Aktivitäten der Glutaminsäuredehydrogenase (GDH), Glutaminsynthetase (GS) and Glutamatsynthase (GOGAT) in Suspensionskulturen von Beta vulgaris (Zuckerrübe) und Chenopodium album (Gänsefuß)

Biochem . Physiol. Pflanzen 183,397-405 (1988) VEB Gustav Fischer Verlag Jena

AktiviUiten der Glutaminsauredehydrogenase (GDH), Glutaminsynthetase (GS) und Glutamatsynthase (GOGAT) in Suspensionskulturen von Beta vulgaris (Zuckerriibe) und Chenopodium album (GansefuB) I. ZELMER und G . GUNTHER Sektion Chemie/Biologie, Padagogische Hochschule "Karl Liebknecht", Potsdam , DDR

Activities of Glutamate Dehydrogenase (GDH), Glutamine Synthetase (GS) and Glutamate Synthase (GOGAT) in Suspension Cultures of Beta vulgaris (Sugar Beet) and Chenopodium album (Goosefoot) Key Te r m Index: glutamate dehydrogen ase, glutamine synthetase, glutamate synthase; Beta vulgaris, Chenopodium album

Summary In extracts of suspension cultures of Beta vulgaris and Chenopodium album the activities of NADH-GDH , GS and NADH-GOGAT were determined. Nitrogen assimilation occurs both via reductive amination of 2-oxoglutarate (GDH-pathway) and the route via glutamine synthetase (GSfGOGAT-pathway). In the course of exponential growth of the cell cultures , which were cultured for about 14 days, the level of the enzymes did not change . GDH and GS activities reached a high level, the value of GOGAT was found to be ca. YI2 the amount of GS. In cases of the absence of ammonia and the addition of twice the amount of nitrate to the suspension medium, the growth was depressed, the GS was stimulated ca. 20-fold, and the GDH activity dropped and vice versa, i. e. while nitrate was eliminated and twice the amount of ammonia added , the growth of cell s was stopped , the GDH rose and GS dropped to zero. The cultures of Beta vulgaris and Chenopodium album did not differ from each other in their enzyme dynamics.

Einleitung Fur den gesamten Komplex der Stickstoff-Assimilation sind neben der Nitratreduktase die Glutaminsauredehydrogenase (GDH) , Glutaminsynthetase (GS) und Glutamatsynthase (GOG AT) wichtige SchlUsselenzyme (MIFLIN und LEA 1976). Neben dem ursprunglich angenommenen Hauptweg der Stickstoffassimilation tiber die reduktive Aminierung von 2-0xoglutarsaure und GDH-Katalyse (FOWDEN 1967; KRAMER 1970) gewann das Auffinden des altemativen Weges tiber die Amidierung der Glutaminsaure, katalysiert durch die GS , und die reduktive Ubertragung der Amidgruppe des Glutamins auf 2-0xoglutarsaure, katalysiert durch das GOGAT -Enzym , zusehens an Bedeutung (TEMPEST et al. 1970; MEERS et al. 1970 ; DOUGALL 1974; LEA und MIFLlN 1974). Heute wird Abkurzungen: GDH, Glutaminsauredehydrogenase; GS, Glutaminsy~thetase; GOGA T, Glutamatsynthase ; TCE, Trichloressigsaure BPP 183 (1988) 5

397

iiberwiegend die Auffassung vertreten, daB das System GS/GOGAT in den meisten Vertretem des Pflanzenreiches als Hauptweg der N-Assimilation fungiert. Dieser Syntheseweg fUr cx-Aminosauren ist in Bakterien (NAGA TINI et al. 1971; MILLER und STADTMANN 1972; MILLER 1974), in Algen (EVSTIGNEEVA et al. 1974), in stickstoff-fixierenden Organismen (NAGATINI et al. 1971) und in griinen und nichtgriinen Teilen von h6heren Pflanzen bzw. in Kulturen pflanzlicher ZeUen und Gewebe nachgewiesen worden (DOUGALL 1974; LEA und MIFLIN 1974; HAYSTEAD 1973; MIFLIN 1974; O'Neal und JOY 1973a u. b, 1974). In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir die Dynamik der GDH, GS und GOGAT in Suspensionskulturen des Systems Beta vulgaris/Chenopodium album. Dabei soUte die Funktion der Wege fiir die Stickstoffassimiiation erfaBt und Vergleiche unter differentialbiochemischen Aspekten gezogen werden. AuBerdem waren in weiteren Arbeiten Voraussetzungen zur Testung von pflanzlichen Wirkstoffen an Suspensionskuituren zu schaffen.

