Zellfunktionen und zellfunktionswechsel in der entwicklung von Dictyostelium discoideum

Experimental

535

Cell Research 25, 535-554 (1961)

ZELLFUNKTIONEN DER ENTWICKLUNG

UND ZELLFUNKTIONSWECHSEL VON DICTYOSTELIUM

IN

DISCOIDEUM

V. STADIENSPEZIFISCHE ZELLKONTAKTBILDUNG QUANTITATIVE ERFASSUNG

UND

IHRE

G. GERISCH Max-Planck-Institut

fiir

Biologie,

Eingegangen

Abt. Weidel, Tiibingen,

Deutschland

am 8. Mai 1961

DIEdurch

Nahrungsmangel [ 111 ausgelijste Metamorphose der DictyosteliumZelle vom solitlren Stadium der vegetativen Amobe zu einer Zelle, die als Glied eines Verbandes an geordneten Gestaltungsbewegungen (Aggregation) teilnimmt, ist offensichtlich mit einem Umbau der Zellmembran verbunden, der die Herstellung fester Verbindungen zwischen den einzelnen Amoben ermijglicht. Der unmittelbare Nachweis einer fiir aggregationsreife Zellen spezifischen Bindungsform ist Gegenstand dieser Arbeit. Wenn eine Suspension von Dictyostelium-discoideum-Zellen schwach bewegt wird, urn die Zellen passiv miteinander in Beriihrung zu bringen, so agglutinieren die Amoben, d. h. die zusammengestoflenen Zellen bleiben aneinander haften und verbinden sich zu griifieren Zellkomplexen, Agglutinaten. Obwohl die Agglutinationsflhigkeit unabhlngig vom Entwicklungsstadium der Zellen ist [3], ist es doch sehr wahrscheinlich, da13 die Stlrke oder die Art der interzellularen Kontakte im Laufe der Entwicklung Verlnderungen unterworfen ist. Dafiir sprechen neben dem unmittelbaren Eindruck der verketteten und in Strange zusammengeschlossenen Aggregatamoben [14] die Ergebnisse immunologischer Teste, nach denen die Zelloberfliche bei der Reifung Anderungen ihres Antigenbestandes erflhrt [6], sowie die Beobachtung, da13 Zellagglutinate von einem bestimmten Reifestadium der Amoben an durch zusatzliche Bindungen stabilisiert werden [3]. Die GriiBe der Zellagglutinate ist einerseits eine Funktion der auBeren mechanischen Beanspruchung, bei konstanter Beanspruchung und sonst identischen Bedingungen (Zelldichte, ZellgroBe, Zellform) aber gibt das Verteilungsdiagramm der AgglutinatgroBen eine Charakteristik der mechanischen Eigenschaften der Zellkontakte. Wenn man in einer geeigneten Versuchsanordnung (Rollkultur) die Fhissigkeitsbewegung standardisiert und Experimenfal

Cell Research 25

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G. Cerisch

gleichzeitig durch Rotation der VersuchsgefgiBe das Festheften der Zellcn an den Glaswsnden verhindert, so erhglt man eine Suspension van Agglutinatcn, aus deren GriiBe sich ein Schlul3 z. B. auf die Festigkeit tier Zellkontakte ziehen lll3t [3] (vgl. eine ghnliche fiir Vertebratenzellen ent\vickelte Methode

[lOI). Abgesehen von dieser Methode zur quantitativen Erfassung der Zellkontaktbildung ist der Nachweis eines fiir aggregationsreife Amiiben spezifischen Zellkontaktes an zwei technische Voraussetzungen gebunden: (1) An ein Kulturverfahren, bei dem die Amijben die Aggregationsreife in Form einzeln suspendierter Zellen synchron erreichen, da nur auf diese Weise genau vergleichbares fiir den Agglutinationstest verwendbares Material vegetativer und aggregationsreifer Zellen gewonnen werden kann. Das hierfiir geeignete Submerskulturverfahren, bei dem die maximale Aggregationsreife etwa 9 Std. nach vollstgndigem Bakterienverbrauch erreicht wird, wurde in der ersten Mitteilung dieser Reihe ausfiihrlich beschrieben [3]. (2) An die Eliminierung der nicht stadienspezifischen Zellkontaktbildung, die sich in der Agglutination der Zellen aller Entwicklungsstadien gufiert. Einen Weg dazu erijffnete die Beobachtung, daB die unspezifische Agglutination bei EDTAl-Konzentrationen, die die Aggregation kaum merklich hemmen, nahezu aufgehoben wird. Im Folgenden wird deshalb die Stabilitit der Zellkontakte vegetativer und aggregationsreifer Zellen gegeniiber EDTA verglichen in der Annahme, da13 die fiir aggregationsreife Zellen charakteristischen Kontakte sich durch eine erhiihte EDTA-Resistenz auszeichnen.

MATERIAL

UND

METHODEN’

Als Versuchsmaterial diente der Dictyostelium-discoideum-Stamm v-12/Ml. Ftir die wurden mit Escherichia coli B/r als Futter submers geziichtete Zellen verwendet, diese 3 x gewaschen und 1 Std. der Rollkultur unterworfen, dann durch vorsichtige Zugabe von Trichloressigstiure fixiert (gleiches Volumen einer 5 %igen LGsung der Zell- und Agglutinatsuspension beigemischt). Trichloressigslure stoppt die Agglutination und stabilisiert die Zellgruppen, so da13 diese durch schonendes Pipettieren zur Auszghlung in eine Blutztihlkammer (0,i mm Tiefe) tibertragen werden kiinnen, ohne da13eine ins Gewicht fallende Zerteilung der Gruppen zu beftirchten ist. Die Auswertung der Rollkulturversuche erfolgte bei schwacher Beeinflussung der Bindungsstlrke durch Ausmessung eines Durchmessers je Agglutinat in zufallsAgglufinationsversuche

1 Abkiirzungen: EDTA, Athylendiamintetraessigslure. SUK, Stadienunspezifiscbe bildung. SSK, Stadienspezifische Kontaktbildung. 2 Ausfiihrliche Darstellung der allgemeinen Versuchstechnik s. [3]. Experimental

