Aminopeptidasen in Brassica napus1) II. Untersuchungen zum Einfluß von Metallionen, über Aminosäure-Zusammensetzung und katalytische Eigenschaften der relativ alaninspezifischen Aminopeptidase

Biochem. Physiol. Pflanzen 170, S. 143-151 (1976)

Aminopeptidasen in Brassica napus1 ) II. Untersuchungen zum Einflu8 von Metallionen, iiber Aminosaure-Zusammensetzung und katalytische Eigenschaften der relativ alaninspezifischen Aminopeptidase

G. HERMANN und A. BARTH Martin-Luther-Universitat, Halle-Wittenberg Sektion Biowissenschaften, Wissenschaftsbereich Biochemie

Aminopeptidases in Brassica napus II. Effect of Metal Ions, Amino Acid Composition and Catalytic Properties of the Relative Alanine-specific Aminopeptidase Key Term Index: Aminopeptidases, amino acid composition, metal ions, SH-groups, substrate specifity; Brassica napus.

Summary Evidence is presented that the relative alanine specific aminopeptidase does not exist as a metal. enzyme-complex. Bivalent cations decrease the enzyme activity in the following order: Mg2+ < Mn2+ <: 002+ < Cu2+ < Zn2+ < Hg2+._ The kinetic parameters of the hydrolysis of p-substituted L-alanine-anilides are correlated with the electronic properties of the substituents. The results can be interpreted as evidence for nucleophilic properties of the active site. Sulfhydryl groups are important for the maintenance of the catalytic activity, although it is not clear whether they are part of the active center. The decline of the enzyme activity curve is hisghest up to two sulfhydryl groups being blocked by Hg2+ or Ag2+. Reducing sulfhydryl compounds do not act as stabilizers or activators of the aminopeptidase. The amino acid composition of the aminopeptidase is characterized by a relative high content of hydrophobic amino acid residues and of residues with ionisa,ble side chains.

Einleitung

Gegenwartig gewinnen Untersuchungen zur Struktur und zum Funktionsmechanismus proteinabbauender Enzyme zunehmend an Bedeutung. Was die Aminopeptidaseenzyme anbelangt, so ist ihr Vorkommen in zahlreichen tierischen Organen seit langem bekannt. Vor allem in den letzten Jahren konnten diese Enzyme wiederholt auch in pflanzlichen Zellen nachgewiesen werden. Ungeklart ist jedoch die Frage, inwieweit sich die Vielzahl der beschriebenen Aminopeptidasell auf bestimmte "Grundtypen", die durch funktionelle und strukturelle Ahnlichkeiten charakterisiert sind, reduzierell Abkiirzungen: EDTA = A.thylendiamintetraessigsaure; SH = Sulfhydrylgruppe; Tris = Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan; pCMB = p-Chlormercuribenzoat; DTNB = 5,5'-Dithio-bis(2-nitrobenzoesaure ). 1) I.

~1itt.:

A. BARTH, u. G. HERMANN; Biochem. Physiol. Pflanzen 166, 23 (1974).

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144

G.

HER~IANN

und A. BARTH

latH. In diesem Zusammenhang sollen die vorliegenden Untersuchungen bcziiglich der Bedingungen der Enzymkatalyse sowie die Aminosaurezusammensetzung der relativ alaninspezifischen Aminopeptidase zu eiller allgemeingiiltigell Charakterisierung der aminopeptidatisch aktiven Ellzymsysteme in Zellell hoherer Pflanzen beitragen und auBerdem fUr vergleichende Untersuchungen mit wirkungsallalogen Enzymen aus tierischen Organism en zur Verfiigullg stehen. Material und Methoden