Material und Methoden Gewebeanzucht Die Anzucht der Suspensions-Zellkulturen von Beta vulgaris L. (Zuckerriibe) subsp. rapacea (KOCH), var. altissima (DOLL), Sorte "Hymona" und Chenopodium album L. (WeiBer GlinsefuB) erfolgte in 500-ml-Standkolben im Dunkeln bei 27 ± 0,5 °C. Die Kolben wurden auf Schiittelmaschinen mit 100-120 rpm bewegt. Die Zellkulturen wuchsen auf einem Nlihrmedium nach MURASHlGE und SKOOG (1962) mit Vitaminzusatz nach KOBLITZ und HAGEN (1962). Das Gesamtsuspensionsvolumen pro Kolben betrug 150 ml, die Inokulumsratel: 15 bis 1: 18. Bei Beta vulgaris handelt es sich urn das Material eines Hypokotylkallus und bei Chenopodium album wurden die Zellen SproBteilen entnommen und kultiviert. Der Passagerhythmus der Stammkulturen betrligt 7 Tage. Das verwendete Versuchsmaterial fiir die Enzymbestimmungen wuchs 14 Tage in demselben Nahrmedium. Extraktion Die entnommenen Zellen, 200 bis 2000 mg je Probe in Abhlingigkeit von der Kultivierungszeit, wurden mit 0,1 M Na-K-Phosphatpuffer nach SORENSEN (1909), pH 7,53, gewaschen. Mit dem gleichen Puffer und Zusatz von 0,1 % ~- Mercaptoethanol erfolgte die Extraktion (60 min) nach Ultraschall-Homogenisation mit dem Sonifer D-12 in Plastbechem. Die Homogenisation und Extraktion ist im Dunkeln bei 2-4 °C durchgefiihrt worden. Das FrischmassePuffer-Verhliltnis betrug 1:4 bis I: 5. Nach der Zentrifugation von 30 min bei 22000 . g und 2-4 °C wurde der Oberstand mit Moiselect (Dextran gel bead polymer, coarse) bzw. Sephadex G-25 bei 2-4 °C von niedermolekularen Bestandteilen befreit. Enzymbestimmungen Die Enzymbestimmungen wurden nach optischen Testverfahren (GDH, GOGAT) bei 24°C und nach der kolorimetrischen Endwertmethode (GS) bei 37°C durchgefiihrt. Die Proteinbestimmung zur Ermittlung der spezifischen Aktivitaten erfolgte nach BRADFORD (1976). Glutaminsauredehydrogenase (EC 1.4.1.2) Die GDH-Bestimmung wurde in Anlehnung an BROWN und HASLETT (1972) sowie EHMKE und HARTMANN (1976) durchgefiihrt. Das Reaktionsgemisch enthielt: 600 [-II 100 [-II 100 [-II 100 [-II 100 [-II

K-Na-Phosphatpuffer 0,1 M; pH 7,53 Enzymextrakt (50-200 [-Ig Protein) NADH 3,5 mM 2-0xoglutarsaure 50 mM NH4Ci 1M.

Extinktionsmessung bei

398

"A. =

BPP 183 (1988) 5

366 nm (Eppendorf-Photometer)

Glutarninsynthetase (EC 6.3.1.2) Die Bestimmung erfolgte in einer modifizierten Form nach WEBSTER (1964) durch kolorimetrische Bestimmung des yGlutamylhydroxamats. Testansatz fi.ir 12 Proben: - 1,2 ml Glutaminsaure 0,85 M - 0,4 ml NH 20H 1,0 M - 0,8 ml MgS04 0,5 M - 7,2 ml K-Na-Phosphatpuffer 0,1 M; pH 7,53 55,8 mg ATP Enzymextrakt pro Probe: 0, I ml - Volumen des Reaktionsgemisches pro Probe : 0,9 ml Nach 30 min Inkubations bei 37 °C wurde mit 0,3 ml Stoppgemisch die Reaktion unterbrochen (Stoppgernisch : FeCl 3 und TCE in HCl) . Extinktionsmessung bei I.. = 546 nm Glutamatsynthase (EC 1.4. 1.13) Das Reaktionsgemisch enthielt in Anlehnung an SODEK und DA SILVA (1977) folgende Bestandteile: - 600 f,ll - 100 f,ll 100 f,ll 1()() f,ll 100 f,ll

K-Na-Phosphatpuffer 0,1 M; pH 7,53 Enzymextrakt (50-200 f,lg Protein) NADH 3,5 mM 2-0xoglutarsaure 50 mM Glutamin 100 mM

Extinktionsmessung bei I.. = nm (Eppendorf-Photometer) Fi.ir die statistische Absicherung der Untersuchungsergebnisse kamen Mittelwertpri.ifungen (WEBER 1972) zur Anwendung. Das arithmitische Mittel wurde aus 3 bis 5 Zufallsvariablen je Versuchsserie (insgesamt 3 Serien) durchgeflihrt. Fi.ir die Darstellung der Ergebnisse erfolgte unter den Serien eine Auswahl derjenigen Mittelwerte, deren Verteilungen die kleinsten Streuungen aufwiesen (s :5 10%).