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Kontakt-

Zellfunktionen

in Dictyostelium

discoideum. V

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bestimmter Richtung und Aufstellung einer Verteilungskurve der AgglutinatgroSen; bei starker Hemmung der Zellkontaktbildung (bei einem hohen Anteil einzelner Zellen und sehr kleiner Gruppen im Praparat) durch Auszahlung der Zellen und direkte Bestimmung der Zellenzahl in Gruppen mit 4 12 Zellen. Bei Gruppen mit > 12 Zellen waren die Zellen nicht mehr genau auszahlbar. Ihr Anteil mul3te durch Subtraktion der pro Volumeneinheit direkt erfal3ten Zellen von der in einer nicht agglutinierten Vergleichsprobe bestimmten Gesamtzelldichte ermittelt werden. Vor dem Eintragen in die Zahlkammer wurden allzu grol3e Agglutinate, falls vorhanden, durch Filtration durch Nylongaze (62 ,u Maschenweite) entfernt. Als ,,vegetative“ Amdben dienten Zellen, die zwischen t, und t,, d. h. innerhalb 1 Std. nach vollstandigem Bakterienverbrauch, der Submerskultur entnommen waren; sie werden im folgenden als f,-Zellen bezeichnet. Bei AbschluS der Versuche hatten diese Zellen nicht das Alter t, (ausnahmsweise t,) iiberschritten. Nach noch unveroffentlichten Versuchen unterliegt die Zellkontaktbildung bis zur Zeit t4 keinen mit der angewendeten Technik fal3baren Veranderungen. - Als aggregationsreife Zellen galten solche, die bis zur Zeit t,,, in der Submerskultur verblieben (t,-Zellen). Durch Auftropfen einer Probe der Zellsuspension auf einen Objekttrager kann man sich auf Grund der unmittelbar beginnenden Strangbildung leicht iiberzeugen, da13 die Zellen tatsachlich das gewunschte Stadium erreicht haben. Atmungsmessungen wurden in der Warburgapparatur in 15 ml-Kegelgefal3en bei 23,O”C vorgenommen. Fiillung 2 ml oder 3 ml gewaschener Zellsuspension (Zelldichte im Mittel 3,3 * 10’ Zellen/ml); im Einsatz 0,2 ml 20 %iger Kalilauge. Fiir Aggregationshemmteste wurden Suspensionen von t,-Zellen nach Mischen mit der zu priifenden Substanz, in diesem Falle EDTA, auf Deckglaspraparate ubertragen und nach 3 Std. kontrolliert. Oder: Einfiillen von 0,2 ml der Suspension in verschlieobare, aus Glasplatten mit aufgekitteten Kunststoffringen (40 mm innerer Durchmesser) bestehende Kammern. Migrierende Pseudoplasmodien entstammten Plattenkulturen auf pbosphathaltigem Glukose-Pepton-Agar (GP-Agar, [3]) oder mit Tris gepuffertem PGTl-Agar [2]. Je etwa 5 Pseudoplasmodien kamen in Boveri-Schalen mit 5 ml der Versuchslosung. Als Grundmedien dienten m/60 Phosphatpuffer nach Sorensen pH 6,0 und 7,4, sowie NaCl-KCl-Tris-Medium [2] mit HCl auf pH 6,7 eingestellt. EDTA wurde als 2,O. 10-l M, auf den jeweils gewiinschten Wert mit NaOH k 0,2 pH-Einheiten genau eingestellte Stammlosung den gepufferten Zellsuspensionen oder Versuchslosungen zugesetzt. ED TA-Bestimmungen erfolgten komplexometrisch mit MgCl,-Losung gegen Indikator-Puffertabletten Merck. Die CaCl,-Liisung wurde ebenfalls gegen Indikator-Puffertabletten auf die verwendete EDTA-Losung eingestellt. Zellenzahlen und Zelldichten gebe ich auf zwei verschiedene Arten an, die nicht denselben Aussagewert haben: (1) In Werten, die durch direkte Auszahlung in einer Probe zur Zeit des Versuches gewonnen sind; so bei der Auswertung der Agglutinationsversuche, bei der es auf die aktuelle Zellzahl in den Proben ankommt. (2) In Werten, die sich auf Messungen des Zellvolumens/ml Suspension griinden, die zur Zeit f, vorgenommen sind. Damit wird fur jede Kultur ein von ihrem Alter 2 t, unabhangiger Bezugswert festgelegt, der durch nachtragliche, mit einer Herabsetzung der durchschnittlichen ZellgrGDe verbundene Teilungen nicht beeinfluI3t wird. Solche Werte erbalten im Folgenden den Zusatz (f,). Beide Skalen sind fur jedes Kulturalter >f, ineinander iiberfiihrbar ([4], Fig. 8). Experimental

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ERGEBNISSE

Ernpjindlichkeit L5Bt man zunehmender

der stadienunspezijschen gegeniiber EDTA

Kontaktbildung

(S UK)

t,-Zellen in der Kollkultur ohne EDTA und in einer R&he EDTA-Konzentrationen agglutinieren, so erhtilt man eine

72

96

104

112 120

128

136

744 152

160

168

I78

184

132 ZOO

Agglutinatdurchmesser /Jo] -

Abb. 1 a.

Abb. 1 b. Abb. 1. - to-Zellen; Agglutinatbildung in EDTA verschiedener Konzentration mit Phosphat pH 6,O ats Grundmedium. (a) Relative Haufigkeit der Agglutinatdurchmesser (Agglutinate mit einem Durchmesser ~40 ,u nicht berticksichtigt). Mittelwerte aus 2 Versuchen; in jedem Versuch jeweils mindestens 115 Agglutinate gemessen. Schwarz: ohne EDTA (m/60 Phosphat pH 6,0); schraffiert: 1,O. lo-41M EDTA; weig: 1,O. 10-s&I EDTA. (b) Hiiufigkeitsverteilung von Einzelzellen und kleinen, aus 1-12 Zellen bestehenden Agglutinaten. Mittelwerte aus 2 Versuchen. WeiB: EDTA 1,O. lo-2M; punktiert: EDTA 1,O. 10-3M; schraffiert: EDTA 1,O. 10-4M; schwarz: m/60 Phosphat pH 6,0. Zelldichte (Mittelwert) 7,3. 106/ml. Experimental

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Zellfunktionen

in Dictyostelium

discoideum.

