Quantitative histochemische untersuchungen zum nachweis der protaminspeicherung von Mäuseascitestumorzellen

Experimental

Cell Research 17, 197-204

197

(1959)

QUANTITATIVE HISTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUM NACHWEIS DER PROTAMINSPEICHERTJNG VON MiiUSEASCITESTUMORZELLEN W. SANDRITTER,

H. FISCHER,

K. St.?SSENBERGEiR

und H. G. SCHIEMERl Senckenbergisches Pathologisches Institut I. Medizinische Universitiits-Klinik,

der Universitiit Frankfurt am Main Frankfurt am Main, Deutschland

and

Eingcgangen am 4. August 1958

WEMC;E

Untersuchungen hahen sich bisher mit der Frage heschsftigt, ob, und in welchem MaBe, Proteine in intakte Zellen eindringen kijnnen 14, 6, 7, 8, 9, 261. Die Beantwortung dieser Frage ist jedoch nicht nur von theoretischer Bedeutung (Zellpermeabilitfit), sondern such wichtig, wenn man sich vor Augen halt, da13 der Angriffspunkt der meisten pharmakologisch wirksamen Proteine (Proteohormone, toxische Proteine und Polypeptide) noch unbekannt ist. Vor einiger Zeit wurde berichtet [la, 13, 14, 15, 161 da13 die stark basischen und relativ niedermolekularen Protamine und Histone fiir solche quantitativen Untersuchungen der Zellpermeabilitfit fiir EiweiIJ besonders geeignet sind. Ihr hoher Gehalt an basischen Aminosauren und daraus ableitbare physiko-chemische Eigenschaften lassen sie leicht von den meisten Zellund Plasmaproteinen unterscheiden. Schon in sehr kleinen Konzentrationen wirken Protamine - in hiiheren such die Histone - ausgesprochen cytotoxisch und bactericid [ll-16, 21, 22, 28, 30). Mit iiblicher chemischer Methodik kann diese toxische Wirkung auf Genebeschnitte oder Zell- und Bakteriensuspension messend verfolgt werden; es 1113t sich dabei zeigen, da13 ansteigende Konzentrationen von Protamin oder Histon zu einer proportional ansteigenden Hemmung von Zellatmung und Glykolyse fiihren; weiter, daIJ diese Hemmung mit Zellquellung, Kationenaustausch und Wasseraufnahme vor sich geht. Das die Schgdigung ausliisende basische Protein wird dabei an die Zellen adsorbiert oder in ihnen gespeichert. Die Entscheidung dariiber, oh die Fixierung an oder in der Zelle vor sich geht, ist mit chemischen Methoden kaum zu treffen. Sie ist jedoch durch die histochemische Analyse von einzelnen Zellen miiglich, iiber deren Ergebnisse, am Beispiel der Protaminspeicherung durch 14scites-Tumorzellen, im nachfolgenden berichtet werden ~011. 1 Mit Unterstiitzung 14-593705

der Deutschen

Forschungsgemeinschaft. Experimental

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W. Sandritter, H. Fischer, K. Siissenberger und H. G. Schiemer METHODE

Gewinnung

und Vorbehandlung

der Tumorzellen

Mluseascitestumorzellen wurden lo-14 Tage nach Inokulation entnommen, einma1 in phys. Kochsalzlosung gewaschen und in Ringer-Losung suspendiert. Nach Zugabe von Protaminsulfat (Hoffmann-La Roche) (Endkonzentration 0,l %, 0,3 % und 0,5 %) wurden die Zellsuspensionen 30 Min. bei 37” inkubiert. AnschlieBend wurden diinne Zellausstriche angefertigt, die IO Min. in 96%igem Alkohol fixiert wurden. Unbehandelte Zellen dienten als Kontrollen. Fiirbungen Vorversuche.-Der

