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A propos du mécanisme du test de shelley
A PROPOS DU MECANISME DU TEST DE SHELLEY Par
A.D. ADO, A.A. POLNEI~ et T . I . SEI~OVA (Moscou)
Les leucocytes basophiles du sang, comme les mastocytes des tissus, jouent un r61e important dans les r6actions a!lergiques du type imm6diat. Les basophiles participent 5 la lib6ration d'histamine et d'h@arine [1], et peut-4tre de s&otonine [16] et de slow-reacting-substance [15] ). Selon G~AHA~ et coll. [5] et SOFTm [21], la moiti6 de l'histamine contenue dans Ie sang circulant est contenue dans les leucocytes basophiles; les granules de ces eellules contiennent environ 6a p. cent de la quantit6 totale de l'histamine intracellulaire [13]. La r4action des leucocytes basophiles avec les antighnes et les anticorps allergiques correspondants se traduit par une d4granulation de ces cellules [18, 19, 21]. Cependant, pour certains auteurs, des substances biologiquemcnt actives peuvent 4tre lib4r6es sans que les granules sortent des cellules [9]. En 1961, SHELLEY et JUHLIN[17] ont propos6 une m&hode de diagnostic fond~e sur la rdaction sp6cifique des basophites sous Finfluence de l'allerg~ne et du s6rum du malade. Puisque le sang pfriph6rique de l'homme contient entre 0,35 et 1 p. cent de basophiles, SHELLEY [19] a mis au point un test indirect utilisant des basophiles de lapin, en raison du fair que le sang de cet animal contient 4 h 8 p. cent de ces cellules. La dfgranulation des basophiles constitue un mod61e de r6action anaphylactique en miniature [8] qui se traduit par des modifications morphologiques. En fair, selon SHELLEY [2@ la d6granulation compl6te ne se rencontre que tr&s rarement. Le test de SHELLEY indirect est actuellement largement utilis6 pour diagnostiquer des r4actions allergiques du type imm6diat chez ]'homme. I1 est utilis6 par divers auteurs darts le diagnostic de l'allergie mddicamenteuse, en particulier aux antibiotiques (tels que la p6nicilline, l'oxacilline, la streptomyeine, ]a t4tracycline, le chloramph4nicol ou ]a colimycine), 5 ]'insuline, ou ~ d'autres substances dans ]e diagnostic de ]'allergie alimentaire, ou de l'allergie aux pollens. Nous avons pour notre part utilis6 le test de SHELLEY indirect dans le diagnostic des pollinoses. On ne connalt pas encore compl~tement la nature des anticorps allergiques que l'on caract&ise par cette r6action. On sait depuis longtemps que dans l'allergie de type imm6diat chez l'homme on distingue au moins trois types d'anticorps. Si l'on
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ADO,
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POLNER
ET
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SEROVA
se r6fbre h la classification des anticorps allergiques propos4e par ADO Iz], on pent consid6rer que les r&gines constituent des anticorps ~ agresseurs ~> qui jouent un r61e capital dans le d4veloppement des r4actions allergiques du type imm6diat. Les anticorps bloquants jouent un r61e de d6fense et les anticorps h4magglutinants sont des (( t6moins ~. S~ELLEY et JUHLIN [181, puis POLNEg [12] out suppos4 que les modifications des basophiles sont provoqu4es par les r4agines. Ce travail r4pond h trois buts : 1) Etudier les modifications morphologiques des basophiles au tours des r6actions antigbne-antieorps ehez des malades atteints de pollinose. 2) Etudier le test de S~ELLEY indirect en taut que r4action immunologique, et plus particu]ihrement d4terminer le rapport optimal entre l'allerg~ne et les anticorps. 3) Tenter de earaet6riser les r6agines ~ l'aide de la r6action de S~ELL~r. La r4action a dr4 effeetu4e selon la technique d~erite par S ~ L ~ ' , sa forme originale, soit modifi4e selon !es modalit6s ci-dessous.
soit darts
MATERIEL ET M~THODES
1) Le s&um sanguin est r6cemment pr41ev6 ou eonserv4 ~ la temp6rature de °C. Nous avons 4tudi6 des s4rums de malades atteints de pollinose avec sensibilisation aux pollens de Phleum pratense et d'Ambrosia artemisiaefolia.
--20
2) L'aIlerg~ne est un extrait de pollen pr4par6 selon la m4thode de CocA [voir 22]. On extrait 3 grammes de pollen d4lipid4 par loo m] de tampon phospha v te ~ pH 7,2, sans addition de ph4nol. Aprhs passage ~ travers un filtre de ZEIss~ l'allerghne est conserv~ ~ la temp6rature de - - 2 0 °C. 3) Les leucocytes de lapin sont obtenus par pr41~vement de la touche leueocytaire aprhs eentrifugation du sang de lapin h4parin4 h la vitesse de 3 ooo tours par minute pendant 5 minutes dans des tubes de verre fins. 4) La r~action proprement dire. Sur une lame pr4alablement color4e par une solution alcoolique de rouge neutre 0,3 p. cent, on place en quantit4s 4gales les 3 414ments suivants : les leucocytes, 1 ~ x i t • le serum du malade que l'on 6tudie et 1 allergene. On les melange avec preeautlons avec le bord d'une ]amelle et on place le tout dans une 4tuve h 3"7 °C pendant lo minutes. En m4me temps, on pr4pare des lots t6moins comprenant Fun, l'allerg6ne et les leucocytes, l'autre, le s6rum et les leucocytes. On 6value les r4sultats l'ai.de d'un microscope a immersion. S~ELLEY [19] propose de compter zo basophiles; nous en avons eompt6 4o. On eonsid~re que la reaction est positive si le ponrcentage des basophiles qui sont modifi4s dans le lot d'exp4rienee d6passe de plus de i o p . cent eelui des lots tdmoins. Lorsque la r4action est positive, les modifications que l'on observe dans ]es basophiles sont tes suivantes : les granules sont gonfl6s et moins fortement color4s ; la morphologie des basophiles se modifie, avec apparition de pseudopodes. Nous n'avons observ4 ni de destruction complete des cellules avee 14sion de leur membrane, ni de d4granu]ation.