V

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fortschreitende Herabsetzung der Agglutinatgrijfle, aus der einmal die Empfindlichkeit der SUK gegeniiber EDTA ablesbar ist, die andererseits aber such die Brauchbarkeit der Rollkulturmethode zum Nachweis von Vergnderungen der Kontaktfestigkeit demonstriert. Die EDTA-Wirkung ist bereits bei einer Konzentration von 1,O. 10-a M nachweisbar (Abb. 1 a), 2ulJert sich in 1,O. 1O-3 M EDTA in einer noch stgrkeren Herabsetzung der AgglutinatgrXle und fiihrt in 1,O. 10d2 molarer Liisung zu so starker Hemmung der Agglutinatbildung, dafi die Zellen entweder einzeln bleiben oder sich hiichstens zu wenigzelligen Gruppen verbinden (Abb. 1 b). Der mit zunehmender EDTA-Konzentration immer hahere Anteil kleinerer Agglutinate und der Abfall der Hgufigkeit griiflerer Agglutinate diirfte typisch sein fiir die Abbildung einer Herabsetzung der Kontaktfesfigkeif im AgglutinatgriX%en-Diagramm. Splter (S. 544) wird ein Beispiel gegeben werden, das nicht diese klare Verlagerung der Hgufigkeit in Richtung kleinerer oder gr6Berer Werte aufweist und deshalb auf eine so einfache Weise nicht zu deuten ist. Grundstiitzliches

ZUT Methodik

Aus Fig. 1 geht hervor, da13 je nach dem Grad der Agglutinationshemmung verschiedene Auswertungsmethoden eingesetzt werden miissen. 1st die Hemmung nur schwach (EDTA-Konzentrationen 1,O. 10-4 M und 1,O. 1O-3 M), so ergibt allein die Ausmessung der AgglutinatgrGIJen (Durchmesser) eine klare Differenz gegeniiber der Kontrolle (Abb. 1 a), wlhrend die Hlufigkeit von Einzelzellen und wenigzelligen Gruppen nicht signifikant erh6ht ist (Abb. 1 b). Bei starker Hemmung dagegen (EDTA-Konzentration 1,O. 1O-2 M) ist eine Ausmessung der hiichstens aus wenigen Zellen bestehenden Agglutinate nicht mehr sinnvoll. In diesem Falle liefert die Bestimmung der GruppengrSBe durch direkte Auszghlung der Zellen ein klares Resultat. Diese Methode ist wesentlich exakter als die erstgenannte, denn sie ergibt unmittelbar die Verteilung der Zellen einer Population auf die einzelnen GriiQenklassen. Der wesentliche Nachteil der erstgenannten Methode in ihrer routinemll3ig durchfiihrbaren Form besteht darin, dalJ sie die Verteilung der Zellen auf die Agglutinatgriiflenklassen nicht ohne weiteres erkennen 1513t und einen unverhlltnismlfiig hohen Anteil kleinerer Agglutinate registriert. Ferner kijnnen bei Darstellungen wie in Abb. 1 a nur die mittleren und hohen GrGflenklassen beriicksichtigt werden, da kleine Agglutinate etwa von 40 ,u an, das sind ungefghr drei Amijbendurchmesser, zu unregelmgflig geformt sind, urn auf diese Weise ausgewertet zu werden. Aufierdem reprgsentiert bei nicht vollkommen runden Agglutinaten die Messung eines AgglutinatdurchExperimental

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messers nur angenfihert die AgglutinatgriiBe, d. h. das ,~gglutinatrolumell oder die Zahl der im ;\gglutinat enthaltenen Zellen. Die gefundene Strcuung Streuung der Agglutinatgriiljen ist infolgedessen: ((I) van de1 frrtsiichlichen der Agglutinatgriifle und (0) von dem Grad der IJnregelmgfiigkeit der Agglutinatform abhgngig. Nur bei einem ausgeprggten CTnterschied zwischen den gefundenen Streuungen zweier Proben (vgl. die Agglutinatgriiflenverteilung der Mutante aggr-4 im Vergleich zum Wildtyp ([3], Abb. 11)) darf daher auf eine tatslchliche Differenz der AgglutinatgrGOen-Streuung geschlossen werden.

Reversibilitlit

der EDTA- Wirkung durch Cu. -

Die Hemmung der Agglutination von t,-Zellen durch 1,O. 1O-2 M EDTA wird durch Zusatz einer Squimolaren Ca*.-Menge aufgehoben (Abb. 2). Daraus folgt, da13 die Agglutinationshemmung nicht auf einem unspezifischen EinfluIj der EDTA, sondern auf der Chelatbildung mit mehrwertigen, fiir die SUK unentbehrlichen Kationen beruht. Ob diese Kationen Ca..-Ionen sind, ist damit nicht erwiesen; es kann sich ebensowohl urn andere Kationen (hlg**) handeln, die mit EDTA weniger stabile Chelate bilden als Ca** und deshalb durch dieses aus dem EDTA-Komplex verdrgngt werden.

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Abb. 2. - t,-Zellen; Reversibilitdt der EDTA-Wirkung durch Ca”. Zellen in Phosphat pH 6,0 3 x gewaschen und suspendiert. Zelldichte 6,3. 10B/ml. Rollkultur: (a) in EDTA 1,O. 10-ZM, nach 73-80 min fixiert; (b) in 1,O. 10-2M EDTA, nach 72 min 0,130 ml CaCl,-Liisung entsprechend 1,02+0,02 EDTA-Iiquivalenten, sowie 0,178 ml Tris 0,5 molar zugesetzt. End-pH 6,0*0,2. 13 min darauf fixiert; (c) Kontrolle, nach 73-80 min fixiert. (a) weiQe Slulen, (b) schraffiert, (c) schwarz. Tris wurde zur Abbindung der freiwerdenden SLure verwendet, weil es beim Einmischen keine Lyse der Zellen verursacht. n NaOH stattdessen ergibt grundstitzlich das gleiche Ergebnis, nur sind dann die Versuche nicht mehr genau auswertbar, weil ein Teil der Zellen lysiert ist. Experimental

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Zellfunktionen Geringftigiger

