- Email: [email protected]
Prozentuale Beteiligung von exogenem Cytidin an der RNS-Synthese der Leber der Ratte
Copyright All rights
0 1973 by Academic Press, Inc. o/ reproduction in any form reserved
Experimental
PROZENTUALE
Cell Research 78 (1973) 143-151
BETEILIGUNG
DER
VON
RNS-SYNTHESE
DER LEBER
G. SCHMID Institut
fiir
Medizinische
EXOGENEM
CYTIDIN
DER
AN
RATTE
und W. MAURER
Strahlenkunde, Universittit 87 Wiirzburg, BRD
Wiirzburg,
SUMMARY The percental participation of exogenous cytidine in liver RNA synthesis was determined after application of 3H-cytidine to rats. The amount of exogenous cytidine was varied by a factor of 5 x 106, between 0.000 02 and 10.0 ,ug/g rat. With the 3H-cytidine doses and specific activities most frequently reported in the literature, the percental participation of the exogenous precursor is only about 0.1 %. with 99.9 % of the cvtidvlic acid incorporated into RNA under these conditions being of endogenous origin. - The results show that the upper limit of the tracer dose of exogenous cytidine is about 1.0 pg/g rat. Within this tracer region 1.8 % of 3H-activity-and therefore 1.8 % of the amount of exogenous cytidine-is incorporated into liver RNA. The dependence of the uercental _uarticioation on the _ duration of the experiments is examined. It is shown that autoradiographic grain density and specific activity of RNA can only be regarded as direct measures for the rate of RNA synthesis in different cells and animals if the percental participation of exogenous cytidine in RNA synthesis is generally of equal value. Comparable situations exist in the incorporation of $H-thymidine into DNA as shown by earlier experimental work. ZUSAMMENFASSUNG Die Prozentuale Beteiligung von exogenem Cytidin an der RNS-Synthese der Leber der Ratte wurde nach Gabe von 3H-Cytidin bestimmt. Die Menge des injizierten Cytidin wurde urn den Faktor 5. lo5 variiert und schwankte zwischen 0,000 02 und 10,O pup/g Ratte. Fiir die tiblicherweise verwandten 3H-Cytidin-Mengen und spez. Aktivitlten betdgt die Prozentuale Beteiligung nur etwa 0,l %, wlhrend 99,9 % der in die RNS eingebauten Cytidylslure endogenen Ursprungs ist. Die Ergebnisse zeigen, dal3 die obere Grenze des Tracer-Bereiches fur exogenes Cytidin etwa 0,l ,ug/g Ratte betrlgt. Innerhalb des Tracer-Bereiches werden 1,8 % der injizierten CytidinAktivitlt - damit 1,s % der exogenen Cytidin-Menge - in die Leber-RNS eingebaut. Es wurde ferner die Abhangigkeit der Prozentualen Beteiligung von der Versuchsdauer untersucht. Es wird gezeigt, da8 die autoradiographische Rorndichte und die spez. Aktivitlt der RNS nur dann als ein direktes Ma8 fur die RNS-Synthese-Rate in verschiedenen Zellen und bei verschiedenen Tieren darstellt, wenn die Prozentuale Beteiligung von exogenem Cytidin an der RNSSynthese i&era11 gleich ist. Vergleichbare Verhlltnisse liegen beim Einbau von ‘H-Thymidin in die DNS vor, wie wir durch friihere Arbeiten zeigen konnten.
Lang, Mtiller & Maurer [15] zeigten fiir Versuche mit 3H-Thymidin, da13die Prozentuale Beteiligung von exogenem Thymidin an der DNS-Synthese bei einer Reihe von Zellarten der Maus tibereinstimmt. Das gilt such ftir Zellen mit verschiedener Dauer der S Phase [l 1, 12, 15, 221. Die Griil?e der Belo-
731818
teiligung ist bei den iiblicherweise in der Literatur verwandten 3H-Thymidin-Aktivitaten hoher spezifischer Aktivitat sehr klein. Nur 0,1-l % der in DNS eingebauten Thymidylsaure sind exogenen Ursprungs. Der Mechanismus, der bei den untersuchten Zellarten zu einer so kleinen aber konstanten BeteiExptl
Cell Res 78 (1973)
144
G. Schmid u. W. Maurer
ligung fiihrt, ist bisher unbekannt. Adelstein, Lyman & O’Brien [I] fanden, da0 bei einigen Nagern die Prozentuale Beteiligung von 3HThymidin an der DNS-Synthese bis zu 200 ma1 kleiner als bei der Maus sein kann. Diese Arbeit berichtet iiber eine Bhnliche Untersuchung ftir 3H-Cytidin. Die Prozentuale Beteiligung von exogenem Cytidin an der RNS-Synthese der Leber der Ratte wurde fur injizierte Cytidin-Mengen von 0,000 02 ,ug/g bis 10 pg/g Ratte gemessen. Ahnlich wie bei Thymidin ergibt sich aus diesen Messungen die obere Grenze der Tracer-Dosis von Cytidin. Auch bei Versuchen mit 3HCytidin ist die Beteiligung an der Leber-RNSSynthese bei den iiblichen Versuchsbedingungen kleiner als einige 0,l %. Die Prozentuale Beteiligung der beiden 3HNukleoside an der DNS bzw. der RNSSynthese ist fiir die Deutung von autoradiographischen Kornzahlen bzw. von chemisch bestimmten spezifischen Aktivitaten der zellularen DNS oder RNS von grundlegender Bedeutung. Die Kornzahlen bzw. die spezifischen Aktivitaten konnen nur dann als ein Ma13 fiir die DNS- oder RNS-SyntheseRate genommen werden, wenn die auffallend kleine Prozentuale Beteiligung fiir exogenes Thymidin bzw. Cytidin von Zelle zu Zelle die gleiche ist.
Im folgenden sol1 unter ,,Cyt-exogen“ die Menge des injizierten exogenen Cytidins verstanden werden, welche nach einmaliger Gabe von 3H-Cytidin in 30 Minuten in die Leber-RNS eingebaut wird. Auf der anderen Seite sol1 “Cyt-total“ die gesamte-endogene + exogene- Cytidin-Menge bedeuten, welche in 30 Minuten in die Leber-RNS eingebaut wird. Die Prozentuale Beteiligung des exogenen Cytidins an der Synthese der LeberRNS ist dann gleich: Prozentuale Beteiligung des exogenen Cyt-exogen Cytidins an der Le- = Cyt-total ’ “OX ber RNS-Synthese Zahler und Nenner von (1) konnen gende Weise bestimmt werden.
Menge des in der Leber-RNS exogenen Cytidins
(1)
auf fol-
eingebauten
Die Menge an exogenem Cytidin, welche wahrend der Versuchsdauer von 30 Minuten in Leber-RNS eingebaut wird, ist gleich dem Quotienten der 3H-Aktivitat der Leber-RNS am Ende der Versuchsdauer T und der spezifischen Aktivitat des injizierten-exogenen3H-Cytidins. Es ist: 3H-Aklivit5t der LeberRNS am Ende der Versuchsdauer T = Spezifische Aktivitat des injizierten “H-Cytidins
Prinzip der Messung der Prozentualen Beteiligung von exogenem Cytidin an der RNS-Syntheses der Leber
Cyt-exogen
Nach Injektion von 3H-Cytidin wird dieses in der Zelle zu einem Teil durch die sog. Cytidin-Kinase zu 3H-Cytidylsaure phosphoryliert. Diese markierte Cytidylsaure vermischt sich in der Zelle mit der auf physiologischem Wege enstehenden endogenennicht-markierten-Cytidylsaure. Der cellulare Pool der Cytidylsaure wird dadurch markiert. Seine spezifische Aktivitat tibertragt sich auf diejenige der neugebildeten RNS.
Dieser Ausdruck ist such dann richtig, wenn im Qrganismus ein physiologischer ,,endogener“ Pool von freiem Cytidin existiert.
Exptl
Cell Res 78 (1973)
(2)
Gesamt-Menge des in Leber-R NS eingebauten Cytidins Die Gesamt-Menge des wahrend der Versuchsdauer von T = 30 Minuten eingebauten Cytidins (Cyt-total) kann aus der absoluten Neubildungsrate der Leber-RNS bzw. der
Beteiligwg
con 3H-Cytidin
an der RNS-Synthese
145
Mittleren Lebensdauer ML der Leter-RNS berechnet werden. Es ist: Cyt-total
=
Menge deM&er---
. 4. T
(3)
Der Bruch ist die neugebildete RNS-Menge pro Zeiteinheit, q ( =0,257) ist der mittlere Gehalt der RNS an Cytidin, T ist die Dauer des Versuchcs. Fur die Prozentuale Beteiligung des exogenen Cytidins an der Synthese der LeberRNS erhalt man: CYt-exwn. Cyt-total
100 “/o -
Suez. Aktivitat der LeL ber-RNS Spez. Aktivitat des exogenen Cytidins
.;-;.
100%
Bei den Versuchen wurde die spez. Akt. des exogenen Cytidins in weiten Grenzen variiert. Am Ende einer Versuchsdauer von T===30 Minuten wurde die spez. Akt. der Leber-RNS gemessen. Die mittlere Lebensdauer ML der Leber-RNS wurde aus Werten der Literatur entnommen. Die Prozentuale Beteiligung kann dann aus (4) berechnet werden. TIERVERSUCHE
UND
METHODISCHES
Tiere: Die Versuche wurden vormittags an normal ernahrten (Altromin R), in klimatisierten Raumen gehaltenen (24”C, 12-sttindiger Licht-Dunkel-Wechsel) weiblichen Wistar-Ratten (AF/Hannover, 165 + IO g) nach 16-stiindiger Nahrungs-Karenz durchgefiihrt. 3H-5-Cvtidin wurde von NEN. Boston. USA mit einer sped. Akt. von 28 900 mCi/mM bezogen. Durch Zugabe von nicht-markiertem Cytidin (C. F. Boehringer, Mannheim) wurden kleinere spez. Akt. hergestellt. Acht Gruppen von ie 3-7 Ratten erhielten pro Tier eine einmalige i.v.Gabe von $H-Cytidin mit 3H-Aktivitaten zwischen 0.0025 &i/g und 0,l ,&i/g und mit Cytidin-Mengen zwischen 0,000 02 Lig/g und IO,0 pug/g. Das entspricht einer Variation der exogenen Cytidin-Menge urn den Faktor 5.105. -Die Tot&g der Tiere erfolgte 30 Minuten nach Injektion in Aether-Narkose durch Eriiffnung der HalsgefPBe zwecks weitgehender Entblutung. Die Leber wurde sofort entnommen und, wie folgt, weiterverarbeitet.
