 est un s6rum anti apo HDL. Diffusion 48 h h 4°C. Coloration : noir amide.
4 p r o t 6 i n e s a n t i g 6 n i q u e m e n t d i s t i n c t e s d a n s YaP totale. Des 6tudes s e r o n t p o u r s u i v i e s p o u r s 6 p a r e r les d i f f 6 r e n t e s c h a i n e s de nos d e u x f r a c t i o n s et les identifier h l'aide d'immuns6rum sp6cifique. DISCUSSION. Les 6tudes faites p a r d ' a u t r e s a u t e u r s S e a n u [17, 8], A v i g a n [18], S h o r e [19] o u t m o n t r 6 que l ' a p o p r o t 6 i n e des H D L d u s 6 r u m h u m a i n p e u t O r e
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M. Agrault-Jarrier, G. Lastra, D. Pastier, J. Burdin et J. Polonovski.
o b t e n u e soluble a p r b s l ' e x t r a c t i o n des l i p i d e s p a r un s o l v a n t 6 t h a n o l - 6 t h e r . La s o l u b i l i t 6 des p r o d u i t s o b t e n n s v a r i e darts c h a q u e 6tude p r o b a b l e m e r i t h c a u s e des d i f f 6 r e n c e s darts le p r o c 6 d 6 d ' e x t r a c t i o n et darts le t a m p o n c h o i s i p o u r la solub i l i s a t i o n de l ' a p o p r o t 6 i n e . N o u s a v o n s v u q u ' u n e p e t i t e p r o p o r t i o n de p r o t 6 i n e s est s o l u b l e darts la p h a s e o r g a n i q u e c o m m e l'a m o n t r 6 S c a n u [7]. Cette p r o t 6 i n e est s o l u b l e darts un t a m p o n b a s i q u e . N o t r e t e c h n i q u e de d 6 1 i p i d a t i o n de la l i p o p r o t6ine et de s o l u b i l i s a t i o n de l ' a p o p r o t 6 i n e n o u s a c o n d u i t h la s 6 p a r a t i o n de 2 s o u s - f r a c t i o n s d o n t les c o m p o s i t i o n s s o n t d i f f 6 r e n t e s . Ce p h 6 n o m b n e de g61ification a d6jh 6t6 s i g n a l 6 p a r S c a n u [8~. Cet a u t e u r d i a l y s e I ' H D L c o n t r e un t a m p o n p H 8,6 F 0,1 a v a n t d 6 1 i p i d a t i o n p a r les s o l v a n t s o r g a n i q u e s . P o u r s o l u b i l i s e r l ' a p o p r o t 6 i n e , il utilise aussi du t a m p o n t r i s et t r o u v e q u e la solubilit6 d 6 p e n d d u p H , il o b t i e n t a u x e n v i r o n s du p H i s o 6 1 e c t r i q u e (4-6) la f o r m a t i o n d ' u n gel q u ' i l i n t e r p r b t e c o m m e u n e p o l y m 6 r i s a t i o n de l ' a p o p r o t6ine avec formation d'agr6gats, mats aucune 6tude de ce gel n ' a 6t6 p r 6 s e n t 6 e darts son t r a v a i l . N o u s a v o n s d 6 t e r m i n 6 un c e r t a i n h o m b r e cle c o n s t i t u a n t s de c h a c u n e des f r a c t i o n s isol6es. La c o m p o s i t i o n en oses et en p h o s p h o l i p i d e s n o n e x t r a c t i b l e s est d i f f 6 r e n t e e n t r e l ' a P ~ et I'~P s. La c o m p o s i t i o n en a c i d e s a m i n 6 s des a P est en a c c o r d a v e c les c h i f f r e s d o n n 6 s p a r S c a n u [23, S h o r e [5] et F r e d r i c k s o n [20]. P o u r la s o u s - f r a c t i o n uP(~ n o u s n o u s r a p p r o c h o n s des c h i f f r e s d o n n 6 s p a r S c a n u p o u r sa f r a c t i o n I I I isol6e p a r S 6 p h a d e x [:2] et des c h i f f r e s d o n n 6 s p a r S h o r e [5] p o u r sa f r a c t i o n R - T h r isol6e p a r c h r o m a t o g r a p h i e sur D E A E c e l l u l o s e . Cette f r a c t i o n est p r a t i q u e m e n t d 6 p o u r v u e d ' i s o l e u c i n e , elle est p l u s p a u v r e en p r o l i n e et v a l i n e q u e l'(xP m a t s p l u s r i c h e en l e u c i n e , h i s t i d i n e et a r g i n i n e . N o t r e (xP G c o n t i e n t un p e u p l u s de l y s i n e q u e les f r a c t i o n s isol6es p a r S h o r e et p a r S c a n u . P a r c o n t r e la f r a c t i o n R - T h r et n o t r e uP G out u n p e u m o t h s de p r o l i n e que la f r a c t i o n III, m a t s la f r a c t i o n I I I a u n e t e n e u r p l u s 61ev6e en l e u c i n e q u e la f r a c t i o n R - T h r et l ' a P G. D ' a p r b s nos r 6 s u l t a t s il s e m b l e q u e n o t r e ccPG c o n t i c n t des c h a l n e s d 6 p o u r v u e s d ' i s o l e u c i n e . s e l o n S h o r e il s ' a g i r a i t d ' u n e c h a l n e u n i q u e q u i c o n s t i t u e 60 p. c e n t des a p o l i p o p r o t 6 i n e s H D L , m a t s il est p o s s i b l e q u ' i l s ' a g i s s e e n c o r e d ' u n m6lange. E n effet la f r a c t i o n ~PG p a r a l t h o m o g 6 n e sur gel d ' a c r y l a m i d e h 10 p. c e n t en u r 6 e 8 M, m a t s si n o u s t r a v a i l l o n s a v e c un gel h 5,5 p. c e n t ou 4 p. c e n t en u r 6 e 8 M n o u s c o n s t a t o n s la p r 6 s e n c e de
BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 7.
