Aminosäure-Transferenzyme aus Leber

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BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

BBA 95519

A M I N O S ~ U R E - T R A N S F E R E N Z Y M E AUS L E B E R II. U N T E R S U C H U N G E N (~TBER F U N K T I O N UND E I G E N S C H A F T E N Z W E I E R KOMPLEMENT~'~R W I R K E N D E R KALBSLEBER

TRANSFERFAKTOREN

AUS

F. K L I N K , K. KLOPPSTECH, G. K R A M E R UND J. D I M I G E N Institut /iir Physiologische Chemie und Physikochemie der Universitiil, Kiel (Deutschland) (Eingegangen am 14. April, 1966) (Revidiertes Manuscript eingegangen am 27. Juli, I966 )

SUMMARY

Amino acid trans/er enzymes /rom liver II. Studies on the /unction and properties o/ two complementary trans/er /actors /rom cal/ liver Some of the properties of 2 complementary amino acid transfer factors (FI, F I I ) isolated by anion-exchange chromatography from calf liver have been studied. Transfer activity was tested in vitro using either polyribosomes or poly (U)-linked 8o-S ribosomes from rat liver. The following results were obtained. I. Neither of the transfer factors alone could be shown to be a "binding enzyme": t R N A binding to ribosomes was found only in the presence of both enzymes while simultaneously effecting peptide synthesis. 2. FI exhibited a ribosome- and sulfhydryl-dependent, specific GTPase activity which was not influenced by added aminoacyl-tRNA or ribonuclease. 3. Gel filtration of FI on Sephadex G-2oo yielded 3 peaks of activity. In the absence of sulfhydryl compounds the main peak represented the lightest fraction; in the presence of cysteamine, the heaviest one. 4. By gel filtration, the transfer activity of F I I was resolved into several peaks of approximately equal height, corresponding to molecular weights between 2oo ooo and more than 3oo ooo. Cysteamine caused the lighter fractions to contain up to 8o o of the eluted activity. 5- The enzymes occurred partly in the form of a complex which could not be resolved by gel filtration. 6. FI, which is somewhat less sensitive to heat than F I I , became much more heat labile after gel filtration on Sephadex G-2oo; the heat stability could not fully restored by the addition of cysteamine.

Abkiirzungen: PEP, Phosphoenolpyruvat; tRNA, 16sliche Ribonucleinsgmre; Poly (U), PolyuridylsSmre.

Transfer-RibonucleinsS.ure; sRNA,

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F.

KLINK

gf

al.

EINLEITUNG

In vorausgehenden Mitteilungenl, 2 wurde fiber die Abtrennung zweier zur Peptidsynthese aus aktivierten Aminostiuren in vitro notwendigen Enzymfraktionen berichtet. Die Wirkung der beiden Faktoren (FI und FII) war kurz als komplement~ir charakterisiert worden, ohne dab dabei Aufschlul3 fiber Einzelheiten von Funktion, Cofaktoren-AbhSmgigkeit und Proteineigenschaften der Enzyme gegeben wurde. Nach den in den letzten Jahren yon verschiedenen Arbeitsgruppen erzielten Ergebnissen a 10 dfirften sich an den Ribosomen bei der f~Iberffihrung einer aktivierten Aminos~iure in eine Peptidbindung mindestens drei Vorg~inge abspielen: Die Codegerechte Adaptation der Aminoacyl-Transfer-RNA, die Peptidknfipfung und ein komplexer Transportvorgang, der mit einer Verschiebung der Messenger-RNA und wahrscheinlich zweier tRNA-Molekfile verbunden ist. Dieser Dreiteilung des Transfervorganges stehen nur zwei verschiedene Transfer-Enzyme des 16slichen Zellfiberstandes gegenfiber, die bisher aus allen daraufhin untersuchten Quellen isoliert werden konnten. Eine Zuordnung der beiden Enzyme zu bestimmten Teilreaktionen ist dann relativ leieht m6glieh, wenn es gelingt, ein Zwischenprodukt der Gesamtreaktion mit Hilfe nur eines der beiden Enzyme darzustellen. Auf diese Weise konnte einer der Faktoren aus Kaninchen-Reticuloeyten der Peptidsynthese-Reaktion zugeordnet werden, der andere der Bindungsreaktiona,4; die Aktion des "binding enzyme" ging mit GTP-Spaltung einher. Im Gegensatz hierzu bildeten sich AminoacyltRNA-Ribosomenkomplexe bei Escherichia coli bereits in AbweseDheit von Enzymen des Zellfiberstandes6-9; einer der beiden Transferfaktoren aus E. coli konnte jedoch als spezifische, ribosomenabhfingige GTPase erkannt werdenn, ~2. In der vorliegenden Arbeit wird fiber Funktion, Cofaktorenbedarf und proteinchemisches Verhalten der beiden Transferenzyme aus Kalbsleber berichtet. Es wird gezeigt, dab einer der Faktoren (FI) eine ribosomenabh~ingige GTPase-Wirkung besitzt, dab ein Aminoacyl-tRNA-Bindungseffekt dagegen nur durch eine Kombination beider Enzyme erzielt werden kann. Der Einflul3 wm Sulfhydryl-substanzen auf Aktivit~it und Stabilitiit eines der Enzyme (FI) sowie auf die durch Gelfiltration ermittelten Molekulargr6gen beider Faktoren wird demonstriert.