hohe Gehalt des Protamins an basischen Aminosauren, insbesondere an Arginin (80 %) lie6 erwarten, da13der farberische Nachweis am besten mit einem sauren Farbstoff oder der Argininreaktion nach Sakaguchi [23] modifiziert nach Baker [2] gelingen wiirde. In Vorversuchen wurde Arginin in steigenden Konzentrationen auf Filtrierpapier aufgetropft und mit einer wassrigen FastgreenLijsung (0,l %, Farbstoff der Anilin-Division, FCF, 88 % Farbstoffgehalt) von verschiedenem pH (I, 2-8) gefarbt. Die besten Ergebnisse, d. h. zunehmende Anfarbung mit steigender Protaminkonzentration wurde mit einer 0,2%igen whsrigen Losung bei pH 6,5 oder 8 erzielt. Das pH wurde mit KOH eingestellt. Die Argininreaktion nach Baker [2] ergab ebenfalls eine zunehmend starkere Anfarbung bei ansteigender Protaminkonzentration. Fastgreenfiirbung.-Die Ausstriche wurden 10 Min. in 96%igem Alkohol fixiert, dann 30 Min. in einer O,l%igen wassrigen Fastgreen-Losung (pH 8) gefarbt, in Aqua dest. differenziert und iiber Xylol in Eukitt (n = 1,48) eingedeckt. AuBerdem wurden von den Zellsuspensionen Schnittpraparate von unbehandelten und mit O,S%iger Protaminlosung behandelten Zellen angefertigt. Nach Alkoholfixierung (15 Min.) wurden die Zellsuspensionen iiber Methylbenzoat in Paraffin eingebettet und die behandelten und unbehandelten Zellen in einem Paraffinblock geschnitten. Dadurch wurde gleiche Schnittdicke in beiden Praparaten erreicht. Die Schnittkante des Mikrotommessers wurde bei einem sorgfaltig nachgeschliffenem Messer vorher tiberprtift. Die Schnittdicke betrug 5 p. Argininreaktion nach Sakaguchi [23], modifiziert von Baker [2].-Die Ausstriche wurden 10 Min. in 96%igem Alkohol fixiert, anschliessend 3 Min. in folgender Losung inkubiert: 2 ccm l%ige NaOH-Losung mit Zusatz von 2 Tropfen einer l%igen cc-Naphthollosung und 4 Tropfen einer l%igen Na-Hypochloritlosung. Abspiilen in Aqua dest., 5 Min. in 96%igem Alkohol differenziert und in ein Medium mit dem Brechungsindex n = 1,54 (Cargille Refraktionsindex-Fluid) eingedeckt. Die Messungen erfolgten innerhalb von 4 Std. nach der Flrbung. Testobjekte (Bullenspermien) zeigten innerhalb dieser Zeit keine Abnahme der Farbungsintensitat. Gallocyaninchromalaunfiirbung.PHerstellung der Farbliisung nach Einarson [lo] mit Gallocyanin der Firma Fluka. Farblosung 20 Min. gekocht. pH 1,64. Eindecken in ein Medium mit dem Brechungsindex 1,54. Histophotometrie

Die Messungen wurden mit einem Cytophotometer 1241vorgenommen. Technische Daten: Objektiv NA 1,3, C)limmersion, Kondensor NA 0,25, Okular IO, ProjektionsExperimental Cell Research 17

Protaminspeicherung

von Miiuseascitestumorzellen

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entfernung 93,5 cm, GroIle der MeBblende 0,84 ~1, Durchmesser der Leuchtfeldblende 30 /A. Van jeder Zelle wurden mindestens 20 einzelne Punkte gemessen. Die Messungen wurden fiir Fastgreen mit einem Interferenzfilter 3, 633 rnp, fur Arginin A 510 m,u und fur Gallocyaninchromalaun I574 rnp vorgenommen. Die Zellen wurden auf einem Projektionsschirm abgezeichnet und planimetriert. Die Ergebnisse sind in Arbeiteinheiten (planimetrierte Flache in pX multipliziert mit der mittleren Extinktion = AE) ausgedruckt. Ultraviolettmikrospektrographische Untersuchungen Die Messungen wurden mit einem automatisch registrierenden Ultraviolettmikrospektrographen vorgenommen (siehe Sandritter, [25]). Kurze technische Daten: Objektiv NA 0,85, Kondensor abgeblendet auf NA 0,3, Gr613e des MeBfeldes 0,5 p, Reproduzierbarkeit der Messungen & 1 %. Die Berechnungen des Nukleinsauregehaltes erfolgten nach Abzug der unspezifischen Absorption bei ii 313 rnp unter der Annahme eines speziellen Extinktionskoeffizienten der Nukleinsaure-n von 20 bei 3, 265 mp. Interferenzmikroskopische Trockengewichtsbestimmungen Die Messungen erfolgten mit dem Bakerschen Interferenzmikroskop mit der Analysatormethode (Objektiv x 100, Okular x 10). Die Zellen wurden in Tyrodelosung 3mal gewaschen und eingedeckt. Die Berechnung des Trockengewichtes erfolgte nach der friiher angegebenen Methode [27]. Wiederholte Messungen an der Einzelzelle ergaben eine Schwankungsbreite der Mefiergebnisse (methodischer Gesamtfehler) von i 5 %. Mit der ,,Fringe-Methode“ stimmten die Werte .innerhalb von & 7 % iiberein. BEFUNDE