2 disques rapproch6s mats distincts. Scanu a o b t e n u p a r e l e c t r o f o c u s i n g 4 b a n d e s a v e c sa f r a c tion I I I s a n s i s o l e u c i n e . D ' a u t r e p a r t n o u s a v o n s montr6 qu'au moths 2 antig6nes sont pr6sents d a n s c e t t e f r a c t i o n . Des i m m u n s 6 r u m s s p 6 c i f i q u e s p r 6 p a r 6 s h p a r t i r de l'(tP G d o n n e n t 2 a r c s de p r 6 c i p i t a t i o n a v e c l ' a P en c o n t i n u i t 6 a v e c les 2 a r c s de p r 6 c i p i t a t i o n de l'o.P G. T o u s nos r6sultats a i n s i q u c c e u x des a u t r e s a u t e u r s d 6 m o n t r e n t l ' h 6 t 6 r o g 6 n 6 i t 6 des apo H D L et c o m n l e S c a n u n o u s p e n s o n s que m 6 m e la f r a c t i o n s a n s i s o l e u c i n e est f o r m 6 e de c h a i n e s d i s t i n c t e s q u i s o n t e n s u i t e tr6s d i f f i c i l e m e n t dissoc i a b l e s p a r l ' u r 6 e 8 M. Ces c h a l n e s p o u r r a i e n t a v o i r le m 6 m e p o i d s m o l 6 c u l a i r e (PM 1 5 5 0 0 d ' a p r b s la c o m p o s i t i o n en a c i d e s amin6s) [5! m a t s p e u v e n t se d i f f 6 r e n c i e r p a r l e u r s c h a r g e s . D a n s la s o u s - f r a c t i o n ctP s a i n s i d 6 b a r r a s s 6 e de la c h a i n e ou des c h a i n e s s a n s i s o l e u c i n e , n o u s a v o n s m i s en 6 v i d e n c e la p r 6 s e n c e de 2 c h a i n e s immunologiquement d i s t i n c t e s , l ' u n e des d e u x p o u r r a i t 6ire la c h a l n e R - G l n isol6e p a r S h o r e . Des 6tudes s o n t en c o u r s p o u r les i s o l e r et les caract6riser. R~svM~. Los apoprotdines des HDL isoldes du s~rum h u m a i n sont obtennes par d$1ipidation h --20°C. Ces apoprotdines out 6t~ sdpardes en 2 fractions, une fraction soluble et une fraction g~lifiable. Ces 2 fractions sont distinctes par leur mobilitd dlectrophor6tique, leurs acides amiuSs et leurs earact6res antig~niqnes. La fraction gdlifiable tr6s semblable h la fraction R-Thr4onine ne semble pas constitu6e d'une seule chalne peptidique puisqu'elle n'est homog6ne ni en gel d'acrylamide ni en immun0~lectrophor6se. ZUSAMMENFASSUNG;
Die aus dem menschliehen S e r u m isolierten Apoprotei~e der HDL 'werden dutch Delipidation bet --20°C erhalten. Diese Apoproteine w u r d e n in zwei Fraktionen, eine 16sliche und eine Gel-forrrmnde Fraktion, getrennt. Diese beiden Fraktionen unterscheiden sich dnrch ihre elektrophoretische Mobillt~4t, ihre Aminosiiuren nnd ihre Antigen-Eigenschaften. Die Gel-formende Fraktion, ~relche der R-ThreoninFraktion sehr /ihnlich ist, scheint nicht ans ether einzigen Peptidkette zu bestehen, da sie vceder im Acrylamidgel noch in der Immunoelektrophorese homogen ist. BIBLIOGRAPHIE. 1. Brown, W. V., Levy, R. I. & Fredrickson, D. S. (1969) Biophys. J., 9, A 147. 2. Scanu, A., Toth, J., Edelstein, C., Koga, S. & Stiller, E. (1969) Biochemistry, 8, 3309. 3. Shore, B. & Shore, V. (1968) Biochemistry, 7, 2773.
Hdtdrogdnditd
des a-lipoprotdines.
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BIOCH1MIE, 1972, 54, n ° 7.
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Mise en 6vidence et sdparation des constituants protdiniques des -lipoprotdines du sdrum humain. M. AYRAULT-JARRIER, G. LASTRA, D. PASTIER, J. BURDIN et J. POLONOVSKI. Laboratoire de B i o c h i m i e - - Facult~ de Mddecine Saint-Antoine, 27, rue Chaligny - - Paris 12 °. (22/12/1971). Summary. - - HDL apoproteins isolated from human serum are obtained by delipidation at --20°C. These apoproteins are separated in two fractions : a soluble fraction and a fraction forming a gel. These two fractions are differeneiated by their electrophoretic mobility, their amino acid composition and their antigenic characteristics. The fraction forming a gel, very similar to the R-Threonin fraction, does not seem to be formed by only one peptidic chain since it is not homogenous in polyacrylamide gel eleetrophoresis and in immnnoeleetrophoresis.
INTROD UCTION. De r6centes 6tudes de s6paration sur colonnes c h r o m a t o g r a p h i q u e s ont m o n t r 6 l'h6t6rog6n6it6 des p o l y p e p t i d e s de l i p o p r o t 6 i n e s It, 2, 3, 4, 5, 6J. La partie p r o t 6 i n i q u e des a-lipoprot6ines ou HDL (*) (apo HDL) est f a c i l e m e n t o b t e n u e sous forme soluble, l i b r e de lipides, p e r m e t t a n t l'6tude des p o l y p e p t i d e s qui se t r o u v a i e n t associ6es dans les macromol6cules de lipoprot6ine. L'h6t6rog6n6it6 i m m u n o l o g i q u e de ces l i p o p r o t 6 i n e s avait d6jh 6t6 6voqu6e p a r c e r t a i n s auteurs [7, 8, 9], m a i s la c o r r e s p o n d a n c e entre les f r a c t i o n s polyp e p t i d i q u e s isol6es p a r c h r o m a t o g r a p h i e et les caract~res i m m u n o l o g i q u e s des diff6rents polyp e p t i d e s n ' a v a i t pus encore 6t6 montr6e. Dans le travail pr6sent6 ici, nous avons s6par6 deux sons-fractions distinctes de l ' a p o HDL, dont n o u s avons m o n t r 6 les diff6rences i m m u n o l o g i ques.