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REVUE
FRAN~AISE
D'ALLEI~GOLOGI~
M E C A N I S M E DU T E S T
DE S H E L L E Y
5) La microcindmatographie nous a 6galement permis d'6tudier les modifications morphologiques an cours de la r4action de S H ~ E Y . Nous avons utilis4 une eam4ra PSK al reli6e 5 un microscope dont le grossissement 6tait 6gal 5 ~ 3oo, plac6 dans un milieu thermostat6. La frdquence de prise de rue 4tait d'une image par seconde. RI~SUI.TATS
1) La microcindmatographie montre que los basophiles normaux ont une forme arrondie. Leurs granules, qui sont eolor4s par le rouge neutre, se r@artissent de fa~on variable h l'int&ieur de la cellule en fonction de la position du noyau. Ils sont anim4s de 14gers mouvements. On n'observe pas de pseudopodes. Lorsque la r~action est positive, apr~s 5 5 lo minutes de contact des basophiles avec l'allerg6ne et le s4rum, on observe une (( activation ,, des cellules, que nous avons appel4e ~ granulokin4sie ,~ : les granules se gonflent ; leurs ondulations se renforcent, formant des pseudopodes, et la forme des cellules se modifie ; nous n'avons pas observ4 d'4clatement des cellules. Aprhs environ 3o h 4o minutes, les cellules reprennent leur forme habituelle : les granules quitrent les pseudopodes et regagnent le corps des eellules ; leurs mouvements deviennent moins intenses, ou ne s'observent m4me plus du tout. Ainsi, apr~s 30 h 4o minutes, les cellules reviennent 5 leur 4tat ant6rieur. La figure 1 montre les modifications qui s'observent successivement au cours d'une r4action typique. Ainsi, dans le protocole courant, on examine les cellules au moment off les modifications morphologiques sont les plus nettes, c'est-5-dire l o ~ 15 minutes apr~s le d4but de la rdaction. En fair, ce que Yon d6signe habituellement par ~( d4granulation des basophiles ,, reprfsente iei Fun des stades de la r4action de ees cellules, qui correspond 5 l'augmentation de leurs mouvements amoeboides, la , granulokinfsie ,,, ~ laquelle fair suite une p4riode de repos relatif. a) Caract&es immunologiques de la r&ction des basophiles. Afin d'4tudier les particularit4s immunologiques de la r4action de SHELLEY indirecte, nous n'avons pas utilis4 les plus fortes concentrations d'allerg~nes et d'anticorps, afin de d6terminer le rapport optimal entre ces dernihres. Pour eela, nous avons 4tudi4 l'influence des concentrations de l'allerg~ne et des anticorps sur l'intensit6 de la r&ction de SHELLEY. Les concentrations optimales de l'allerg6ne et du s4rum, c'est-h~dire celles avec lesquelles on observe le plus grand pourcenrage de basophiles modififs, sont indiqu4es sur le tableau I. I~rsque nous avons fait agir l'allerghne et les antieorps aux concentrations optimales, nous avons observ4 des r&ctions positives, m4me avec des s4rums qui ont donn6 des r4actions n6gatives dans Ies conditions standard. Selon AUSTEN et coll. [3], un execs d'antighne a pour effet d'inhiber la ]ibdration d'histamine ~ partir des mastocytes. Nous avons obtenu des r4sultats analogues 5 partir de basophiles de lapin. Nous avons reprdsent4, ~ titre d'exempte, l'6tude que nous avons effectu6e sur le s6rum d'une malade sensibilis4e au pollen d'ambrosie (fig. a). On peut en fair d6finir pour chaque matade les concentrations optimales de l'allerg6ne et du strum selon la concentration des anticorps allergiques qu'il contient.
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SEROVA
O
FIG. a
1. - -
Test
de
SHELLEY i n d i r e c t
dans
h d : modifications suceessives dans un faeon typique. Grossissement : X 1300.
l'allergie basophile
au
pollen.
r6agissant
de
En vue de rechercher une corrdlation entre le test de SHELLEY et la rdaetion de P~AUSNITz-KfisTNER (qui constitue une m&hode classique de recherche des r&gines), nous avons partiellement 4puisd les immunoglobulines IgA et IgG dans le sdrum de malades atteints de pollinose. FIREMAN et coll. [4], puis ORTIZ [10] ont en effet m o n t d que l'activitd des dagines diminue apds dpuisement de ces deux types d'immunoglobulines. Pour cda, nous avons utilisd ]a m&hode qui consiste 5 pr&ipiter les immunoglobulines par des antisdrums de lapin (*). Le degr6 d'dpuisement des immunoglobulines est contr614 par une daction de micro-pr&ipitation sur gel d'agar. A la suite de cette rdaction d'dpuisement, nous avons 6tudid deux autres facteurs : le taux des r&gines dans le s&um (&alu6 par la surface
(*) Ccs a n t i s 6 r u m s
~06
sont pr6par6s
p a r l ' I n s t i t u t des v a c c i n s et des s & u m s
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FP, ANC~AISE
/i P r a g u e .
D'ALLEI~GOLOGIE
MECANISME DU TEST DE SHELLEY
SERUM NON DILUE
50:
---- SERUM DILUE AU I/4 --.--SERUM DILUE AU I/8
co 30
20
'J."
:\
\ %
10
0 NON DILUE
1)5
1/25
t )" CONCENTRATION 1/125 1/'625 113125 DE L'ALLERGENE
FIG. 2 . S c h 6 m a des r e c h e r e h e s effectu6es s u r le s 6 r u m d ' u n m a l a d e s e n s i b i l i s 4 a u p o l l e n d ' a m b r o s i e (voir texte). La ligne h o r i z o n t a l e d o n t l ' o r d o n n 6 e est 6gale a 10 p. cent r e p r 6 s e n t e le p o u r c e n t a g e des b a s o p h i l e s modifi6s en l ' a b s e n c e de s 6 r u m , TABLEAU I INFLUENCE DES CONCENTRATIONS OPTIMALES DE L'ALLERG~NE ET DU SERUM S U R L'INTENSITE
ALLERG~NES
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.