in Dictyostelium

EinflujJ

der EDTA

discoideum. V

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auf die Aggregation

Obwohl die SUK in 1,0 * 1O-2 M EDTA-Losung nahezu vollig unterdrtickt ist, wird das Verhalten aggregationsftihiger Amijben unter den gleichen Bedingungen nur unwesentlich beeinfluot. Die Amijben vermogen sich noch zu strecken, in Kettenform aneinanderzuheften und zu Strangen zusammenzulagern (Abb. 3). Lediglich an einer Verzogerung der Ausbildung des Aggregationsmusters ist ein leichter EDTA-EinfluB zu bemerken. Ferner gewinnt man beim Vergleich einer griiBeren Zahl von Prlparaten den Eindruck, da13 die unter EDTA-Einflul) gebildeten Strange lockerer sind als die der EDTA-freien Kontrollpraparate, die seitliche Zusammenlagerung der Amoben zu Strangen also etwas gestiirt ist. Die Grenze der EDTA-Toleranz liegt fiir die Aggregation zwischen 2,0 * low2 M und 4,0 *1O-2 M. Dagegen blockiert EDTA (1,O * 1O-2 M) die Entwicklung am Ende des Aggregationsstadiums; die Amiiben wandern zwar zusammen, die entstehenden, am Rande diffus verlaufenden Zellgruppen entwickeln sich aber nicht zu Fruchtkorpern weiter, obwohl die Amiiben noch 46 Std. nach der Zugabe der EDTA beweglich, also intakt sein kiinnen. Die terminale Verbindung der Zellen oder die Fahigkeit, laufend neue Verbindungen zu kniipfen, bleibt ebenfalls mindestens genau so lange erhalten, was am Rande der Zellgruppen, wo die Amijben locker liegen, an der Verkettung der Zellen zu erkennen ist. In 5,O. 1O-3 molarer Losung konnen in Deckglasprlparaten, wo die Zellgruppen der Wasser-Luftgrenzfllche aufliegen, Capitula entstehen, ha&g unterbleibt aber such hier dieser erste Schritt der Fruchtkorperbildung. Wie an anderer Stelle [5] ausfiihrlich berichtet, werden dagegen in 2,5. 1O-3 dd EDTA Fruchtkorper, jedoch stark aberrante, gebildet. Beispiel: Aggregation in EDTA, Phosphat pH 6,0. t,,-Zellen 3 x in Phosphat gewaschen, in EDTA + Phosphat resuspendiert, 2 mm3 auf Deckglas. Zelldichte 3,O. lO’/ml (t2) = 4,3 * 102/mm2 (tB). Beurteilung 3 Std. nach Fertigstellung (je 2 Prap.): EDTA 4,0~10-~ M, die meisten Amoben annahernd rund, kaum beweglich. Ein kleiner Teil mit Pseudopodien, nicht gestreckt, nicht verkettet, kontraktile Vakuolen aktiv, im Zellinnern lebhafte Plasmabewegung; EDTA 2,O.1O-2 M, Amoben tiberwiegend gestreckt, grofienteils verkettet, deutliches Aggregationsmuster; EDTA 1,O*1O-2 M und 5,O.lOF M, annabernd normale Aggregation, Strange z.T. dicht, z.T. noch locker. Kontrolle (Phosphat ohne EDTA), Aggregation, vereinzelt Capitula gebildet. Beurteilung nach 6 Std.: EDTA 4,O.1O-2 M kaum verandert, im Zellinnern bei den meisten Zellen Brown’sche Bewegung; 2,O. 1O-2 M und 1,O. 1O-2 M Aggregation, Strange und dichte Gruppen, keine Capitula; 5,O. lO-s M, Gruppen meist mit Capitulum Kontrolle, Entwicklung z.T. bis zur Conusbildung fortgeschritten. Experimental

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Beurteilung nach 46 Std.: 4,O. IOP M und 2,0 * 1OP JI. Zellen desintegriert; I,0 .lOP M, Amdben stellenweise desintegriert, die iibrigen in dichten oder lockeren Gruppen, beweglich, durch feste Kontakte zusammengehalten; 5,0 .1O-3 tihnlich vorige, Capitula riickgebildet, nicht mehr deutlich abgesetzt; Kontrolle, normale Fruchtk6rper. Experimental

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Zellfunktionen

in Dictyostelium

discoideum. V

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Auf Grund dieser Beobachtungen mufi man erwarten - vorausgesetzt, da0 sich die EDTA-Wirkung nur auf die Kontaktbildung erstreckt -, 1. da13 die aggregierenden Zellen die Ftihigkeit haben, Zellkontakte zu bilden, die wesentlich EDTA-stabiler sind als die stadienunspezihschen, und 2. daB an der Fruchtkijrperbildung eine weitere, wiederum wesentlich EDTAemphndlichere Form der Zellkontaktbildung beteiligt ist. Die Richtigkeit dieser Folgerungen wird in den nachsten Abschnitten gepruft. Quantitativer Phosphatpuffer

Vergleich der Agglutination

von t,- und t,-Zellen

in EDTA

pH 6,0 als Grundmedium

Die Kontaktbildung von Zellen, die die Aggregationsreife erlangt haben, ist wesentlich unemptindlicher gegen EDTA als die der t,-Zellen. Entnimmt man Zellen zur Zeit t, der Submerskultur, wlscht sie mit Puffer, fiigt EDTA 1,0 * 1O-2 ill hinzu und bringt sie in der Rollkultur unter die gleichen Bedingungen, die bei t,-Zellen die Agglutinatbildung fast vollsthndig verhindern, so erhalt man dichte Agglutinate (Abb. 4 and 5), die allerdings nicht die gleiche GriiBe wie in EDTA-freien Kontrollkulturen erreichen; ihr Durchmesser erreicht nach Messungen von je 200 Agglutinaten aus 5 Versuchen maximal 96-144 ,u. Zum Vergleich sind in Abb. 6 die Agglutinatgroflen ohne EDTA zur Zeit to und t, als Mittelwerte aus 2 Kulturen gegeniibergestellt, denselben, die bereits in Abb. 1 herangezogen wurden.

Abb. 4. - Agglutinafbildung eon t,- und f,-Zellen in EDTA 1,O. IOFM und in EDTA-freien Kontrollen (Phosphaf pH 6,O). Mittelwerte aus Zghlungen an 10 Kulturen. Zelldichte f, (8,45 &0,63) .lO”/ml, Standardabweichung s = 1,98; t, (lo,32 *0,95) .lOB/ml, s = 3,Ol. Experimental

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, - Agglutinatbildung uon to- und t,-Zeilen in ED T-4. Vcrsuchsbedingungen Abb. (a) f,; ‘b) f,.

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wit bei Fig. 4.

Zellfunktionen

in Dictyostelium

discoideum. V

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Beim Vergleich dieser Hlufigkeitsverteilung.,(Abb. 6) fiillt auf, dal3 zwar die Gipfel bei etwa 128,~ zusammenfallen, da13 aber der Anteil kleinerer Agglutinate bei t, gegeniiber t, stark verringert ist. Hier liegt ein Fall vor, der nicht einfach durch Zu- oder Abnahme der Kontaktfestigkeit erklHrt werden kann, worauf bereits auf S. 339 hingewiesen wurde.

llw

120

13.8 752

769

IBY 2&l

216 232 ‘232

Agglufinaidurchmesw &] -

Abb. 6. - Relative Htiufigkeit der Agglutinatdurchmesser von t,- und t,-Zellen in Phosphat pH 6,O. (Agglutinate mit einem Durchmesser < 40 p nicht beriicksichtigt). Zelldichte (Mittelwert) 8,4. 10B/ ml (t.J. Mittelwerte aus zwei Versuchen. In jedem Versuch jeweils mindestens 115 Agglutinate gemessen.