MATERIEL ET METHODES. 1 °) I s o l emen t des u-lipoprol~ines (HDL). Les s6rums h u m a i n s nous sont f o u r n i s p a r le Centre D6partemental de T r a n s f u s i o n S a n g u i n e de l'H6pital Saint-Antoine. Les l i p o p r o t 6 i n e s de densit6 comprise entre 1,100 et 1,170 sont isol6es apr6s p l u s i e u r s u l t r a c e n t r i f u g a t i o n s f r a c t i o n n 6 e s [10]. Ces fractions d6barrass~es de routes traces de ~-lipoprot6ines et d ' a u t r e s prot6ines du s6rum sont dialys6es 48 h e u r e s contre une solution isoto(*) HDL = high density lipoprotein.
n i q u e de NaC1 ou contre u n e solution de t a m p o n p h o s p h a t e pH 7,16 1/45 M c o n t e n a n t EDTA 10-3 M, et les c o n c e n t r a t i o n s obtenues sont en g6n6ral de 12 h 15 mg de l i p o p r o t 6 i n e s p a r ml de solution. 2 °) Ddlipidation des a-lipoprotdines. Les d61ipidations sont effectu6es p a r la m6thode de H a r d y et G a r d i n e r [11] avec u n m~lange 6thanol-6ther (3-1) h - - 2 0 ° C . 10 volumes de solvant p o u r 1 volume de solution sont utilis6s. La p r o t 6 i n e p r 6 c i p i t e l e n t e m e n t et le c o n t a c t avec le solvant est m a i n t e n u 16 heures. Apr6s centrifugation ~ - - 2 0 ° C , le solvant est 61imin6 et la prot6ine est lav6e 2 fois p a r remise en s u s p e n s i o n darts 10 v o l u m e s du m6me solvant. U n d e r n i e r lavage est alors p r a t i q u 6 avec de l'6ther pur, afin d'61iminer c o m p l 6 t e m e n t l'alcool du pr6cipit6. Le pr6cipit6 est a m e n 6 ~ 4 ° p e n d a n t 10 m i n u t e s puts h 20°C off il est repris p a r u n demi volume de t a m p o n p h o s p h a t e pH 7,16 M/45 ( c o n c e n t r a tion p r o t 6 i n i q u e e n v i r o n 10 m g / m l ) . 3 °) Analyse c h i m i q u e . La quantit6 de p r o t 6 i n e est d6termin6e apr6s u n microdosage d'azote p a r la m6thode de Dumas. Le dosage des oses totaux est f a r p a r la m6thode h l ' o r c i n o ! [12]. La quantit6 de p h o s p h o r e r e s t a n t d a n s la prot6ine d61ipid6e est d6termin6e apr6s m i n 6 r a l i s a t i o n p a r l'acide s u l f u r i q u e et H~O~ 300 ° p a r la m6thode de Fiske et S u b b a r o w [13]. 4 °) Analyse des acides amines. Les h y d r o l y s a t s sont pr6par6s avec HC1 6 N 110 ° p e n d a n t 48 h e u r e s et les acides amin6s dos6s
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M. A y r a u l t - J a r r i e r , G. L a s t r a , D. P a s t i e r , J. B u r d i n et J. P o l o n o v s k i .
h l'aide d'un autoanalyseur Technicon par chromatographic sur r~sine ~changeuse d'ions (Chrom o b e a d s A 120). 5 °) Electrophor~se sur acetate de cellulose.
a d j u v a n t d e F r e u n d ( v / v ) . A c h a q u e i n j e c t i o n les a n i m a u x r e c o i v e n t 12 h 14 m g d e p r o t 6 i n e s ; 10 j o u r s a p r 6 s l a d e r n i 6 r e i n j e c t i o n u n e p r i s e d e s a n g p e r m e t d e c o n t r 6 1 e r la f o r m a t i o n d e s a n t i c o r p s ; l ' a n i m a l est a l o r s s a c r i f i 6 .
Les dlectrophor~ses sont faites sur ac6tate de c e l l u l o s e e n t a m p o n b a r b i t u r a t e p H 8,6, f o r c e i o n i q u e 0,05. U n e t e n s i o n d e 10 V / c m est a p p l i qu~e h chaque bande avec une intensit6 de 2 mA par bande de 2 cm. Les bandes sont ensuite c o l o r 6 e s p a r le n o i r a m i d e .
P o u r t e s t e r la p u r e t 6 d e s H D L n o u s e m p l o y o n s un immuns6rum pr6par6 par l'Institut Pasteur, s~rum de cheval anti s6rum humain total (Lot. 742).
6 °) Electrophorbse en gel de polgacrglamide.
A p r 6 s d 6 t i p i d a t i o n le r e n d e m e n t d e s a p o - l i p o p r o t ~ i n e s o b t e n u e s e s t d e 85 h 90 p. c e n t e n v i r o n . L e s p r o t ~ i n e s n o n r 6 c u p 6 r 6 e s o n t ~t6 s o l u b i l i s 6 e s d a n s le s o l v a n t , e n t r a i n d e s p a r les l i p i d e s et elles prdcipitent lorsque nous ramenons la phase organ i q n e d e - - 2 0 0 C h la t e m p e r a t u r e d u l a b o r a t o i r e . Cette prot~ine est soluble darts un tampon basique et se c o m p o r t e e n ~ l e c t r o p h o r e s e c o m m e l ' a p o p r o t 6 i n e n o n e n t r a i n 6 e d a n s le s o l v a n t h - - 2 0 ° C .