103
IO1
10"
10'
1Ci'
1
10
Fig. 1. Abscissa: injected cytidine in pug/g rat; ordinate: (left) spec. act. of liver RNA in ,&i/pg RNA-cytidine; (right) 3H-activity of total liver RNA related to total 3H-activity injected. 3H-activity of liver RNA for different amounts of exogenous cytidine injected. Each point one animal. Injection of 0.1 #J/g rat. Chemische Aufarbeitung der Leber: Nach Homogenisieren (0°C) der Leber wurde das Homogenat 3 mal mit 10 %iger Eis-gektihlter Trichloressigsaure (TCE) gewaschen. Beim Homogenisieren und dem ersten Waschen mit TCE wurden 0.1 mg/ml nicht-markiertes Cytidin zugegeben, urn Reste des applizierten 3HCytidins zu verdrlngen. Dann wurden die Lipoide bei 0°C tiber je 10 Minuten extrahiert mit: Aethanol, Aethanol-Chloroform (3 : l), Aethanol-Diaethylaether (3:l) und Diaethylaether (2 ma]). Die bis zur Gewichts-Konstanz getrockneten Proben wurden pulverisiert und ergaben die ..Trockenmasse“ der Leber. Dann wurdedie RNS nach Schmidt & Thannhauser [20] extrahiert. Von der Leber-Trockenmasse eines jeden Tieres wurden 2-4 Proben von je 100 mg mit 0,4 N KOH 16 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach Ansauerung mit 0,s N Perchlorsaure und Zentrifugieren befindet sich die RNS im Uberstand. Hiervon ausgehend erfolgte die Bestimmung von 1. der 3H-Aktivitat der RNS (TriCarb Mod. 3380): und 2. der RNS-Menge auf photometrischem Wege nach Ceriotti 141.Aus den beiden Messungen ergibt sich die spezifische Aktivitat der Leber-RNS (Abb. 1, linker MaSstab). Aus diesem Wert und der mittleren RNSMenge der Leber (62? 3,7 mg) erhalt man die relative 3H-Aktivitat des in Leber-RNS eingebauten exogenen Cytidins (Abb. 1, rechter Ma&tab). In die Berechnung der Prozentualen Beteiligung des exogenen Cytidins an der Leber-RNS-Synthese geht die RNS-Menge der Leber nach (4) nicht ein.
ERGEBNISSE Menge des in Leber-RNS eingebauten exogenen Cytidins (Cyt-exogen) Abb. 1, linker MaBstab, zeigt die 3H-Aktivitat des in 1 pg Leber-RNS eingebauten exogenen Cytidins fiir eine gleichbleibende Injektion von 0,l ,&X/g Ratte. Die Abszisse gibt die Menge des injizierten exogenen Cytidins wieder. Nach Abb. 1 ist der Bruchteil der in Exptl Cell Res 78 (1973)
146
10
G. Schmid u. W. Maurer
-
l?/ I’ :.
,’
,’
I’ .I; /‘;*-
-
10
-
I
-
lo-'
-
10-z
-
10-J
-
10.'
-
10-S
I’
10“
-
,/.-f
10-1 -
10-s m'
,‘/
.I’ .: /
I’
- ,’ ,?//+ ,’ ’
.G.
/
.fi
10s I 105
I mJ
I a’
I 10-z
I II-’
I 1
I 10
Fig. 2. Abscissa: injectedcytidinein pg/grat; ordinate:
doppelt-logarithmischen Darstellung der Abb. 2 liegen die Werte auf einer unter 45” abfallenden Geraden. Zeitlicher Anstieg der 3H-Aktivitiit Leber-RNS
der
Bei sonst gleichen Versuchsbedingungen wurde der zeitliche Anstieg der in LeberRNS eingebauten 3H-Aktivitgt fiir eine Versuchsdauer von 10, 20 und 30 Minuten gemessen.Jeder Punkt in Abb. 3 a ist das Mittel von 5-8 Tier-Versuchen. Wlihrend einer Versuchsdauer von 30 Minuten wird also die Einbaurate des exogenen Cytidins stetig kleiner.
pg exogenouscytidine incorporatedinto total liver RNA; (right) % participation of exogenous Absolute Umsatzrate bzw. Mittlere cytidinein synthesisof liver RNA. Percentalparticipation of exogenouscytidine in Lebensdauerder Leber-R NS der liver RNA synthesized within 30min. Eachpoint one Ratte nach Angaben in der Literatur animal. Nach Ausdruck (1) bzw. (4) muI die absolute Umsatzrate der Leber-RNS bzw. ihre Mittlere Leber-RNS eingebauten exogenen 3H-CytiLebensdauer MLNs bekannt sein, wenn die din-Aktivitgt unabhgngig von der Menge des Prozentuale Beteiligung von exogenem Cytiexogenen Cytidins. Eine Ausnahme bilden din an der Synthese der Leber-RNS bestimmt werden solI. In der Literatur wurden fi.ir die nur die Werte bei 10 pg/g. Der rechte MaDstab in Abb. 1 gibt den Leber-RNS der Ratte sowohl direkte MesBruchteil der exogenen 3H-Cytidin-AktivitBt sungen der absoluten Umsatzrate wie such wieder, welcher in die RNS der ganzen Leber Messungen der Mittleren Lebensdauer ML eingebaut wird. Als RNS-Gehalt der Leber aus zeitlichen Abfallskurven markierter RNS wurde der Mittelwert aller RNS-Bestimbeschrieben. Hierauf sol1 in den beiden folmungen von 62,0+ 3,7 ,ug RNS/Leber ge- genden Abschnitten ntiher eingegangen wernommen. Abb. 1 zeigt, da13etwa 1,s % der den. exogenen 3H-Cytidin-Aktivitgt in die RNS Messung der absoluten Umsatzrate der Leber eingebaut wird. Das gleiche gilt dann such fiir die in Leber-RNS eingebaute der Leber-R NS (left)
relative Cytidin-Menge. Unabhgngig von der Menge des exogenen Cytidins wird also stets der gleiche Bruchteil in Leber-RNS eingebaut. Abb. 2, linker MaBstab, zeigt die absolute Cytidin-Menge, welche in die RNS der ganzen Leber ( = 62 mg RNS gesetzt) eingebaut wird (= Cyt-exogen) und zwar bei verschiedenen exogenen Cytidin-Mengen. DieseWerte ergeben sich unmittelbar aus Abb. 1. In der Exptl Cell Res 78 (1973)
Von Ernst, Deimel & Maurer [7] wurde die absolute Umsatzrate der Leber-RNS iiber eine 32P-Markierung der freien PhosphatJonen im Organismus der Ratte bestimmt. Freies Phosphat ist ein physiologischer Vorlgufer der RNS. Wenn man den zeitlichen Verlauf der spezifischen Aktivitat des freien Phosphats ,,st“ wghrend der Versuchsdauer ,,T” und die in RNS inkorporierte Phosphat-
Beteiligung von 3H-Cytidin 32P-AktivitHt am Ende der Versuchsdauer T mibt, kann die absolute RNS-Umsatzrate bezogen auf Phosphat berechnet werden. Es ist: Phosphat-Menge, eingebaut in Leber-RNS wahrend der Zeit Null bis T
32P-Akt. der Leber-RNS (T)
0.03
an der RNS-Synthese
147
a
i
(5)
fi,.dt
Mit dieser absoluten Neubildungsrate der Leber-RNS kann dann such die Mittlere Lebensdauer ML der Leber-RNS bestimmt werden. Es ist:
0.01
Menge der Leber-RNS der = Leber-RNS
ML,, = Neubildungsrate
%
0.03
fit - dt = Spez. Akt. der Leber-RNS zur Zeit T
(6)
Alle RNS-Mengen beziehen sich auf Phosphat. Aus Messungen (1) des zeitlichen Verlaufes der spez. “2P-Akt. des freien Phosphats in der Leber; (2) der spez. Akt. der LeberRNS bezogen auf Phosphat am Ende der Versuchsdauer T kann die Mittlere Lebensdauer der Leber-RNS MLRNs berechnet werden. Vier verschiedene Versuche mit Ratten (ca 200 g) bei T=2 Std lieferten fur die Mittlere Lebensdauer der Leber-RNS einen Wert von ML,, = 3,4 + 0,5 Tage (StandardAbweichung der 4 Einzelwerte vom Mittelwert). Wegen der kleinen Mittleren Lebensdauer der mRNS von ca 6 Std (s. folg.Abschn.) wird wahrend der Versuchsdauer von 2 Std ein Teil der 32P-markierten mRNS wieder abgebaut. Der obige Wert der ML,,, enthalt eine entsprechende Korrektion. Diese macht aber nur etwa 13 “/ aus. Im Gegensatz zur Bestimmung der ML der RNS-Fraktionen aus zeitlichen Abfallskurven spielt bei dem hier angegebenen Verfahren die Wiederverwendung von freiem mar-
0.02 0.01
Ot 0
I
I
I
10
70
30
Fiz. 3. Abscissa: duration of the experiment with SHcytidine; ordinafe: (a) 3H-activity of total liver RNA related to total SH activity injected; (b) % participation of exogenous cytidine in synthesis of liver RNA in 10, 20 and 30 min expts. Percental participation of exogenous cytidine for varying times of the experiment. Each point the mean of 6-8 animals. Injection of 1O-2 [Lg/g rat.