Kontrollen Abhiingigkeit der Agglutinatbildung von der Zelldichte. - Aliquote Volumina von Submerskulturen zur Zeit t, und t, enthalten weder dieselbe Zahl an Zellen, noch ist das Gesamtzellvolumen in ihnen gleich. Die Zahl der Zellen ist bei t, durch nachtrggliche Teilungen erhiiht, das Volumen der Zellmasse dagegen vermindert; wahrscheinlich infolge der ausschliefilich endogenen Atmung (vgl. [41 Abb. 8). Es ist deshalb nicht miiglich, die Agglutinationsversuche mit absolut vergleichbaren Zellsuspensionen durchzufiihren. Gliicklicherweise sind die Ergebnisse von der Zelldichte und dem Gesamtzellvolumen in den Suspensionen so wenig abhlngig, daB such dann noch ein klarer Unterschied in der Agglutinatbildung zwischen t,- und t,-Proben bestehen bleibt, wenn der Bereich dieser unvermeidlichen Differenzen iiberschritten wird. Versuchsbeispiel. - Zur Zeit t, stieg bei Erhiihung der Zelldichte von 5,4’ 10s/ml auf 21,4. 10B/ml der %-Anteil der Zellen in Agglutinaten mit mehr als 12 Zellen von 4,6 auf 27,2; zur Zeit t, schwankte der %-Anteil bei Variation der Zelldichte zwischen 6,2. iOB/ml und 24,8 +lPjm1 nur zwischen 97,0 und 98,2.

Beeinflussung der Atmung durch EDTA. EDTA die Kontaktbildung direkt beeinfluat,

Es wurde vorausgesetzt, da13 d. h. unmittelbar an den fiir Experimental

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G. Gerisch die Kontaktbildung verantwortlichen Strukturen der Zellmembran angreift. Falls der ,,turn-over” fur die Kontaktbildung notwendiger Verbindungen sehr hoch ist, wiirde man ein lhnliches Ergebnis aber such dann erhalten, wenn EDTA so in den Stoffwechsel eingreift, dalj die Synthese dieser Verbindungen dadurch betroffen wird; wobei man voraussetzen mu&e, dat3 f,Zellen gegen diesen EDTA-EinfluB empfindlicher sind als Zellen zur Zeit t,. Wegen der Stabilitlt der Fe.*.-Chelate kommt fur EDTA in erster Linie Atmungshemmung in Betracht. Da die Xtochondrienform [16] und die Cytochromoxydase-Aktivitlt [ 161 mit der Entwicklung parallelgehenden Anderungen unterworfen sind, kijnnte die Empfindlichkeit der Atmung durchaus phasenspezifisch verschieden sein. Signifikante Einfliisse der EDTA auf die Atmung sind jedoch bei der in den Agglutinationsversuchen angewendeten Konzentration (1,0 * 1O-2 M, pH 6,0) und bei verdoppelter Konzentration weder bei t,- noch bei t,-Zellen zu erkennen. (Die Abweichungen im O,-Verbrauch gegeniiber Kontrollen in m/60 Phosphat pH 6,0 sind < 4 “/.) Da das Verhalten der Amijben unter den vorliegenden Bedingungen ebenfalls nicht sichtlich durch EDTA verandert wird - besonders entstehen keine Bruchsackpseudopodien (,,surface bubbling“) - ist die Annahme gut begriindet, dat3 EDTA die SUK unmittelbar beeinflufit und im vorliegenden Fall keine stijrenden Nebenwirkungen besitzt. Bestimmung des EDTA-uberschusses.-Zur Zeit f, wurden die Zellen einer Submerskultur (Zelldichte 7,s *106/ml (tz)) a b zentrifugiert und im Uberstand (A) die mit EDTA titrierbaren Kationen bestimmt. Die gewaschenen Zellen wurden 1. in Phosphat pH 6,0, 2. unter Zusatz von 1,0 * 1O-3 M EDTA submers weiterkultiviert (Zelldichte 6,s * 106/ml (Q), dann abzentrifugiert und in den Uberstanden der Phosphatkontrolle (B) und des EDTA-Ansatzes (C) wiederum die freien bzw. an EDTA gebundenen komplexbildenden Kationen bestimmt. Ergebnisse (1 A4 verbrauchte EDTA =l M Kation gesetzt): Titrierbare Kationen in Phosphat (Grundmedium) 0,O. lo+ Rf/l; Titrierbare Kationen in A, aus den Futterbakterien stammend 11,4* lop5 M/l; Titrierbare Kationen in B, von den Amiiben an das Medium abgegeben, 0,s. lO-6 M/l; Freie EDTA in C, mit MgCl, zurticktitriert (vorgegebene EDTA = 100,O. 1O-5 iI4 gesetzt) 97,7. 1O-5M/l; das sind (nach Abrechnung des Zellvolumens) 97,1x der eingetragenen Menge. Hiichstens 5 % EDTA aus einer 1,O. 10-Z III Liisung werden also in einer gewaschenen Zellsuspension gebunden (die Fehlerbreite der Bestimmung auf -+_2 % geschgtzt). Unter den Bedingungen des Agglutinationstestes (1 ,O . 1O-2 ,v EDTA) ist der gebundene Anteil sicher <: 1 y;. Auf Grund des hohen EDTA-Uberschusses ist es verst%ndlich, dalj die Zelldichte (und die Konzentration der mit den Zellen eingetragenen, mit EDTA reagierenden Experimental

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Zellfunktionen

in Dictyostelium

discoideum. V

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Kationen) nur einen schwachen EinfluS auf das Ergebnis der Agglutinationsversuche hat. Aus demselben Grunde kiinnen die Agglutinations- und Atmungsmessungen ohne weiteres aufeinander bezogen werden, obwohl die Zelldichte bei letzteren 5-fach erhoht war. T&Medium

pH 6,7 und Phosphat pH 7,4 als Grundmedien.