L e s 6 1 e c t r o p h o r 6 s e s s o n t f a i t e s s u r gel d e p o l y a c r y l a m i d e s u i v a n t la m ~ t h o d e d e D a v i s [141 d a n s u n a p p a r e i l Q u i c k f i t 8 P E M . L e s gels s o n t p o l y m 6 r i s ~ s e n p r e s e n c e d ' u r 6 e 1 M o u d ' u r d e 8 M. L a c o n c e n t r a t i o n d u gel u t i l i s ~ est s o i t d e 5,5, s o i t d e 10 p. c e n t . L ' ~ l e c t r o p h o r b s e est f a i t e d a n s u n t a m p o n t r i s - g l y c i n e p H 8,3, 4°C, p e n d a n t 90 m i n u t e s avec une intensit6 de 2 mA par tube de 5 × 65 r a m . L e s gels s o n t c o l o r , s p a r le n o i r a m i d e .
RESULTATS.
TABLEAU II. 7 °) Immuno~lectroph~se. L e s i m m u n o ~ l e c t r o p h o r 6 s e s s o n t f a i t e s s u r agar o s e h 1 p. c e n t s e l o n la t e c h n i q u e d e G r a b a r et S c h e i d e g g e r El51. Le t a m p o n d ' 6 1 e c t r o p h o r ~ s e est u n t a m p o n b a r b i t u r a t e p H 8,6 F 0,05 a l o r s q u e l ' a g a r o s e est p r 6 p a r ~ d a n s u n t a m p o n b a r b i t u r a t e de mbme pH mais de force ionique plus faible F 0,025. L a t e n s i o n a p p l i q u ~ e h la l a m e d ' a g a r o s e est d e 8 V / e r a a v e c n n e i n t e n s i t 6 d e 4 m A p a r l a m e , la m i g r a t i o n d u r e 60 m i n u t e s . L e s i m m u n o d i f f u s i o n s s o n t a u s s i r 6 a l i s ~ e s darts l ' a g a r o s e h 1 p. c e n t [16] a v e c u n e a d a p t a t i o n p o u r la d i s p o s i t i o n d e s c u v e t t e s off l ' o n d ~ p o s e les f r a c t i o n s h O u d i e r et les i m m u n s 6 r u m s . 8 °) Preparation des immuns~rums. Les immuns6rums utilis6s sont des s6rums de lapin anti-apo-HDL totale, pr6par6s dans notre laboratoire. Les lapins re~oivent une injection tousles 15 j o u r s d ' u n m 6 1 a n g e d e p r o t 6 i n e qTABLEAU I.
Composition des constituants de l'aP correspondant & 100 mg de prot~ines et des 2 sons-fractions soluble et gdlifide. P Prot6ines . . . . . . . . . . . . . Phospholipides . . . . . . . . Oses . . . . . . . . . . . . . . . . .
~xPs
xPG
100 mg 34 mg / 60 mg 1 , 3 mg 0 , 9 mg 0 , 4 rng 1 , 2 mg [0,78 m g 10,43 mg
Ces r6sultats sont des m o y e n n e s de 6 exp6riences.
BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 7. r
Composition en nombre de tool. d'acides amines pour 1 000 tool. d'acides amines totaux.
Aeide aspartique . . . . . . Thr~onine . . . . . . . . . . . . S6rine . . . . . . . . . . . . . . . Acide glutamique . . . . . Proline . . . . . . . . . . . . . . . Glycocolle . . . . . . . . . . . . Alanine . . . . . . . . . . . . . . Valine . . . . . . . . . . . . . . . Mgthionine . . . . . . . . . . . lso'eueine . . . . . . . . . . . . Leucine . . . . . . . . . . . . . . Tyrosine . . . . . . . . . . . . . Ph6nylalanine . . . . . . . . Lysine . . . . . . . . . . . . . . . Histidine . . . . . . . . . . . . . Arginine . . . . . . . . . . . . .
cop
aPG
~Ps
84 49 57 174 64 50 75 65 10
87 44 59 188
75 64 44 146
44
46
45 77 53 13 2 149 32 28 98 2O 64
59 52 85 15 14 136 45 52 103 12 51
8
136 31 33 91 16 53
Ces analyses ne t i e n n e n t pas eompte du t r y p t o p h a n e n o n dos6, ni de la eystdine qui est p r a t i q u e m e n t a b s e n t e (il n ' a pas dt6 f a r d ' o x y d a t i o n p e r f o r m i q u e a v a n t l ' h y d r o l y s e de la protdine).
L a d 6 1 i p i d a t i o n 6 1 i m i n e e s s e n t i e l l e m e n t le c h o l e s t e r o l , les g l y c ~ r i d e s et 98 h 99 p. c e n t d e s p h o s pholipides. E n v i r o n 0,1 m g d e p h o s p h o l i p i d e s p o u r 10 m g d e p r o t ~ i n e s n ' o n t p a s 6t6 e x t r a i t s . Ces p h o s p h o l i p i d e s p e u v e n t ~ t r e n ~ a n m o i n s d 6 t a c h ~ s p a r le m 6 1 a n g e m ~ t h y l a l - m 6 t h a n o l et d e s 1 6 c i t h i n e s o n t ~t6 i d e n t i f i 6 e s c o m m e c o m p o s 6 s m a j e u r s p a r c h r o matographic en couches minces.
Hdtdrogdnditd des a-lipoprotdines.
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975
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. . . . . .