phl6ole phl6ole phl4ole phl6ole phl4ole ambrosie ambrosie ambrosie ambrosie ambrosie phl4ole phl4ole phl6ole phl6ole
phl4ole phl6ole
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DE
]q.ESULTATS D E LA REACTION SELON LA TECHNIQUE ]DE S H E L L E Y
÷
÷÷ ++÷ ÷ + -÷ ÷
+ ÷ +
LA REACTION
DES
BASOPHILES
DE
LAPIN
R-EACTIONS SELON N O T R E Concentrations optimales du s6rum
Concentrations optimales de l'allerg6ne
1:4 1:4 1:2 n o n dilu6 n o n dilu4 1:4 1:2 1:2 1:8 n o n dilu6 1:2 1:4 1:4 1:4 1:4 n o n dilu6
1:25 1 : 3125 I : 625 1:5 n o n dilug 1 : 625 1:5 ]:25 I : 125 1 : 125 1:25 1:25 1 : 125 1:25 1 : 625 1 : 125
TECHNIQUE
R4sultats de la r6action
++ +÷ ÷++ ++ ÷+ +++ ++÷+ ++÷+ ++÷ +++÷ ÷÷ +÷÷ ++ ÷+ ÷++ +++
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FRAN~IAISE
D'ALLERGOLOGIB
MECANISME
DU T E S T
DE SHELLEY
de la papule dans la traction de PRALTS~'ITz-KfiSTNER) et le pourcentage de basophiles ayant subi des modifications morphologiques au tours de la rfaction de S~ELLEY. NOUS avons choisi des concentrations du sfrum qui permettent d'appr4cier un @uisement partiel des anticorps, taut par la r6action de S~ELLEY que par leur transfert passif au cours de la r6action de PRAIJSNITZ-K/_iSTNEP,. Dans la r4action de PRAUSSrITz-KfiSTNER effectude sans 4puisement des anticorps, la surface moyenne de la papule, calcul4e en multipliant le plus grand diam6tre par le plus petit diamhtre de ta papule, est 4gale h ~1,~ 5 ± ~a,35 mmL Elle est 4gale 5 3"- --+ 9 mm~ aprhs 4puisement de l'immunoglobuline IgA et h 37,5 +-lo,8 ram'-' apr~s @uisement de l'immunoglobuline IgG. Ainsi, l'intensit4 de la r4action de PRAUSNITz-KfiSTNERdiminue d'un facteur en moyenne 4gal 5 3,5 apr~s @uisement de l'immunoglobuline IgA (p < 0,o05), et d'un facteur en moyenne 4gal 5 a,9 apr~s @uisement de l'immunoglobuline IgG (p < o,oz). Le pourcentage des basophiles modifi4s s'abaisse d'un facteur a,z apr~s 4puisement des immunoglobulines IgA (p < o,oo~), et d'un facteur 1,5 apr~s 6puisement des immunoglobulines IgG (p < o,ol). Si l'on compare les r4sultats obtenus clans la r6aetion de PRAIJSNITZ-KfiSTNERavec ceux de la rfiaetion de S~ELLm', on constate que le coefficient de corr41ation est 6gal h 0,80, ce qui correspond h u n degr4 de significativit4 de 98 p. cent (tableau II). Ainsi, l'activit4 des r4agines du s4rum, comme le pourcentage des basophiles modifids, s'abaissent aussi bien aprhs 4puisement de I'immunoglobuline IgA que de l'immunoglobuline IgG. Cet abaissement est cependant un peu plus accusd aprhs @uisement de l'immunoglobuline IgA. L'ensemble de ces r4sultats nous conduit 5 supposer que la r4action de S~.LLEXr reflhte, comme la r4aetion de P~A~:SNITz-KiisTNF.R,le taux des r6agines clans le s6rum de malades atteints de pollinose, et peut permettre d'4valuer le degr4 de sensibilisation de l'organisme.
DISCUSSION
Grfic~. 5 l'observation micro-cin6matographique des leucocytes basophiles sous l'influenee de l'allerg~ne sp&ifique et des anticorps allergiques, nous avons constat6 que l'activit4 motrice de ces eellules augmente, que des pseudopodes se forment et que la granulokin4sie se renforce. I1 est probable que des substances biologiquement actives sont alors libfirdes 5 partir des granules. C'est 5 ce stade que l'on 6tudie les modifications morphologiques des basophiles dans ]e test de SHELLEY tel qu'on le pratique habituellement, et e'est pourquoi le terme de ~ d4granulation semble quelque peu impropre. Lorsque nous avons examin4 ]es basophiles pendant une longue p&iode, nous n'avons pas observ6 d'alt4rations cellulaires irrfversibles : la recrudescence de l'aetivit6 amoeboide et la granulokin4sie c~dent progressivement la place 5 une pfriode de repos relatif des eellules, qu'il est alors diffieile de distinguer de cellules t6moins n'ayant pas subi la r6action. Nous avons rechereh6 une corr61ation entre la baisse d'intensit4 de la r6aetion de PRAUS~ITz-KtisT~ER et la diminution du poureentage des basophiles modififs, apr~s 4puisement des immunoglobulines IgA et IgG. Puisque darts ces conditions il existe une eorr41ation statistiquement signifieafive entre la r6action des baso-
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A . D . ADO~ A . A . POLNER ET T. I. SEROVA
philes et le taux des anticorps sensibilisant la peau (r&gines), nous pensons que ces derniers partieipent 5 la r&ction de d4granulation. Cependant, selon ISI-IIZAKAet coll. [6, 7], l'activit4 des r6agines serait lide 'a une immunoglobuline d'un type nouveau. I1 est nfanmoins possible que cette derni&e accompagne les immnnoglobulines IgA et IgG et s'4puise au eours de l'immuno-adsorption eonmre ces derni&res, ou bien que la nature immunologique des r&gines soit hdt6rog&ne [11, 14]. Nous n'avions pas pour but de prdeiser dans ce travail la nature des rdagines, mais nous avons constat6 qne l'4puisement de deux types d'immunoglobulines a pour cons4quence de modifier l'activit4 des r&gines. La r&ction de SHELLEY fait donc intervenir les r&gines, et nous pensons que si elle est effectu4e dans de bonnes conditions, elle peut constitner un modhle de r4action allergique in vitro. Nous avons montrfi qu'il importe pour cela de faire intervenir la proportion optimale entre les concentrations de l'allerghne et des anticorps. Nous pensons que cette r&ction n'est pas li4e 5 la sensibilisation hdtdrologue des basophiles de lapin par des anticorps allergiques humains, mais qu'elle est la cons4quence de la formation d'un complexe allerg6ne-anticorps, et de l'action de ce dernier snr les basophiles.
