Perjodat-bestimmung: einfache, kolorimetrische methode mit hoher empfindlichkeit und selektivität

Analytica OElscvicr

Chimica Acia, 96 (1978) Scientific

31X-317

Publishing Company,

Amsterdam

- Printed in The Netherlands

PE~O~AT-BEST~~~U~~: ELNFACHE, KOL~RI~~TRISCHE METHOL3E MIT HOHER E.MPFINDLICHKEIT UND SELEKTIVITiiT

H. GALLATI

Diagnostische

~~~~h~n~~a~~eil~n~

der F. ~offma~n-I-a

(Eingcgangcn

den 17. August 1977)

Rock

Q Co. AC, Base1 Gchweiz)

ZUSAMMENFASSUNG Durch Ferjodat wird Phenol aktiviert und kondcnsicrt mit 4-hminountipyrin zum rotcn Chinonimin-Farbstoff. Die Farbintensitit zeigt einc lineare Proportionalitat zum eingesetzten Perjodat im Konzcntrationsbcreich von O-200 pmol I- I. Diese neue Perjodatbestimmungsmcthode zeichnet sich aus durch eine einfache und schnelle Testdurchfiihrung (nach Vermischen dcr Probe mit dcr Reagenzienltisung kann die Farbintensitit nach 10 hlin bcstimmt werden), durch hohc Sensibilitit (bis &mol I-’ Perjodat), gutc Selektivitit und Reproduzierbarkeit (VK = 0.7%). Sic ist interessant fcir analytische und synthetische Arbcitcn mit Perjodat aIs Oxydationsmittel. Es werden Bcispielc fiir den Oxydationsvcrlauf

Perjodat

van l&licher

St&kc

sowic

vcrschiedcnen

Sephadcxartcn

bci Anwcscnheit

von

gcgebcn.

SUXfMARY Phenol is activated by periodate and condensed with 4-aminoantipyrine to a red quinoneimine dye; the absorbance is proportional to the periodate concentration in the range O-200 urnol 1-“‘. The procedure is simple and quick (the sample and reagent are incubated at 25°C for 10 min). shows high sensitivity (2 pmol I-’ periodate), and good selectivity and reproducibility (r.s.d. = 0.7%). It is usefu1 for analytical and synthetic work when periodate is used .a.soxidizing agent. Esamptes are given for the oxidation of soluble starches as well as for various species of Sephadex.

Fiir die analytischen und synthetischen Arbeiten mit Perjodat als Oxydationsmittel ist es wesentlich, den Reaktionsverlauf durch wiederholte quantitative Bestimmungen der eingesetzten Reaktionspartner oder der gebildeten Keaktionsprodukte zu verfolgcn. Dazu wird tieistens der Verbrauch an Pejodat gemessen, indem entweder das bei der Reaktion gebildete Jodat nach eincr koforimetrischen Methode [l-5 J oder das in der Reaktionsmischung noch vorhandene Perjodat titrimetrisch [ 6-91, photometrisch bei dcr Wellenllnge 222,5 nm [ lo-12 f oder kolorimetrisch [ 13-151 bestimmt wird. All diese Methodcn haben aber den Nachteil, dass sic in der Durchftihrung aufwendig und zeitraubend sind (titrimetrische und kolorimetrische Methoden), oder dass sie nur beschtinkt eingesetzt werden kannen (photometrische Bestimmung des Perjoda+A bei 222,5 nm ist nur mijglich, sofem keine andere Subsfanz der Reaktionslijsung bei diescr WcllenEinge absorbiert).

312 In der vorliegenden Arbeit wird eine neue Methode zur Bestimmung von Perjodat beschrieben, die sich durch Einfachheit in der Durchftihrung, dwch eine gute Reproduzierbarkeit sowie durch eine hohe Empfindhchkeit und SeIektiviGt auszeichnet. Ueberraschenderweise hat sich gezeigt, dass Phenol durch Perjodat aktiviert wird und mit 4-Aminoantipyrin zum roten Chinonimin-Farbstoff kondensiert, dessen Farbintensitit der Perjodatkonzentration direkt proportional ist. &lit der VorgeschIagenen IMethode kann innerhalb von 10 iMin Pejodat in einem Konzentrationsbereich von Z-ZOO pmol1-’ quantitativ bestimmt werden, MATERIAL

UND METHODEN