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1
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FIG. 1. - - Electrophor~ses des lipoprot~ines sur cellogel : aLP, uP, aP~, aPs. Electrophor~se : tampon barbiturate pH 8,6 F 0,05, 14 V/cm, 2,5 mA, 1 h. Coloration : noir amide.
L ' a P ( a p o H D L ) est solubi]is6e d a n s un t a m p o n p h o s p h a t e 1 / 4 5 M F 0,05, c e t t e p r o t 6 i n e est i m m 6 d i a t e m e n t soluble q u e l l e que soit la v a l e u r du p H de ce t a m p o n .
F o r m a t i o n d'un gel. La p r o t 6 i n e (aP) d i s s o u t e d a n s le t a m p o n p h o s p h a t e se r 6 i n s o l u b i l i s e p a r t i e l l e m e n t au b o u t de I h e u r e en f o r m a n t au s e i n de la s o l u t i o n u n gel. On laisse ce gel se f o r m e r de 4 h 10 h e u r e s ; u n e fois le gel form6, les t u b e s p e u v e n t 6tre s o i t laiss6s h la t e m p 6 r a t u r e d u l a b o r a t o i r e , soit c o n s e r v 6 s au f r o i d s a n s q u e ce gel se solubilise. Ce gel se f o r m e q u e l que soit le p H de la s o l u t i o n t a m p o n e n t r e 5,29 et 9,18. Si n o u s a j o u t o n s de la s o u d e 0,1 M p o u r 61ever le p H v e r s 11, la s o l u b i l i s a t i o n d u gel est i m m 6 d i a t e et i r r 6 v e r s i b l e , c a r m 6 m e en r a m e nallt e n s u i t e le p H h 7 il n ' y a p l u s f o r m a t i o n de ce gcl. P a r c e n t r i f u g a t i o n h 4 000 t / r a i n on s 6 p a r e la f r a c t i o n s u r n a g e a n t e , le gel est a l o r s lay6 3 fois
BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 7.
+ FI(L 2 . . - - Electrophor6ses des apoprotfines sur gel d'acrylamide 5,5 p. cent en ur6e 1 M. A : aP~ (50 i~g) B : aP (50 .Ixg) C : aPs (20 ug). Electrophor6se : tampon tris glyeine pH 8,3, 23 V / c m 2 mA, 1 h. Coloration : noir amide. a v e c le t a m p o n p h o s p h a t e p H 7,16 afin d ' 6 1 i m i n e r le m i e u x p o s s i b l e la f r a c t i o n s u r n a g e a n t e . Cc gel a i n s i isol6 est a l o r s s o l u b i l i s 6 darts le t a m p o n p h o s p h a t e p H 7,16 a d d i t i o n n 6 d ' u n e q u a n t i t 6 m i n i m u m de N a O H N / 1 0 (pH ~ 11). Les 2 sousf r a c t i o n s o b t e n u e s (if) s o l u b l e (aPs) et aP g61ifi6e (ctPc;) s o n t c o m p a r 6 e s e n t r e elles et c o m p a r 6 e s h l ' a p o H D L totale. Le d o s a g e d ' a z o t e n o u s a p e r m i s de d 6 t e r m i n e r le p o u r c e n t a g e de c h a c u n e des f r a c t i o n s p a r r a p p o r t h l ' a P ( t a b l e a u I). N o u s a v o n s d 6 t e r m i n 6 la q u a n t i t 6 de p h o s p h o l i p i d e s et d ' o s e s t o t a u x de c h a c u n e des f r a c t i o n s et n o u s a v o n s c o n s t a t 6 q u e la f r a c t i o n g61ifi6e, p l u s i m p o r t a n t e q u e la f r a c t i o n s o l u b l e p u i s q u ' e l l e e n t r a i n e en m o y e n n e 60 p. c e n t d e p r o t 6 i n e s (12 e x p 6 r i e n c e s ) , c o n t i e n t p r o portionnellement m o i n s de p h o s p h o l i p i d e s et d'oses. Les d o n n 6 e s s u r les a c i d e s a m i n 6 s t o t a u x de c h a c u n e des f r a c t i o n s s o n t p o r t ~ e s s u r le ta-
976
M. Ayrault-Jarrier, G. Lastra, D. Pastier, J. Burdin et J. Polonovski.
b l e a u II. N o u s n o t o n s u n t a u x p l u s 61ev~ d e leuc i n e , h i s t i d i n e et a r g i n i n e d a n s l a p r o t 6 i n e g61i-
t 6 i n e t o t a l e et u n e t e n e u r p l u s f a i b l e d e s a c i d e s amin6s diacides.
+ Fro. 3. - - Electrophor6ses des apoprotdines en gel d ' a e r y l a m i d e en ur~e 8 M. LAeS t u b e s de droite sont en gel d ' a c r y l a m i d e 10 p. cent. : a P (50 Ilzg) B : ctP¢ (50 Iv,g) C : u p s (40 ~xg). Les tubes de gauche sont en gel d ' a c r y l a m i d e 5,5 p. cent. A' : a P s (30 ~tg) B : aPQ (50 teg) C ' : a P (40 ~zg). Electrophor6se : t a m p o n tris glycine pH 8,3, 23 V/cm, 2 mA, 1 h. C o l o r a t i o n : n o i r amide. fiable qui ne contient pratiquement pas l'isoleuc i n e t a n d i s q u e la p r o t 6 i n e s o l u b l e a u n e q u a n t i t 6 d ' i s o l e u c i n e b e a u c o u p p l u s 61ev6e q u e la p r o -
A
B FIG. 4. - - Immuno61ectrophor6se d'(xLP (5~ ttg). A : Coloration de la lame au noir soudan. B : Coloration de la lame au noir amide. L ' i m l n u n s d r u m utilis6 est u n sdrum a n t i apo HDL. Electrophor6se : t a m p o n b a r b i t u r a t e pH 8,6 1~ 0,05, 8 V/cm, 4 mA, 1 h. Diffusion : 48 h h 4°C.