Bestirnrnung der enzyrnatischen Aktivitat Die Aktivitat der Aminopeptidase wurde in der Regel gegen L-Alanin-4-(phenylazo)-phenylamid nach dem diskontinuierlichen Verfahren ermittelt. Die Messungen erfolgten bei 30 °0 in folgenden Ansatzen: 2,2 ml Universalpuffer nach Teorell-Stenhagen (1939), pH 8,4 (wenn nicht anders vermerkt) 0,1 ml L-Alanin-4-(phenylazo )-phenylamid: Endkonzentration 2 x 10- 4 M, 0.1 ml Enzym entsprechender Verdiinnung, 0.1 ml Effektor bzw. Puffer. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,5 ml Trichloressigsaure abgestoppt und das gebildete p-Aminoazobenzol bei 500 nm am VSU-2 (VEB Carl Zeiss, JENA) vermes sen. Bei Untersuchungen zum EinfluB von Effektoren wurde nach Zugabe des entsprechenden Effektors 30 min prainkubiert und danach die enzymatische Reaktion durch Substratzusatz ausgelost. Zur Bestimmung der Aminopeptidaseaktivitat mit p-substituierten L-Alanylaniliden wurde die Menge an freigesetztem p-substituierten Anilin ermittelt. Dazu wurde das p-substituierte Anilin in saurer Losung diazotiert und dann in einer nach GOLDBARG und RUTENBURG (1960) modifizierten Bratton-:\
Spektrophotornetrische Titration durch Sulfhydrylgruppen Eine vor Beginn jeder Messung frisch bereitete DTNB-Losung (10- 2 M) wurde zu gleichen Teilen mit einer 2.06 x 10-6 M Enzymlosung vermischt und die Extinktion bei 405 nm am Eppendorf Photometer (Fa,. Netheler und Hinz) kontinuierlich registriert. Fiir diese Wellenlange betrug der Extinktionskoeffizient des 3-0arboxy-4-nitrothiophenolats 13.0 cm2/pM.

M odifizierung des His tid ins rnit Diathylpyrocarbonat 0,1 ml Enzymlosung (Endkonzentration: 1,7 x 10- 7 M) wurden in 0,4 ml Phosphatpuffer nach Sorensen, pH 6,0, mit 20 pI einer alkoholischen Losung von Diathylpyrocarbonat steigender Konzentra,tion 30 min bei 30 °0 inkubiert. Danach erfolgte die Uberpriifung der enzyma,tischen Aktivitat. Als Aktivitatsstandard dienten Ansatze gleicher Enzymkonzentration, die unter sonst adaquaten Bedingungen anstelle des Diathylpyrocarbonats Alkohol enthielten.

Arninosaureanalyst Die Proteinprobe (0,9 mg Enzym) wurde mit 0,5 ml Norleucinliisung (1,25 pM) und 1,36 ml konz. HCl versetzt und 24 h bei 110 °0 hydrolysiert. N achdem das Hydrolysat zweimal am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt und in 2,1 ml Analysenpuffer, pH 2,2, gelost wurde, erfolgte die Ermittlung des Aminosaurespektrums am Autoanalyzer Unichron (Fa. Beckmann) nach MOORE nnd STEIN (1958).

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145

Ergebnisse und Diskussion

Der Einflu13 von Metalleffektoren und Metallchelatbildnern auf die enzymatische Aktivitat Zur Charakterisierung des Einflusses von Metallionen auf die relativ alaninspezifische Aminopeptidase wurden Kationen mit zunehmender Stabilitat der jeweiligen Amminkomplexe (Mg2+ < Mn2+ < C02+ < Cu2+ < Zn 2+), mit zunehmendem lonenradius (Mg2+ < Ca2+ < Ba2+) und mit gleicher Elektronendichteverteilung um das Metallion sowie ahnlichem lonenradius (Mg2+ ""' Mn2+ ""' Zn 2+ ""' Cd2+) getestet. Die relative Aminopeptidaseaktivitat wurde ermittelt aus Messungen nach jeweils 30 min Prainkubation in UniversalpufferlOsung nach Teorell-Stenhagen bei pH 8.4 und 30°C. Tabelle 1. EinflufJ von MetaUionen auf die Aktivitiit der relativ alaninspezifischen Aminopeptidase. Zur jeweiligen Effektorkonzentration ist die relative Aminopeptidaseaktivitat in % angegeben. Metallion