Die venvendeten Chemikaben waren analysenrein. 4--4mino=tipyrin (4-Amino-l,5dimethyl-2-phenyl-3-pyrazolon, 4-Aminophenazon) wurde von Fluka, Schweiz bezogen. Zur Bestimmung der Pejodatkonzentration in einer Reaktionsmischung wird eine bestimmte Probenmenge in 0,15 mol 1-i Natrium-Boratpuffer vom pH 10 mit 25 mmoll-l Phenol und 2 mmol I-’ 4-Amino~tipy~n bei 25°C inkubiert und zwischen der 10 und 40 1Vin die Farbintensitit photometrisch bei 500 nm gemessen. Mit Hilfe einer PerjodatStandardkurve, einer Perjodat-StandardlGsung oder eines Umrechnungsfaktors kann dann die Perjodatkonzentration in der Reaktionsmischung berechnet werden. RESULTATE

Spektrum

UND

DISKUSSION

der en tstehenden

Farbliisung

Das durch Perjodat aktivierte Phenof kondensiert mit dem 4-Aminoentipyrin zu einem roten Farbstoff, dessen Spektrum (Abb. 1) identisch ist mit demjenigen des Chinonimin-Farbstoffes, der bei der “Trinder-Reaktion” [ 16) unter Einwirkung von Peroxidase auf HZOZ in Gegenwart von Phenol und 4-Aminoantipyrin entsteht. Es ist daher anzunehmen, dass bei der Bildung dieses Farbstoffs die katiytische Reaktion dcr Peronidase mit H,02 durch das Oxydationsmittel Perjodat ersetzt werden kann. Der gebildcte Chinonimin-Farbstoff zeigt ein breites Absorptionsband mit dcm 1Maximum bei der WellenI&nge 500 nm. Im Bcreich von 400 nm bis 600 nm bestcht eine lineare ProportionalitZt zwischen der eingesetzten ?vIenge an Perjodat und der entstehenden Farbintensitit.

Einfluss des pH-Weries und des Puffersystems

auf die Farbentwickiungskurze

Die Farbentwicklungskutve wird wesentlich vom pH-Wert der Reaktions!(isung b~ein~usst (Abb. 2). Unter sonst identischsn Re~~ionsbed~~ngen v&d beim pH IO nach einer Reaktionsdauer von 5-10 Mm die maximale Farbintensitit erreicht, die iiber 40 i&finstabil ist, Whrend bei tieferen-und hijheren pH-Werten innerhalb der Messdauer die Farbintensitit instabil bleibt. Dabei kann festgestellt werden, dass im stark alkahschen ,Miiieu

313

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Abb. 1. Die angcgebenen Mcngen Perjodnt wecden in 0,I5 moI I-lNatrium-Boratpuffer vom ptl 10 mit 28 mmol I-’ Phenol und 2 mmol 1- ’ I-Aminoantipytin vrPhrend 10 Min bei 25°C inkubicrt und anschlierscnd die Spektren der cntsprechenden Farbl&sungen aufgenommen. Abb. 2. Perjodat (100 rmol1-‘) werdcn in 0,X5 moI 1-’ ~atrium-Boratpuffcr dcr angegebenen pli-Werte mit 25 mmol I”’ Phenol und 2 mmal 1-l 4-Aminoantipyrin bei 25°C inkubicrt und nach bestimmten Zcitintervallen die Absorption bei 500 nm gemessen.

(2-B. bei pH 12) langsam eine Farbvefindenmg von Rot nach Blau eintritt, was sich in den entsprechenden Spektren dieser ReaktionslMmgen zeigt. (Abb. 3). Beim pH 12 nimmt nach 5 Min Reaktionsdauer die FarbintensiGt bei 500 nm langsam ab und bei 630 nm entsprechend zu. Diese FarbverGnderung ist aber nach 60 Min noch nicht abgesehlossen. Der bei pi-I 10 gebildete und stabile Chinonimin-Farbstoff verliert bei hijheren und tieferen pH-Wertzn an Farbintensitit und FarbstabiWit. Rci sonst identischen ~e~tionsbedin~ngen zur Bestimmung von Perjodat ist die entstehende Farbintensitit abh%ngig vom eingesetzten Puffersystem. Die htichste Absorption wird mit dem Puffersystem Natriumcarbonat (=lOO%) enielt., gefolgt van l\latrhnr&orat (94%), Natriumphosphat (88%). Triethanolamin (50%) und Tris(hydroxymethy~)-~inometh~ (6%). Die Resultate ftir die beiden tetztcn Puffer lassen vermuten, dass Triethanolamin und vor ailem Tris t13J durch Pejodat oxydiext werden. Die Konzentmtion an Natrium-Borat beeinflusst die Reaktionsge: schwindigkeit wie such die Farbintensit& Whrend mit 150 mmol 1-l NatiumBoratpuffer innerhalb von 5-10 Min (je nach eingcsetzter Perjodatmenge) die maximale FarbintensitZit erreicht wird, die anschliessend iiber 40 Min stabil bleibt, nimmt bei geringerer Pufferkonzentration die Reaktionsgeschwindigkeit wesentlich ab, so dass die maximale Farbintcnsitit erst nach Ungerer Reaktionsdauer erreicht wird. Bei hijilerer Natrium-Borat-