Morphologische Beobachtungen Auf eine morphologische Beschreibung der Mauseascitestumorzellen kann verzichtet werden [3, 17, 181. Lediglich die Veranderungen nach Protaminbehandlung sollen hier kurz dargestellt werden. Die eindrucksvollsten farberischen Veranderungen beobachtet man nach Behandlung mit 0,5%igem Protamin. Bei Fastgreenfarbung und der Argininreaktion sieht man eine deutlich starkere Anfarbung der Zellkerne und des Cytoplasmas (Abb. 1 a), wobei die Zunahme der Farbungsintensitat kleinere und griil3ere Zellelemente in gleicher Weise betrifft. Gleichzeitig erscheinen die Zellen vergroaert. Feinere morphologische Details lassen sich in den Ausstrichpraparaten bei diesen Farbungen nicht erkennen. Haufig sieht man aber knopfformige Ausstiilpungen des Cytoplasmas, die sich intensiv anfarben. Im Interferenzmikroskop oder bei Gallocyaninchromalaunfarbung sind diese schwach basophilen Protoplasmaprotuberantien deutlicher zu sehen. Die Anfarbung der Zellen mit Gallocyaninchromalaun ist nach Behandlung unverlndert, das Cytoplasma erscheint diffus schwach basophil gefarbt, die Chromatinstrukturen des Zellkernes treten deutlicher hervor als bei Kontrollen. Im Interferenzmikroskop sind die Zellkerne kleiner und mittelgrofier behandelter Zellen blasig aufgetrieben und der Kerninnenraum ist homogen, die Nukleolen sind erhalten. Bei groBen Zellen Experimental

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W. Sandritter, H. Fischer, K. Siissenberger und H. G. Schiemer

Abb. 1 a.-MLiuseascitestumorzellen nach Behancllung mit 0,5 76 Protamin, Fastgreenflrbung. Starke Anfirbung von Kern und Cytoplasma grol3er und kleiner Zellen. Die Feinstruktur der Zellen ist kaum zu erkennen. Abb. 1 b.-M~useascitestumorzellen nach Behandlung Bakerschen Interferenzmikroskop. Beachte die Faltung des Nucleolus, sowie die blasigen Cytoplasmaeinschliisse.

mit 0,5 % Protamin. Aufnahme mit dem der Kernmembran und die Stechapfelform

nach Behandlung mit Protamin die Kernmembran hsufig unregelmCJ%g gefaltet und das Chromatin dicht und verklumpt. Die Nukleolen zeigen hsufig einc Stechapfelform (Abb. 1 b). In Schnittprgparaten von mit Fastgreen gefiirbten Zellen sieht man im Cytoplasma unbehandelter Zellen zahlreiche gefsrbte und ungeflrbte Granula. Nach Behandlung mit Protamin ist das Protoplasma diffus griin gefgrbt, die Zellkerne erscheinen blasig aufgetrieben mit deutlich gefsrbter Kernmembran und Chromatinstrukturen. Auch der Kernsaft ist deutlich griin geflrbt. Bei den Untersuchungen im UV-Licht beobachtet man nach Behandlung mit Protamin ebenfalls die Protoplasmaprotuberantien, das Cytoplasma erscheint gegeniiber Kontrollen homogener, die Kernstrukturen sind teils verwachsen oder treten durch Schrumpfungseffekte deutlicher hervor.

erscheint

Schon die mikroskopische Beohachtung 11flt demnach erkennen, da13 nach Protaminbehandlung die Anfgrbung der Zellen mit dem sauren Farbstoff Fastgreen und nach Argininreaktion verstgrkt ist, wobei gleichzeitig die morphologischen Feinstrukturen vom dem eingedrungenen Protein iiberdeckt werden und Schrumpfungseffekte am Kern oder Protrusionen des Cytoplasmas auf die Zellsch5digung hinweisen.