In dieser Arbeit wird EDTA nur als Hilfsmittel benutzt, urn die SUK auszuschalten, und die grBI.lere EDTA-Stabilitat der stadienspezifischen Kontaktbildung (SSK) ist lediglich ein giinstiger Umstand, sie isoliert zu untersuchen. Es ist nicht das Ziel nachzuweisen, daI.l Ca*. bei der SSK iiberhaupt keine Rolle spielt und damit die SSK in Bezug auf ihren Mechanismus als prinzipiell verschieden von der SUK zu erklaren. Dennoch ist es im Hinblick auf die von DeHaan [2] betonte hohe EDTA-Emphndlichkeit der Aggregation und die daraus gezogenen Folgerungen wichtig, die Grenze der EDTAStabilitat fur die SSK zu kennen. Aus diesem Grunde wurde die Agglutination bei erhijhtem pH-Wert und dadurch erhiihter Stabilitlt des Ca-EDTAChelats und in ‘Iris-Medium untersucht, das such in anderen Fallen die EDTA-Wirksamkeit erhiiht [ 131. Die Agglutinatbildung ist sowohl in EDTA-Phosphat pH 7,4 als such in EDTA-Tris im Vergleich zu EDTA-Phosphat pH 6,0 herabgesetzt (Abb. 7), doch ist die Stabilitlt der SSK noch bemerkenswert hoch. Zumindest im erstgenannten Medium ist aber die Grenze des spezitischen EDTA-Einflusses auf die Kontaktbildung bereits tiberschritten: Die Atmung ist gehemmt (urn 23 y0 nach 2 Std. in EDTA 1,0 * 10e2 Al; urn 28 y, in EDTA 2,0 * 1O-2 iM(je 1 Messung)), als Schadigungseffekt tritt Bruchsackpseudopodienbildung (,,surface bubbling“) auf. Die Aggregation wird bei einer Konzentration von 1,0 * 10e2 M EDTA in Tris-Medium pH 6,7 weitgehend gehemmt. In Phosphat pH 7,4 hemmt EDTA bereits bei einer Konzentration von 5,0 *1O-3 J4 die Aggregation vollstandig. Die Zellkontaktbildung als Teilfunktion der Aggregation ist also EDTA-stabiler als die Aggregation als Ganzes. Beispiele: (a) Aggregation in EDTA, Phosphat pH 7,4. t,-Zellen 3 x in Phosphat gegewaschen, in EDTA + Phosphat resuspendiert. Zelldichte 3,s . 10’ /ml (f,) = 8,6. lo2 /mm2 (t2). Beurteilung 3 Std. nach Fertigstellung (je 2 Praparate): EDTA 5,0~10-~ M, Zellen nicht verkettet, nicht deutlich gestreckt, zum Teil abgerundet; zum Teil mit spitzen Pseudopodien schwach beweglich, zum Teil Bruchsackpseudopodien bildend. Die Plasmabewegung wird undeutlich und durch Brown’sche Bewegung von Zelleinschliissen tiberlagert (Viskositatsabnahme!); EDTA 2,5. 10M3M, nur vereinzelt Zellen gestreckt und verkettet, sonst wie vorige; EDTA 1,O. lO-3 1M, sowie Kontrolle (Phosphat ohne EDTA pH 7,4) und EDTA 1,O.1O-2 M in Phosphat pH 6,0, Zellen gestreckt, verkettet und Strgnge bildend. Experimental

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(b) Aggregafion in EDTA, NnCI-KC/-Tris pH 6,7. t,-Zellen (a) in Tris-Medium + EDTA i,0.10-2 M, (b) in Tris-Medium ohne EDTA und (c) in Phosphat pH 6,0 + EDTA 1,O.1O-2 &I 3x gewaschen und resuspendiert. Zelldichte 6,8. 10B/ml = I,3 * i03/mm2. Beurteilung nach 3 Std. (je 2 Prgparate): (a) etwa die HBlfte der Zellen vom Glas geliist, in Gruppen, die tibrigen zu einem kleinen Teil gestreckt und kurze Ketten bildend; (b) und (c) Zellen h&fig verkettet, fest haftend. Beurteilung nach 13 Std.: (a) nur wenige Amiiben am Glase haftend, die tibrigen in dichten Gruppen; (b) und (c) ausgeprggtes Strangmuster, ZeIIen haftend. Nach 21 Std. in (a) nur wenige Zellen desintegriert. Die iibrigen z.T. mit spitzen Pseudoplasmodien langsam beweglich, z.T. Bruchsackspeudopodien bildend. Amiiben hgufig durch feste, bei gestreckten Zellen terminale Kontakte verbunden.

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7. - t,- und t,-Zellen; Vergleich der Agglufinatbildung in oerschiedenen Grundmedien mit und ohne EDTA. Mittelwerte aus 2 Versuchen. Zelldichten (Mittelwerte) t,; t,: Phosphat pH 6,0 11,l;

Abb.

14,5.10s/ml; Phosphat pH 7,4 9,2; 11,3.10B/ml;Tris 10,8; 10,9.10g/ml. Experimental

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EDTA- Wirkung auf migrierende Pseudoplasmodien Die auf eine nur schwache EDTA-Hemmung der Aggregation gegriindete Voraussage, da13 bei aggregationsreifen Zellen ein EDTA-stabiler Zellkontakt nachweisbar sein miisse, hat sich im Agglutinationstest bestltigen lassen. An migrierenden Pseudoplasmodien ist nun zu priifen, ob die zweite Annahme ebenfalls zutrifft, da13 die Blockierung der Entwicklung nach AbschlulJ der Aggregation auf die unentbehrliche Beteiligung einer weiteren, und zwar EDTA-labilen Bindung am Aufbau der folgenden Entwicklungsstadien hinweist. Eine solche Bindung kijnnte die EDTA-stabile Aggregationsbindung ersetzen oder zus5tzlich auftreten, so da13 beide Bindungen gemeinsam den Zusammenhalt der Zellen in migrierenden Pseudoplasmodien bewirken. Migrierende Pseudoplasmodien, von Agarplatten entnommen und in EDTA-Lijsung (1,0 * 10d2 M in Phosphat pH 6,0) eingelegt, verlieren ihre glatte Kontur und beginnen unmittelbar sich aufzulockern, bilden formlose Zellmassen; doch zerfallen sie spontan nicht in unverbundene Einzelzellen. Der gr613te Teil der Zelloberfllche wird zwar freigelegt, an einzelnen Punkten bleiben die Zellen aber fest untereinander verbunden (Abb. 8). Die auf diese Weise verketteten und vernetzten Zellen sind lebhaft

Abb. 8. - Migrierende Pseudoplasmodien in ED TA I,0 .I OVm. Pbosphat (pH 6,0 als Grundmedium). Zellen durch teilweise spiralig gedrehte (+) plasmatische FortsPtze verbunden. Pseudoplasmodien von GP-Agar entnommen; photographiert 2 Std., nach EDTA-Zusatz. 36 - 61173267

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beweglich, wodurch es zu Dehnungen und Verdrehungen in der Nachbarschaft der Kontaktstellen, aber selten zum Abreifien der Verbindungen kommt. Doch kiinnen die Kontakte in der EDTA-Losung such gel&t und neu gekniipft werden. In Abb. 8 CI sind Stellen durch Pfeile markiert, an denen die aneinanderhaftenden Fortsltze zweier Zellen spiralig aufgedreht sind. Diese Bilder vermitteln einen Eindruck von der betrachtlichen Zerreififestigkeit der EDTA-stabilen Kontakte des Pseudoplasmodiums, die selbst nach 5pH stiindigem Aufenthalt in 2,0 . lo- 2 M EDTA, gel&t in KCl-NaCl-Tris 6,7 noch erhalten ist, such wenn auf phosphatarmem PGTl-Agar geziichtete Pseudoplasmodien verwendet werden (vgl. dagegen [a]). Bei dem EDTA-Effekt handelt es sich nicht nur urn eine Auflijsung der sondern zweifellos urn eine Wirkung auf die Pseudoplasmodiumhiille, Bei Zerteilung von Pseudoplasmodien in interzellullren Verbindungen. EDTA-freien Medien bleiben die Zellen in kompakten, nicht in der fur EDTA bezeichnenden Weise aufgelockerten Massen vereinigt. - Die Grenze der EDTA-Empfindlichkeit liegt bei 1,0 * 10-4 M EDTA (Phosphat pH 6,0 als Grundmedium). Bei dieser Konzentration bilden die Zellen unregelmaoig begrenzte, aber noch kompakte Massen. DISKUSSION