314

der nngcgcbcnen Abb. S. Perjndat (100 Ltmoi 1-‘) tverden in 0,15 mot I- ’ Nat&m-nor&puffer pH-Wxte mit 25 mmol I-’ Phenol und 2 mmol 1-l 4-Aminoantipyrin bei 35°C wahrend 60 Min inkubicrt und nnschliessrnd die Spektren der entsprechenden Farbtbsungen aufgenommen.

konzentration bleibt die rasch gebildete Farbintensitit nicht stab& Auf Grund dieser Ergebnisse wurde ftir die Perjodat-Bestimmung eine NatriumBoratkonzentration von 150 mmol l-’ g:ewSihlt_

Bestimmung

des Ko~ze~trat~onso~t~rn~rns

fiir Phenol und ~-Ami~uanti~yri~

Die AbhSngigkeit der Farbintensitit von der Phenollronzentration wurde bei Anwesenheit von 100 ~rrno! I-’ Perjodat und 2 mmol l-’ 4-Am~o~t~py~n untersucht und dabei festgestellt, dass mit 25 mmol 1-l Phenol die h6chst.e Farbintensitit und eine gute Farbstabiiitit erreicht wird, Die Unterschiede der Farbintensitit im Konzentrationsbereich von 3 bis 100 mm01 1-l Phenol sind gering, Mit Pheno~onzent~tionen unter 3 mmol l-’ werden wesenthch geringere Farbintensititen erreicht. Bei Anwesenheit von 100 pmol 1-l Pejodat und 25 mmoi 1-l Phenol sind zur Erreichung einer optimalen Farbintensitit minimal 300 pm01 I“ 4-Aminoantipyrin notwendig. Eine hiihere 4-Aminoantipyrin-Konzentration hat auf die Perjodat-Bestimmung keinen negativen Einfluss, Mhrend bei Konzentrationen untcr 300 Crmol !-I die erreichbare FarbintensitSt stark abnimmt.

Empfindiichkeit,

1Zeproduzierbarkeit,

SelektivitO’t und StabilitCt

Unter den vorgeschiagenen Testbedingungen besteht eine lineare Proportionalit% zwischen der Absorption bei 500 nm und der in der Testlijsung vorhandenen Perjodatmenge jm Konzentrationsbereich von O-120 ctmol I-’ CAS,,Onm= O--0,9). Die Nachweisgrenze liegt bei 2 umollW1 Pejodat. An Stelle von Pejodat kann bei entsprechend abg&inderten Testbedingungen sowohl 4-Aminoantipyrin wie such Phenol mit gleicher Empfindlichkeit nachgewiesen

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werden, sodass bezogen auf die Proportionalitiit der Farbintensitgt zur eingesetzten molaren Konzentration identische Standardkurven fur Perjodat, 4--4minoantipyrin und Phenol erhalten werden. Die Priifung dcr Reproduzierbarkeit dieser Perjodat-Bestimmungsmethode mit 20 serienmgssig durchgefiihrten Bestimmungen [80 Drnol 1-l NaIO,] ergab eincn Variationskoef!Lienten von 0,7X Die Interferenzstudien mit verschiedenen Anionen im Konzentrationsbereich von l-100 mmol 1-l haben ergeben, dass die beschriebene PerjodatBestimmungsmethode durch Jodid, Jodat, Chlorid, Chlorat, Perchlorat, Nitrat, Nitrit, Sulfat, Ammoniumacetat, Wasserstoffperoxyd und EDTA nicht beeinflusst wird, w&rend Hypochlorit, Sulfit und T&Puffer stark interferieren. Protein in Konzentrationen iiber 0.1 g 1-l in der Testlijsung bewirken eine der Proteinkonzentration entsprechende Abnahme der l?arbintensit.?it sowie eine Verschlechterung der Farbstabilitit. Diese Proteininterferenz kann dadurch erklti werdcn, dass das durch Pejodat aktivierte Phenol such mit freien Aminogruppen