CONCLUSIONS
1) Au cours du test de SHELLEY indirect, effectu4 avec des s4rums de malades atteints de pollinose, nous n'avons pas observ6 d'alt4rations irr4versibles des basophiles de lapin. La forme des cellules se modifie avec formation de pseudopodes et apparition d'une granulokin&ie, suivies d'un retour progressif ~ un aspect de repos relatif. z) La r&ction de SHKLLEY, effeetu4e selon la technique que nous avons d6erite, reflhte le taux de rdagines dans le s4rum des malades atteints de pollinose. 3) Avec .des concentrations optimales de l'allerghne et dn s&nm ~ 4tudier, cette r6action peut permettre d'4tudier in vitro ehez l'homme l'allergie de type immddiat provoqude par des pollens. [Demandes de lirds d part : Professeur A.D. ADO, Clinique des Maladies Allergiques, Leninski Prospekt I0, Korpus 18, Moscou B 71 (U.R.S.S.)Z.
[Laboratoire de R e c h e r c h e s A l l e r g o l o g i ques, A c a d i m i e des Sciences Mddfeales (Direeteur : p r A . D . ADO), Moseou].
R¢SUMI~
Nous avons utilis4 la miero-cin6matographie pour 6tudier les modifications morphologiques que snbissent les leucocytes basophiles au cours de la r4action de SHELLEY. Nous avons eu reeours ~ des sdrums de malades non trait4s, sensibilisds aux pollens de Phleum pratense et d'dmbrosia artemisiaefolia. Lorsque la r6action 6tait positive, nous avons observ6 des modifications morphologiques des eellules, avee formation de psetldopodes, et apparition d'une ~ granulokin6sie ~, suivies d'un retour progressif ~ un 6tat de repos relatif. Nous n'avons pas constat6 d'6clatement des cellules.
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MI~CANISME DU
TEST DE SHELLEY
N o u s a v o n s recherch4 u n e corr41ation e n t r e u n e baisse de l ' i n t e n s i t 4 de la r4action de PRAUSNITz-KiiSTNER et u n e d i m i n u t i o n d u p o u r c e n t a g e des basophiles a y a n t s u b i des m o d i fications m o r p h o l o g i q u e s a u t o u r s de la r 4 a c d o n de SEEELLEY, apr~s avoir 4puts6 les immnllOglobulincs s4riques I g A et IgG. D a n s ees conditions, n o u s a v o n s c o n s t a t 6 qu'il existe u n e corr61ation s t a t i s t i q u e m e n t significative e n t r e la r4aetion des b a s o p h i l e s et te t a u x des a n t i corps s e n s i b i l i s a n t la p e a u (r6agines). t o n s s u p p o s o n s d o n e q u e la r6aetion des b a s o p h i l e s p e r m e t d ' 6 v a l u e r le t a u x des r4agines d a n s le s d r u m des m a l a d e s a t t e i n t s de pollinose. A v e c d e s c o n c e n t r a t i o n s o p t i m a l e s de l'allerg~ne et d u s 6 r u m k 4tudier, la r 4 a e t i o n de SttELLEY p e u t p e r m e t t r e d'4tudier, chez l ' h o m m e , in vitro, l'allergie de t y p e i m m 4 d i a t p r o v o q u 4 e p a r .des pollens.
SUMMARY CONCERNING THE
MECHANICS OF SHELLEY'S TEST
W e u s e d m i c r o - c i n e m a t o g r a p h y to s t u d y t h e m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s w h i c h occur in b a s o philic l e u c o c y t e s d u r i n g Shelley's t e s t . W e u s e d t h e sera of u n t r e a t e d p a t i e n t s sensitized to t h e pollens of Phleum pratense a n d Ambrosia artemisiaefolia. W h e r e t h e r e a c t i o n w a s positive w e o b s e r v e d m o d i f i c a t i o n s in t h e m o r p h o l o g y of t h e cells w i t h f o r m a t i o n of p s e u d o p o d s a n d t h e a p p e a r a n c e of a <~g r a n u l o k i n e s i a ~>, followed b y a p r o g r e s s i v e r e t u r n to a s t a t e of relative repose. W e f o u n d no b u r s t i n g of cells. W e s o u g h t for s o m e correlation b e t w e e n a decrease in t h e i n t e n s i t y of P r a u s n i t z - i K f i s t n e r ' s r e a c t i o n a n d a decrease in t h e p o u r c e n t a g e of basophiles w h i c h h a d u n d e r g o n e m o r p h o l o g i c a l m o d i f i c a t i o n s in t h e course of Shelley's r e a c t i o n after e x h a u s t i o n of t h e seric i m m u n o - g l o b u l i n s I g A a n d IgG. U n d e r t h e s e conditions we f o u n d a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t correlation b e t w e e n t h e r e a c t i o n of t h e basophiIes a n d t h e n u m b e r of a n t i b o d i e s sensitizing t h e s k i n (reagins). W e p r e s u m e threfore t h a t t h e r e a c t i o n of t h e basophfles e n a b l e s t h e n u m b e r of r e a g i n s in t h e s e r u m of p a t i e n t s suffering f r o m pollinosis to be assessed. W i t h o p t i m u m conc e n t r a t i o n s of t h e allergen a n d t h e s e r u m u n d e r s t u d y Shelley's r e a c t i o n e n a b l e s t h e i m m e d i a t e t y p e of allergy c a u s e d b y pollen to be s t u d i e d in vitro in h u m a n s .
