Untersuchungen zum Cytokininstatus während der Ontogenese von Beta vulgaris (Zuckerrübe) und Chenopodium album (Weiβer Gänsefuβ)

Biochem. Physiol. Pflanzen 180, 501-505 (1985)

Untersuchungen zum Cytokininstatus wahrend der Ontogenese von Beta vulgaris (Zuckerrube) und Chenopodium album (WeiBer GansefuB) H. WEDDELER, A. GZIK und G. GUNTHER Sektion Chemie/Biologie, Padagogische Hochschule "Karl Liebknecht" Potsdam, DDR

Investigations on the Cytokinin Status in Beta vulgaris (Sugar Beet) and Chenopodium album (Goosefoot) during Their Ontogenesis Key T erm Index: cytokinin, conj ugates, ontogenesis; B eta vulgaris, Chenopodium album

Summary The cytokinin content was determined in afterripened dry and germinating seeds as well as in growing seedlings from Beta vulgaris and Chenopodium album. The compounds with cytokinin activity were quantitatively determined in the Amaranthus cytokinin bioassay after separation and purification. The various cytokinin compounds were identified after HPLC separation. The seeds of both species contained about the same amount of total cytokinins. The cytokinin concentration decreased during germination and increased during the further development of the seedlings. 6 d old sugar beet seedlings showed a very low cytokinin concentration in comparison with goosefoot and furthermore the pattern of the various forms of free and bound cytokinins differed in the early stages of development. These differences were less pronounced in 48 d old plants_

Einleitung Die Phytohormone haben einen bedeutenden EinfluB auf das Wachstum und die Entwicklung der Pflanzen. Sie finden somit zunehmen d das Interesse der modernen Landwirtschaft. Voraussetzung fUr einen gezielten Eingriff in den Hormonstatus von Nutzpflanzen ist die Kenntnis liber das Vorkommen und die Konzentration der nativen Phytohormone. Bisher liegen jedoch nur wenig Daten zum Cytokininstatus wahrend der Onto genese wichtiger Kulturpflanzen vor (WACHOWIUS 1979). 1m Rahmen unserer differentialbiochemischen Untersuchungen im System Beta vulgaris/Chenopodium album bestimmten wir den Cytokiningehalt ausgewahlter Entwicklungsstadien beider Pflanzenarten, urn Entwicklungsbesonderheiten besser charakterisieren zu ktinnen und Ansatzpunkte fUr eine gezielte Beeinflussung der Pflanzenentwicklung aufzuzeigen. Material und Methoden Fur die Untersuchungen wurde nachgereiftes Saatgut, keimende Samen, 6 d alte Keimlinge und 48 d alte FreilandpHanzen von Beta vulgaris L. und Chenopodium album L. verwendet. Die Anzucht der keimenden Samen und der Keimlinge erfolgte bei 26 °C und Dunkelheit auf Filterpapier bzw. im Keimbett aus Sagespanen. 33 Biochem. Physiol. Pflanzen, Bd. 180

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H. WEDDELER, A. GZIK und G. GUNTHER

Das tiefgefrorene Untersuchungsmaterial wurde fein pUlverisiert und in Anlehnung an DEKHUIJZEN und GEEVERS (1975) mit siedendem Wasser extrahiert. Nach Abtrennung der Ruckstande wurde der Extrakt 3mal mit gleichen Volumina ammoniakalischen n-Butanols nach FRIEDRICH et al. (1972) ausgeschUttelt. Zur Umwandlung der Cytokininribotide und der Cytokinin-O-glucoside in freie Basen und Riboside wurde die Wasserphase einer enzymatischen Hydrolyse mit alkalischer Phosphatase und f1-Glucosidase unterworfen. Durch Ausschutteln mit ammoniakalischem n-Butanol erfolgte die Uberfiihrung der freigesetzten eytokininaktiven Verbindungen in die Butanolphase. Die weitere Reinigung der ursprunglich freien Cytokininbasen und Cytokininriboside und der aus den Konjugaten freigesetzten Verbindungen wurde separat durchgefiihrt. Zur Reinigung und Trennung der Cytokinine wurde Sephadex G-15 (Saulenparameter: 2,5 x 90 em, Elutionsmittel: 20% Methanol) eingesetzt. Die Zeatin-, Zeatinribosid- und Isopentenyladeninfraktionen jedes Extraktes wurden iiber PolycIar AT (Saulenparameter: 1 x140 cm, Elutionsmittel: Aqua bidest.) weiter gereinigt. Die eytokininhaltigen Fraktionen wurden im Amaranthus-Test nach CONRAD (1974) auf ihre biologische Aktivitat untersucht. Die quantitative Auswertung erfolgte mit einer Benzyladenin (BA)-Eichkurve. Parallel dazu wurde eine qualitative Analyse mit Hilfe der Hochdruekfliissigchromatographie durchgeflihrt (Saule: LiChrosorb RP 8, 4,6 x 250 mm, Elutionsmittel: 30 bzw. 60 % Methanol).