kiertem Phosphat, herrtihrend aus dem Wiederabbau der 32P-Phosphat-haltigen Substanzen des Organismus, keine Rolle. Mittlere Lebensdauerder Leber-RNS aus den zeitlichen Abfallskurven der markierten RNS-Fraktionen Fur die Mittlere Lebensdauer der drei Fraktionen der Leber-RNS der Ratte finden sich in der Literatur eine Reihe von Angaben. Bei diesen Untersuchungen wurde nach Applikation von vor allem 14C- oder 3H-Orotsaure [3, 6, 9, 10, 14, 16-19, 23-261 und 14C-Cytidylsaure [S] die Leber-RNS der Rztten zu verschiedenen Zeiten nach Injektion Exptl
Cell Res 78 (1973)
148
G. Schmid u. W. Maurer
isoliert und in ihre Fraktionen mRNS, tRNS und rRNS zerlegt. Aus dem zeitlichen Abfall der Markierung dieser Fraktionen kann dann auf ihre Mittlere Lebensdauer geschlossen werden. Als Mittelwerte der Angaben der verschiedenen Autoren findet man eine Mittlere Lebensdauer fur die mRNS von etwa 6 Stunden [21, 23, 24, 261, fur die tRNS von 150525 Std [2, 3, 6, 8, 10, 181 und fur die rRNS von 167f: 11 Std [3, 6, 8, 14, 16-18, 261. Die angegebenen Fehler sind Standardabweichungen. Aus den bekannten Haufigkeiten [.5] der mRNS von q1 = 5 %, der tRNS von q2 = 15 % und der rRNS von q3 = 80 % kann die mittlere Lebensdauer MLRNs der gesamten RNS der Leber berechnet werden. Es ist:
dauer von T=30 Minuten werden dann 104 ,ug Cytidin in neugebildete Leber-RNS eingebaut. Der linke Ordinaten-Ma&tab in Abb. 2 gibt die absolute Menge an exogenem Cytidin wieder, welche fiir T = 30 Minuten in LeberRNS eingebaut wird (Cyt-exogen). Nach Division dieser Werte durch die absolute Neubildungsrate der Leber-RNS “Cyt-total” = 104 ,ug Cytidin findet man die Prozentuale Beteiligung von exogenem Cytidin an der Synthese der Leber-RNS (rechter OrdinatenMaDstab in Abb. 2).
DISKUSSION Gr$e der Prozentualen Beteiligung von exogenem Cytidin an der Synthese der Leber-R NS
und nach Einsetzen obiger Werte: =0,0083 +O,OOlO +0,0048 =0,0141 Daraus erhalt man MLRNs = 71 Std bzw. 3,0 Tage. Der Fehler von ML,,, hangt im wesentlichen von den unterschiedlichen Angaben der einzelnen Autoren fur MLmRNS ab. Absolute Neubildungsrate der LeberRNS der Ratte bezogen auf Cytidin Die in den beiden vorhergehenden Abschnitten auf verschiedenem Wege gefundenen Mittleren Lebensdauern der Leber-RNS von 3,4 Tagen und 3,0 Tagen stimmen gut iiberein. Fi.ir eine mittlere ML,,, von 3,2 Tagen bzw. 77 Stunden und fiir einen RNS-Gehalt der Leber von 62,0+ 3,7 mg ist die absolute Neubilduntsrate der Leber-RNS dann gleich: 62 mg Leber-RNS 77 Std
=0,81 mg RNSjStd
(8)
bzw. 0,208 mg/Std bezogen auf den Anteil q = 0,257 an Cytidin. Wahrend der VersuchsExptl
Cell Res 78 (1973)
Abb. 2 zeigt, dal3 die Prozentuale Beteiligung von exogenem Cytidin an der Synthese der Leber-RNS in einem sehr weiten Bereich variiert. Bei der griiBten applizierten exogenen Cytidin-Menge von 10.0 pug/g Ratte ergibt sich nach Ausdruck (4) eine Prozentuale Beteiligung von ca 10 76. Unterhalb von 1,0 ,ug/g fallt die Kurve unter 45” ab. Die in Leber-RNS eingebaute exogene CytidinMenge ist proportional zur gesamten Menge des injizierten exogenen Cytidins. Bei der Cytidin-Menge von kleinsten exogenen 0,000 02 ,ug/g betragt die Prozentuale Beteiligung nur 0,002 %. Eine Injektion von z. B. 16 ,&i 3H-Cytidin mit einer spezifischen Aktivitat von 3 000 mCi/mM entspricht einer injizierten CytidinMenge von 0,Ol pg/g Ratte. In diesem Bereich liegen die iiblicherweise bei Versuchen mit 3H-Cytidin verwandten 3H-Aktivitaten und spez. Akt. Nach Abb. 2 liegt fiir diese Versuchsbedingungen eine Beteiligung von nur 0,03 % vor. Es werden also 99,97 % der in Leber-RNS eingebauten Cytidylsaure (be-
Beteiligung von 3H-Cytidin
an der RNS-Synthese
149
Beteiligung ftihren also zu dem gleichen SchluD wie die Diskussion des geradlinigen Kurven-Verlaufes in Abb. 1 und 2. Die obere Grenze der Tracer-Dosis von 1,0 pg/g entspricht bei einer spez. Akt. des 3H-Cytidins von 6 000 mCi/mM einer exogenen 3H-Aktivitat von ca 20 @X/g. Ftir 14CCytidin mit einer 200 ma1 kleineren spez. Akt. von 30 mCi/mM ist die Tracer-Dosis in Bezug auf die Menge die gleiche. Die obere Grenze fur die 14C-Aktivitat ist aber nur gleich 0,l $i/g. Daraus folgt, da13 die tiblicherweise verwandten 3H- und 14C-Cytidin-Praparate Tracer-Dosen sind. Das ftihrt u. a. zu der wichtigen Konsequenz, da13 die relativen Kornzahlen auf RNS-Autoradiogrammen bzw. Tracer-Dosis fiir exogenes Cytidin chemisch bestimmte spezifische RNS-AktiviAbb. 1 zeigt, da8 unabhangig von der applitaten von der spez. Akt. der verwandten 3Hzierten exogenen Cytidin-Menge ftir den Fall Cytidin-Praparate nicht abhangen. einer konstanten 3H-Aktivitat des injizierten Ftir die Berechnung der Prozentualen Be3H-Cytidins in der Leber-RNS stets die gleiche teiligung nach Ausdruck (4) wurde fur alle 3H-Cytidin-Aktivit&t gefunden wird. Unterexogenen Cytidin-Mengen ML,,, = 3,2 Tage halb von 1,0 ,ug/g Ratte ist also die injizierte gesetzt. Dieser Wert wurde mit Tracer-Dosen exogene Cytidin-Menge ohne EinfluB auf den gemessen und entspricht deshalb dem physioEinbau von 3H-Aktivitat. Die 3H-Aktivitat logischen Verhalten der Leber-RNS. Dieser der Leber-RNS hangt dann nur noch von der Wert von ML,,, gilt dann such innerhalb des injizierten 3H-Aktivitat ab. Das zeigt, da13 Tracer-Bereiches von exogenem Cytidin. Bei exogene Cytidin-Mengen in dem horizontalen griirjeren exogenen Cytidin-Mengen kann Bereich von Abb. 1 als Tracer-Dosen ange- MLivs einen anderen Wert haben. Damit sehen werden konnen. Nach Abb. 1 liegt die kiinnte der flacher werdende Kurven-Verlauf obere Grenze der Tracer-Dosis fur exogenes bei der groaten exogenen Cytidin-Menge von Cytidin bei 1,0 pg/g. 10,O pg/g in Abb. 2 zusammenhangen. Eine Tracer-Dosis kann nur dann vorliegen, Bei den kleinsten exogenen Cytidin-Mengen wenn die Menge der aus 3H-Cytidin gebildevon 0,000 02 pg/g in Abb. 2 liegen die gemesten 3H-Cytidylsaure sehr vie1 kleiner ist als senen Prozentualen Beteiligungen hiiher als die auf endogenem Wege gebildeten Menge die unter 45” abfallende Gerade. Das kann der nicht-markierten Cytidylsaure. Die Promit einem evtl. vorhandenen physiologischem zentuale Beteiligung mu13 also im TracerPool von freiem Cytidin nicht zusammenBereich klein sein. Wenn man davon ausgeht, hangen. Unter der Wirkung der Cytidindal3 eine Beteiligung von 2 % die obere Grenze Kinase entsteht dann aus dem exogenen 3Hdes Tracer-Bereiches ftir exogenes Cytidin Cytidin markierte Cytidylsaure und zusatzist, folgt aus Abb. 2, da8 diese Grenze bei lich aus dem Cytidin des Pool’s nicht-mar1,Opug/g liegt. Die MeDwerte der Prozentualen kierte Cytidyldure. Da beide Prozesse vonei-
zogen auf Cytidin) auf physiologischem Wege gebildet. Von dem injizierten exogenen Cytidin werden nach Abb. 1 ca 2% in Leber-RNS eingebaut. Aus der relativen Korndichte von RNSAutoradiogrammen nach Gabe von 3H-Cytidin kann abgeschatzt werden, daB in die RNS des gesamten Organismus im Vergleich zur Leber 2-3 ma1 mehr eingebaut wird. Der weitaus griiBte Teil der Cytidin-Menge wird im Organismus abgebaut. Ahnliche Verhaltnisse liegen bei 3H-Thymidin vor. Nach Hinrichs, Petersen & Baserga [13] werden in die gesamte DNS des Organismus der Maus bei 1 Stunden-Versuchen 8-9 % der applizierten 3H-TdR-Aktivitat eingebaut.