Ergebnisse Fur die Bestimmung und Diskussion der Enzymaktivitaten in den Suspensionskulturen war es erforderlich, den genauen Wachstumsverlauf und die Dynamik des loslichen Proteins wiihrend der 14tagigen Kultivierungszeit zu verfolgen (Abb. 1). 1m frischen Niihrmedium erreichen die Zellkulturen etwa nach 2 Tagen die logarithmische Wachstumsphase. Sie ist bei Beta vulgaris nach 8 und Chenopodium album nach 13 Tagen beendet. Die relativen Wachstumsraten betragen in dieser Phase !.l = 0,40 fur die Zuckerriiben-Kulturen und !.l = 0,28 fUr die Kulturen des WeiBen GansefuBes. Die Zahlenwerte fUr!.l sind dem Anstieg der Kurven bzw. der durch logarithmische Transformation in Geraden umwandelbaren Exponentialkurven proportional. Mit anderen Worten, die Chenopodiumalbum-Kulturen wachsen langsamer, was auch durch die Dynamik des IOslichen Proteins deutlich wird (Abb. I b) . Zu Beginn des Wachstums liegen die hochstenZuwachsraten an IOslichem Protein, woran die Syntheseleistung der Kulturen an funktionellen Protein en wie Enzymproteinen ablesbar ist. Die Betrage der GDH-Aktivitaten nehmen in dieser Zeit ab und erreichen in der logarithmischen Wachstumsphase die niedrigsten Werte. Sie liegen bei 50 % des Ausgangsniveaus im Inokulummaterial. Gegen Kultivierungsende istdie spezifische GDH bis zum 8fachen stimuliert und dem Gehalt an IOslichem Protein negativ korreliert (Abb . 2). Auch im GS/GOGAT-System ist in den ersten beiden Entwicklungsphasen ein Ruckgang der spezifischen Aktivitaten zu beobachten. Der BPP 183 (1988) 5

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2 4 6 8 10 12 14 Chenopodium album [d]

Abb. 1. Wachstumsverlauf - 1 a (oben) - und Dynamik des loslichen Proteins - 1 b (un ten) - in SuspensionsZellkulturen der Zuckerrube (Beta vulgaris) und des WeiJ3en GiinsefufJes (Chenopodium album) wiihrend 14tiigiger Kultivierung auf Niihrmedium !lach MURASHIGE und SKOOG (1962) modiJiziert nach KOBLITZ und HAGEN (1962). - Wachstumsverlauf: mg Frischmasse (FM) pro ml SuspensionslOsung [mg FM ml - I ], - relativer Frischmas ~e­ zuwachs [mg FM ml- I d - I ], - Proteindynamik:!!g Protein pro mg Frischmasse [!!g Prote in mg- I FM], - relativer Zuwachs an ol slichem Protein (!!g Protein mg - I FM d - I ] .

weitere Verlauf ist iihnlich der GDH-Dynamik, bis auf die Glutaminsynthetase, die ab der logarithmischen Phase nur wenig variiert bzw. zum Entwicklungsende leicht abfiillt (Abb . 2). Ursachen fUr diese Dynamik liegen in der N-Versorgung tiber das Niihrmedium, das sowohl als Nitrat- und Ammoniumquelle fungiert als auch Glutamin und Glutaminsaure enthiilt. Da in den ersten beiden Tagen die Nitratreduktase ebenfalls reprimiert ist (ROSE 1982), kann mit einer primiiren Assimilation der beiden Aminosiiuren gerechnet werden . 400

BPP 183 (1988) 5

NA01H-GDH

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2 4 6 8 10 12 14 Chenopodium album [d]

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Abb. 2. Dy/U1mik der GDH, GS und GOGAT in Suspensions-Zellkulturen der Zuckerriibe (Beta vulgaris) und des WeifJen GiinsefufJes (Chenopodium album) wiihrend 14tiigiger Kullivierung aufNiihrmedium (s . Abb. I) . - Enzymaktivitiiten pro mg liislicbes Protein (spezifische Aktivitiiten) [nkat mg- I Protein) .