BIOCH1MIE, 1972, 54, n ° 7.
Ettzde dlectrophordtique. Si n o u s c o m p a r o n s la m o b i l i t 6 d e n o s f r a c t i o n s s u r c e l l o g e l d a n s u n t a m p o n p H 8,6 (fig. 1), n o u s constatons que l'aP a deux bandes de mobilit6 trbs diff6rente de celle de l'a-lipoprot6ine native ; l'une reste sur la ligne de d6part, l'autre a une m o b i l i t 6 6 q u i v a l e n t e a u x ~x2 g l o b u l i n e s . N o u s a v o n s c o i n p a r 6 les m o b i l i t 6 s 6 1 e c t r o p h o r 6 t i q u e s d e n o s d e u x s o u s - f r a c t i o n s : l ' a P G c o r r e s p o n d ~ la f r a c t i o n a P r a p i d e t a n d i s q u e l ' a P s c o r r e s p o n d 5 la f r a c t i o n se d 6 p l a c a n t p e u s u r le s u p p o r t . L e s 6 1 e c t r o p h o r b s e s s u r gel d ' a c r y l a m i d e 5,5 p. c e n t u r 6 e 1 ~ t a m p o n p H 8,3 (fig. 2) n o u s p e r mettent de mettre en 6vidence 7 bandes colorables au noir amide dans l'aP. Les 3 bandes pr6s e n t e s d a r t s l ' a P G se t r o u v e n t p a r m i l e s b a n d e s l e s p l u s l e n t e s d e I'ctP. L e s 4 b a n d e s d e la f r a c t i o n uP s sont au contraire plus sp6cifiquement local i s 6 e s p a r m i les p l u s r a p i d e s . L a p r 6 s e n c e d ' u n si grand hombre de bandes peut s'expliquer par l ' e x i s t e n c e d e p l u s i e u r s c h a i n e s a s s o c i 6 e s d a r t s les m o l 6 c u l e s d ' a L P q u i se d i s s o c i e n t a p r b s d 6 1 i p i d a t i o n . Mais il est p r o b a b l e q u ' e l l e s c o r r e s p o n d e n t
H~tdrogdnditd des u-lipoprotdines. e n c o r e h des a s s o c i a t i o n s p l u r i c a t 6 n a i r e s . A p r 6 s t r a i t e m e n t p a r l ' u r 6 e 8 M n o u s o b t e n o n s u n e s6par a t i o n t o t a l e m e n t d i f f S r e n t e . Si les 6 1 e c t r o p h o r 6 s e s s o n t faites sur gel d ' a c r y l a m i d e h 10 p. c e n t ex. t a m p o n t r i s u r 6 e 8 M (fig. 3), l ' a P totale p r 6 s e n t e 2 b a n d e s tr6s i m p o r t a n t e s de m o b i l i t 6 s p e u diff6r e n t e s c o r r e s p o n d a n t /~ des c h a i n e s p r o t ~ i n i q u e s de p o i d s m o l 6 c u l a i r e s tr6s p r o c h e s et au m o t h s 3 b a n d e s fines m o n t r a n t l ' e x i s t e n c e de c h a i n e s
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C
Immunodlectrophorbse. T o u t e s les i m m u n o 6 1 e c t r o p h o r ~ s e s o u t ~t6 faites a v e c des i m m u n s 6 r u m s s p 6 c i f i q u e s a n t i a p o H D L t o t a l e p r 6 p a r 6 s darts n o t r e l a b o r a t o i r e . L ' u L P (fig. 4) m o n t r e un c o m p o s 6 m a j e u r d o n t la l i g n e de p r 6 c i p i t a t i o n se c o l o r e f o r t e m e n t p a r le n o i r s o u d a n c o l o r a n t des l i p i d e s et u n e l i g n e de p r 6 c i p i t a t i o n en a r r i 6 r e q u i ne se c o l o r e p a s au n o i r s o u d a n , m a t s q u i est en c o n t i n u i t 6 p a r t i e l l e a v e c la l i g n e p r i n c i p a l e de I'~P.
L'uP one contient pas tousles a n t i g 6 n e s de I~gLP, c e c i est m o n t r ~ p a r la c o n t i n u i t 6 p a r t i e l l e de la l i g n e de I ' u L P a v e c les l i g n e s de I'uP o. L ' a P s c o n t i e n t au m o t h s 2 p r o t 6 i n e s i m m u n o l o g i q u e merit d i f f 6 r e n t e s de I'uP o et 2 p r o t 6 i n e s m i n e u r e s d o n t les l i g n e s de p r 6 c i p i t a t i o n s o n t en c o n t i n u i % a v e c celles de I'aP G. I1 y a doric b i e n au m o t h s •
D
Fro. 5. - - Immunodlectrophor6se. A : aLP (80 Ixg) B : uP (150 Ilxg) C : aPG (120 itxg) D : uPs (90 Ilxg). L'immuns6rum utilis6 est un sfrum anti apo HDL. M~mes conditions techniques que la figure 4. Coloration : noir amide.
p r o t 6 i n i q u e s de p o i d s m o l ~ c u l a i r e p l u s faible. L ' a P G ne d o n n e q u ' u n e b a n d e p r i n c i p a l e c o r r e s p o n d a n t h u n e des b a n d e s i m p o r t a n t e s de I'uP. P o u r l ' a P s n o u s r e t r o u v o n s toutes les b a n d e s de l'aP. Si n o u s u t i l i s o n s u n gel d ' a c r y l a m i d e m o t h s c o n c e n t r 6 h 5,5 p. c e n t en t a m p o n t r i s u r 6 e 8 M (fig. 3), la d i s s o c i a t i o n des b a n d e s est p l u s n e t t e : l ' a P n o u s m o n t r e 3 b a n d e s p r i n c i p a l e s au l i e u de 2. L'ctP G d o n n e aussi 2 b a n d e s tr6s r a p p r o c h 6 e s au lieu de I (en gel d ' a c r y l a m i d e h 4 p. cent, ces 2 b a n d e s s o n t e n c o r e m i e u x s6par6es), t a n d i s q u e
BIOCHIMIE, 1972,
l ' u P s n'a q u e 2 b a n d e s i m p o r t a n t e s c o r r e s p o n d a n t h la m o b i l i t 6 des 2 b a n d e s i m p o r t a n t e s les p l u s a n i o n i q u e s de l ' e P .