Exptl
Cell Res 78 (1973)
150 G. Schmid u. W. Maurer nander unabhangig sind und sich lediglich tiberlagern, hat die evtl. Existenz eines Cytidin-Pool’s keinen EinfluB auf die gemessene Prozentuale Beteiligung. Abhlingigkeit der Prozentualen Beteiligung in Abb. 2 van der Versuchsdauer Die zeitliche Anstiegskurve der 3H-Aktivitat der Leber-RNS nach einmaliger Gabe von 3H-Cytidin in Abb. 3a zeigt, da13 der Einbau von 3H-Cytidin mit der Zeit immer kleiner wird. Das hangt damit zusammen, da13 die Konzentration des freien exogenen Cytidins im Organismus stetig abnimmt. Nach Abb. 2 wird dadurch die Prozentuale Beteiligung mit zunehmender Zeit kleiner. In jedem Zeitelement wird dabei in die Leber-RNS eine exogene Cytidin-Menge eingebaut, welche proportional ist zu der im Organismus noch vorhandenen Menge an freiem exogenem Cytidin (Abb. 2). Die bei einer Versuchsdauer von 30 Minuten gemessene Prozentuale Beteiligung bezieht sich also nicht auf eine definierte exogene Cytidin-Konzentration. Die Abszissen-Werte der Abb. 2 geben lediglich die bei Versuchsbeginn auftretenden maximal mSglichen Cytidin-Konzentrationen wieder. Die Menge des in Leber-RNS eingebauten exogenen Cytidins (Cyt-exogen in Ausdruck (1)) steigt also mit der Zeit weniger als linear an, wahrend Cyt-total in (1) natiirlich mit der Zeit linear ansteigt. Mit zunehmender Versuchsdauer mu13 also der Wert der Prozentualen Beteiligung kleiner werden. Abb 3b gibt die Prozentuale Beteiligung fur eine Versuchsdauer von 10, 20 und 30 Minuten wieder. Eine Extrapolation dieser Werte zur Zeit Null hin zeigt, da13 fiir eine sehr kleine Versuchsdauer die Beteiligung 1,5 ma1 grijl3er ist als fiir einen 30 Minuten Versuch. Das gilt aber nicht nur ftir die in Abb. 3a injizierten Cytidin-Mengen sondern innerhalb des ganzen Tracer-Bereiches von exogenem Cytidin und zwar deshalb, weil innerhalb des Exptl
Cell Res 78 (1973)
Tracer-Bereiches nach Abb. 1 und 2: (a) die injizierte exogene Cytidin-Menge; (b) die in Leber-RNS eingebaute Cytidin-Menge; (c) sehr wahrscheinlich such der Katabolismus von freiem Cytidin zueinander proportional sind. Die punktierte Linie in Abb. 2 liegt urn den Faktor 1,5 hoher als die ausgezogene unter 45” abfallende Gerade. Sie entspricht der Prozentualen Beteiligung fur eine sehr kurze Versuchsdauer. Die Konzentration des exogenen Cytidins im Organismus ist in diesem Fall gleich den Abszissen-Werten in Abb. 2. Die punktierte Gerade wiirde man such erhalten, wenn durch eine Dauerinf usion von 3H-Cytidin die Konzentration des exogenen Cytidins im Organismus zeitlich konstant gehalten wird. Problematik der Deutung der autoradiographischen Korndichte bzw. der spezifischen RNS-Aktivittit als ein MaJ fiir die RNS-Synthese-Rate In der Literatur wird bei Versuchen mit 3HCytidin die autoradiographische Korndichte bzw. die chemisch bestimmte spezifische RNS-Aktivitat oft als ein Mal3 fi.ir die Umsatzrate der RNS eines Organs etc. gedeutet. Es sol1 gezeigt werden, da13ein solcher SchluB an eine Voraussetzung gebunden ist, welche nicht iibersehen werden darf. Bei einem Tier-Versuch mit 3H-Cytidin kann die von verschiedenen Zellarten in RNS eingebaute 3H-Cytidin Aktivitat nur dann als RNS-Umsatzrate gedeutet werden, wenn in allen Zellarten die eingebaute 3HCytidin-Aktivitat proportional zur Menge der neugebildeten RNS ist. Das ist aber nur dann der Fall, wenn die spezifische Aktivitat der neugebildeten RNS in allen Zellarten gleich ist. Nur unter dieser Voraussetzung bedeutet die doppelte eingebaute 3H-Aktivitat such die doppelte Menge an neugebildeter RNS. Die spez. Akt. der neugebildeten RNS ist
Beteiligung van 3H-Cytidin an der RNS-Synthese aber in verschiedenen Zellarten nur dann gleich, wenn such die spez. Akt. der freien CytidyGure in diesen Zellarten gleich ist. Das ist aber nur dann der Fall, wenn bei allen Zellarten die Prozentuale Beteiligung des exogenen Cytidins an der zellu&ren RNSSynthese gleich ist. Dies ist die Voraussetzung daf iir, daB die autoradiographische Korndichte bzw. die spezifische Aktivitgt bei chemischen Versuchen ein Ma13 fiir die RNSSynthese-Rate ist. Die gleichen iiberlegungen gelten such in solchen Ftillen, bei denen eine zellul&e RNSSyntheserate bei einem behandelten und einem normalen Tier verglichen wird. Auch dann mu13 die Voraussetzung erfiillt sein, da6 die Prozentuale Beteiligung beim experimentell behandelten Versuchstier und bei dem Kontroll-Tier gleich ist. Unbekannt ist zur Zeit eine Kopplung zwischen der Phosphorylierung von 3H-Cytidin durch die sog. Cytidin-Kinase auf der einen Seite und der mengenm%ig iiberwiegenden physiologischen Synthese von Cytidylsgure auf der anderen Seite. Solange aber nicht allgemein gezeigt worden ist, dal3 die Prozentuale Beteiligung von exogenem Cytidin an der RNS-Synthese bei verschiedenen Zellarten gleich ist, kann die inkorporierte 3H-Cytidin-Aktivit%t nicht als ein MaB fiir die Rateder RNS-Synthesegenommen werden. Von Lang, Miiller & Maurer [15] wurden Bhnliche Versuche mit 3H-Thymidin bei Zellarten der Maus und bei HeLa-Zellen durchgefiihrt. Fiir die Prozentuale Beteiligung von exogenem freiem Thymidin an der zellulgren DNS-Synthese fanden sich tihnliche Werte wie in Abb. 2. Auch bei Versuchen mit 3HThymidin ist die Kornzahl/Kern bzw. die specifische DNS-Aktivitgt nur dann ein Ma13 fiir die DNS-Syntheserate, wenn die Prozentuale Beteiligung des exogenen Thymidins an der DNS-Synthese von Zelle zu Zelle und nach experimenteller Behandlung eines
151
Tieres die gleiche ist. Fi.ir 3H-Thymidin konnte die Prozentuale Beteiligung fiir mehrere Zellarten der Maus direkt gemessen werden. Sie war bei den untersuchten Zellarten gleich. Das beweist aber noch nicht, da13 die Prozentuale Beteiligung such bei anderen-nicht untersuchten-Zellarten die gleich sein mul3. Mit Unterstiitzung schaft.
der Deutschen Forschungsgemein-
REFERENCES 1. Adelstein, S J. Lyman. C P & O’Brien. R C. Coma biochem phy&oi 12 (i964) 223. ’ . 2. Anarwal, M K & Weinstein, I B, Biochemistry 9 (1970) 503. 3. Blobel, G & Potter, R, Biochim biophys acta 166 (1968) 48. 4. Ceriotti, G, J biol them 198 (1952) 297. 5. David&, J N, The biochemistry of the nucleic acids. Methuen & Co., London (1965). 6. Erdos, T & Bessada, R, Biochim biophys acta 129 (1966) 628. 7. Ernst, H, Deimel, M & Maurer, W. Unveriiffentlicht. (Siehe: Ernst, H, Dissertation, K61n (19561.) 8. Gerber, G, Gerber, G & Altman, K I, J biol them 235 (1960)
2682.
9. Hadjioloi,
A A, Biochim biophys acta 119 (1966)
547.
10. Hanoune,J&Agarwal,MK,FEBSlett 11(1970)78. 11. Hempel, K, Habilitationsschrift (1967), Med Fak Univ Wiirzburg. 12. Hilscher, B, Hilscher, W & Maurer, W, Naturwiss 53 (1966) 415. 13. Hinrichs, R H, Petersen, 0 P & Baserga, R, Arch path 78 (1964) 245. 14. H$;ah, C A, Hiatt, H H, J biol them 241 (1966) 15. Lang, W, Miiller, D & Maurer, W, Exptl cell res 49 (1968)
558.
Loeb, J N, Howell, R R & Tomkins, G M, Science 149 (1965) 1093. 17. McElhone, M J, O’Connor, P J & Craig, A W, Biochem j 125 (1971) 821. 18. Quincey, R V & Wilson, S H, Proc natl acad sci 16.
US 64 (1969) 19.
20. 21. 22. 23. 24. 25. 26.
681.
Revel, M & Hiatt, H H, Proc natl acad sci US 51 (1964) 810. Schmidt, G & Thannhauser, S J, J biol them 161 (1945) 83. Staehelin, T, Wettstein, F 0 & Noll, H, Science 140 (1963) 180. StGcker, E & Pfeifer, U, Naturwiss 52 (1965) 663. Tominaga, H, Aki, J & Natori, Y, Biochim biophys acta 228 (1971) 183. Trakatellis, A C, Axelrod, A E & Montjar, M, J biol them 239 (1964) 4237. - Nature 203 (1964) 1134. Wilson, S H & Hoagland, M B, Biochem j 103 (1967) 556.