Als weitere Frage interessierte in den Versuchen der Aktivitatsverlauf der drei Enzyme nach NH4+- bzw. N0 3 --Eliminierung (Abb. 3). Der Gesamtstickstoffgehalt wurde dabei durch jeweiligen aquivalenten Ersatz , bei NH4 + -Eliminierung durch N0 3 - und bei N0 3 -Eliminierung durch NH4 + , unverandert gehalten.

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14

Abb. 3. Wachstumsverlaufund DYllamik der GDH, GS sowie GOGAT in Suspensions-Zellkulturen der Zuckerrube (Beta vulgaris) wiihrend der 14tagigen Kultivierung aufNiihrmedium (s. Abb. I) ohne Ammonium- bzw. Nitratversorgung (s. Tab. 1).0---0 Kontrolle, ~ obne NH4 +, . - - - . obne N03 -. BPP 183 (1988) 5

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Bei fehlenden Ammoniumionen betrug die Wachstumsdepression nach 14 Tagen Kultivierung etwa 50 %. Die Betrage der spezifischen GDH sanken auf Werte zwischen 10 bis 30 % der Kontrollen (Tabelle 1). Das erh6hte Nitratangebot und Ammoniummangel fiihrten zur Stimulation der GS, wobei das GOGAT-Enzym deprimiert wurde und sich dem Wert Null naherte. Tabelle I. Einflufi der Nitrat- bzw. Ammoniumversorgung auf das Wachstum. die Glutaminsiiuredehydrogenase (GDH), Glutaminsynthetase (GS) und Glutamatsynthase (GOG AT) von Suspensions-Zellkulturen der Zuckerrube (Beta vulgaris - B) und des WeifJen Giinsefufies (Chenopodium album - Chi nach einer 14tiigigen Kultivierungszeit. Behandlung

Kontrolle N0 3 NH4+

Wachstumsverlauf mgFM

GDH nkat

GS nkat

GOGAT nkat

ml

mg Protein

mg Protein

mg Protein

B

Ch

B

Ch

B

Ch

B

Ch

185,7 90,6 5,0

210,0 119,0 7,1

11 ,70 1,82 22 ,40

10,18 3,56 28,71

1,03 23 ,40 0,0

3,20 21,70 0,0

0,84 0,02 0,0

0,88 0,12 0,0

- Kontrolle : Nlihrmedium nach MURASHIGE und SKOOG (1962), - N0 3 -: Niihrmedium ohne NH4 +, mit 200 % KN0 3 , - NH4 + :Nlihrmedium ohne NO) - , mit 200 % NH4 + .

Wurden die Zellen auf Nahrmedium ohne N0 3 - und 2facher NH4 - -Konzentration kultiviert, blieb das Wachstum aus. Der Frischmassezuwachs war auBerst gering . Die spezifische GDH ist unter diesen Bedingungen stimuliert, die GS sinkt dagegen stark ab und das GOGAT-Enzym ist in der ersten Kultivierungswoche zunachst erh6ht, bevor durch Depression die Werte bis auf Null zurUckgehen (Tabelle 2). Dieser in Zellkulturen von Beta vulgaris beobachtete Aktivitatsverlauf gilt gleichermaBen fi.ir die Enzymdynamik in Zellkulturen von Chenopodium album.

Tabelle 2. Einflufi der Nitrat- bzw. Ammoniumversorgung aUf das Wachstum, die GDH, GS und GOGAT von Suspensions-Zellkulturen der Zuckerriibe (Beta vulgaris) nach 7- und 14tiigiger Kultivierungszeit (5. Tab. I.) . - Wachstumsverlauf: [mg FM ml - ' ] - Enzymaktivitiiten: [nkat mg - I Protein] Behandlung

Wachstumsverlauf 7d

Kontrolle

14d

123,0

GDH 7d

46 ,S

402

BPP 183 (1988) 5

14 d

14 d

0,25

8,0

0,84 0,36

23,4 0,71

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7d

1,0

1,82 13,0

5,5

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3,4

1,39

5,5

7d

11,7

90,6 NH4+

14 d

2,3 185,7

N0 3 -

GS

0,33 0,98

0,00

0,00

Neben der ermittelten und in ihrer Dynamik verfolgten NADH-abhangigen GDH sind in den heterotrophen Suspensionskulturen eine NADPH- und eine NAD-GDH aktiv. Sie sind in ihren absoluten Betriigen wesentlich kleiner als die NADH-GDH und waren erst nach weiterer Enzyrnreinigung durch Gelfiltration an Sephadex G-l00 und G-200 ausreichend verftigbar. Eine NADPH-abhangige GOG AT konnte in den Kulturen nicht nachgewiesen werden.