Effektorkonzentration in }I 5 x 10-3 10- 3

10-2

10.3

Zn2 + Hg2+ Cd2+ Cu2+ Mn2 + C02+ Mg2+ Ca2+ Ba2+ Li+ Na+ K+ Cs+

5,0 57,1

0 10.5 21,3 13,5 82,5

96,8 98,2 100 100

18.5 0 8,9 67,9 74,4 70,2 96,1 59,5 68,9 100 100 100 100

1O-~

46.1 0 13,1 9:2 98,4 99,4 100 78,4 94,2 100

Wie der Tabelle 1 zu entnehmen ist, modifizieren einwertige Kationen im untersuchtcn Konzentrationsbereich die cnzymatische Aktivitat nicht. Die zweiwertigen Kationen hemmen die Aminopeptidaseaktivitat urn so effektiver, je gri:i13er die Stabilitat der Amminkomplexe der betreffenden Metallionen (d. h. die Starke der Elektroncnakzeptoreigenschaften der Metallionen bei gegebenem Elektronendonator, ( NH3) ist: Mg2+

<

Mn 2+ < C02+

<

Cu2+

<

Zn 2+ < Hg2+

In diesc Reihe lie13e sich pCMB einordnen. Ihm kame eine Stellung zwischen Zn 2+ und Hg2+ zu. Der lonenradius und dic Elektronendichte scheinen somit nur sekundar am Metallionencffekt beteiligt zu sein. Die ermittelte Abstufung der inhibierenden Wirkung durch die zitierten Metallionen macht nach VALLEE (1964) die Anwesenheit eines Schwefel- und/oder Stickstoffatoms als Elektroncndonator im metallbindenden Zentrum wahrscheinlich. In diesem Zusammenhang ist die Sensibilitat des Enzyms gegenuber Schwermetallionen zu sehen.

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146

G.

HERMANN

nnd A.

4-4

BARTH

Da dil' Inhibierung enzymatischer Reaktionen durch Metallchelatbildner und die anschlieBende Reaktivierung durch Zusatz von Metallionel1 als klassischer Beweis fur die essentiellc Funktion eines Metallions im katalytischen ProzeB gilt, wurde der EinfluB von Metallchelatbildnern auf die aminopeptidatisehe Aktivitat uberpruft. EDTA und o-Phenanthrolin uben einen konzentrationsabhiingigen Hemmeffekt auf die Aminopeptidaseaktivitat aus (Tabelle 2). Diese Inhibierung kann durch Zusatz von bivalenten Metallionen wie Mg2+, Mn 2+ oder Co2+ nieht kompensiert werden. Nach Zugabe der entspreehenden MetallionenlaBtsieh maximal nur die Aktivitat des mit Komplexbildner inhibierten Enzyms realisierfm. Diese Befunde sowie der ausbleibende Aktivierungseffekt metallischer Kationel1 sprechen dafUr, daB die relativ alaninspezifische Aminopeptidase keine aktivierenden Metallienen im Sinne eines Metall-Enzym-Komplexes enthiilt. . Tabelle 2. Einfluf3 von Metallchelatbildnern auf die Aktivitiit der relativ alaninspezifischen Aminopeptidase.

Zur jeweiligen Effektor-Konzentration wurde die relative Enzymaktivitiit in Effektor

EDTA 0- Phenan throlin

% angegeben.