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31t
A . D . ADO, A . A . POLNER ET T. I. SEROVA
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3 ]2
REVUE FIIAsNCdAISE D'ALLERGOLOGIE
A.D. ADO, A.A. POLNEI~ et T . I . SEI~OVA (Moscou)
Les leucocytes basophiles du sang, comme les mastocytes des tissus, jouent un r61e important dans les r6actions a!lergiques du type imm6diat. Les basophiles participent 5 la lib6ration d'histamine et d'h@arine [1], et peut-4tre de s&otonine [16] et de slow-reacting-substance [15] ). Selon G~AHA~ et coll. [5] et SOFTm [21], la moiti6 de l'histamine contenue dans Ie sang circulant est contenue dans les leucocytes basophiles; les granules de ces eellules contiennent environ 6a p. cent de la quantit6 totale de l'histamine intracellulaire [13]. La r4action des leucocytes basophiles avec les antighnes et les anticorps allergiques correspondants se traduit par une d4granulation de ces cellules [18, 19, 21]. Cependant, pour certains auteurs, des substances biologiquemcnt actives peuvent 4tre lib4r6es sans que les granules sortent des cellules [9]. En 1961, SHELLEY et JUHLIN[17] ont propos6 une m&hode de diagnostic fond~e sur la rdaction sp6cifique des basophites sous Finfluence de l'allerg~ne et du s6rum du malade. Puisque le sang pfriph6rique de l'homme contient entre 0,35 et 1 p. cent de basophiles, SHELLEY [19] a mis au point un test indirect utilisant des basophiles de lapin, en raison du fair que le sang de cet animal contient 4 h 8 p. cent de ces cellules. La dfgranulation des basophiles constitue un mod61e de r6action anaphylactique en miniature [8] qui se traduit par des modifications morphologiques. En fair, selon SHELLEY [2@ la d6granulation compl6te ne se rencontre que tr&s rarement. Le test de SHELLEY indirect est actuellement largement utilis6 pour diagnostiquer des r4actions allergiques du type imm6diat chez ]'homme. I1 est utilis6 par divers auteurs darts le diagnostic de l'allergie mddicamenteuse, en particulier aux antibiotiques (tels que la p6nicilline, l'oxacilline, la streptomyeine, ]a t4tracycline, le chloramph4nicol ou ]a colimycine), 5 ]'insuline, ou ~ d'autres substances dans ]e diagnostic de ]'allergie alimentaire, ou de l'allergie aux pollens. Nous avons pour notre part utilis6 le test de SHELLEY indirect dans le diagnostic des pollinoses. On ne connalt pas encore compl~tement la nature des anticorps allergiques que l'on caract&ise par cette r6action. On sait depuis longtemps que dans l'allergie de type imm6diat chez l'homme on distingue au moins trois types d'anticorps. Si l'on
Reu. franG Allergol., 1970, 10 (4), 303-312
A.D.
ADO,
A.A.
POLNER
ET
T.I.
SEROVA
se r6fbre h la classification des anticorps allergiques propos4e par ADO Iz], on pent consid6rer que les r&gines constituent des anticorps ~ agresseurs ~> qui jouent un r61e capital dans le d4veloppement des r4actions allergiques du type imm6diat. Les anticorps bloquants jouent un r61e de d6fense et les anticorps h4magglutinants sont des (( t6moins ~. S~ELLEY et JUHLIN [181, puis POLNEg [12] out suppos4 que les modifications des basophiles sont provoqu4es par les r4agines. Ce travail r4pond h trois buts : 1) Etudier les modifications morphologiques des basophiles au tours des r6actions antigbne-antieorps ehez des malades atteints de pollinose. 2) Etudier le test de S~ELLEY indirect en taut que r4action immunologique, et plus particu]ihrement d4terminer le rapport optimal entre l'allerg~ne et les anticorps. 3) Tenter de earaet6riser les r6agines ~ l'aide de la r6action de S~ELL~r. La r4action a dr4 effeetu4e selon la technique d~erite par S ~ L ~ ' , sa forme originale, soit modifi4e selon !es modalit6s ci-dessous.
soit darts
MATERIEL ET M~THODES
1) Le s&um sanguin est r6cemment pr41ev6 ou eonserv4 ~ la temp6rature de °C. Nous avons 4tudi6 des s4rums de malades atteints de pollinose avec sensibilisation aux pollens de Phleum pratense et d'Ambrosia artemisiaefolia.
--20
2) L'aIlerg~ne est un extrait de pollen pr4par6 selon la m4thode de CocA [voir 22]. On extrait 3 grammes de pollen d4lipid4 par loo m] de tampon phospha v te ~ pH 7,2, sans addition de ph4nol. Aprhs passage ~ travers un filtre de ZEIss~ l'allerghne est conserv~ ~ la temp6rature de - - 2 0 °C. 3) Les leucocytes de lapin sont obtenus par pr41~vement de la touche leueocytaire aprhs eentrifugation du sang de lapin h4parin4 h la vitesse de 3 ooo tours par minute pendant 5 minutes dans des tubes de verre fins. 4) La r~action proprement dire. Sur une lame pr4alablement color4e par une solution alcoolique de rouge neutre 0,3 p. cent, on place en quantit4s 4gales les 3 414ments suivants : les leucocytes, 1 ~ x i t • le serum du malade que l'on 6tudie et 1 allergene. On les melange avec preeautlons avec le bord d'une ]amelle et on place le tout dans une 4tuve h 3"7 °C pendant lo minutes. En m4me temps, on pr4pare des lots t6moins comprenant Fun, l'allerg6ne et les leucocytes, l'autre, le s6rum et les leucocytes. On 6value les r4sultats l'ai.de d'un microscope a immersion. S~ELLEY [19] propose de compter zo basophiles; nous en avons eompt6 4o. On eonsid~re que la reaction est positive si le ponrcentage des basophiles qui sont modifi4s dans le lot d'exp4rienee d6passe de plus de i o p . cent eelui des lots tdmoins. Lorsque la r4action est positive, les modifications que l'on observe dans ]es basophiles sont tes suivantes : les granules sont gonfl6s et moins fortement color4s ; la morphologie des basophiles se modifie, avec apparition de pseudopodes. Nous n'avons observ4 ni de destruction complete des cellules avee 14sion de leur membrane, ni de d4granu]ation.