Received July 14, 1972 Exptl
Cell Res 78 (1973)
0 1973 by Academic Press, Inc. o/ reproduction in any form reserved
Experimental
PROZENTUALE
Cell Research 78 (1973) 143-151
BETEILIGUNG
DER
VON
RNS-SYNTHESE
DER LEBER
G. SCHMID Institut
fiir
Medizinische
EXOGENEM
CYTIDIN
DER
AN
RATTE
und W. MAURER
Strahlenkunde, Universittit 87 Wiirzburg, BRD
Wiirzburg,
SUMMARY The percental participation of exogenous cytidine in liver RNA synthesis was determined after application of 3H-cytidine to rats. The amount of exogenous cytidine was varied by a factor of 5 x 106, between 0.000 02 and 10.0 ,ug/g rat. With the 3H-cytidine doses and specific activities most frequently reported in the literature, the percental participation of the exogenous precursor is only about 0.1 %. with 99.9 % of the cvtidvlic acid incorporated into RNA under these conditions being of endogenous origin. - The results show that the upper limit of the tracer dose of exogenous cytidine is about 1.0 pg/g rat. Within this tracer region 1.8 % of 3H-activity-and therefore 1.8 % of the amount of exogenous cytidine-is incorporated into liver RNA. The dependence of the uercental _uarticioation on the _ duration of the experiments is examined. It is shown that autoradiographic grain density and specific activity of RNA can only be regarded as direct measures for the rate of RNA synthesis in different cells and animals if the percental participation of exogenous cytidine in RNA synthesis is generally of equal value. Comparable situations exist in the incorporation of $H-thymidine into DNA as shown by earlier experimental work. ZUSAMMENFASSUNG Die Prozentuale Beteiligung von exogenem Cytidin an der RNS-Synthese der Leber der Ratte wurde nach Gabe von 3H-Cytidin bestimmt. Die Menge des injizierten Cytidin wurde urn den Faktor 5. lo5 variiert und schwankte zwischen 0,000 02 und 10,O pup/g Ratte. Fiir die tiblicherweise verwandten 3H-Cytidin-Mengen und spez. Aktivitlten betdgt die Prozentuale Beteiligung nur etwa 0,l %, wlhrend 99,9 % der in die RNS eingebauten Cytidylslure endogenen Ursprungs ist. Die Ergebnisse zeigen, dal3 die obere Grenze des Tracer-Bereiches fur exogenes Cytidin etwa 0,l ,ug/g Ratte betrlgt. Innerhalb des Tracer-Bereiches werden 1,8 % der injizierten CytidinAktivitlt - damit 1,s % der exogenen Cytidin-Menge - in die Leber-RNS eingebaut. Es wurde ferner die Abhangigkeit der Prozentualen Beteiligung von der Versuchsdauer untersucht. Es wird gezeigt, da8 die autoradiographische Rorndichte und die spez. Aktivitlt der RNS nur dann als ein direktes Ma8 fur die RNS-Synthese-Rate in verschiedenen Zellen und bei verschiedenen Tieren darstellt, wenn die Prozentuale Beteiligung von exogenem Cytidin an der RNSSynthese i&era11 gleich ist. Vergleichbare Verhlltnisse liegen beim Einbau von ‘H-Thymidin in die DNS vor, wie wir durch friihere Arbeiten zeigen konnten.
Lang, Mtiller & Maurer [15] zeigten fiir Versuche mit 3H-Thymidin, da13die Prozentuale Beteiligung von exogenem Thymidin an der DNS-Synthese bei einer Reihe von Zellarten der Maus tibereinstimmt. Das gilt such ftir Zellen mit verschiedener Dauer der S Phase [l 1, 12, 15, 221. Die Griil?e der Belo-
731818
teiligung ist bei den iiblicherweise in der Literatur verwandten 3H-Thymidin-Aktivitaten hoher spezifischer Aktivitat sehr klein. Nur 0,1-l % der in DNS eingebauten Thymidylsaure sind exogenen Ursprungs. Der Mechanismus, der bei den untersuchten Zellarten zu einer so kleinen aber konstanten BeteiExptl
Cell Res 78 (1973)
144
G. Schmid u. W. Maurer
ligung fiihrt, ist bisher unbekannt. Adelstein, Lyman & O’Brien [I] fanden, da0 bei einigen Nagern die Prozentuale Beteiligung von 3HThymidin an der DNS-Synthese bis zu 200 ma1 kleiner als bei der Maus sein kann. Diese Arbeit berichtet iiber eine Bhnliche Untersuchung ftir 3H-Cytidin. Die Prozentuale Beteiligung von exogenem Cytidin an der RNS-Synthese der Leber der Ratte wurde fur injizierte Cytidin-Mengen von 0,000 02 ,ug/g bis 10 pg/g Ratte gemessen. Ahnlich wie bei Thymidin ergibt sich aus diesen Messungen die obere Grenze der Tracer-Dosis von Cytidin. Auch bei Versuchen mit 3HCytidin ist die Beteiligung an der Leber-RNSSynthese bei den iiblichen Versuchsbedingungen kleiner als einige 0,l %. Die Prozentuale Beteiligung der beiden 3HNukleoside an der DNS bzw. der RNSSynthese ist fiir die Deutung von autoradiographischen Kornzahlen bzw. von chemisch bestimmten spezifischen Aktivitaten der zellularen DNS oder RNS von grundlegender Bedeutung. Die Kornzahlen bzw. die spezifischen Aktivitaten konnen nur dann als ein Ma13 fiir die DNS- oder RNS-SyntheseRate genommen werden, wenn die auffallend kleine Prozentuale Beteiligung fiir exogenes Thymidin bzw. Cytidin von Zelle zu Zelle die gleiche ist.
Im folgenden sol1 unter ,,Cyt-exogen“ die Menge des injizierten exogenen Cytidins verstanden werden, welche nach einmaliger Gabe von 3H-Cytidin in 30 Minuten in die Leber-RNS eingebaut wird. Auf der anderen Seite sol1 “Cyt-total“ die gesamte-endogene + exogene- Cytidin-Menge bedeuten, welche in 30 Minuten in die Leber-RNS eingebaut wird. Die Prozentuale Beteiligung des exogenen Cytidins an der Synthese der LeberRNS ist dann gleich: Prozentuale Beteiligung des exogenen Cyt-exogen Cytidins an der Le- = Cyt-total ’ “OX ber RNS-Synthese Zahler und Nenner von (1) konnen gende Weise bestimmt werden.
Menge des in der Leber-RNS exogenen Cytidins
(1)
auf fol-
eingebauten
Die Menge an exogenem Cytidin, welche wahrend der Versuchsdauer von 30 Minuten in Leber-RNS eingebaut wird, ist gleich dem Quotienten der 3H-Aktivitat der Leber-RNS am Ende der Versuchsdauer T und der spezifischen Aktivitat des injizierten-exogenen3H-Cytidins. Es ist: 3H-Aklivit5t der LeberRNS am Ende der Versuchsdauer T = Spezifische Aktivitat des injizierten “H-Cytidins
Prinzip der Messung der Prozentualen Beteiligung von exogenem Cytidin an der RNS-Syntheses der Leber
Cyt-exogen
Nach Injektion von 3H-Cytidin wird dieses in der Zelle zu einem Teil durch die sog. Cytidin-Kinase zu 3H-Cytidylsaure phosphoryliert. Diese markierte Cytidylsaure vermischt sich in der Zelle mit der auf physiologischem Wege enstehenden endogenennicht-markierten-Cytidylsaure. Der cellulare Pool der Cytidylsaure wird dadurch markiert. Seine spezifische Aktivitat tibertragt sich auf diejenige der neugebildeten RNS.
Dieser Ausdruck ist such dann richtig, wenn im Qrganismus ein physiologischer ,,endogener“ Pool von freiem Cytidin existiert.
Exptl
Cell Res 78 (1973)
(2)
Gesamt-Menge des in Leber-R NS eingebauten Cytidins Die Gesamt-Menge des wahrend der Versuchsdauer von T = 30 Minuten eingebauten Cytidins (Cyt-total) kann aus der absoluten Neubildungsrate der Leber-RNS bzw. der
Beteiligwg
con 3H-Cytidin
an der RNS-Synthese
145
Mittleren Lebensdauer ML der Leter-RNS berechnet werden. Es ist: Cyt-total
=
Menge deM&er---
. 4. T
(3)
Der Bruch ist die neugebildete RNS-Menge pro Zeiteinheit, q ( =0,257) ist der mittlere Gehalt der RNS an Cytidin, T ist die Dauer des Versuchcs. Fur die Prozentuale Beteiligung des exogenen Cytidins an der Synthese der LeberRNS erhalt man: CYt-exwn. Cyt-total
100 “/o -
Suez. Aktivitat der LeL ber-RNS Spez. Aktivitat des exogenen Cytidins
.;-;.
100%
Bei den Versuchen wurde die spez. Akt. des exogenen Cytidins in weiten Grenzen variiert. Am Ende einer Versuchsdauer von T===30 Minuten wurde die spez. Akt. der Leber-RNS gemessen. Die mittlere Lebensdauer ML der Leber-RNS wurde aus Werten der Literatur entnommen. Die Prozentuale Beteiligung kann dann aus (4) berechnet werden. TIERVERSUCHE
UND
METHODISCHES
Tiere: Die Versuche wurden vormittags an normal ernahrten (Altromin R), in klimatisierten Raumen gehaltenen (24”C, 12-sttindiger Licht-Dunkel-Wechsel) weiblichen Wistar-Ratten (AF/Hannover, 165 + IO g) nach 16-stiindiger Nahrungs-Karenz durchgefiihrt. 3H-5-Cvtidin wurde von NEN. Boston. USA mit einer sped. Akt. von 28 900 mCi/mM bezogen. Durch Zugabe von nicht-markiertem Cytidin (C. F. Boehringer, Mannheim) wurden kleinere spez. Akt. hergestellt. Acht Gruppen von ie 3-7 Ratten erhielten pro Tier eine einmalige i.v.Gabe von $H-Cytidin mit 3H-Aktivitaten zwischen 0.0025 &i/g und 0,l ,&i/g und mit Cytidin-Mengen zwischen 0,000 02 Lig/g und IO,0 pug/g. Das entspricht einer Variation der exogenen Cytidin-Menge urn den Faktor 5.105. -Die Tot&g der Tiere erfolgte 30 Minuten nach Injektion in Aether-Narkose durch Eriiffnung der HalsgefPBe zwecks weitgehender Entblutung. Die Leber wurde sofort entnommen und, wie folgt, weiterverarbeitet.