Diskussion Mit den vorliegenden Ergebnissen konnte nachgewiesen werden, daB in den SuspensionsZellkulturen von Beta vulgaris und Chenopodium album beide Wege der Stickstoffassimilation, der GDH- und GSIGOGAT-Weg, zur Verftigung stehen. Unter den normalen Anzuchtbedingungen der Zellkulturen auf dem nach MURASHIGE und SKOOG (1962) modifizierten Nahrmedium liegen gtinstige Voraussetzungen ftir den Einbau des Stickstoffs tiber die reduktive Aminierung der 2-0xoglutarsaure vor. Wesentlich ist das tiber das Nahrmedium verftigbare Angebot an Ammonium (20 mM NH4N0 3). So wird in den Zellen durch aufgenommene und tiber Nitrat- und Nitritreduktion bereitgestellte NH4 + die entsprechende Konzentration erreicht. Der Km-Wert flir Ammoniumionen ist flir die GDH im Gegensatz zur GS relativ hoch und kann mitWerten urn 10- 3 M angegeben werden (LEA und THURMANN 1972; DOUGALL 1977). Die GS und GOGAT haben Km-Werte von etwa 1;100 bzw. lIlO unter dem der GDH (0 'NEAL und JOY 1974; DOUGALL 1977; MIFLIN und LEA 1976). Ftir die Gs waren durch den Nitratstickstoff und die Glutaminsaure in den heterotroph emahrten Suspensionskulturen ebenfalls wesentliche stimulierende Substrate gegeben. AuBerdem begtinstigen die kleine Km und die hohe Affinitiit zwischen GS und Ammoniumionen (MEERS et al. 1970) die N-Assimilation tiber die Glutaminsynthetase die Amidierung der Glutaminsaure. Nach Tabellen 1 und 2 kann die Abhangigkeit beider Synthesewege yom exogenen Stickstoffangebot bestatigt werden. Ftir die N-Inkorporation sind sowohl ftir den GDH-Weg als auch GS/GOGA T -Weg in der logarithmischen Wachstumsphase (7. Kultivierungstag) bei den praktizierten Anzuchtbedingungen optimale und reproduzierbare Reaktionsablaufe gegeben. Die GDH und GS sind dabei relativ konstant und zeigen einen ahnlichen Betrag. Das GOGAT-Enzym erreicht unter den normalen N-Versorgungsstufen 1;10 bis lIl3 der GDH- bzw. GS-Werte. Durch ein verandertes Angebot von Nitrat und Ammonium vollzieht sich ein Wechsel im Aktivitatsverlauf zwischen der GDH und GS. Beide verhalten sich antagonistisch bzw. sind negativ korreliert. An Hand der Daten flir das Ende der 14tagigen Kultivierungszeit (Tab. 1) laBt sich weiterhin eine Ubereinstimmung der diskutierten Parameter im System Beta vulgaris/ Chenopodium album ableiten. Die bei beiden Arten wahrend der der einzelnen Entwicklungsstadien beobachteten Effekte treten auf Grund der unterschiedlichen Wachstumsraten lediglich zeitlich versetzt auf. Ftir die Interpretation und Diskussion der Ergebnisse bzw. flir physiologische Untersuchungen eignen sich die verwendeten Kulturen bis zu einem Frischmassegehalt von 150 mgt ml Suspensionsl6sung, das entspricht einer Kultivierungszeit fiir Beta vulgaris-Kulturen von 7 Tagen und flir Chenopodium album-Kulturen von 10 Tagen. Bei Kultivierungen tiber diese BPP 183 (1988) 5

403

Zeit treten beim Wachstum III demselben Nahrmedium StreBbedingungen durch Nahrstoffmangel bzw. durch die veranderten Konzentrationsverhaltnisse und die hohe Zelldichte auf. Das hat zwangslaufig Auswirkungen auf die Aktivitaten der GDH, GS und GOGAT zur Folge und ist beim Einsatz von Suspensionskulturen zur Testung der Wirkung von Effektoren auf den N-Stoffwechsel zu beriicksichtigen. Zwischen den Zellkulturen von Chenopodium album und Beta vulgaris treten bei den 3 Enzymen keine signifikanten Differentialmerkmale auf. 1m Gegensatz zu Ganzpflanzen, bei denen als Folge einer genetischen Adaptation von Kulturpflanze und Ruderalpflanze sowohl in den Betragen der Enzyme als auch der Prioritat des einen oder anderen Weges der NAssimilation Unterschiede zu verzeichnen sind.

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