304
REVUE
FRAN~AISE
D'ALLEI~GOLOGI~
M E C A N I S M E DU T E S T
DE S H E L L E Y
5) La microcindmatographie nous a 6galement permis d'6tudier les modifications morphologiques an cours de la r4action de S H ~ E Y . Nous avons utilis4 une eam4ra PSK al reli6e 5 un microscope dont le grossissement 6tait 6gal 5 ~ 3oo, plac6 dans un milieu thermostat6. La frdquence de prise de rue 4tait d'une image par seconde. RI~SUI.TATS
1) La microcindmatographie montre que los basophiles normaux ont une forme arrondie. Leurs granules, qui sont eolor4s par le rouge neutre, se r@artissent de fa~on variable h l'int&ieur de la cellule en fonction de la position du noyau. Ils sont anim4s de 14gers mouvements. On n'observe pas de pseudopodes. Lorsque la r~action est positive, apr~s 5 5 lo minutes de contact des basophiles avec l'allerg6ne et le s4rum, on observe une (( activation ,, des cellules, que nous avons appel4e ~ granulokin4sie ,~ : les granules se gonflent ; leurs ondulations se renforcent, formant des pseudopodes, et la forme des cellules se modifie ; nous n'avons pas observ4 d'4clatement des cellules. Aprhs environ 3o h 4o minutes, les cellules reprennent leur forme habituelle : les granules quitrent les pseudopodes et regagnent le corps des eellules ; leurs mouvements deviennent moins intenses, ou ne s'observent m4me plus du tout. Ainsi, apr~s 30 h 4o minutes, les cellules reviennent 5 leur 4tat ant6rieur. La figure 1 montre les modifications qui s'observent successivement au cours d'une r4action typique. Ainsi, dans le protocole courant, on examine les cellules au moment off les modifications morphologiques sont les plus nettes, c'est-5-dire l o ~ 15 minutes apr~s le d4but de la rdaction. En fair, ce que Yon d6signe habituellement par ~( d4granulation des basophiles ,, reprfsente iei Fun des stades de la r4action de ees cellules, qui correspond 5 l'augmentation de leurs mouvements amoeboides, la , granulokinfsie ,,, ~ laquelle fair suite une p4riode de repos relatif. a) Caract&es immunologiques de la r&ction des basophiles. Afin d'4tudier les particularit4s immunologiques de la r4action de SHELLEY indirecte, nous n'avons pas utilis4 les plus fortes concentrations d'allerg~nes et d'anticorps, afin de d6terminer le rapport optimal entre ces dernihres. Pour eela, nous avons 4tudi4 l'influence des concentrations de l'allerg~ne et des anticorps sur l'intensit6 de la r&ction de SHELLEY. Les concentrations optimales de l'allerg6ne et du s4rum, c'est-h~dire celles avec lesquelles on observe le plus grand pourcenrage de basophiles modififs, sont indiqu4es sur le tableau I. I~rsque nous avons fait agir l'allerghne et les antieorps aux concentrations optimales, nous avons observ4 des r&ctions positives, m4me avec des s4rums qui ont donn6 des r4actions n6gatives dans Ies conditions standard. Selon AUSTEN et coll. [3], un execs d'antighne a pour effet d'inhiber la ]ibdration d'histamine ~ partir des mastocytes. Nous avons obtenu des r4sultats analogues 5 partir de basophiles de lapin. Nous avons reprdsent4, ~ titre d'exempte, l'6tude que nous avons effectu6e sur le s6rum d'une malade sensibilis4e au pollen d'ambrosie (fig. a). On peut en fair d6finir pour chaque matade les concentrations optimales de l'allerg6ne et du strum selon la concentration des anticorps allergiques qu'il contient.
TO~IE 10, N ° 4, 1970
305
A . D . ADO~ A . A . P O L N E R ET T . I .
SEROVA
O
FIG. a
1. - -
Test
de
SHELLEY i n d i r e c t
dans
h d : modifications suceessives dans un faeon typique. Grossissement : X 1300.
l'allergie basophile
au
pollen.
r6agissant
de
En vue de rechercher une corrdlation entre le test de SHELLEY et la rdaetion de P~AUSNITz-KfisTNER (qui constitue une m&hode classique de recherche des r&gines), nous avons partiellement 4puisd les immunoglobulines IgA et IgG dans le sdrum de malades atteints de pollinose. FIREMAN et coll. [4], puis ORTIZ [10] ont en effet m o n t d que l'activitd des dagines diminue apds dpuisement de ces deux types d'immunoglobulines. Pour cda, nous avons utilisd ]a m&hode qui consiste 5 pr&ipiter les immunoglobulines par des antisdrums de lapin (*). Le degr6 d'dpuisement des immunoglobulines est contr614 par une daction de micro-pr&ipitation sur gel d'agar. A la suite de cette rdaction d'dpuisement, nous avons 6tudid deux autres facteurs : le taux des r&gines dans le s&um (&alu6 par la surface
(*) Ccs a n t i s 6 r u m s
~06
sont pr6par6s
p a r l ' I n s t i t u t des v a c c i n s et des s & u m s
REVUE
FP, ANC~AISE
/i P r a g u e .
D'ALLEI~GOLOGIE
MECANISME DU TEST DE SHELLEY
SERUM NON DILUE
50:
---- SERUM DILUE AU I/4 --.--SERUM DILUE AU I/8
co 30
20
'J."
:\
\ %
10
0 NON DILUE
1)5
1/25
t )" CONCENTRATION 1/125 1/'625 113125 DE L'ALLERGENE
FIG. 2 . S c h 6 m a des r e c h e r e h e s effectu6es s u r le s 6 r u m d ' u n m a l a d e s e n s i b i l i s 4 a u p o l l e n d ' a m b r o s i e (voir texte). La ligne h o r i z o n t a l e d o n t l ' o r d o n n 6 e est 6gale a 10 p. cent r e p r 6 s e n t e le p o u r c e n t a g e des b a s o p h i l e s modifi6s en l ' a b s e n c e de s 6 r u m , TABLEAU I INFLUENCE DES CONCENTRATIONS OPTIMALES DE L'ALLERG~NE ET DU SERUM S U R L'INTENSITE
ALLERG~NES
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.