MATERIALIEN

UND

METHODEN

Materialien

Phosphoenolpyruvat (PEP) (krist. Tri-Cyclohexylammoniumsalz), Pyruvatkinase (EC 2.7.1.4o), ATP (Na-Salz), GTP (Li-Salz), GDP (Li-Salz), 3-Phosphoglycerat, Phosphoglyceratkinase (EC 2.7.2.3), Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase (EC 1.2.I.I2), und sRNA wurden yon Fa. Boehringer (Mannheim), CTP yon der Calbiochern. Corp. (Luzern), Polyuridylstiure von Fa. Miles (Elkhart/Ind.), [14C]Proteinhydrolysat aus Here (spez. Aktivittit 700 ffC/mg) und Na2H32P04 von Fa. Philips-Duphar (Amsterdam), Cysteamin yon Fa. Serva (Heidelberg) bezogen. Ionentauscher-Zellulosen lieferte Fa. Schleicher und Schfill (Dassel), Dextrangele die Dtsch. Pharmacia GmbH (Frankfurt). Biochim. Biophys. Acta, ~34 (1967) 373-387

AMINOSAURE-TRANSFERENZYME AUS LEBER. II

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Pu//erlbsungen Puffer B: o.o5 M Tris-HC1 (pH 7.6); o.25 M Saccharose; o.oo8 M Magnesiumazetat; o.I M KC1. Puffer G: 0.05 M Tris-HC1 (pH 7.5); 0.008 M Magnesiumazetat; o.I M KCI.

Methoden Grobfraktionierung der Leber, Pr~tparation von E14ClAminoacyl-tRNA. (NH4)~SQ-Fraktionierungen und Proteinbestimmungen wurden wie frfiher beschrieben durchgeffihrt 2. Polyribosomen wurden aus Rattenleber nach Methode c dargestellt 2.

Prdparation yon 8o-S-Ribosomen Rattenleber-Polysomen wurden fiber Nacht durch Dialyse auf eine Mg 2+Konzentration yon 6. IO 5 M gebracht. Je 1.5 ml Ribosomenl6sung (A26om, I cm 12o) wurden im Rotor SW 25 der pr~iparativen Ultrazentrifuge "Spinco" tiber einen kontinuierlichen Zuckergradienten (5-20 %) geschichtet und 2.5 h bet 25 ooo Umdrehungen/min zentrifugiert. Die R6rchen wurden durch Abtropfen bei automafischer Extinktionsschreibung geleert, der Hauptgipfel gesammelt und eingefroren aufbewahrt*.

Darstellung der E14C]Phenylalanyl-t RNA Diese wurde in gleicher Weise durchgeftihrt wie die der [14C]Aminoacyl-tRNA ~, nur wurde anstelle der " p H 5 - F r a k t i o n " eine tRNA-freie Pr~iparation von Aminoacyl-tRNA-Synthetasen TM verwendet; zur Veresterung von je 25 mg t R N A wurden 12.5 ~C I14C]Phenylalanin (spez. Aktivit~it 300 mC/mM) eingesetzt; die Ausbeuten betrugen etwa 15 mg, die spezifischen Aktivit~ten zwischen 4 ° ooo und 60 ooo counts/ rain pro mg tRNA.

Darstellung der Trans/erenzym/raktionen Die beiden Transferfaktoren F I und H I wurden wie beschrieben aus (NH~)2SO 4Fraktionen des pH5-1]berstandes von Kalbsleber durch Chromatographie an T E A E Cellulose (FI) bzw. DEAE-Sephadex (FII) dargestellt 2.

Aus/iihrung der Trans/er-Tests Die Enzymfraktionen wurden zur Prfifung ihrer Transferaktivit~tt bet 37 ° (in Temperaturinaktivierungsexperimenten bet 32°) mit dem Testsystem inkubiert. Das polysomale Einbausystem enthielt im Gesamtvolumen von I.O ml: o.I ml Polysomenl6sung (A26o mu I cm = 55); 4 °00 counts/min -- 25-3 °/~g II~ClAminoacyl-tRNA; fibriges und Verarbeitung der Ans~itze siehe 2. * E i n e A n a l y s e m i t f l a c h e r e n Z u c k e r g r a d i e n t e n liel3 e r k e n n e n , d a b es sich g r 6 B t e n t e i l s u m e i n G e m i s c h y o n 3o-S - u n d 5 o - S - U n t e r e i n h e i t e n h a n d e l t e , die u n t e r d e n T e s t b e d i n g u n g e n zu ,So-S-Ribosomen r e k o m b i n i e r t e n .

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F. KLINK et al.

Das Polyphenylalaninsynthese-System enthielt in i.o ml: o.I ml 8o-S-Ribosomenl6sung (A260mt, I c m = 4 5 ) ; 3 5 o o c o u n t s / m i n - - e t w a 7 o # g [14ClPhenylalanyl-tRNA; o.I mg Poly (U); Io/~Mol Magnesiumazetat; ATP, PEP, Pyruvatkinase, Cysteamin, KC1 und Tris-HC1 wie im Polysomen-Test. Die Verarbeitung der Testans~itze sur Isolierung des ~4C-markierten Proteins geschah wie frtiher besehrieben 2. Zur Erfassung yon ribosomengebundener il~ClAminoaeyl-tRNA wurden die Ansfitze sofort nach der Inkubation mit dem io-fachen Volumen an eiskaltem Puffer B verdtinnt und 12o min bei lO5 ooo ×g zentrifugiert; die Innenwand der R6hrchen wurde nach dem Abgief3en sorgf~iltig ausgewischt, die Ribosomen-Pellets getrocknet, in konzentrierter Ameisens~ture gelSst und im Methandurchflul3z~ihler auf ~4C-Aktivit~it untersucht; aus der Differenz der so erzielten und der durch Proteinisolierung gewonnenen Werte wurde die netto-AminoacyltRNA-Anlagerung berechnet.