Effektorkonzentration in M 10-2 10- 3 5xlO- 3

5 X 10- 4

10-4

14,1 8,6

81,1 55,1

100 82,1

22,2 16,0

68,1 38,8

Wahrend eine Vielzahl der naher charakterisierten peptidspaltenden Enzyme aus tierisehen Zellen in die Gruppe der Metallproteasen eingeordnet werden konnte (BARMAN 1969), seheinel1 Metallioneneffekte fiir die hydrolytische Spaltung dureh Aminopeptidasen aus hoheren Pflanzen nur bedingt berueksichtigt werden zu mussen. So erzeugen Ca 2 + und Mg2+ eine Aktivierung der Aminopeptidase aus den Kotyledonen der Sojabohne (CATSIMPOOLAS et al. 1971), Mg2+ und M1l2+ stabilisierendie Leucinaminopeptidase aus Gerste (SOPANEN et al. 1975). Die Hemmung der Aminopeptidase-2 aus Pisum sativum dureh o-Phenanthrolin (ELLEMAN 1974) laBt auf die Bedeutung von Metallionen fiir den Katalysemechanismus schlieBen. Demgegenuber liegell wie fUr diehier beschriebelle Aminopeptidase noeh keine Beweise fUr einen aktivierenden EillfluB von Metallionen auf die Aminopeptidase-1 aus Pisum sativum (ELLEMAN 1974) und auf die von KOLEHlVIAINEN et al. (1971) isolierte Aminopeptidase aus Gerste vor.

Amin 0 s a urezus amm ensetzung Die Ermittlung der Aminosaurezusanunensetzung erfolgte in Form einer Ubersichtsanalyse. 1m sauren Aminosaurehydrolysat waren keine Oxydationsprodukte des Cysteins/Cystins oder Methionins nachzuweisen. Danach kann eine unter Umstanden durch die Isolierungsprozedur herbcigefUbrte Oxydation der Aminopeptidase ausgeschlossen werden.

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147

Tabelle 3. Aminosaurezusammenselzung der relativ alaninspezifischen Aminopeptidase. Zur Berechnung der Anzahl der Aminosiiurereste wurde eine Molmasse von 79000 Dalton zugrunde gelegt Aminosiiure

Aminosiiurerestj ml Hydrolysat (flgjml)

gerundete Anzahl vermutlich vorhandener Reste pro Enzymmolekiil

Lysin Histidin Arginin Cysteinsiiure1 ) Asparaginsiiure Threonin Serin Glutaminsiiure Prolin Glycin Alanin Valin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin

5,34 1,78 3,31 0,41 5,99 3,16 2,66 5,74 3,45 3,00 3,56 4,09 1,49 2,36 4,13 1,63 2,81

53 17 27 4 65 38 40 56 43 58 58 49 14 26 45 13 24

1) Durch Oxydation des sauren Hydrolysats mit Luftsauerstoff erhalten.

Ka talytische Eigenschaften Anhaltspunkte tiber den Reaktionsmechanismus des Enzyms wurden aus Untersuchungen zum Einflul3 der Substratstruktur auf die Reaktivitat der relativ alaninspezifischen Aminopeptidase gewonnen. Zu diesem Zwecke wurden fUr eine Serie p-substituierter L-Alanyl-anilide des Typs: R CH -CH-CO-NH 3 I NHz

r\ U

die kinetischen Parameter V max und Vmax/KM mit hydrophoben, sterischen und elektronischen Substituentenparametern korreliert. Die Approximation des funktionellen Zusammenhangs zwischen Aktivitiits- und Substituentenkonstanten nach der Methode der kleinsten Quadrate erzeugte die folgenden Gleichungen: 19 Vmax = 0,25 P + 0,31 S + 0,26 Es - 2,76 r = 1,00, s = 0,013, F-Wert = 7,55 X 105 Signifikanz = 99,9

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g -

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G. HERMAl'\N und A. BARTH

148 19 V max =~ 0,26 a - 2,6 r = 0,999, s = 0,16, F-Wert Signifikanz = 99,74

V max 19 - K = 0,32 P M

=

2,57xl02

+ 0,08 S + 0,32 Es -

r = 1,00, s = 0,005, F -Wert Signifikanz = 99,98

=

3,62

1,2 X 107

Da die Substituenten so gewahlt wurden, daB sie einen groBen Bereich an sterischen, hydrophoben und elektronischen Eigenschaften erfassen, sind auch die berechneten Dreipara.metergleichungen im untersuchten Intervall als geeignete Regressionsfunktion zur Interpreta,tion eines miiglichen Re.a.ktionsmechanismus zu betrachten. S = Substituentenkonstante, die aile Induktionseffekte iiber (J wiederspiegelt (UNGER 1970); P = Substituentenkonstante, die a.lle Effekte a,uf das n-Elektronensystem zusammenfaBt (UNGER 1970); Es = sterischer Substituentenpara.meter nach Taft (THT 1956); (J = Ha.mmetkonsta,nte (JAFFE 1953).