phl6ole phl6ole phl4ole phl6ole phl4ole ambrosie ambrosie ambrosie ambrosie ambrosie phl4ole phl4ole phl6ole phl6ole
phl4ole phl6ole
TO~E 10, ~° 4, 1970
DE
]q.ESULTATS D E LA REACTION SELON LA TECHNIQUE ]DE S H E L L E Y
÷
÷÷ ++÷ ÷ + -÷ ÷
+ ÷ +
LA REACTION
DES
BASOPHILES
DE
LAPIN
R-EACTIONS SELON N O T R E Concentrations optimales du s6rum
Concentrations optimales de l'allerg6ne
1:4 1:4 1:2 n o n dilu6 n o n dilu4 1:4 1:2 1:2 1:8 n o n dilu6 1:2 1:4 1:4 1:4 1:4 n o n dilu6
1:25 1 : 3125 I : 625 1:5 n o n dilug 1 : 625 1:5 ]:25 I : 125 1 : 125 1:25 1:25 1 : 125 1:25 1 : 625 1 : 125
TECHNIQUE
R4sultats de la r6action
++ +÷ ÷++ ++ ÷+ +++ ++÷+ ++÷+ ++÷ +++÷ ÷÷ +÷÷ ++ ÷+ ÷++ +++
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A.D.
ADO~
A.A.
POLNER
ET
T.I.
SEROVA
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30B
F
REVUE
I
FRAN~IAISE
D'ALLERGOLOGIB
MECANISME
DU T E S T
DE SHELLEY
de la papule dans la traction de PRALTS~'ITz-KfiSTNER) et le pourcentage de basophiles ayant subi des modifications morphologiques au tours de la rfaction de S~ELLEY. NOUS avons choisi des concentrations du sfrum qui permettent d'appr4cier un @uisement partiel des anticorps, taut par la r6action de S~ELLEY que par leur transfert passif au cours de la r6action de PRAIJSNITZ-K/_iSTNEP,. Dans la r4action de PRAUSSrITz-KfiSTNER effectude sans 4puisement des anticorps, la surface moyenne de la papule, calcul4e en multipliant le plus grand diam6tre par le plus petit diamhtre de ta papule, est 4gale h ~1,~ 5 ± ~a,35 mmL Elle est 4gale 5 3"- --+ 9 mm~ aprhs 4puisement de l'immunoglobuline IgA et h 37,5 +-lo,8 ram'-' apr~s @uisement de l'immunoglobuline IgG. Ainsi, l'intensit4 de la r4action de PRAUSNITz-KfiSTNERdiminue d'un facteur en moyenne 4gal 5 3,5 apr~s @uisement de l'immunoglobuline IgA (p < 0,o05), et d'un facteur en moyenne 4gal 5 a,9 apr~s @uisement de l'immunoglobuline IgG (p < o,oz). Le pourcentage des basophiles modifi4s s'abaisse d'un facteur a,z apr~s 4puisement des immunoglobulines IgA (p < o,oo~), et d'un facteur 1,5 apr~s 6puisement des immunoglobulines IgG (p < o,ol). Si l'on compare les r4sultats obtenus clans la r6aetion de PRAIJSNITZ-KfiSTNERavec ceux de la rfiaetion de S~ELLm', on constate que le coefficient de corr41ation est 6gal h 0,80, ce qui correspond h u n degr4 de significativit4 de 98 p. cent (tableau II). Ainsi, l'activit4 des r4agines du s4rum, comme le pourcentage des basophiles modifids, s'abaissent aussi bien aprhs 4puisement de I'immunoglobuline IgA que de l'immunoglobuline IgG. Cet abaissement est cependant un peu plus accusd aprhs @uisement de l'immunoglobuline IgA. L'ensemble de ces r4sultats nous conduit 5 supposer que la r4action de S~.LLEXr reflhte, comme la r4aetion de P~A~:SNITz-KiisTNF.R,le taux des r6agines clans le s6rum de malades atteints de pollinose, et peut permettre d'4valuer le degr4 de sensibilisation de l'organisme.
DISCUSSION
Grfic~. 5 l'observation micro-cin6matographique des leucocytes basophiles sous l'influenee de l'allerg~ne sp&ifique et des anticorps allergiques, nous avons constat6 que l'activit4 motrice de ces eellules augmente, que des pseudopodes se forment et que la granulokin4sie se renforce. I1 est probable que des substances biologiquement actives sont alors libfirdes 5 partir des granules. C'est 5 ce stade que l'on 6tudie les modifications morphologiques des basophiles dans ]e test de SHELLEY tel qu'on le pratique habituellement, et e'est pourquoi le terme de ~ d4granulation semble quelque peu impropre. Lorsque nous avons examin4 ]es basophiles pendant une longue p&iode, nous n'avons pas observ6 d'alt4rations cellulaires irrfversibles : la recrudescence de l'aetivit6 amoeboide et la granulokin4sie c~dent progressivement la place 5 une pfriode de repos relatif des eellules, qu'il est alors diffieile de distinguer de cellules t6moins n'ayant pas subi la r6action. Nous avons rechereh6 une corr61ation entre la baisse d'intensit4 de la r6aetion de PRAUS~ITz-KtisT~ER et la diminution du poureentage des basophiles modififs, apr~s 4puisement des immunoglobulines IgA et IgG. Puisque darts ces conditions il existe une eorr41ation statistiquement signifieafive entre la r6action des baso-
TO)~E 10, Y° 4, 197~
309
A . D . ADO~ A . A . POLNER ET T. I. SEROVA
philes et le taux des anticorps sensibilisant la peau (r&gines), nous pensons que ces derniers partieipent 5 la r&ction de d4granulation. Cependant, selon ISI-IIZAKAet coll. [6, 7], l'activit4 des r6agines serait lide 'a une immunoglobuline d'un type nouveau. I1 est nfanmoins possible que cette derni&e accompagne les immnnoglobulines IgA et IgG et s'4puise au eours de l'immuno-adsorption eonmre ces derni&res, ou bien que la nature immunologique des r&gines soit hdt6rog&ne [11, 14]. Nous n'avions pas pour but de prdeiser dans ce travail la nature des rdagines, mais nous avons constat6 qne l'4puisement de deux types d'immunoglobulines a pour cons4quence de modifier l'activit4 des r&gines. La r&ction de SHELLEY fait donc intervenir les r&gines, et nous pensons que si elle est effectu4e dans de bonnes conditions, elle peut constitner un modhle de r4action allergique in vitro. Nous avons montrfi qu'il importe pour cela de faire intervenir la proportion optimale entre les concentrations de l'allerghne et des anticorps. Nous pensons que cette r&ction n'est pas li4e 5 la sensibilisation hdtdrologue des basophiles de lapin par des anticorps allergiques humains, mais qu'elle est la cons4quence de la formation d'un complexe allerg6ne-anticorps, et de l'action de ce dernier snr les basophiles.