Priiparation vo~, y-32P-markierten Nucleosidtriphosphaten EV-a2PIATP wurde nach der yon GLYNN UND CHAPPELL~7 angegebenen Methode dargestellt. Ha2PO42-, ATP, 3-Phosphoglycerat, Phosphoglyceratkinase und Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase wurden in Mg 2+- und cysteinhaltiger Tris-HC1 Pufferl6sung I h bei 26 ° inkubiert. Das markierte ATP wurde an DEAE-Zellulose absorbiert und mit einem logarithmischen Gradienten yon Triaethylammoniumcarbonat ts eluiert und abgetrennt; das Elutionsmittel wurde im Vakuum entfernt. [y-3~PIGTP wurde aus markiertem ATP und GDP mit Hilfe wm Nucleosiddiphosphatkinase (EC 2.7.4.6) dargesteI10 9 und ebenfalls an DEAE-Zellulose yon ATP, ADP, G D P und Hilfsstoffen getrennt. Die spez. Aktivit~it der Triphosphate lag maximal bei etwa IO mC/mMol.

Aus/iihrung der Triphosphatase-Tests Die auf ATPase- bzw. GTPase-Wirkung zu priifenden Enzymfraktionen wurden ffir 15 min bei 37 ° mit ATP bzw. GTP inkubiert. Das Testsystem enthielt im Gesamtvolumen von I mh Je nach spez. Aktivit~tt zwischen 6 und 18 m/,Mol A T P bzw. [?~-32P]GTP; 3o/*g Aminoacyl-tRNA; 3o #Mol Cysteamin; 8 #Mol Magnesiumazetat; Ioo/.tMol KC1; 5o #Mol Tris-HCl-Puffer (pH 7.7). Die Reaktion wurde durch 2 ml 5 °.oige Triehloressigs~iure beendet. Nach Zusatz von I pMol Phosphat wurde das fiberschiissige ET-32P]GTP an IOO mg Aktivkohle (Norit A) adsorbiert; der Zentrifugationstiberstand wurde im Liquid Scintillation Spectrometer auf 3~p untersucht.

Gel/iltration Die Dextrangele wurden einige Stunden (Sephadex G-5 o) bzw. 3 Tage (Sephadex G-200) in Puffer G gequollen und nach Dekantieren der feinsten Teilchen und Entgasen im Vakuum zum Giel3en der S~ule verwendet. Nach Ausbildung einer konstanten Oberfl~iche wurde das ~iuBere Volumen V 0 mit Ribosomenl6sung oder Dextranblau bestimmt; die Auftragung geschah durch Unterschichten der auf dem Gel stehenden Pufferschicht mit einer gebogenen Kapillare. Die Lage der Elutionsgipfel wurde durch Messung bei 254 m# im Durchflul3photometer, bei 26o und 28o m/t Biochim. Biophys, .4cla, 134 (I967) 373-387

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AMINOSAURE-TRANSFERENZYME AUS LEBER. II

im Spectralphotometer bestimmt. Die Temperatur (zwischen 3 und 5 °) und die Elutionsgeschwindigkeit w~ihrend eines Laufes wurden konstant gehalten. Eichsubstanzen s. Legende Fig. 2.

ERGEBNISSE

Wirkung der Trans/er/aktoren au/ die Anlagerung yon Aminoacyl-tRNA an Ribosomen W E T T S T E I N UND NOLL 5 s o w i e H A W T R E Y , N O U R S E AND K I N G 2° zeigten, dal3 bei der Peptidsynthese an Leberpolysomen jedes aktive Ribosom ein Molekiil Aminoacyl-tRNA spezifisch zu binden imstande ist. Es wird aus der bisher vorliegenden Literatur 5,2°-22 jedoch nicht klar, ob der Anlagerungsvorgang Enzym-abhfingig abl/iuft, da in keinem Falle die Freiheit der Ribosomen von beiden Transferfaktoren nachgewiesen wurde. In Tabelle I sind einige Ergebnisse yon Experimenten zusammengefal3t, die wir mit dem Ziel unternahmen, mit Hilfe nur eines der beiden Transferenzyme eine Anlagerung von Aminoacyl-tRNA an Ribosomen ohne gleichzeitige Peptidsynthese nachzuweisen. Es wurden neben natfirlichen Polyribosomen

TABELLE

I

V E R G L E I C H VON A M I N O A C Y L - t R N A - B I N D U N G U N D A M I N O S A U R E E I N B A U IN T E S T S Y S T E M E N NAT/]IRLICHEN POLYSOMEN U N D MIT POLY ( U ) - V E R K N / £ 1 P F T E N 8 0 - S - R I B O S O M E N

MIT

E n z y m m e n g e n s. Fig. 6. T e s t b e d i n g u n g e n u n d V e r a r b e i t u n g de r A n s ~ t z e s. METHODEN.