L ' u P (fig. 5) m o n t r e 3 l i g n e s de p r 6 c i p i t a t i o n d o n t u n e est tr6s p r 6 s de la c u v e t t e de l ' i m m u n . . s6rum. L ' a P c m o n t r e 2 l i g n e s de p r 6 c i p i t a t i o n c o r r e s p o n d a n t a u x 2 l i g n e s de l ' a P situ6es les p l u s p r 6 s de la c u v e t t e de l ' i m m u n s 6 r u m . L ' u P s m o n t r e 3 l i g n e s de p r 6 c i p i t a t i o n . P a r l ' i m m u n o d i f f u s i o n (fig. 6) on p e n t m o n t r e r q u e t o u s l e s a r c s des f r a c t i o n s d61ipid6es s o n t en c o n t i n u i t 6 a v e c I ' u L P native.
B
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54, n ° 7.
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Fro. 6. - - Immunodiffusion. De gauche h droite aLP (50 Itxg), uPG (60 .ttg), aLP (50 Ilxg), uPs (50 '.lxg), ctPo (60 ,Ixg), uLP (50 ilxg). L'immuns6rum utilis6 est un s6rum anti apo HDL. Diffusion 48 h h 4°C. Coloration : noir amide.
4 p r o t 6 i n e s a n t i g 6 n i q u e m e n t d i s t i n c t e s d a n s YaP totale. Des 6tudes s e r o n t p o u r s u i v i e s p o u r s 6 p a r e r les d i f f 6 r e n t e s c h a i n e s de nos d e u x f r a c t i o n s et les identifier h l'aide d'immuns6rum sp6cifique. DISCUSSION. Les 6tudes faites p a r d ' a u t r e s a u t e u r s S e a n u [17, 8], A v i g a n [18], S h o r e [19] o u t m o n t r 6 que l ' a p o p r o t 6 i n e des H D L d u s 6 r u m h u m a i n p e u t O r e
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M. Agrault-Jarrier, G. Lastra, D. Pastier, J. Burdin et J. Polonovski.
o b t e n u e soluble a p r b s l ' e x t r a c t i o n des l i p i d e s p a r un s o l v a n t 6 t h a n o l - 6 t h e r . La s o l u b i l i t 6 des p r o d u i t s o b t e n n s v a r i e darts c h a q u e 6tude p r o b a b l e m e r i t h c a u s e des d i f f 6 r e n c e s darts le p r o c 6 d 6 d ' e x t r a c t i o n et darts le t a m p o n c h o i s i p o u r la solub i l i s a t i o n de l ' a p o p r o t 6 i n e . N o u s a v o n s v u q u ' u n e p e t i t e p r o p o r t i o n de p r o t 6 i n e s est s o l u b l e darts la p h a s e o r g a n i q u e c o m m e l'a m o n t r 6 S c a n u [7]. Cette p r o t 6 i n e est s o l u b l e darts un t a m p o n b a s i q u e . N o t r e t e c h n i q u e de d 6 1 i p i d a t i o n de la l i p o p r o t6ine et de s o l u b i l i s a t i o n de l ' a p o p r o t 6 i n e n o u s a c o n d u i t h la s 6 p a r a t i o n de 2 s o u s - f r a c t i o n s d o n t les c o m p o s i t i o n s s o n t d i f f 6 r e n t e s . Ce p h 6 n o m b n e de g61ification a d6jh 6t6 s i g n a l 6 p a r S c a n u [8~. Cet a u t e u r d i a l y s e I ' H D L c o n t r e un t a m p o n p H 8,6 F 0,1 a v a n t d 6 1 i p i d a t i o n p a r les s o l v a n t s o r g a n i q u e s . P o u r s o l u b i l i s e r l ' a p o p r o t 6 i n e , il utilise aussi du t a m p o n t r i s et t r o u v e q u e la solubilit6 d 6 p e n d d u p H , il o b t i e n t a u x e n v i r o n s du p H i s o 6 1 e c t r i q u e (4-6) la f o r m a t i o n d ' u n gel q u ' i l i n t e r p r b t e c o m m e u n e p o l y m 6 r i s a t i o n de l ' a p o p r o t6ine avec formation d'agr6gats, mats aucune 6tude de ce gel n ' a 6t6 p r 6 s e n t 6 e darts son t r a v a i l . N o u s a v o n s d 6 t e r m i n 6 un c e r t a i n h o m b r e cle c o n s t i t u a n t s de c h a c u n e des f r a c t i o n s isol6es. La c o m p o s i t i o n en oses et en p h o s p h o l i p i d e s n o n e x t r a c t i b l e s est d i f f 6 r e n t e e n t r e l ' a P ~ et I'~P s. La c o m p o s i t i o n en a c i d e s a m i n 6 s des a P est en a c c o r d a v e c les c h i f f r e s d o n n 6 s p a r S c a n u [23, S h o r e [5] et F r e d r i c k s o n [20]. P o u r la s o u s - f r a c t i o n uP(~ n o u s n o u s r a p p r o c h o n s des c h i f f r e s d o n n 6 s p a r S c a n u p o u r sa f r a c t i o n I I I isol6e p a r S 6 p h a d e x [:2] et des c h i f f r e s d o n n 6 s p a r S h o r e [5] p o u r sa f r a c t i o n R - T h r isol6e p a r c h r o m a t o g r a p h i e sur D E A E c e l l u l o s e . Cette f r a c t i o n est p r a t i q u e m e n t d 6 p o u r v u e d ' i s o l e u c i n e , elle est p l u s p a u v r e en p r o l i n e