Ergebnis

der Messungen

In Tabelle 1 und 2 ist das Ergebnis der Messungen zusammengestellt. In den Ausstrichpriparaten sieht man nach Behandlung mit steigenden Konzentrationen von Protamin nach Fgrbung mit Fastgreen eine deutliche Steigerung der mittleren Extinktion und Zunahme der Zellflgche. Das ProExperimental

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Protaminspeicherung

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von Miiuseascitestumorzellen

dukt aus Flache x Extinktion, die Arbeitseinheit, ist nach Behandlung mit O,l%igem Protamin urn das 1,68fache (68 %), mit 0,3 % urn das 2,63fache (163 %) und mit 0,5 y0 urn das 10,30fache (930 %) angestiegen. In Schnittpraparaten sollte der Beweis erbracht werden, da13 Protamin tatsachlich in die Mauseascitestumorzellen eingedrungen ist und nicht nur TAB.

1. Ergebnis

der Messungen von protaminbehandelten ascitestumorzellen.

Behandlung Protamin Konz.

n

Fastgreenfarbung (Ausstriche)

unbeh. O,l % 0,3 % 035 %

49 50 50 50

1246 118,7 153,9 196,O

0,145 0,246 0,302 0,893

l&22 3063 48,OO 187,7’0

i 1,38 31 4,18 I 6,16 i 15,63

Fastgreenfarbung (Schnitte)

unbeh. 0,5 %

50 50

73,0 83,5

0,764 1,304

56,43 108,99

& 8,37 + 5,37

Argininreaktion

unbeh. 0,5 %

50 50

181,O 179,0

0,168 0,864

30,3 155,6

4 2,79 rfI 10,98

Gallocyaninchromalaun

unbeh. 0,5 %

50 50

83,5 so,2

1,17 1,228

Methode

Mittlere Extinktion

Miiuse-

Fllche u2

E Kern U\’

unbeh. 095 %

TAB.

50 50

2. Ergebnis

96,0 151,0

I265

97,6!3 96,4:2

NS-Gehalt E mp 3,313 mp x lo-l2 g

0,73 0,54

der interferenzmikroskopischen bestimmungen.

FlPche, p2

Mittl. Fehler

AE

0,06 0,06

30,71 37,49

+ 2,25 4 3,96 Mittl. Fehler i: 3,34 4 5,02

Trockengewichts-

Konzentration lo-* g/cm2

Trockengewicht lo-‘* g

Kern

Kern

Behandlg. ProtaminKonz.

n

Kern

IJnbch.

50

102,9

94,l

6064,s 13224,l --19288,90

62,4 123,s L--c-a 185,73

i 19,36

03 %

50

95,4

111,4

7574,4 17090,3 --24654,67

72,6 --a

& 16,69

Plasma

Plasma

Plasma

191,7

Mitt]. Fehler

264,36 Experimental

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W. Sandriffer, H. Fischer, K. Siissenberger und H. G. Schiemer

an der ObertlBche angelagert wurde. Die Messungen ergeben eine Steigerung der mittleren Extinktion urn fast das Doppelte, die Arbeiteinheit hat urn das 1,93fache (93 “/o) zugenommen. Damit ist erwiesen, dafl Protamin tatsgchlich ist allerdings bei in das Zellinnere eingedrungen ist. Diese Speichcrung weitem nicht so stark wie in den Ausstrichprgparaten. Wir miichten glauben, da0 in den Ausstrichen ein Teil des Protamins nur an der OherfEiche der Zellen liegt und dadurch eine hiihere Protaminspeicherung vorgetguscht wird. Es ist aber such daran zu denken, dalj bei dem Einbettungs- und Nachbehandlungsprozess Protamin in Liisung gegangen ist. Bei der Argininreaktion ist die entwickelte Farbstoffkonzentration behandelter Zellen etwa 5mal grijner als in unbehandelten (Anstieg der AE urn das 5,14fache, 414 %). Die interferenzmikroskopischen Messungen lassen ebenfalls erkennen, da0 Protamin vom Kern und Plasma aufgenommen wurde. Die Zunahme der Trockengewichtskonzentration betragt fiir Kerne 25 % (1,25fach), fiir das Plasma 29 % (1,29fach). Das Trockengewicht hat im Kern urn 16 % (1,16fach), im Plasma urn 15 % (1,15fach) zugenommen. Diese im Vergleich zu den farberischen Methoden nur geringe Zunahme des Trockengewichtes bei behandelten Zellen ist wahrscheinlich auf einen Verlust an Protamin beim Waschen in Tyrodeliisung zurtickzuftihren. Fischer [13] fand bei dreimaligem Waschen von mit Protamin behandelten Mauseascitestumorzellen einen Protaminverlust von etwa 25 %. Die Messungen im UV-Licht und nach GallocyaninchromalaunfLirbung zeigen, da13 der Nukleinsauregehalt der Zellkerne und des Cytoplasmas durch die Protaminbehandlung nicht beeinflul3t wird. Die Anwesenheit dieses Proteins stiirt demnach such nicht die Farbstoffbindung zwischen dem Farbstoff Gallocyaninchromalaun und der Nukleinsiure.