Testsystem mit

Enzyme*

[14ClAminosiiureEinbau (counts/rain)

[laClA~ninoacyl-tRNABindung+ AminosdureEinbau

Netto-~14Cl.4minoacyltRNA Bindung (counts/rain)

Q**" Einbau

Bindung

3.16

3.48

3.5 8

.~. V)

(counts/ rain) ** Polyribosomen in 8 mM Mg ~+

-FI FII F[+FII

o 5 93 294

26 7 144 472

26 2 5I 178

8o-S-Ribosomen+ FI I ' o l y (U) in FII IO mM Mg 2+ F I I + F I

4 2 lO6 380

32 14 156 548

28 12 5° 168

8o-S-Ribos o m e n ohne P o l y (U) ( end ogene Peptidsynthese)

F[+FII

5°

* Alle E n z y m w e r t e sind d u r c h S u b t r a k t i o n der R i b o s o m e n - L e e r w e r t e (Zeilen i u n d 5) korrigiert. ** G e s a m t 14C-Markierung der a b z e n t r i f u g i e r t e n R i b o s o m e n . Effekt von (FI+FII) Effekt von FII

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F. KLINK el al.

auch aus den Untereinheiten rekombinierte 8o-S-Ribosomen (METHODEN) verwendet; da diese nahezu frei von anhaftender Aminoacyl- und Peptidyl-tRNA waren*, wurde die Gefahr einer Blockierung yon tRNA-Anlagerungsstellen vermieden. FI allein besaB keinen tRNA-Bindungseffekt. Die l~Tbereinstimmung der Quotienten (Tabelle I) ffir Einbau und Bindung machte wahrscheinlich, dab auch F I I allein kein Bindungsfaktor ist; diese Folgerung konnte dutch Versuche bestStigt werden, in denen Leber-FII durch den entsprechenden Transferfaktor aus Hefe 2Gersetzt wurde, welcher in fast wirkungsreiner Form vorlag. Die relativ geringe tRNA-Bindung an transferenzym-freie Ribosomen stellte zu einem Teil durch die Ribosomen-Isolierungsmethode bedingte Contamination dar. Versuche mit Histidyl-tRNA im Poly (U)-System zeigten jedoch, dab aueh ein Code-spezifischer Bindungsanteil darin enthalten war. Tabelle I macht au[3erdem deutlich, dab in der Wirkung der Transferfaktoren kein Untersehied zwisehen dem System mit natfirlichem und kfinstlichem Messenger bestand; hierdurch wurden andere Experimente 2 best/itigt, die ffir die Transferenzymfreiheit unserer Polyribosomenprtiparate sprachen.

TABELLE I [ NUCLEOSIDTRIPHOSPtIATASE-\VIRKUNG

VON I'OLYRIBOSOMF.N UND TRANSFERFAKTOREN

AUS LEBER

Enzymmenge: 53/zg FI; 72/~g FI I. Triphosphate: Je 16 m#Mol [y-aq~]ATP bzw. ~7-a2P-GTP iJbriges s. METHODEN Teslsyslem rail

Gespaltenes ?2PjGTP in mffMol

Polyribosomen FI Polyribosomen + F[ FII Polyribosomen+ FII

0.22 o.2[ t.8 7 8.8 8.9

GTPase-Effekt A TPase E//ekt

0.65 0.32 I4.o 1.2 1.2

GTP-spaltende W i r k u n g der Trans/er/aktoren Wie bereits in vorl/iufiger Form mitgeteilt wurde 2a, setzten beide Transferenzym-Fraktionen bei Inkubation mit I7-a2pIGTP anorganisches a2p frei. Dieser GTPase-Effekt war linear yon den Enzymmengen abhtingig. Die chromatographisch dargestellten FII-Pr/iparate besaBen wesentlieh h6here GTPase-Aktivit/iten als FI, wenn beide Enzyme etwa im Verhttltnis der S/ittigungsmengen des Transfer-Testsystems verwendet wurden (Tabelle I[). Die GTPase-II war jedoch durch Gelfiltration von F I [ abtrennbar, ohne dab die Transferaktivittit von F I I verlorenging (Fig. 6); auch in anderen Eigensehaften, z.B. der Hitzelabilit/it (s. Tabelle I I I ) , zeigten F I I und GTPase I I unterschiedliches Verhalten. Die Annahme erscheint daher berechtigt, dab diese Triphosphatase keine unmittelbare Bedeutung ffir die Peptidsynthese besitzt. Im Gegensatz zu der GTPase in F I I war die an sich relativ geringe GTPase-Wirkung von FI durch Zusatz von Polyribosomen um das Mehrfache ihres Betrages stimulierbar (Fig. I). Die GTPase-Aktivit/it yon FI stieg noch bei

* G.

tkRAMER,

unver6ffentlichte Ergebnisse.

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AMINOSAURE-TRANSFERENZYME AUS LEBER. II TABELLE III VERGLEICH DENEN

VON

GTPAsE-

UND

TRANSFER-WIRKUNG

DER

TRANSFERFAKTOREN

UNTER

VERSCHIE-

BEDINGUNGEN

E n z y m m e n g e n fiir G T P a s e - T e s t s. Tabelle II. Transfer-Test: lO.9 #g F I ; 7 2/zg F I I

Bedingungen

Ribosomen-abhiingige GTPase4Virkung GTPase-Wirkung yon yon F I I F I in ml~'l,lol G T P in m121VIol G T P

[14CIA minosduretrans/er durch ( F I + FII) in #[~Mol Aminosdure

Vollst~indiges S y s t e m Ohne Aminoacyl-t R N A Ohne Cysteamin F I erhitzt* F I t erhitzt* Vollst&ndiges S y s t e m + R i b o n u c l e a s e (i #g) R i b o s o m e n erhitzt**

1.35 1.25 0.32 o.41

2,I6

8.8 9.0 8.8 8.22

1.19 1.33

0.04 0.56 O.21 0.22

1.80

* 5 rain bei 55 °. I m T r a n s f e r t e s t Ergiinzung d u t c h nicht erhitztes Gegenenzym. ** IO rain bei 55 °.