Ergebnisse

In den Friichten von Beta vulgaris und in den Samen von Chenopodium album wurden etwa gleiche Cytokininkonzentrationen urn 170 nmol BA-Aquivalente/kg Frischmasse festgestellt (Abb. 1). In beiden Pflanzenarten war der Gehalt an freien Cytokininen (Basen und Riboside) hOher als der an Konjugaten (Abb. 2 und 3). Wahrend bei der Zuckerriibe Zeatin als Hauptcytokinin ermittelt wurde, dominierten beim wei13en GausefuB die Zeatinribosidkonjugate.

nmol BA ,iiqu. kgFM

CJ Beta vulgaris ~

200

w

HIS

Chenopodium album

8

SSp

100

Abb. 1. Der Cytokiningehalt wiihrend verschiedener Entwicklungsstadien von Beta vulgaris und Chenopodium album. 1 - trockene Friiehte bzw. Samen, 2 - keimende Samen, 3 - 6 d alte Keimpflanzen, 4 - 48 d alte Freilandpflanzen, W - Wurzeln, H - Hypocotyle, S - SproJ3achsen, B - Blatter, Ssp - SproJ3spitzen

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Cytokininstatus in Beta und Chenopodium

nmol BA A·qu . kgFM

CJ frefe Cytokinine

100

~

w

Cytokininkonjugate B

H

SSp

Abb. 2. Der Gehalt an freien Cytokininen und Cytokininkonjugaten wiihrend verschiedener Entwicklungsstadien von Beta vulgaris. Erlauterungen s. Abb. 1.

I

..

nmol BA Aqu. kgFM

Chenollodium olbum

CJ freie Cytokinine ~

200

w

HIS

Cytokininkonjugafe B

SSp

100

Abb.3. Der Gehalt an freien Cytokininen und Cytokininkonjugaten wiihrend verschiedener Entwicklungsstadien von Chenopodium album. Erlauterungen s. Abb. 1.

1m Stadium der Keimung verringerten sich in beiden Species die Cytokininkonzentrationen. Bei Beta vulgaris war der Gehalt an freien Cytokinin en, bei Chenopodium album der an Konjugaten hoher. Beide Arten unterschieden sich in ihren Hauptcytokininen (Isopentenyladenin bei der Zuckerriibe, Zeatinkonjugate beim Weil3en GansefuB). In den Keimpflanzen von Beta vulgaris konnten nur geringe Cytokininkonzentrationen ermittelt werden, wahrend die Werte bei Chenopodium album bis auf etwa 300 nmol 33*

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H.

WEDDELER,

A.

GZIK

und

G. GUNTHER

BA-Aquivalentejkg Frischmasse anstiegen. In der Zuckerriibe iiberwog der Gehalt an Cytokininkonjugaten, im WeiJ3en GansefuJ3 der an freien Cytokinin en. Wahrend wir bei Beta vulgaris besonders die Konjugate des Zeatins fanden, lag bei Chenopodium album Zeatinribosid als Hauptcytokinin vor. Die 48 d alten Freilandpflanzen beider Arten wiesen nur quantitative Unterschiede iIll Cytokininstatus einzelner Pflanzenteile auf. Der Gesamtcytokiningehalt pro Pflanze war nahezu gleich. In den W urzeln wurde bei Beta vulgaris im Vergleich zu Chenopodium album ein geringerer Gehalt an Cytokininen festgestellt. Beide Arten stimmten sowohl im hOheren Gehalt an freien Cytokininen als auch im Hauptcytokinin (Zeatinribosid) iiberein. 1m Hypocotyl von Beta vulgaris und Chenopodium album (einschliel3lich SproJ3achse) wurden etwa gleiche Cytokininkonzentrationen ermittelt. Auch hier gab es Ubereinstimmungen im hoheren Gehalt an freien Cytokininen im Vergleich zu den Konjugaten. Unterschiede wurden bei den Cytokininkonzentrationen der Blatter beider Objekte festgestellt. Beta vulgaris hatte einen vergleichsweise geringen Cytokininspiegel. Insgesamt iiberwogen sowohl in der Zuckerriibe als auch im WeiJ3en Gansefu./3 die Konjugate des Zeatins. In den SproJ3spitzen von Beta vulgaris lag die Konzentration an Cytokininen erheblich iiber der von Chenopodium album. Wiihrend wir bei der Zuckerriibe besonders Konjugate des Zeatins fan den, lagen bei Chenopodium album Zeatinund Zeatinribosidkonjugate zu etwa gleichen Teilen vor. Diskussion