Fiir die enzymatische Hydrolyse der L-Alanyl-anilide durch die relativ alaninspezifische Aminopeptidase nach dem Schema:

~ ES~ES'~

Ef-S :;;;..t=k=I::::..

Ef-Y

X

k_/

geltell allgemein die bekannten Beziehungen: ~

V max

A

k2

. ka

+ ka . [EJo bzw.

V max KM

A

k2 . kl k-l + k2 . [E]o

Da im vorliegenden FaIle die Geschwindigkeitskonstante des Deacylierungsschrittes ka invariant, die Korrelationsfunktion fUr V max aber statistisch hoch gesichert ist, ist die Variabilitat von V max in Abhiingigkeit von der Arylsubstitution eine Funktion von k 2. Aus den grundsatzlich gleichen Korrelationsfunktionen fUr V max und V max/KM folgt, daB die Abhangigkeit der Spezifitatskonstanten V max/KM von der Arylsubstitution der Substrate mit hoher Wahrscheinlichkeit ebenfalls eine Funktion von k2 ist. (Die Gleichgewichtskonstante K. = k -1/kl diirfte daher weitgehend unabhiingig von den elektronischen Substituentenparametern sein.) D. h. aber, daB in beiden Fallen die Korrelationsfunktionen den Acylierungsschritt (ES --0- ES') charakterisieren. Die experimentell ermittelten relativ geringen Abweichungen von V max fUr die einzelnen Substrate im Vergleich zu V max/Krn (Tabelle 4) deuten an, daB in allen untersuch ten Fallen wahrscheinlich ka < k2 ist, d. h., daB die Deacylierungsreaktion (ES'--oE + Y) hauptsachlich am geschwindigkeitsbestimmenden ProzeB beteiligt ist. Die Korrelierbarkeit der Spezifitatskonstanten V max/K M mit den elektronischen Parametern S und P bringt eine Abhiingigkeit der Acylierungsreaktion von elektronischen Einfliissen zum Ausdruck. Auf Grund der positiven Koeffizienten fUr die elektronischen Substitutentenparameter ist cine Beschleunigung der Acylierungsreaktiol1 durch elektronel1ziehende Substituenten im Arvltest des Substrates anzunehmen. Dieser oJ

\(

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149

Tabelle 4. Enzymkinetische Parameter fur die Hydrolyse p-substituierter L-Alanylanilide bei pH 8.4 und 30 °0. Substituent

V max X 105 (M·min.)

V max/K M X 1()2 (min-I)