Enzymmengen linear an, die 4-fach h6her waren als die S~ittigungsmenge des Aminos~turetransfersystems. Der durch eine gegebene FI-Menge erzielte molare GTPUmsatz fibertraf den Aminos~ureeinbau fast um das Ioo-fache. Der Stimulationseffekt der Polysomen auf die FI-GTPase besal3 eine strenge Spezifit~it fiir GTP (s. Tabelle II), w~thrend beide Komponenten getrennt mehr ATP als GTP zersetzten. Die Ribosomen-abh~ingige GTPase-Wirkung und die Transferaktivit~it von FI waren stark w~irmelabil, wfihrend sich die GTPase-Stimulationswirkung der Ribosomen ~ihnlich wie ihre Proteinsynthesef~thigkeit als wesentlich weniger hitzeempfind-

2ol/ •

/ - ............ /

,7OO

/¢" ° f

,s4/

"600

/

"500 •4 0 0 o

:E

1.0

-300 : ~

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5 i :~ 0.5 i •

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i

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-100

.................... .

10

FI (IJg)

20

P

.

.

.

.

.

.

30

40

t/)

n v-0

50

Fig. I. Vergleich yon AminosSmretransfer- u n d G T P a s e - W i r k u n g steigender FI-Mengen. Aminosiiuretransfer im P o l y s o m e n - T e s t s y s t e m : . . . . . . . , F I wie angezeigt + 60/~g F I I ; . . . . F I I allein. G T P - S p a l t u n g : [E- - - m, F I allein; I t - I , F I + o . l ml P o l y s o m e n l 6 s u n g abziiglich der S u m m e der Einzeleffekte y o n F I u n d Polysomen.

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F.

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KLINK e~ al.

lich erwies (Tabelle I I I ) . Die Ribosomen-abh~tngige GTPase war weder durch Aminoacyl-tRNA noch durch Ribonuclease deutlich zu beeinflussen, verlor jedoch in Abwesenheit freier Sulfhydrylgruppen etwa 75 °o ihrer Aktivitgt.

log M o l e k u l c l r g e w ] c h t 4.0 4.2 4 . 4 4.6 4.8

1(X3

5.0

5.2

5.4

5.6

5.8

Adenosin

~ 8C g

_Eu

>o 6c vl

-

~

Ovalburnm

5 t13

4C

2C

10 4

5.10 4

10 5

Molekulargewlcht

2.10 5 3.10 5

Fig. 2. Eichkurve zur Molekulargewichtsbestimnmng durch Gelfiltration all Sephadex G-2oo (Lit. 24). Eichproteine: Ovalbumin, 5mal krist, reinst (Serva, Heidelberg); Serumalbumin, bovin, reinst, und v-Globulin, bovin (Behring, Marburg); Creatinphosphatkinase (EC 2.7.3.2 ) p.a. (Boehringer, Mannheim). Sfiulenvolumen 1oo ml, GelhOhe 55 ° mm.

Verhalte~ der Trans/er/aktoren bei Gel/illration Zur Priifung der chromatographisch gewonnenen Faktoren I und I I auf Einheitlichkeit und zur Absch~ttzung ihrer Molekulargr6Be wurden Gelfiltrationsexperimente an Dextrangel geeigneter Porenweite (Sephadex G-2oo) unternommen. Fig. 2 zeigt eine Eichkurve, die mit reinen Standardproteinen (s. Legende Fig. 4) gewonnen wurde; es sei betont, dab die Zahlenwerte ftir Molekulargr613en besonders im Bereich oberhalb 15o ooo nur N~iherungen darstellen, w/ihrend der relativen Lage der Transferaktivit~ttsgipfel eine gr66ere Bedeutung zukommt. Faktor I. Wie Fig. 3 zeigt, wurde die FI-Aktivit~tt dutch das Gel stark retardiert. In Abwesenheit yon SH-Substanzen wurde ein Hauptgipfel gefunden, dem in vielen F~illen kleinere Vorgipfel (B und C) h6heren Molekulargewichtes vorausgingen. Bei Gelfiltration in Gegenwart yon 0.005 M Cysteamin ~tnderte sich das H6henverh~iltnis der 3 Gipfel entscheidend; nach partieller Oxydation des Cysteamins blieb dieser Wechsel aus. Das E n z y m besal3 auch nach der Gelfiltration die ribosomenabh~tngige GTPase-Wirkung; naeh vorl~iufigen Ergebnissen war jedoch tier Quotient aus GTPase- und Transferwirkung ftir A, B und C verschieden, l~ber einen Teil tier Gelfiltrationsversuche an FI war bereits in kurzer Form berichtet worden ~3. Biochim. Biophys..4cta, ~34 (L907) 373 387

AMINOS'd_UF, E-TRANSFERENZYME AUS LEBER. II

3~I

Molekulacgewicht x 10 -5 2.0 15 125 0.9 200

15C

C

E

8

It

u 10C

i

b

:~ 5c~ 0

/o\ o

30

0 10 20 Fraction No.