Aus der unterschiedlichen, auf einem direkten EinfluB des Inhibitors beruhenden EDTA-Empfindlichkeit der Kontaktbildung bei t,- und t,-Zellen geht zunlchst klar hervor, dal3 die Fahigkeit, Zellkontakte zu bilden, bei vegetativen und aggregationsreifen Zellen verschieden ist. Es bedarf nun noch der Klarung, (1) ob es sich dabei nur urn quantitative Unterschiede handelt oder urn die Ausbildung einer neuen Art des Zellkontaktes wahrend der Zellreifung; (2) ob die im Agglutinationstest nur bei t,-Zellen gefundene Form der Zellkontaktbildung wirklich der Verbindung der Amiiben in den Aggregationsstrangen aquivalent ist und (3) ob an der Entstehung des migrierenden Pseudoplasmodiums noch weitere Bindungstypen beteiligt sind. Zu 1. - Wenn bei aggregationsreifen Zellen nur die interzellularen Haftpunkte vermehrt win-den, dann miil3te man nach Ausfall der EDTA-Hemmversuche erwarten, da13 die Haufigkeitsverteilung der Agglutinatgriiften in Richtung hiiherer Werte verlagert wird. Eine so einfache Beziehung ist an Vergleichsdiagrammen von t,- und t,-Agglutinaten aus EDTA-freien Proben jedoch nicht zu erkennen. Im angefiihrten Beispeil (Abb. 6) liegt der Hauptgipfel bei t, und t, an der gleichen Stelle; in anderen Fallen lag sogar der t,-Gipfel bei niedrigeren Werten als das entsprechende $-Maximum, trotz Experimental

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erhiihter EDTA-Stabilitlt der Kontakte. Dennoch ist aus den Verteilungsdiagrammen eine Verlnderung der Kontaktbildung ablesbar. Sie luBert sich in der geringeren Hautigkeit extrem kleiner Agglutinate. Die interzellularen Bindungen sind demnach bei t,-Amijben in ihren mechanischen Eigenschaften so verandert, da13 die Abspaltung kleiner Zellgruppen aus groBen Agglutinaten erschwert wird. Nimmt man vorweg, daB der EDTA-stabile Anteil der t,-Kontaktbildung der fur die Verkettung der Amijben in den Aggregationsstrlngen verantwortlichen Bindung entspricht, so erhllt man ein weiteres Argument gegen die Annahme nur quantitativer Unterschiede. Denn es besteht keine Korrelation zwischen der Flhigkeit zur Strangbildung und der im Agglutinationstest gefundenen Stlrke unterzellullrer Bindungen. Die AgglutinatgriiBen im EDTA-freien Medium zur Zeit to iibertreffen die im EDTA-Medium zur Zeit t, bedeutend, dennoch kiinnen die Amijben unter den letztgenannten Bedingungen Aggregationsstrange bilden (Abb. 3), im ersten Faile aber nicht. Somit kann nur die EDTA-stabile Bindung fur die Aggregation von Bedeutung sein, die absolute Bindungsstlrke dagegen ist unwesentlich. Eine eindeutige Erklarung dafiir lCl3t sich auf Grund der Ergebnisse dieser Arbcit nicht geben. Die Eigenart der Aggregationskontakte, die Zellen nur an kleinen Teilarealen ihrer Membran, an diesen aber sehr fest zu verbinden, diirfte dabei eine Rolle spielen, da im Agglutinationstest iiber die gesamte Zelloberflache integriert wird. Daneben ist zu beriicksichtigen, daB such Anderungen der Kontaktstlrke zwischen Zelle und Substrat, die bei Dictyostelium bisher noch nicht quantitativ untersucht wurden, mitwirken kiinnen. Dalj die aggregierenden Zellen nicht flach auf dem Substrat ausgebreitet, sondern gestreckt-zylindrisch mit annahernd kreisfiirmigem Querschnitt sind, deutet auf eine Verminderung des Substratkontaktes hin. Es sprechen also alle Befunde dafiir, da13 bei t,-Zellen nur oder fast ausschliefilich eine Art des interzellullren Kontaktes (SUK) ausgebildet ist, wahrend sich bei i,-Zellen zwei Kontakte (SUK und SSK) iiberlagern, und daI3 beide Arten der Kontaktbildung durch ihre unterschiedliche EDTAEmpfindlichkeit weitgehend getrennt werden kiinnen. Ihre Entsprechung auf molekularem Niveau findet diese funktionelle Umstellung in der Besetzung der Zellmembran mit neuen antigen wirksamen Komponenten [B, 71. Zu 2. - Die Identitat der im Agglutinationstest fal3baren EDTA-stabilen Bindungsform und der fiir die Verkettung aggregierender Amiiben verantwortlichen wird durch zwei Parallelen, die hohe EDTA-Stabilitat und die Gleichzeitigkeit des Auftretens, belegt. Dazu kommt, da13 die Amiiben aus t,-Agglutinaten hautig als Ketten verbunden auswandern, wenn die AgglutiExperimental