H

3,69 3,76 3,39 1,44 2,15

2,28 4,54 5,10 1,14 2,36

Cl N02 C~

OCHa

Sachverhalt impliziert die Existenz einer nucleophilen Wirkstelle in der Aminopeptidase, die mit dem positiv polarisierten Carbonylkohlenstoff des Anilidsub&trats in Reaktion tritt. Ais solche nucleophilen Wirkstellen im katalytisch aktiven Zentrum fungieren bei den pflanzlichen Proteinasen die Sulfhydrylgruppen von Cysteinresten. Auch fUr pflanzliche Aminopeptidasen wird auf die Beeinflussung der enzymatischen Aktivitat durch Sulfhydrylgruppen blockierende Reagenzien hingewiesen (KOLEHMAINEN u. MIKOLA 1971; ZEMCHIK et al. 1973; ELLEMAN 1974; SOPANEN u. MIKoLA 1975). Die Analyse des aktiven Zentrums der relativ alaninspezifischen Aminopeptidase mit gruppenspezifischen Hemmstoffeil, die mehr oder weniger selektiv Sulfhydrylgruppen blockieren, liefert das folgende Ergebnis: pCMB setzt, erst in gro13em molaren Uberschu13 angewendet, die Aminopeptidaseaktivitat merklich herab. Die Ursache dieser lnaktivierung diirftc in durch den hohen Reagenziiberschu13 herbeigefUhrten inaktivierenden Transkonformationen zu suchen sein. DafUr spricht die Irreversibilitat dieser Reaktion und eine ausbleibende Reaktivierung durch 2-Mereaptoathanol oder Cystein. Mit DTNB lassen sich in 0.05 M Tris/RCI-Puffer, pR 8,0,4,1 bis 4,6 SH-Gruppen pro Enzymmolekiil bestimmen. Nachdem iiberschiissiges DTNB aus dem lnkubationsansatz abdialysiert ist, besitzt die Aminopeptidase noch eine enzymatische Aktivitat zwischen 85 und 90%. Das wiirde bedeuten, daJ3 diese von dem DTNB modifizierten SH-Gruppen keine direkte Bedeutung fUr die Aufrechterhaltung der enzymatischen Aktivitat besitzen oder daJ3 bereits wahrend des Dialysevorganges eine Riickbildung des nativen Enzyms mit freien SH"Gruppen erfolgt. Der Zusatz von 1 % Natriumdodecylsulfat zur nativen Aminopeptidase erhOht die Anzahl der mit DTNB titrierbaren SH-Gruppen nieht. Bei der Mofifizierung der Sulfhydrylgruppen mit Hg2+ - oder Ag+ -lonen in Teorell-Stenhagen-Puffer, pH 8.4, ist der gro13te Aktivitatsabfall naeh der Bloekierung Von jeweils ca. 2 Sulfhydrylgruppen pro Molekiil Aminopeptidase zu verzeichnen (Abb.1). Steigende Konzentrationen an Hg2+ bzw. Ag+ erzeugen nur noeh eine relativ geringe Aktivitatsabnahme. Um eventuelle Nebenreaktionen der Aminogruppen mit den Hg2+_ bzw. Ag+-Ionen auszuschlieJ3en, wurden die Titrationsversuche in Teorell-Stenhagen-Puffer, pH 7,0, sowie in einem Tris/HCI-Puffer mit einem tJbersheuJ3 an Tris wieduholt. In beiden Fallen konnte der oben besehriebene Aktivitatsabfall wiedergefunden werden. Diese ldentitat macht im vorliegenden FaIle eine primare Beteiligung von Aminogruppen an

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150

G.

HERMANN

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BARTH

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SH /'1o/e Enzym

Abb.1. Anderung der enzymatischen Aktivitiit in Abhiingigkeit von der Zahl der pro Molekiil Aminopeptidase blockierten SH-Gruppen. A: bei SHberionenzusatz, B: bei Quecksilberionenzusatz.

der Inaktivierung der Aminopeptidase unwahrscheinlich. Eine fUr 1, 3, 5 und 30 min Inkubation der relativ alaninspezifischen Aminopeptidase mit Cystein, 2-Mercaptoathanol bzw. Glutathion steigender Konzentrationen fiihrt zu keiner Aktivierung oder Stabilisierung des Enzyms. 1m Bereich hoherer Effektorkonzentrationen (10-3 M) sind im Gegenteil Inhibierungen zu beobachten, die auf die Reduktion einer labilen, aber konformativ bedeutsamen Disulfidbriicke oder auf die Bildung eines gemischten Disulfids mit den SH-Gruppen des Reagenzes zrtriickgehen konnten. ELLEMAN (1974) machte auf eine analoge Reaktion der Aminopeptidase-1 und der Aminopeptidase-2 aus Pisum sativum mit Cystein aufmerksam. Zusammenfassend kann zum Verhalten der relativ alaninspezifischen Aminopeptidase gegeniiber SH-Gruppen modifizierenden und SH-Gruppen aktivierenden Reagenzien festgestellt werden: Offensichtlich sind Sulfhydrylgruppen fiir die Aufrechterhaltung der katalytischen Aktivitat des Enzyms bedeutsam. Nicht eindeutig festzustellen ist jedoch, inwieweit SH-Gruppen ausschlie13lich das mit der Aminopeptidaseaktivitat verbundene nucleophile Reaktionszentrum reprasentieren, d. h., inwieweit die relativ alaninspezifische Aminopeptidase als echtes Sulfhydrylenzym anzusprechen ist. Versuche, die Imidazol-