40

50

60

70

Fig. 3. G e l f i l t r a t i o n yon F I an S e p h a d e x G-2oo. S~ule: V o l u m e n 41o ml, G e l h6he 572 mm. A u f t r a g je e t w a 13 m g F I - P r o t e i n + o . 7 m g A d e n o s i n (zur 13 e s t i mmung des i n n e r e n V o l u m e n s ; Gipfel n i c h t m i t d a r g e s t e l l t ) . -~ul3eres V o l u m e n d u r c h D e x t r a n - b l a u (D) in g e t r e n n t e m L a u f b e s t i m m t : . . . . A245 ml,. T r a n s f e r t e s t m i t P o l y s o m e n + 3 6 / ~ g F I I : A - A , A u f t r e n n u n g in A b w e s e n h e i t , bzw. ~ -2J, in G e g e n w a r t v o n o.oo 5 M C y s t e a m i n ; - - - , F I I allein.

14000

1.2

:4C

L I0000 •

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6C

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Fraction No.

Fig. 4. G e l f i l t r a t i o n einer m i t 0.35 M KC1 v o n D E A E - S e p h a d e x A-5o e l u i e r t e n F I I - F r a k t i o n in A b w e s e n h e i t v o n S u l f h y d r y l s u b s t a n z e n an S e p h a d e x G-2oo. A u f t r a g 22 m g F I I + 0.6 Ing A d e n o s i n (A). S~iulendimensionen u n d E l u t i o n wie in Fig. 3 . . . . . A2so m~; z ~ - - - / x , G T P a s e - A k t i v i t / i t von o. 4 nil E l u a t f r a k t i o n . T r a n s f e r a k t i v i t ~ t t yon: m-m, o. 4 ml E l u a t f r a k t i o n + 2 7 / ~ g F I ; [] . . . . . [], o. 4 m l E l u a t f r a k t i o n allein; T e s t i m P o l y s o m e n s y s t e m .

Biochim. Biophys. i4cta, 134 (1967) 373-387

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F. KLINK el al.

F a k t o r i i . E i n Tell der F I I - A k t i v i t f i t w u r d e v o m Gel v611ig a u s g e s c h l o s s e n ; dieser Tell e n t h i e l t p r a k t i s c h die g e s a m t e T r i p h o s p h a t a s e - A k t i v i t f i t des P r f i p a r a t e s (Fig. 4). E t w a die Hfilfte des E n z y m m a t e r i a l s w u r d e j e d o c h r e t a r d i e r t , einer Molekulargr613e w m k n a p p 2oo ooo e n t s p r e c h e n d ; m e i s t w a r e n i n s g e s a m t 3 (;ipfel erk e n n b a r . Die L a g e d e r l e i c h t e s t e n F I I - A n t e i l e ist e b e n s o wie die d e r 3 F I - F r a k t i o n e n A, B u n d C, auf d e r E i c h k u r v e m a r k i e r t (Fig. 2). A u c h bei V I I b e w i r k t e r e d u z i e r t e s C y s t e a m i n eine V e r s c h i e b u n g der M e n g e n v e r h f i l t n i s s e , j e d o c h z u g u n s t e n der leicht e r e n F r a k t i o n e n ; diese \ : e r s e h i e b u n g w a r z u m Tell sehr a u s g e p r S g t (s. Fig. 5), w e c h s e l t e j e d o c h in i h r e m Ausmal3 je n a e h F I I - P r S p a r a t . Kombi~alio¢~ beider l,'aklore~. B e s o n d e r e s I n t e r e s s e g a i t d e r Vrage, ob sich die n a c h d e m c h r o m a t o g r a p h i s c h e n V e r h a l t e n d e r E n z y m e " p o s t u l i e r t e E x i s t e n z eines K o m p l e x e s z w i s c h e n F I u n d VII d u r c h G e l f i l t r a t i o n b e s t S t i g e n lieB. I n Fig. 4 u n d 5 ist die E i g e n t r a n s f e r w i r k u n g d e r F I I - F r a k t i o n e n (ohne F I - Z u s a t z im T e s t ) a n g e g e b e n ; sie w a r k a u m g e r i n g e r als die des auf die Gelsfiule a u f g e t r a g e n e n M a t e r i a l s . Das bei d e r c h r o m a t o g r a p h i s c h e n G e w i n n u n g w m F I I an D E A E - S e p h a d e x ~

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Fig. 5. (;elfiltration (Sephadex (; 2oo) einer rail o.35 M I,[C1 yon DEAE-Sephadex A 5° eluierten FlI-Fraktion in (;egenwart yon o.oo5M Cvsteamin. Auftrag 22 mg FIr ~ o . 6 m g Adcnosin (nicht mit dargestellt) . . . . . H'2sO raft. Transferaktivitfit yon: I1-1111,o.3 ml Eluatfraktion L 27 fig FI; IJ. . . . . q, o. 3 ml Eluatfraktion allein; Test im l'olysomensystem. Fig. 6. (;elfiltration einer beide Transferfaktoren enthaltenden Proteinfraktion (sehe Text) an Sephadex (?,-2oo. Sfiule s. I;ig. 3. Elution mit Puffer G . . . . , ~42s0 mm Transferakti\itSt yon: m-m, o.o5ml Eluatfraktion -.27ffgF[; • . . . . • , o.o5 ml Eluatfraktion+72ffg FII; • • , 72 fig P'I 1 allein. Test im ]'olysomens},stenl, s. METHODEN. Biochim. Bmphvs. Acta, 134 (1()(~7) 373-387

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am Ionentauscher nicht haftende Protein enthielt beide F a k t o r e n in vergleichbaren Mengen. Gelfiltration dieser Fraktion fiihrte nicht zur v611igen Trennung der Faktoren (s, Fig. 6): Fast die gesamte FII-Aktivit~it wurde vom Gel ausgeschlossen; die leichteren FII-Anteile waren nur als kleine Schultern erkennbar. F I hingegen wurde nur zu etwa 6o-7o o~,,oretardiert; der Rest verliel3 die Sfiule gemeinsam mit F I I . B~ide Faktoren scheinen also nicht nur in freier Form, sondern teilweise als Komplex zu existieren, der gegen Gelfiltration resistent ist.