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nate mit einem Substrat in Kontakt gebracht werden, die Kettenbildung also zweifellos such im Agglutinat selbst erfolgt. Zu 3. - An der Verbindung der Zellen in migrierenden Pseudoplasmodien sind ebenso wie in t,-Agglutinaten offensichtlich 2 Kontaktformen unterschiedlicher EDTA-Stabilitgt beteiligt. Die EDTA-stabilere gleicht in dieser Eigenschaft und ebenso in der Beschrgnkung auf kleine Membranareale der EDTA-stabilen Aggregationsbindung, so da13 es sich in beiden Fgllen wahrscheinlich urn denselben Bindungstyp handelt. Das wiirde bedeuten, dalj die SSK im migrierenden Pseudoplasmodium persistiert. Dagegen ist es zweifelhaft, ob die EDTA-labile Pseudoplasmodienbindung mit der SUK identisch ist. Und zwar deswegen, weil elektronenmikroskopische Aufnahmen [9] eine nahezu liickenlose Verbindung der Zellen im migrierenden Pseudoplasmodium zeigen, die Kontaktstellen in Agglutinaten aber von griifleren Liicken unterbrochen sind, was an der stlrkeren Lichtstreuung der Agglutinate ohne Weiteres zu sehen ist. Die Herstellung fast liickenloser Verbindungen, die als Hinweis auf das Wirksamwerden einer weiteren Zellgruppen beKontaktart angesehen werden kann, ist auf polarisierte schrtinkt und steht somit in einem noch unbekannten Zusammenhang mit der Induktion der Polaritst [3]. Fiir eine besondere, artspezifische Oberfl%chenaffinit$t der Zellen des migrierenden Pseudoplasmodiums spricht der Befund, dalj Dictyostelium discoideum und D. mucoroides gemeinsame Aggregate, aber getrennte Fruchtkijrper bilden [12]. Immunologisch konnten dagegen keine Unterschiede zwischen den OberflCchen aggregierender Amijben und Zellen migrierender Pseudoplasmodien aufgedeckt werden [7]. Doch schliel3t dies such nach der Theorie von Tyler [ 171 und Weiss [18] die Existenz besonderer KontaktSubstanzen in migrierenden Pseudoplasmodien nicht aus. Die Theorie fordert lediglich, daB die interzellultire Bindung nach dem Prinzip einer Antigen-AntikGrper-Bindung erfolgt, nicht aber, dal3 die ,,combining sites“ der Zellkontakte immer such eine spezifische immunologische Antigenitlt besitzen miissen. Zur Beurteilung von Inhibitorwirkungen auf die Aggregation ist es entscheidend, ob Zellen benutzt werden, die aggregationsflhig sind oder solche, die die Aggregationsreife erst noch erlangen miissen. Im ersten Fall kann man damit rechnen, an der Aggregation unmittelbar beteiligte Mechanismen zu blockieren, im anderen braucht nur die Reifung, nicht aber die Aggregation selbst gestijrt zu sein. Auf solchen Materialunterschieden diirften Differenzen zwischen Ergebnissen von DeHaan [2] und den hier vorgelegten beruhen. Nach DeHaan ist die Aggregation, besonders die Strangbildung wghrend der Experimental

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Aggregation, stark EDTA-empfindlich. Da in diesen Versuchen, in denen Zellen im nichtaggregationsreifen Zustand nach Abschwemmen von Agarplatten mit dem Inhibitor versetzt werden, EDTA eine hohe Letalwirkung besitzt und anscheinend als Folge einer Stoffwechselschadigung Bruchsackpseudopodienbildung (,,surface bubbling“; vgl. [S]) auslost [2], diirften die Ergebnisse keinen SchluB auf eine unmittelbar die Aggregation hemmende EDTA-Wirkung zulassen. Beziiglich der EDTA-Emptindlichkeit migrierender Pseudoplasmodien stimme ich mit DeHaan soweit iiberein, dal3 EDTA eine weitgehende Auflockerung und den Verlust der typischen Form bewirkt. Nicht aber darin, da13 die Zellen vollstandig isoliert werden und tiberhaupt keine Kontakte untereinander bilden. Fur diese Differenz lassen sich methodische Griinde nicht anfiihren; vielleicht ist sie nur scheinbar, denn DeHaan beobachtete nach Trypanblau-Farbung Verbindungen zwischen den Zellen, die diinn ausgezogene plasmatische Fortsatze (Abb. 8) sein konnten. Auf eine theoretische Besprechung kann hier verzichtet werden, da in den Experimenten keine Ergebnisse zutage traten, die eine der bestehenden Theorien iiber die molekulare Basis der Zellkontaktbildung [l, 15, 17, 181 strikt beweisen oder andere strikt widerlegen. Doch mijchte ich nochmals darauf hinweisen, da0 fur die SUK mehrwertige Kationen, wahrscheinlich sind, wahrend die SSK gegen deren Entfernung mindeCa*., unentbehrlich stens ebenso unempfindlich ist wie die Zelle als Ganzes. Da der EDTAEffekt auf die SUK trotz EDTA-Uberschusses mit zunehmender Konzentration nur langsam verstlrkt wird, diirften die Ionen am Wirkungsort in komplex gebundener Form vorliegen. SUMMARY

1. From the results of quantitative agglutination studies it is concluded that Dictyostelium cells can establish at least two different types of intercellular contacts differing in their sensitivity to EDTA. The more sensitive contact is independent of the developmental stage of the cells; the less sensitive contact is not established until the aggregation stage. Likewise, the binding of amoeba cells in chains and streams, typical of aggregation, is only slightly affected by EDTA and therefore corresponds to the second type of cell contact demonstrated in the agglutination test. 2. By means of EDTA the development can be blocked spec.ifically after aggregation is finished, since for the establishment of the migrating pseudoplasmodium an EDTA-sensitive cell binding is indispensable. Besides this, Experimental

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pseudoplasmodia

are connected

by contacts

of high

Herm Prof. Dr. Dr. W. Weidel danke ich ftir die grofiztigige Untersttitzung Arbeit und ftir anregende Diskussionen. LITERATUR 1. CURTIS, A. S. G., Am. Naturalist 94, 37 (1960). 2. DEHAAN, R. L., J. Embryol. expil. Morphol. 7, 335 (1959). 3. GERISCH, G., Wilhelm Roux Arch. Entwickhmgsmech. 152, 632 (1960). 4. Developmental Biol. (im Druck).

5. __ Wilhelm Roux’ Arch. Entwicklungsmech. 6. GREGG, J. H., J. gen. Physiol. 39, 813 (1956). 7. Biol. Bull. 118, 70 (1960).

153, 158 (1961).

8. LETTR~, H., ALBRECHT, M. und LETTRB, R., Ncdurwissenschaften 38, 505 (1951). 9. MERCER, E. H. and SHAFFER, B. M., J. Biophys. Biochem. CytoI. 7, 353 (1960). 10. MOSCONA, A., Exptl. Cell Research 22, 455 (1961). 11. RAPER, K. B., J. Elisha Mitchell Sci. Sot. 56, 241 (1940). 12. RAPER, K. B. and THOM, C., Am. J. Botany 28, 69 (1941). 13. REPASKE, R., Biochim. et Biophys. Acfa 30, 225 (1958). 14. SHAFFER, B. M., Quart. J. microscop. Sci 98, 377 (1957). 15. STEINBERG, M. S., Am. Naturalist 92, 65 (1958). 16. TAKEUCHI, I., Developmenfal Biol. 2, 343 (1960). 17. TYLER, A., Growth 10 (Suppl.), 7 (1946). 18. WEISS, P., Yale J. Biol. Med. 19, 235 (1947).

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