103
IO1
10"
10'
1Ci'
1
10
Fig. 1. Abscissa: injected cytidine in pug/g rat; ordinate: (left) spec. act. of liver RNA in ,&i/pg RNA-cytidine; (right) 3H-activity of total liver RNA related to total 3H-activity injected. 3H-activity of liver RNA for different amounts of exogenous cytidine injected. Each point one animal. Injection of 0.1 #J/g rat. Chemische Aufarbeitung der Leber: Nach Homogenisieren (0°C) der Leber wurde das Homogenat 3 mal mit 10 %iger Eis-gektihlter Trichloressigsaure (TCE) gewaschen. Beim Homogenisieren und dem ersten Waschen mit TCE wurden 0.1 mg/ml nicht-markiertes Cytidin zugegeben, urn Reste des applizierten 3HCytidins zu verdrlngen. Dann wurden die Lipoide bei 0°C tiber je 10 Minuten extrahiert mit: Aethanol, Aethanol-Chloroform (3 : l), Aethanol-Diaethylaether (3:l) und Diaethylaether (2 ma]). Die bis zur Gewichts-Konstanz getrockneten Proben wurden pulverisiert und ergaben die ..Trockenmasse“ der Leber. Dann wurdedie RNS nach Schmidt & Thannhauser [20] extrahiert. Von der Leber-Trockenmasse eines jeden Tieres wurden 2-4 Proben von je 100 mg mit 0,4 N KOH 16 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach Ansauerung mit 0,s N Perchlorsaure und Zentrifugieren befindet sich die RNS im Uberstand. Hiervon ausgehend erfolgte die Bestimmung von 1. der 3H-Aktivitat der RNS (TriCarb Mod. 3380): und 2. der RNS-Menge auf photometrischem Wege nach Ceriotti 141.Aus den beiden Messungen ergibt sich die spezifische Aktivitat der Leber-RNS (Abb. 1, linker MaSstab). Aus diesem Wert und der mittleren RNSMenge der Leber (62? 3,7 mg) erhalt man die relative 3H-Aktivitat des in Leber-RNS eingebauten exogenen Cytidins (Abb. 1, rechter Ma&tab). In die Berechnung der Prozentualen Beteiligung des exogenen Cytidins an der Leber-RNS-Synthese geht die RNS-Menge der Leber nach (4) nicht ein.
ERGEBNISSE Menge des in Leber-RNS eingebauten exogenen Cytidins (Cyt-exogen) Abb. 1, linker MaBstab, zeigt die 3H-Aktivitat des in 1 pg Leber-RNS eingebauten exogenen Cytidins fiir eine gleichbleibende Injektion von 0,l ,&X/g Ratte. Die Abszisse gibt die Menge des injizierten exogenen Cytidins wieder. Nach Abb. 1 ist der Bruchteil der in Exptl Cell Res 78 (1973)
146
10
G. Schmid u. W. Maurer
-
l?/ I’ :.
,’
,’
I’ .I; /‘;*-
-
10
-
I
-
lo-'
-
10-z
-
10-J
-
10.'
-
10-S
I’
10“
-
,/.-f
10-1 -
10-s m'
,‘/
.I’ .: /
I’
- ,’ ,?//+ ,’ ’
.G.
/
.fi
10s I 105
I mJ
I a’
I 10-z
I II-’
I 1
I 10
Fig. 2. Abscissa: injectedcytidinein pg/grat; ordinate:
doppelt-logarithmischen Darstellung der Abb. 2 liegen die Werte auf einer unter 45” abfallenden Geraden. Zeitlicher Anstieg der 3H-Aktivitiit Leber-RNS
der
Bei sonst gleichen Versuchsbedingungen wurde der zeitliche Anstieg der in LeberRNS eingebauten 3H-Aktivitgt fiir eine Versuchsdauer von 10, 20 und 30 Minuten gemessen.Jeder Punkt in Abb. 3 a ist das Mittel von 5-8 Tier-Versuchen. Wlihrend einer Versuchsdauer von 30 Minuten wird also die Einbaurate des exogenen Cytidins stetig kleiner.
pg exogenouscytidine incorporatedinto total liver RNA; (right) % participation of exogenous Absolute Umsatzrate bzw. Mittlere cytidinein synthesisof liver RNA. Percentalparticipation of exogenouscytidine in Lebensdauerder Leber-R NS der liver RNA synthesized within 30min. Eachpoint one Ratte nach Angaben in der Literatur animal. Nach Ausdruck (1) bzw. (4) muI die absolute Umsatzrate der Leber-RNS bzw. ihre Mittlere Leber-RNS eingebauten exogenen 3H-CytiLebensdauer MLNs bekannt sein, wenn die din-Aktivitgt unabhgngig von der Menge des Prozentuale Beteiligung von exogenem Cytiexogenen Cytidins. Eine Ausnahme bilden din an der Synthese der Leber-RNS bestimmt werden solI. In der Literatur wurden fi.ir die nur die Werte bei 10 pg/g. Der rechte MaDstab in Abb. 1 gibt den Leber-RNS der Ratte sowohl direkte MesBruchteil der exogenen 3H-Cytidin-AktivitBt sungen der absoluten Umsatzrate wie such wieder, welcher in die RNS der ganzen Leber Messungen der Mittleren Lebensdauer ML eingebaut wird. Als RNS-Gehalt der Leber aus zeitlichen Abfallskurven markierter RNS wurde der Mittelwert aller RNS-Bestimbeschrieben. Hierauf sol1 in den beiden folmungen von 62,0+ 3,7 ,ug RNS/Leber ge- genden Abschnitten ntiher eingegangen wernommen. Abb. 1 zeigt, da13etwa 1,s % der den. exogenen 3H-Cytidin-Aktivitgt in die RNS Messung der absoluten Umsatzrate der Leber eingebaut wird. Das gleiche gilt dann such fiir die in Leber-RNS eingebaute der Leber-R NS (left)
relative Cytidin-Menge. Unabhgngig von der Menge des exogenen Cytidins wird also stets der gleiche Bruchteil in Leber-RNS eingebaut. Abb. 2, linker MaBstab, zeigt die absolute Cytidin-Menge, welche in die RNS der ganzen Leber ( = 62 mg RNS gesetzt) eingebaut wird (= Cyt-exogen) und zwar bei verschiedenen exogenen Cytidin-Mengen. DieseWerte ergeben sich unmittelbar aus Abb. 1. In der Exptl Cell Res 78 (1973)
Von Ernst, Deimel & Maurer [7] wurde die absolute Umsatzrate der Leber-RNS iiber eine 32P-Markierung der freien PhosphatJonen im Organismus der Ratte bestimmt. Freies Phosphat ist ein physiologischer Vorlgufer der RNS. Wenn man den zeitlichen Verlauf der spezifischen Aktivitat des freien Phosphats ,,st“ wghrend der Versuchsdauer ,,T” und die in RNS inkorporierte Phosphat-
Beteiligung von 3H-Cytidin 32P-AktivitHt am Ende der Versuchsdauer T mibt, kann die absolute RNS-Umsatzrate bezogen auf Phosphat berechnet werden. Es ist: Phosphat-Menge, eingebaut in Leber-RNS wahrend der Zeit Null bis T
32P-Akt. der Leber-RNS (T)
0.03
an der RNS-Synthese
147
a
i
(5)
fi,.dt
Mit dieser absoluten Neubildungsrate der Leber-RNS kann dann such die Mittlere Lebensdauer ML der Leber-RNS bestimmt werden. Es ist:
0.01
Menge der Leber-RNS der = Leber-RNS
ML,, = Neubildungsrate
%
0.03
fit - dt = Spez. Akt. der Leber-RNS zur Zeit T
(6)
Alle RNS-Mengen beziehen sich auf Phosphat. Aus Messungen (1) des zeitlichen Verlaufes der spez. “2P-Akt. des freien Phosphats in der Leber; (2) der spez. Akt. der LeberRNS bezogen auf Phosphat am Ende der Versuchsdauer T kann die Mittlere Lebensdauer der Leber-RNS MLRNs berechnet werden. Vier verschiedene Versuche mit Ratten (ca 200 g) bei T=2 Std lieferten fur die Mittlere Lebensdauer der Leber-RNS einen Wert von ML,, = 3,4 + 0,5 Tage (StandardAbweichung der 4 Einzelwerte vom Mittelwert). Wegen der kleinen Mittleren Lebensdauer der mRNS von ca 6 Std (s. folg.Abschn.) wird wahrend der Versuchsdauer von 2 Std ein Teil der 32P-markierten mRNS wieder abgebaut. Der obige Wert der ML,,, enthalt eine entsprechende Korrektion. Diese macht aber nur etwa 13 “/ aus. Im Gegensatz zur Bestimmung der ML der RNS-Fraktionen aus zeitlichen Abfallskurven spielt bei dem hier angegebenen Verfahren die Wiederverwendung von freiem mar-
0.02 0.01
Ot 0
I
I
I
10
70
30
Fiz. 3. Abscissa: duration of the experiment with SHcytidine; ordinafe: (a) 3H-activity of total liver RNA related to total SH activity injected; (b) % participation of exogenous cytidine in synthesis of liver RNA in 10, 20 and 30 min expts. Percental participation of exogenous cytidine for varying times of the experiment. Each point the mean of 6-8 animals. Injection of 1O-2 [Lg/g rat.