Verhalte~ der Trans/er/aktores bei Temperalagreiswirk~ng Je einer der aus E. coliS,v,~ und Rattenleber ~s isolierten Transferfaktoren war als recht labil, der andere als relativ stabil gegen Lagerung in der K/ilte beschrieben

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Fig. 7. A k t i v i t / i t s / i n d e r u n g der beiden T r a n s f e r f a k t o r e n d u r c h E r w S J m u n g auf v e r s c h i e d e n e T e m p e r a t u r e n . Die E n z y m e w u r d e n in P u f f e r B je 5 rain bei d e n a n g e g e b e n e n T e m p e r a t u r e n i n k u b i e r t , in Eis gektihlt, a n s c h l i e g e n d m i t C y s t e a m i n a u f o.o 4 M g e b r a c h t (s. METHODEN). h n T r a n s f e r T e s t (i 5 m i n bei 32°) w u r d e jedes E n z y m d u t c h einen k o n s t a n t e n t3berschul3 a n n i c h t e r h i t z t e m G e g e n e n z y m ergS, nzt. Die T r a n s f e r w i r k u n g der n i c h t e r h i t z t e n K o n t r o l l e w u r d e i o o qo gesetzt, o,~ TransferaktivitS.t yon: m - m , F I I ; • - - - O , FI (an T E A E - Z e l l u l o s e isoliert); • ..... • , F[ (durch Gelfiltration g e w o n n e n -- F r a k t i o n e n 51 54 a u s Fig. 6). E n z y m k o n z e n t r a t i o n c n w ~ h r e n d der E r w & r m u n g : F I I o.0 m g / m l ; F I ( T E A E ) lO 9 fig/nil; F1 ((;-200) 320 ffg/ml. h n T e s t e i n g e s e t z t e M e n g e n der erwS.rnlten E n z y m e : F I [ 6o fig; FI ( T E A E ) lO.9 fig; FI (G 200) 32 fig. Fig. 8. Aktivit~tts/~nderung u n t e r s c h i e d l i c h v o r b e h a n d e l t e r F I - P r / i p a r a t e d u r c h E r w S J m u n g a u f v e r s e h i e d e n e T e m p e r a t u r e n . E r h i t z u n g u n d T e s t der E n z y m e siehe L e g e n d e Fig. 7. og T r a n s f e r aktivit/it yon: • • , F [ ( T E A E ) . © - - - ( 7 ) , Z e n t r i f u g a t i o n s i i b e r s t a n d yon: FI ( T E A E ) n a c h ErwS.rmung a u f 5 °0 fiir IO min; • . . . . . • , F I A (s. Fig. 3), o h n e C y s t e a m i n ; & . . . A , F1 A " 0.005 M C y s t e a m i n . E n z y m k o n z e n t r a t i o n e n w g h r e n d der E r h i t z u n g : FI ( T E A E ) 78ffg/1nl; FI ( T E A E ) v o r e r h i t z t 3 l f f g / m l ; FI A 188 ffg/ml. E n z y m m e n g e n i m T e s t a n s a t z : FI ( T E A E ) 7.8 fig; F l ( T E A E ) v o r e r h i t z t 6.2 fig; FI A i8.8 fig.

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worden. Bei unseren Enzymfraktionen waren /ihnliche Stabilit/itsunterschiede nur bei Lagerung in Form stark verdfinnter, eingefrorener L6sungen erkennbar. Um exakte Angaben tiber die Labilit~it der Transferfaktoren zu gewinnen, ffihrten wir eine Serie von Experimenten durch, in denen die Enzyme in relativ hoher Verdtinnung einer kurzzeitigen Erw~irmung auf verschiedene Temperaturen ausgesetzt wurden; im Einbautest wurde dann jeweils das nicht erhitzte Gegenenzym im konstanten Uberschuf3 zugesetzt. Fig. 7 gibt einen Vergleich der W~trmeempfindlichkeit beider Faktoren. F I I zeigte zwischen 45 und 55 ° einen raschen Aktivitfitsabfall. Das in fiblicher Weise an TEAE-ZelIulose prfiparierte FI erwies sich als wesentlich weniger hitzelabil. Durch Gelfiltration ohne vorhergehende Chromatographie an T E A E dargestellter Faktor I (s. Fig. 6, Fraktionen 51-54) verlor hingegen bereits durch Praeinkubation bei 4 o~ 3o 0~ seiner AktivitSt. Im n;~tchsten Experiment wurde an T E A E gewonnenes FI in verschiedener Weise vorbehandelt und danach dem Erw/irmungstest unterworfen (Fig. 8). Man sieht, (tab bereits eine Vorerw~irmung ffir Io min auf 5 °o die Empfindlichkeit des Enzyms im nachfolgenden ErwSrmungstest deutlich steigerte. Die stSrkste Labilit~itssteigerung wurde durch Gelfiltration an Sephadex G-2oo in Abwesenheit von Sulfhydrylsubstanzen erzielt; Zusatz von Cysteamin w~ihrend der Erw~trmung iibte eine gewisse, abet unvollstfindige Schutzwirkung aus. Um festzustellen, ob die Steigerung der WSrmelabilitfit nach der Gelfiltration lediglich durch die Entfernung von Sulfhydrylsubstanzen zustande kam, wurde anstelle von Sephadex G-zoo Sephadex G-5o verwendet; das in dieser Weise vorbehandelte E n z y m zeigte gegenfiber nicht gelfiltriertem H zwar ebenfalls eine StabilitStsverminderung, die aber wesentlich geringer war als bei dem durch Sephadex G-2oo gegangenen Material. Eine auffallende Einzelheit der Praeinkubationskurven sind die Wendepunkte zwischen 35 und 45 ° (s. Fig. 8), (tie in iedem Experiment reproduziert wurden, wenn aueh in unterschiedlicher Deutlichkeit; nicht immer lagen die Einbauwerte nach Praeinkubation bei 45 ° h6her als die Wirkung des nicht praeinkubierten Enzyms, zumal wenn es sich um filtere Pr~iparationen handelte.