CONCLUSIONS
1) Au cours du test de SHELLEY indirect, effectu4 avec des s4rums de malades atteints de pollinose, nous n'avons pas observ6 d'alt4rations irr4versibles des basophiles de lapin. La forme des cellules se modifie avec formation de pseudopodes et apparition d'une granulokin&ie, suivies d'un retour progressif ~ un aspect de repos relatif. z) La r&ction de SHKLLEY, effeetu4e selon la technique que nous avons d6erite, reflhte le taux de rdagines dans le s4rum des malades atteints de pollinose. 3) Avec .des concentrations optimales de l'allerghne et dn s&nm ~ 4tudier, cette r6action peut permettre d'4tudier in vitro ehez l'homme l'allergie de type immddiat provoqude par des pollens. [Demandes de lirds d part : Professeur A.D. ADO, Clinique des Maladies Allergiques, Leninski Prospekt I0, Korpus 18, Moscou B 71 (U.R.S.S.)Z.
[Laboratoire de R e c h e r c h e s A l l e r g o l o g i ques, A c a d i m i e des Sciences Mddfeales (Direeteur : p r A . D . ADO), Moseou].
R¢SUMI~
Nous avons utilis4 la miero-cin6matographie pour 6tudier les modifications morphologiques que snbissent les leucocytes basophiles au cours de la r4action de SHELLEY. Nous avons eu reeours ~ des sdrums de malades non trait4s, sensibilisds aux pollens de Phleum pratense et d'dmbrosia artemisiaefolia. Lorsque la r6action 6tait positive, nous avons observ6 des modifications morphologiques des eellules, avee formation de psetldopodes, et apparition d'une ~ granulokin6sie ~, suivies d'un retour progressif ~ un 6tat de repos relatif. Nous n'avons pas constat6 d'6clatement des cellules.
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REVUE FRAN~AISE D'ALLERGOLOGI~
MI~CANISME DU
TEST DE SHELLEY
N o u s a v o n s recherch4 u n e corr41ation e n t r e u n e baisse de l ' i n t e n s i t 4 de la r4action de PRAUSNITz-KiiSTNER et u n e d i m i n u t i o n d u p o u r c e n t a g e des basophiles a y a n t s u b i des m o d i fications m o r p h o l o g i q u e s a u t o u r s de la r 4 a c d o n de SEEELLEY, apr~s avoir 4puts6 les immnllOglobulincs s4riques I g A et IgG. D a n s ees conditions, n o u s a v o n s c o n s t a t 6 qu'il existe u n e corr61ation s t a t i s t i q u e m e n t significative e n t r e la r4aetion des b a s o p h i l e s et te t a u x des a n t i corps s e n s i b i l i s a n t la p e a u (r6agines). t o n s s u p p o s o n s d o n e q u e la r6aetion des b a s o p h i l e s p e r m e t d ' 6 v a l u e r le t a u x des r4agines d a n s le s d r u m des m a l a d e s a t t e i n t s de pollinose. A v e c d e s c o n c e n t r a t i o n s o p t i m a l e s de l'allerg~ne et d u s 6 r u m k 4tudier, la r 4 a e t i o n de SttELLEY p e u t p e r m e t t r e d'4tudier, chez l ' h o m m e , in vitro, l'allergie de t y p e i m m 4 d i a t p r o v o q u 4 e p a r .des pollens.
SUMMARY CONCERNING THE
MECHANICS OF SHELLEY'S TEST
W e u s e d m i c r o - c i n e m a t o g r a p h y to s t u d y t h e m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s w h i c h occur in b a s o philic l e u c o c y t e s d u r i n g Shelley's t e s t . W e u s e d t h e sera of u n t r e a t e d p a t i e n t s sensitized to t h e pollens of Phleum pratense a n d Ambrosia artemisiaefolia. W h e r e t h e r e a c t i o n w a s positive w e o b s e r v e d m o d i f i c a t i o n s in t h e m o r p h o l o g y of t h e cells w i t h f o r m a t i o n of p s e u d o p o d s a n d t h e a p p e a r a n c e of a <~g r a n u l o k i n e s i a ~>, followed b y a p r o g r e s s i v e r e t u r n to a s t a t e of relative repose. W e f o u n d no b u r s t i n g of cells. W e s o u g h t for s o m e correlation b e t w e e n a decrease in t h e i n t e n s i t y of P r a u s n i t z - i K f i s t n e r ' s r e a c t i o n a n d a decrease in t h e p o u r c e n t a g e of basophiles w h i c h h a d u n d e r g o n e m o r p h o l o g i c a l m o d i f i c a t i o n s in t h e course of Shelley's r e a c t i o n after e x h a u s t i o n of t h e seric i m m u n o - g l o b u l i n s I g A a n d IgG. U n d e r t h e s e conditions we f o u n d a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t correlation b e t w e e n t h e r e a c t i o n of t h e basophiIes a n d t h e n u m b e r of a n t i b o d i e s sensitizing t h e s k i n (reagins). W e p r e s u m e threfore t h a t t h e r e a c t i o n of t h e basophfles e n a b l e s t h e n u m b e r of r e a g i n s in t h e s e r u m of p a t i e n t s suffering f r o m pollinosis to be assessed. W i t h o p t i m u m conc e n t r a t i o n s of t h e allergen a n d t h e s e r u m u n d e r s t u d y Shelley's r e a c t i o n e n a b l e s t h e i m m e d i a t e t y p e of allergy c a u s e d b y pollen to be s t u d i e d in vitro in h u m a n s .
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REVUE FIIAsNCdAISE D'ALLERGOLOGIE