Cytokinine spielen nach KHAN (1971) eine wichtige Rolle bei der AusHisung der Samenkeimung. Die von uns ermittelten Cytokininkonzentrationen in den Samen von Beta vulgaris und Chenopodium album sind im Vergleich zu Literaturwerten tiber andere Pflanzenarten (THOMAS 1977) recht hoch. Ein Zusammenhang zwischen dem Cytokiningehalt und der Keimfiihigkeit konnte jedoch nicht nachgewiesen werden (GzIK 1983). Der nachfolgende Abfall der Konzentration extrahierbarer Cytokinine in den keimenden Samen konnte auf einer schon von VAN STADEN und CARMI (1982) postulierten metabolischen Umsetzung beruhen. 1m Gegensatz zu Chenopodium album haben die 6 d alten Keimpflanzen von Beta vulgaris einen geringeren Cytokiningehalt, moglicherweise besteht hier ein ursachlicher Zusammenhang mit der langsamen Jugendentwicklung der Zuckerriibe. Aus der Literatur geht hervor, daJ3 die Wurzelspitzen ein Hauptsyntheseort fUr Cytokinine sind (TORREY 1976). Die von uns ermittelten hohen Cytokininkonzentrationen in den Wurzeln 48 d alter Freilandpflanzen beider untersuchten Arten und ihr nachfolgender Abfall im Hypocotyl bzw. in der SproJ3achse unterstiitzen diese Annahme. Die Cytokinine werden von der Wurzel iiber den Xylemstrom in die Blatter transportiert; eine Verwertung erfolgt jedoch vorwiegend in schnell wachsenden Apicalregionen und in jungen expandierenden Blattern (DAVEY und VAN STADEN 1978). Unsere Ergebnisse fiir die Blatter der Zuckerriibe deuten aber im Zusammenhang mit der langsam verlaufenden Entwicklung des Blattapparates von Beta vulgaris in den Monaten Mai und Juni auf einen genetisch bedingten niedrigen Cytokininspiegel hin.

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Cytokininstatns in Bela nnd Chellopodium

Wachstumsverzogernd wirkt vermutlich auch das Verhaltnis del' Konzentration von freien Cytokininen und Konjugaten bei Beta vulgaris in der SproBspitze sowie in den Blattern. Die in groBeren Mcngen enthaltenen Cytokininkonjugate haben, wie aus der Arbeit von DEKHUIJZEX (1976) hervorgeht, im Verglcich zu dcn Bascn und Ribosiden eine erheblich geringere biologische Aktivitat. Ausgehend von den Ergcbnissen zum Gesamtstatus des Cytokininhaushaltcs und zum Verhaltnis del' freien Cytokinine zu den Konjugaten sollte gepriift werden, ob die Jugendentwicklung von Beta vulgaris durch eine gezicIte ErhOhung des Spiegels der Cytokininbasen gefOrdert werden kann. Literatur CONRAD, K.: Ein sensibilisierter Amaranthus-Cytokinintest (AT 74). Biochem. Physiol. Pflanzen lS;;, 531-535 (1974). DAVEY, J. E., and VAN STADEN, J.: Cytokinin activity in Lupirtus albus. I. Distribution in vegetative and flowering plants. Physiol. Plant. 43, 77-81 (1978). DEKH UlJZEX, H. )1.: Endoge nous cytokinins in healthy and diseased plants. In: Encyclopedia of Plant Physiology, New Series. (HEITEFt.:SS, R., and WILLLDIS, P. H. eds.) 4, 526-559. Physiological Plant Pathology, Springer-Verlag 1976. DEKHUlJZEX, H. 1\1., and GEEVERS, E. CH. TH .: The recovery of fytokinins dnring extraction and purification of clubroot tissue. Physiol. Plant. 3il, 297-302 (1975). F RIEDRICH , A., HEJMOVA, 1., and CHVOJKA, 1.: Substances with cytokinin activity extracted from growing apices of apple-tree sho ots. BioI. Plantarum 14, 164-166 (1972). GZIK, A.: Vergleiehende Untersnehunge n zur entwieklungsphysiologischen Wirkung und zum Stoffwechsel von Zytokininen in Beta vulgaris nnd Chenopodium album. Dissertation (B), Potsdam 1983. THOMAS, T. H.: Cytokinins, cytokinin-active eompounds and see d germination. In: The physiology and biochemistry of seed dormancy and germination (KHAN, A. A., ed.), pp.111-114. North· Holland Pub!. Comp., Amst erd am-New York-Oxford 1977. TORREY, J. G.: Root hormones and plant growth. Ann. Rev. Plant Physiol. 27, 435-459 (1976). VAN STADEN, J ., and CARMI, A.: The effects of decapitation on the distribution of cytokinins and growth of Phaseolus vulga'ris plants. Physiol. Plant. 5il, 39-44 (1982). WA CHOWIUS, R.-P.: Untersuchungen zur Cytokininaktivitii.t bei Phaseolus-vulgaris-Pfianzen wii.hrend der Ontogcnese unter besonderer Beriicksiehtigung der SproB-Wurzel-Beziehungen. Dissertation (A), Berlin 1979.

Eingegangen am 21. November 1984, revidierle Fassung akzeplierl am 14.

~Iii.rz

1985

Anschrift der Verfasser: Dr. HELMUT WEDDELER, Dr. AXEL GZIK und Prof. Dr. GOTTFRIED GUNTHER, Pii.dagogische Hochschule " Karl 1iebknecht", Sektion Chemie/Biologic, DDR - 1500 Potsdam, ~Iaulbeerallee 2.