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151

gruppe des Histidins bzw. die alkoholische Hydroxylgruppe des Serins als essentielle Bestandteile des aktiven Zentrums zu charakterisieren, verliefen negativ. Die Histidinreste der Aminopeptidase wurden nach OVADI (1967) mit Diathylpyrocarbonat carbathoxyliert. Nach 30 min Reaktion mit einem 10- bis 1000fachen DberschuB an Diathylpyrocarbonat konnte keine Beeintrachtigung der Aminopeptidaseaktivitat festgestellt werden. Modifizierungsreaktionen mit Phenylmethylsulfonylfluorid schlossen eine aktive Beteiligung von Serinresten an der Substrathydrolyse aus. 5 x 10-4 m Konzentrationen an PhenylmethylsulfonylfIuorid hatten keinen EinfluB auf die enzymatische Aktivitat der Aminopeptidase. Danksagung Frau Dr. I. MARQUARDT, Institut fiir Physiologische Chemie der Martin-Luther-Universitat HalleWittenberg, danken wir fiir die Durchfiihrung der Aminosaureanalyse. Herm. Dr. sc. R. FRANKE, Institut fiir Wirkstofforschung der Akademie der Wissenschaften der DDR, Berlin, sei fiir die Bearbeitung der Struktur-Wirkungs-Analyse gedankt.

Literatur BARMAN, T. E., "Enzyme Handbook", Springer-Verlag (1969). CATSIMPOOLAS, W., FUNK, S. K., WANG, J., und KENNEY, J., "Isoelectric Fractionation and some Properties of a Protease from Soybean Seeds", J. Sci. Food Agric. 22, 79 (1971). ELLEMAN, T. C., "Aminopeptidases of Pea", Biochem. J. 141,113 (1974). GOLDBARG, J. A., FRIEDMAN, G. M., PINEDA, E. P., SMITH, E. E., CHATTERJI, R., STEIN, E. H., und RUTENBURG, A. M., "The Colorimetric Determination of y-Glutamyl Transpeptidase with a Synthetic Substrate", Arch. Biochem. Biophys. 91, 61 (1960). JAFFE, H. H., "Reexamination of the Hammet Equation", Chern. Rev. a3, 191 (1953). KOLEHMAINEN, L., und MIKOLA, J., "Partial Purification and Enzymatic Properties of an Aminopeptidase from Barley", Arch. Biochem. Biophys. 14a, 633 (1971). MOORE, S., SPACKMANN, D. R., und STEIN, W. R., "Chromatography of Amino Acids on Sulfonated Polystyrene Resins", Anal. Chern. 30, 1185 (1958). SOPANEN, T., und MIKOLA, J., "Purification and Partial Characterisation of Barley Leucine Aminopeptidase", Plant Physiol. aa, 809 (1975). TAFT, R. W. jr., "Steric Effects in Organic Chemistry", M. S. Newman, Ed., Wiley, New York 1956. TEORELL, T., und STENHAGEN, W., Biochem. Z. 299, 417 (1939); zitiert aus "Biochemisches Taschenbuch", S. 651, R. M. RAUEN, (Hrsg.) Springer-Verlag, 1956. UNGER, S. R., Diss. Inst. of Technology, Mass. USA, 1970. VALLEE, B. L., und COLEMAN, J. E., "Metal Coordination and Enzyme Action", Comprehensive Biochemistry 12, 165 (1964). ZEMCHIK, E. J., SHUTOV, A. 0., und VAINTRAUB, A., "Partial Purification and Charakterisation of an Aminopeptidase from Vetch Seeds" (russ.), Biokhimija 38,964 (1973). Eingegangen 26. Marz 1976 Anschrift der Verfasser: Dr. G. HERMANN und Prof. Dr. A. BARTH, Sektion Biowissenschaften der Martin-Luther-Universitat Halle-Wittenberg, Wissenschaftsbereich Biochemie, DDR - 402 Halle/ Saale, Domplatz 1. 10 Bioehem. Physiol. Pflanzen, Ed. 170