et v a l i n e q u e l'(xP m a t s p l u s r i c h e en l e u c i n e , h i s t i d i n e et a r g i n i n e . N o t r e (xP G c o n t i e n t un p e u p l u s de l y s i n e q u e les f r a c t i o n s isol6es p a r S h o r e et p a r S c a n u . P a r c o n t r e la f r a c t i o n R - T h r et n o t r e uP G out u n p e u m o t h s de p r o l i n e que la f r a c t i o n III, m a t s la f r a c t i o n I I I a u n e t e n e u r p l u s 61ev6e en l e u c i n e q u e la f r a c t i o n R - T h r et l ' a P G. D ' a p r b s nos r 6 s u l t a t s il s e m b l e q u e n o t r e ccPG c o n t i c n t des c h a l n e s d 6 p o u r v u e s d ' i s o l e u c i n e . s e l o n S h o r e il s ' a g i r a i t d ' u n e c h a l n e u n i q u e q u i c o n s t i t u e 60 p. c e n t des a p o l i p o p r o t 6 i n e s H D L , m a t s il est p o s s i b l e q u ' i l s ' a g i s s e e n c o r e d ' u n m6lange. E n effet la f r a c t i o n ~PG p a r a l t h o m o g 6 n e sur gel d ' a c r y l a m i d e h 10 p. c e n t en u r 6 e 8 M, m a t s si n o u s t r a v a i l l o n s a v e c un gel h 5,5 p. c e n t ou 4 p. c e n t en u r 6 e 8 M n o u s c o n s t a t o n s la p r 6 s e n c e de
BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 7.
2 disques rapproch6s mats distincts. Scanu a o b t e n u p a r e l e c t r o f o c u s i n g 4 b a n d e s a v e c sa f r a c tion I I I s a n s i s o l e u c i n e . D ' a u t r e p a r t n o u s a v o n s montr6 qu'au moths 2 antig6nes sont pr6sents d a n s c e t t e f r a c t i o n . Des i m m u n s 6 r u m s s p 6 c i f i q u e s p r 6 p a r 6 s h p a r t i r de l'(tP G d o n n e n t 2 a r c s de p r 6 c i p i t a t i o n a v e c l ' a P en c o n t i n u i t 6 a v e c les 2 a r c s de p r 6 c i p i t a t i o n de l'o.P G. T o u s nos r6sultats a i n s i q u c c e u x des a u t r e s a u t e u r s d 6 m o n t r e n t l ' h 6 t 6 r o g 6 n 6 i t 6 des apo H D L et c o m n l e S c a n u n o u s p e n s o n s que m 6 m e la f r a c t i o n s a n s i s o l e u c i n e est f o r m 6 e de c h a i n e s d i s t i n c t e s q u i s o n t e n s u i t e tr6s d i f f i c i l e m e n t dissoc i a b l e s p a r l ' u r 6 e 8 M. Ces c h a l n e s p o u r r a i e n t a v o i r le m 6 m e p o i d s m o l 6 c u l a i r e (PM 1 5 5 0 0 d ' a p r b s la c o m p o s i t i o n en a c i d e s amin6s) [5! m a t s p e u v e n t se d i f f 6 r e n c i e r p a r l e u r s c h a r g e s . D a n s la s o u s - f r a c t i o n ctP s a i n s i d 6 b a r r a s s 6 e de la c h a i n e ou des c h a i n e s s a n s i s o l e u c i n e , n o u s a v o n s m i s en 6 v i d e n c e la p r 6 s e n c e de 2 c h a i n e s immunologiquement d i s t i n c t e s , l ' u n e des d e u x p o u r r a i t 6ire la c h a l n e R - G l n isol6e p a r S h o r e . Des 6tudes s o n t en c o u r s p o u r les i s o l e r et les caract6riser. R~svM~. Los apoprotdines des HDL isoldes du s~rum h u m a i n sont obtennes par d$1ipidation h --20°C. Ces apoprotdines out 6t~ sdpardes en 2 fractions, une fraction soluble et une fraction g~lifiable. Ces 2 fractions sont distinctes par leur mobilitd dlectrophor6tique, leurs acides amiuSs et leurs earact6res antig~niqnes. La fraction gdlifiable tr6s semblable h la fraction R-Thr4onine ne semble pas constitu6e d'une seule chalne peptidique puisqu'elle n'est homog6ne ni en gel d'acrylamide ni en immun0~lectrophor6se. ZUSAMMENFASSUNG;
Die aus dem menschliehen S e r u m isolierten Apoprotei~e der HDL 'werden dutch Delipidation bet --20°C erhalten. Diese Apoproteine w u r d e n in zwei Fraktionen, eine 16sliche und eine Gel-forrrmnde Fraktion, getrennt. Diese beiden Fraktionen unterscheiden sich dnrch ihre elektrophoretische Mobillt~4t, ihre Aminosiiuren nnd ihre Antigen-Eigenschaften. Die Gel-formende Fraktion, ~relche der R-ThreoninFraktion sehr /ihnlich ist, scheint nicht ans ether einzigen Peptidkette zu bestehen, da sie vceder im Acrylamidgel noch in der Immunoelektrophorese homogen ist. BIBLIOGRAPHIE. 1. Brown, W. V., Levy, R. I. & Fredrickson, D. S. (1969) Biophys. J., 9, A 147. 2. Scanu, A., Toth, J., Edelstein, C., Koga, S. & Stiller, E. (1969) Biochemistry, 8, 3309. 3. Shore, B. & Shore, V. (1968) Biochemistry, 7, 2773.
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