DISKUSSION

Unsere Messungen an Asciteszellen haben gezeigt, da0 die erheblichen Strukturvergnderungen nach Protaminbehandlung tatsgchlich auf eine - im wesentlichen intracellultire - Speicherung von Protamin zuriickzufiihren sind. Zwar ist such die ZelloberEiche verlndert; als Zeichen der Schgdigung finden sich Protoplasmaextrusionen und Auflagerungen von Protamin. Doch deuten die Homogenisierung oder Schrumpfung der Strukturen des Cytoplasmas und des Zellkernes, verbunden mit der Zunahme des Arginingehaltes, der Fastgreenfgrbung und des Trockengewichtes auf eine durch Protaminfixierung hervorgerufene grobe Zerstiirung der feineren ZellstrukExperimental

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von Miiuseascitestumorzellen

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turen hin. Die von Fischer et (11. [ll-151 beschriebene Hemmung der Zellatmung hat wahrscheinlich ihre Ursache in einer Schldigung der Mitochondrienstrukturen. Wahrscheinlich wird zumindest ein Teil des eingedrungenen Protamins an die Nukleinsauren angelagert (Verminderung des Methylgrtinfarbung [12]). Der Farbstoff Gallocyaninchromalaun vermag aber trotzdem mit dem Protamin in Konkurrenz zu treten, da keine Abnahme der Farbungsintensittit auftritt. Der NS-Gehalt der Zellen bleibt nach den UV-Messungen zu urteilen unverandert. Von groBem theoretischen Interesse scheint uns zu sein, dlaB Protamin nicht nur im Zellplasma diffus und an bestimmten Strukturen tixiert wird, sondern such im Zellkern nachzuweisen ist. Somit sind nicht nur die auBeren Grenzschichten der Zelle, sondern auc.h die inneren membranartigen Barrieren wie die Kernmembran fur basische Protamine permeabel. Daraus lal3t sich ableiten, da13 der Stoffaustausch zwischen Kern und Cytoplasma, wit z. B. die Abgabe von Nucleolarsubstanz an das Cytoplasma nicht unbedingt an mikroskopisch sichtbare Strukturen [l] gebunden sein mu13. In welcher Weise der Transport griitlerer Molekiile vonstatten geht (aktiver ,,CarrierMechanismus“ oder passive Adsorption) mu13 vorlaufig noch oRen bleiben. Fischer [13] hat friiher versucht, die sich zum Teil widersprechenden Ergebnisse kinetischer Studien so zu deuten, da13 sowohl passive Adsorption wie such aktiver Transport (Protoplasmastromung) am Aufnahmevorgang beteiligt sind. In jiingster Zeit ist eine ahnliche Arbeitshypothese, die ebenfalls bride Mechanismen beriicksichtigt, als das ,,concept of membrane flow for active transport“ von Bennett [5] beschrieben worden. Aus nnseren Modellversuchen lath sich auBerdem ableiten, wie man sich die Wirkung anderer basischer Proteine auf den Zellstoffwechsel vorstellen kann (basische Polypeptidhormone, z. B. Vasopressin; Polypeptidantibiotika, z. B. Gramicidin). Auch die toxischen Produkte aus nekrotischem Tumorgewebe, entziindlichen Exsudaten [20, 311 usw., die aus der Histonfraktion der Zellkerne zu stammen scheinen [ 16, 321, sind in diesem Zusammenhang von Interesse. SUMMARY Quantitative histochemical methods are employed in order to study whether protamine penetrates the cell wall and the nucleus of ascites tumor cells of the mouse or whether it is only deposited on the cell surface. Photometric measurements made on smears stained with Fast-green or after arginine reaction indicate an increase in staining intensity of nucleus and cytoplasm. A Experimental

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similar phenomenon is also observed in tissue sections, in which a protamine deposit on the cell surface may be excluded. These findings are also corroborated by dry-weight determinations with the Baker-interference microscope. The nucleic acid content and staining with gallocyanin chromalum remain unaffected after treatment with protamine. The significance of these experiments in relation to the problem of cell permeability and the action of basic polypeptide hormones and polypeptide antibiotics are discussed. LITERATUR 1. 2. 3. 4. 5. 6.

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