kiertem Phosphat, herrtihrend aus dem Wiederabbau der 32P-Phosphat-haltigen Substanzen des Organismus, keine Rolle. Mittlere Lebensdauerder Leber-RNS aus den zeitlichen Abfallskurven der markierten RNS-Fraktionen Fur die Mittlere Lebensdauer der drei Fraktionen der Leber-RNS der Ratte finden sich in der Literatur eine Reihe von Angaben. Bei diesen Untersuchungen wurde nach Applikation von vor allem 14C- oder 3H-Orotsaure [3, 6, 9, 10, 14, 16-19, 23-261 und 14C-Cytidylsaure [S] die Leber-RNS der Rztten zu verschiedenen Zeiten nach Injektion Exptl
Cell Res 78 (1973)
148
G. Schmid u. W. Maurer
isoliert und in ihre Fraktionen mRNS, tRNS und rRNS zerlegt. Aus dem zeitlichen Abfall der Markierung dieser Fraktionen kann dann auf ihre Mittlere Lebensdauer geschlossen werden. Als Mittelwerte der Angaben der verschiedenen Autoren findet man eine Mittlere Lebensdauer fur die mRNS von etwa 6 Stunden [21, 23, 24, 261, fur die tRNS von 150525 Std [2, 3, 6, 8, 10, 181 und fur die rRNS von 167f: 11 Std [3, 6, 8, 14, 16-18, 261. Die angegebenen Fehler sind Standardabweichungen. Aus den bekannten Haufigkeiten [.5] der mRNS von q1 = 5 %, der tRNS von q2 = 15 % und der rRNS von q3 = 80 % kann die mittlere Lebensdauer MLRNs der gesamten RNS der Leber berechnet werden. Es ist:
dauer von T=30 Minuten werden dann 104 ,ug Cytidin in neugebildete Leber-RNS eingebaut. Der linke Ordinaten-Ma&tab in Abb. 2 gibt die absolute Menge an exogenem Cytidin wieder, welche fiir T = 30 Minuten in LeberRNS eingebaut wird (Cyt-exogen). Nach Division dieser Werte durch die absolute Neubildungsrate der Leber-RNS “Cyt-total” = 104 ,ug Cytidin findet man die Prozentuale Beteiligung von exogenem Cytidin an der Synthese der Leber-RNS (rechter OrdinatenMaDstab in Abb. 2).
DISKUSSION Gr$e der Prozentualen Beteiligung von exogenem Cytidin an der Synthese der Leber-R NS
und nach Einsetzen obiger Werte: =0,0083 +O,OOlO +0,0048 =0,0141 Daraus erhalt man MLRNs = 71 Std bzw. 3,0 Tage. Der Fehler von ML,,, hangt im wesentlichen von den unterschiedlichen Angaben der einzelnen Autoren fur MLmRNS ab. Absolute Neubildungsrate der LeberRNS der Ratte bezogen auf Cytidin Die in den beiden vorhergehenden Abschnitten auf verschiedenem Wege gefundenen Mittleren Lebensdauern der Leber-RNS von 3,4 Tagen und 3,0 Tagen stimmen gut iiberein. Fi.ir eine mittlere ML,,, von 3,2 Tagen bzw. 77 Stunden und fiir einen RNS-Gehalt der Leber von 62,0+ 3,7 mg ist die absolute Neubilduntsrate der Leber-RNS dann gleich: 62 mg Leber-RNS 77 Std
=0,81 mg RNSjStd
(8)
bzw. 0,208 mg/Std bezogen auf den Anteil q = 0,257 an Cytidin. Wahrend der VersuchsExptl
Cell Res 78 (1973)
Abb. 2 zeigt, dal3 die Prozentuale Beteiligung von exogenem Cytidin an der Synthese der Leber-RNS in einem sehr weiten Bereich variiert. Bei der griiBten applizierten exogenen Cytidin-Menge von 10.0 pug/g Ratte ergibt sich nach Ausdruck (4) eine Prozentuale Beteiligung von ca 10 76. Unterhalb von 1,0 ,ug/g fallt die Kurve unter 45” ab. Die in Leber-RNS eingebaute exogene CytidinMenge ist proportional zur gesamten Menge des injizierten exogenen Cytidins. Bei der Cytidin-Menge von kleinsten exogenen 0,000 02 ,ug/g betragt die Prozentuale Beteiligung nur 0,002 %. Eine Injektion von z. B. 16 ,&i 3H-Cytidin mit einer spezifischen Aktivitat von 3 000 mCi/mM entspricht einer injizierten CytidinMenge von 0,Ol pg/g Ratte. In diesem Bereich liegen die iiblicherweise bei Versuchen mit 3H-Cytidin verwandten 3H-Aktivitaten und spez. Akt. Nach Abb. 2 liegt fiir diese Versuchsbedingungen eine Beteiligung von nur 0,03 % vor. Es werden also 99,97 % der in Leber-RNS eingebauten Cytidylsaure (be-
Beteiligung von 3H-Cytidin
an der RNS-Synthese
149
Beteiligung ftihren also zu dem gleichen SchluD wie die Diskussion des geradlinigen Kurven-Verlaufes in Abb. 1 und 2. Die obere Grenze der Tracer-Dosis von 1,0 pg/g entspricht bei einer spez. Akt. des 3H-Cytidins von 6 000 mCi/mM einer exogenen 3H-Aktivitat von ca 20 @X/g. Ftir 14CCytidin mit einer 200 ma1 kleineren spez. Akt. von 30 mCi/mM ist die Tracer-Dosis in Bezug auf die Menge die gleiche. Die obere Grenze fur die 14C-Aktivitat ist aber nur gleich 0,l $i/g. Daraus folgt, da13 die tiblicherweise verwandten 3H- und 14C-Cytidin-Praparate Tracer-Dosen sind. Das ftihrt u. a. zu der wichtigen Konsequenz, da13 die relativen Kornzahlen auf RNS-Autoradiogrammen bzw. Tracer-Dosis fiir exogenes Cytidin chemisch bestimmte spezifische RNS-AktiviAbb. 1 zeigt, da8 unabhangig von der applitaten von der spez. Akt. der verwandten 3Hzierten exogenen Cytidin-Menge ftir den Fall Cytidin-Praparate nicht abhangen. einer konstanten 3H-Aktivitat des injizierten Ftir die Berechnung der Prozentualen Be3H-Cytidins in der Leber-RNS stets die gleiche teiligung nach Ausdruck (4) wurde fur alle 3H-Cytidin-Aktivit&t gefunden wird. Unterexogenen Cytidin-Mengen ML,,, = 3,2 Tage halb von 1,0 ,ug/g Ratte ist also die injizierte gesetzt. Dieser Wert wurde mit Tracer-Dosen exogene Cytidin-Menge ohne EinfluB auf den gemessen und entspricht deshalb dem physioEinbau von 3H-Aktivitat. Die 3H-Aktivitat logischen Verhalten der Leber-RNS. Dieser der Leber-RNS hangt dann nur noch von der Wert von ML,,, gilt dann such innerhalb des injizierten 3H-Aktivitat ab. Das zeigt, da13 Tracer-Bereiches von exogenem Cytidin. Bei exogene Cytidin-Mengen in dem horizontalen griirjeren exogenen Cytidin-Mengen kann Bereich von Abb. 1 als Tracer-Dosen ange- MLivs einen anderen Wert haben. Damit sehen werden konnen. Nach Abb. 1 liegt die kiinnte der flacher werdende Kurven-Verlauf obere Grenze der Tracer-Dosis fur exogenes bei der groaten exogenen Cytidin-Menge von Cytidin bei 1,0 pg/g. 10,O pg/g in Abb. 2 zusammenhangen. Eine Tracer-Dosis kann nur dann vorliegen, Bei den kleinsten exogenen Cytidin-Mengen wenn die Menge der aus 3H-Cytidin gebildevon 0,000 02 pg/g in Abb. 2 liegen die gemesten 3H-Cytidylsaure sehr vie1 kleiner ist als senen Prozentualen Beteiligungen hiiher als die auf endogenem Wege gebildeten Menge die unter 45” abfallende Gerade. Das kann der nicht-markierten Cytidylsaure. Die Promit einem evtl. vorhandenen physiologischem zentuale Beteiligung mu13 also im TracerPool von freiem Cytidin nicht zusammenBereich klein sein. Wenn man davon ausgeht, hangen. Unter der Wirkung der Cytidindal3 eine Beteiligung von 2 % die obere Grenze Kinase entsteht dann aus dem exogenen 3Hdes Tracer-Bereiches ftir exogenes Cytidin Cytidin markierte Cytidylsaure und zusatzist, folgt aus Abb. 2, da8 diese Grenze bei lich aus dem Cytidin des Pool’s nicht-mar1,Opug/g liegt. Die MeDwerte der Prozentualen kierte Cytidyldure. Da beide Prozesse vonei-
zogen auf Cytidin) auf physiologischem Wege gebildet. Von dem injizierten exogenen Cytidin werden nach Abb. 1 ca 2% in Leber-RNS eingebaut. Aus der relativen Korndichte von RNSAutoradiogrammen nach Gabe von 3H-Cytidin kann abgeschatzt werden, daB in die RNS des gesamten Organismus im Vergleich zur Leber 2-3 ma1 mehr eingebaut wird. Der weitaus griiBte Teil der Cytidin-Menge wird im Organismus abgebaut. Ahnliche Verhaltnisse liegen bei 3H-Thymidin vor. Nach Hinrichs, Petersen & Baserga [13] werden in die gesamte DNS des Organismus der Maus bei 1 Stunden-Versuchen 8-9 % der applizierten 3H-TdR-Aktivitat eingebaut.