des Proteins kondensiert, und dass sich anderseits em Protein-Farbstoffkomplex bildet, wodurch das Resonanzsystem des Chinonimin abgeschwacht und dadurch die Farbintensitit vermindert wird. Die Pejodat-Testlosung in der vorgcschlagenen Zusammensetzung (0,15 mol 1-l Natrium-Boratpuffer vom pH 10 mit 25 mmol 1-l Phenol und 2 mmol 1-l 4-Aminoantipyrin) ist in einer gut verscblossenen, braunen Glasflasche bei Raumtemperatur 7 Tage und bei 4°C 4 Wochen haltbar. Die langsam entstehende Rosaftibung hat auf die Perjodat-Bestimmung keinen Einfluss. Eine 5 mmol I-’ Perjodatlijsung in 50 mmol 1-l Natriumphosphat im pH-Bereich von 2-11 ist in einer braunen Glasflache bei Raumtemperatur aufbewahrt w?ihrend mindestens 2 Wochen haltbar. Dank dieser guten Stabilitit der Pejodatlijsung kann die Berechnung der Perjodatkonzentration in einer Probe - neben dcr Beniitzung einer PerjodatStandardkurve oder eines Umrechnungsfaktors - such mit Hilfe einer mitgeftihrten PejodatStandardlosung erfolgcn. Praktische Anwendungsbeispiele der Perjodat-Bestimmungsmethode Die Oxydation von loslicher Stike bei 25°C durch Pejodat verkiuft langsam und ist nach 24 Stunden noch nicht abgeschlossen. Fiir den Oxydationsverlauf der _4bb. 4 wurden zu 5 mmol 1-l Perjodat losliche St&ke im Konzentrationsbereich von O-5 mmol 1-l (bezogen auf den Glucosegehalt) zugesetzt und nach bestimmten Zeitintervallen der Verbrauch an Perjodat gemessen. Fiir die Versuche der Abb. 5 wurde die liisliche St3rke durch verschiedene Arten von Sephadex ersetzt. Daraus ist ersichtlich, dass Perjodat Sephadex bedeutend schneller oxydiert als losliche Stirke, und dass anderseits stirker vemetzte Sephadexarten wie Sephadcx G-10 oder G-15 weniger Perjodat verbrauchen als die weniger stark vernetzten Sephadexarten van G-25 bis G-200.

316

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Abb. 4. LGsiiche Sttike in den angegebenen Konzentrationen wird in einer wiissrigcn, 5 mmoi I-’ Perjodatlljsung bei 25°C inkubiert. Nach bestimmten Zeitintervailen wird nach der beschriebcnen Methode die noeh vorhandene Perjodatmenge gemcssen. Abb. 5. Vcrschiedcne Arten von Sephadex (in einer auf Glucose bczogencn Konzentration vcn 80 mmol 1-l) wcrden in einer w&srigen, 40 mmol 1-l Perjodatlosung bei 25°C inkubiert. Nach bestimmtcn Zeitintervailcn wird nach der beschriebenen Methode die noch vorhandene Perjodatmcnge gemcssen. Der durch Perjodat bemirkte, zeitliche Oxydationsverlauf der Disaccharide Saccharose, Maltose und Lactose ist unterschiedlich. Am schnellsten wird Lactose oxydiert, gefolgt von der Maltose und der Saccharose. Zudem ist such der Verbrauch an Perjodat zur Osydation von 1 mmol 1-l der drei Disacchariden verschieden (Lactose: 4 mmol I-’ ; Maltose und Saccharose: 3 mmol

1-l NaIO.+).

Von den untersuchten lMonosacchariden wird die Fructose am schnellsten durch Pejodat oxydiert, gefolgt von der Glucose und der Mannose. Der Perjodatverbrauch ist such bei diesen drei untersuchten Monosacchariden unkrschiedlich: 1 M Mannose und Glucose verbrauchen 4 M Perjodat, w&end 1 IM Fructose 3 IM Pejodat benijtigen. Ethylengiycol ist in wenigen Minuten durch Perjodat oxydiert. Dabei entsteht eine lineare Proportionalit& des Perjodatverbrauchs zur eingesetzten Ethylenglycolkonzentration: 1 M Pejodat vermag 1 M Ethylenglycol zu oxydieren. Der Autor dankt Fri. H. Dettmar der Durchfiirung der Versuche.

fiir die effiziente

technische

HiLfe bei

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