Exptl
Cell Res 78 (1973)
150 G. Schmid u. W. Maurer nander unabhangig sind und sich lediglich tiberlagern, hat die evtl. Existenz eines Cytidin-Pool’s keinen EinfluB auf die gemessene Prozentuale Beteiligung. Abhlingigkeit der Prozentualen Beteiligung in Abb. 2 van der Versuchsdauer Die zeitliche Anstiegskurve der 3H-Aktivitat der Leber-RNS nach einmaliger Gabe von 3H-Cytidin in Abb. 3a zeigt, da13 der Einbau von 3H-Cytidin mit der Zeit immer kleiner wird. Das hangt damit zusammen, da13 die Konzentration des freien exogenen Cytidins im Organismus stetig abnimmt. Nach Abb. 2 wird dadurch die Prozentuale Beteiligung mit zunehmender Zeit kleiner. In jedem Zeitelement wird dabei in die Leber-RNS eine exogene Cytidin-Menge eingebaut, welche proportional ist zu der im Organismus noch vorhandenen Menge an freiem exogenem Cytidin (Abb. 2). Die bei einer Versuchsdauer von 30 Minuten gemessene Prozentuale Beteiligung bezieht sich also nicht auf eine definierte exogene Cytidin-Konzentration. Die Abszissen-Werte der Abb. 2 geben lediglich die bei Versuchsbeginn auftretenden maximal mSglichen Cytidin-Konzentrationen wieder. Die Menge des in Leber-RNS eingebauten exogenen Cytidins (Cyt-exogen in Ausdruck (1)) steigt also mit der Zeit weniger als linear an, wahrend Cyt-total in (1) natiirlich mit der Zeit linear ansteigt. Mit zunehmender Versuchsdauer mu13 also der Wert der Prozentualen Beteiligung kleiner werden. Abb 3b gibt die Prozentuale Beteiligung fur eine Versuchsdauer von 10, 20 und 30 Minuten wieder. Eine Extrapolation dieser Werte zur Zeit Null hin zeigt, da13 fiir eine sehr kleine Versuchsdauer die Beteiligung 1,5 ma1 grijl3er ist als fiir einen 30 Minuten Versuch. Das gilt aber nicht nur ftir die in Abb. 3a injizierten Cytidin-Mengen sondern innerhalb des ganzen Tracer-Bereiches von exogenem Cytidin und zwar deshalb, weil innerhalb des Exptl
Cell Res 78 (1973)
Tracer-Bereiches nach Abb. 1 und 2: (a) die injizierte exogene Cytidin-Menge; (b) die in Leber-RNS eingebaute Cytidin-Menge; (c) sehr wahrscheinlich such der Katabolismus von freiem Cytidin zueinander proportional sind. Die punktierte Linie in Abb. 2 liegt urn den Faktor 1,5 hoher als die ausgezogene unter 45” abfallende Gerade. Sie entspricht der Prozentualen Beteiligung fur eine sehr kurze Versuchsdauer. Die Konzentration des exogenen Cytidins im Organismus ist in diesem Fall gleich den Abszissen-Werten in Abb. 2. Die punktierte Gerade wiirde man such erhalten, wenn durch eine Dauerinf usion von 3H-Cytidin die Konzentration des exogenen Cytidins im Organismus zeitlich konstant gehalten wird. Problematik der Deutung der autoradiographischen Korndichte bzw. der spezifischen RNS-Aktivittit als ein MaJ fiir die RNS-Synthese-Rate In der Literatur wird bei Versuchen mit 3HCytidin die autoradiographische Korndichte bzw. die chemisch bestimmte spezifische RNS-Aktivitat oft als ein Mal3 fi.ir die Umsatzrate der RNS eines Organs etc. gedeutet. Es sol1 gezeigt werden, da13ein solcher SchluB an eine Voraussetzung gebunden ist, welche nicht iibersehen werden darf. Bei einem Tier-Versuch mit 3H-Cytidin kann die von verschiedenen Zellarten in RNS eingebaute 3H-Cytidin Aktivitat nur dann als RNS-Umsatzrate gedeutet werden, wenn in allen Zellarten die eingebaute 3HCytidin-Aktivitat proportional zur Menge der neugebildeten RNS ist. Das ist aber nur dann der Fall, wenn die spezifische Aktivitat der neugebildeten RNS in allen Zellarten gleich ist. Nur unter dieser Voraussetzung bedeutet die doppelte eingebaute 3H-Aktivitat such die doppelte Menge an neugebildeter RNS. Die spez. Akt. der neugebildeten RNS ist
Beteiligung van 3H-Cytidin an der RNS-Synthese aber in verschiedenen Zellarten nur dann gleich, wenn such die spez. Akt. der freien CytidyGure in diesen Zellarten gleich ist. Das ist aber nur dann der Fall, wenn bei allen Zellarten die Prozentuale Beteiligung des exogenen Cytidins an der zellu&ren RNSSynthese gleich ist. Dies ist die Voraussetzung daf iir, daB die autoradiographische Korndichte bzw. die spezifische Aktivitgt bei chemischen Versuchen ein Ma13 fiir die RNSSynthese-Rate ist. Die gleichen iiberlegungen gelten such in solchen Ftillen, bei denen eine zellul&e RNSSyntheserate bei einem behandelten und einem normalen Tier verglichen wird. Auch dann mu13 die Voraussetzung erfiillt sein, da6 die Prozentuale Beteiligung beim experimentell behandelten Versuchstier und bei dem Kontroll-Tier gleich ist. Unbekannt ist zur Zeit eine Kopplung zwischen der Phosphorylierung von 3H-Cytidin durch die sog. Cytidin-Kinase auf der einen Seite und der mengenm%ig iiberwiegenden physiologischen Synthese von Cytidylsgure auf der anderen Seite. Solange aber nicht allgemein gezeigt worden ist, dal3 die Prozentuale Beteiligung von exogenem Cytidin an der RNS-Synthese bei verschiedenen Zellarten gleich ist, kann die inkorporierte 3H-Cytidin-Aktivit%t nicht als ein MaB fiir die Rateder RNS-Synthesegenommen werden. Von Lang, Miiller & Maurer [15] wurden Bhnliche Versuche mit 3H-Thymidin bei Zellarten der Maus und bei HeLa-Zellen durchgefiihrt. Fiir die Prozentuale Beteiligung von exogenem freiem Thymidin an der zellulgren DNS-Synthese fanden sich tihnliche Werte wie in Abb. 2. Auch bei Versuchen mit 3HThymidin ist die Kornzahl/Kern bzw. die specifische DNS-Aktivitgt nur dann ein Ma13 fiir die DNS-Syntheserate, wenn die Prozentuale Beteiligung des exogenen Thymidins an der DNS-Synthese von Zelle zu Zelle und nach experimenteller Behandlung eines
151
Tieres die gleiche ist. Fi.ir 3H-Thymidin konnte die Prozentuale Beteiligung fiir mehrere Zellarten der Maus direkt gemessen werden. Sie war bei den untersuchten Zellarten gleich. Das beweist aber noch nicht, da13 die Prozentuale Beteiligung such bei anderen-nicht untersuchten-Zellarten die gleich sein mul3. Mit Unterstiitzung schaft.
der Deutschen Forschungsgemein-
REFERENCES 1. Adelstein, S J. Lyman. C P & O’Brien. R C. Coma biochem phy&oi 12 (i964) 223. ’ . 2. Anarwal, M K & Weinstein, I B, Biochemistry 9 (1970) 503. 3. Blobel, G & Potter, R, Biochim biophys acta 166 (1968) 48. 4. Ceriotti, G, J biol them 198 (1952) 297. 5. David&, J N, The biochemistry of the nucleic acids. Methuen & Co., London (1965). 6. Erdos, T & Bessada, R, Biochim biophys acta 129 (1966) 628. 7. Ernst, H, Deimel, M & Maurer, W. Unveriiffentlicht. (Siehe: Ernst, H, Dissertation, K61n (19561.) 8. Gerber, G, Gerber, G & Altman, K I, J biol them 235 (1960)
2682.
9. Hadjioloi,
A A, Biochim biophys acta 119 (1966)
547.
10. Hanoune,J&Agarwal,MK,FEBSlett 11(1970)78. 11. Hempel, K, Habilitationsschrift (1967), Med Fak Univ Wiirzburg. 12. Hilscher, B, Hilscher, W & Maurer, W, Naturwiss 53 (1966) 415. 13. Hinrichs, R H, Petersen, 0 P & Baserga, R, Arch path 78 (1964) 245. 14. H$;ah, C A, Hiatt, H H, J biol them 241 (1966) 15. Lang, W, Miiller, D & Maurer, W, Exptl cell res 49 (1968)
558.
Loeb, J N, Howell, R R & Tomkins, G M, Science 149 (1965) 1093. 17. McElhone, M J, O’Connor, P J & Craig, A W, Biochem j 125 (1971) 821. 18. Quincey, R V & Wilson, S H, Proc natl acad sci 16.
US 64 (1969) 19.
20. 21. 22. 23. 24. 25. 26.
681.
Revel, M & Hiatt, H H, Proc natl acad sci US 51 (1964) 810. Schmidt, G & Thannhauser, S J, J biol them 161 (1945) 83. Staehelin, T, Wettstein, F 0 & Noll, H, Science 140 (1963) 180. StGcker, E & Pfeifer, U, Naturwiss 52 (1965) 663. Tominaga, H, Aki, J & Natori, Y, Biochim biophys acta 228 (1971) 183. Trakatellis, A C, Axelrod, A E & Montjar, M, J biol them 239 (1964) 4237. - Nature 203 (1964) 1134. Wilson, S H & Hoagland, M B, Biochem j 103 (1967) 556.
Received July 14, 1972 Exptl
Cell Res 78 (1973)