DISKUSSION

Es wurden bisher aus E. coli6,7,12, Rattenleber 13 15, Hefe~6 und Reticulozyten3, 4 je zwei verschiedene Transferenzyme isoliert. Aufgrund der oben dargestellten Ergebnisse wurde es mSglieh, jedem unserer beiden Faktoren je einen funktionell gleichwertigen oder zumindest nahestehenden heterologen Transferfaktor zuzuordnen. Anhand von CTbereinstimmungen und Differenzen funktioneller und proteinchemischer Art zwischen den einander entsprechenden Enzymen sollen abschliel3end einige Anhaltspunkte fiber die Natur der von beiden Enzymen katalysierten Teilreaktionen der Peptidsynthese zusammengestellt werden.

Faktor I GASIOR UND MOLDAVE14,15 trennten dureh Dextran-Gelfiltration einer mit Calciumphosphatgel vorbehandelten Proteinfraktion aus Rattenleber die komplement/ir wirkenden "Transferasen I und I I " . Aus der Gr613enordnung der Molekulargewichte lassen sich Transferase I mit F I I , Transferase I I mit FI in Beziehung

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setzen. Transferase I I zeigte ein anderes Verhalten bei (NH4)2SQ-Fraktionierung und offenbar eine wesentlich h6here Labilit/it als FI, diirfte jedoch mit dem durch Gelfiltration aus FI abgetrennten, stark thermolabilen FI A (s. Fig. 3) iibereinstimmen. Die unterschiedliche Molekulargr6f3enverteilung von FI bei Gelfiltration mit und ohne Sulfhydrylsubstanzen deutet an, in welcher Weise die Stabilisierungswirkung der SH-Gruppen auf FI bzw. Transferase I I (Lit. 27) zustande kommen k6nnte. Die hochspezifische GTPase-Wirkung yon FI, die an die Gegenwart von Ribosomen und SH-Substanzen, nicht aber von Aminoacyl-tRNA gebunden ist, bedeutet, dab FI eine der tRNA-Bindung vorausgehende Reaktion am Ribosom katalysiert; SL'TTER UND MOLDAVE2s kamen aufgrund kinetischer Versuche zu dem gleichen Schlul3. Eine fast analoge GTPase-Wirkung zeigte Faktor G aus E. coli 7,12. Allerdings tibte hier Aminoacyl-tRNA eine Stimulationswirkung auf die Reaktion aus; gerade in der tRNA-Bindung scheinen ja erhebliche Unterschiede zwischen beiden Systemen zu bestehen. Faktor G aus E. coli k o m m t wie FI offenbar in zwei Formen mit sehr unterschiedlicher Stabilit/it vorT, 1~. Es wird in weiteren Untersuchungen zu kl~iren sein, ob der auffallende Verlauf der W/irmeinaktivierungskurven (s. Fig. 9), insbesondere die mehrfach beobachtete Aktivit/itszunahme von FI bei Erw~irmung, Ausdruck einer Umwandlung des Enzyms in eine andere Form ist. Der aus Hefe isolierte Transferfaktor I (Lit. 26), der durch Kombination mit LeberF I I im Transfertest identifiziert wurde, ist FI aus Leber in allen untersuchten Eigenschaften sehr/ihnlich. Dagegen erscheint (lie Zuordnung der Reticulozyten-Enzyme a,4 schwierig, da hier der GTP-spaltende Faktor (T-f I) zugleich tRNA-Bindungsenzym ist und keine Sulfhydrylsubstanzen benStigt.

Faklor I I

Transferase I, deren Molekulargewicht auf Werte zwischen 5oo ooo und 8oo ooo gesch~itzt wurde ~5, dtirfte hierin dem FII-Anteil der Durchlauffraktion aus DEAE-Sephadex (s. Fig. 6) entsprechen; dagegen besa[3 ein grol3er Teil der an DEAE-Sephadex haftenden FII-Aktivitfit geringere Molekulargr613en (s. Figs. 4 und 5). Noch st~irkere Molekulargewichtsunterschiede wurden bei H e f e - F I I beobachtet": Hier fanden sich nebeneinander Enzymanteile mit MolekulargrSl3en um 300 ooo und yon nur 65 ooo. Wie bei Leber 2 wurden auch bei Hefe 26 und E. coli 1~ Anhaltspunkte ftir die Existenz yon Komplexen zwischen beiden Transferfaktoren gefunden, welche h6here Stabilit~tt und einen st/irker anionischen Charakter besaBen als die wirkungsreinen FII-Fraktionen. Es soll in weiteren Experimenten gekl~trt werden, ob beide Transferenzyme direkt miteinander verkniipft oder gemeinsam an einen hochmolekularen Tr/iger gebunden sind; die Molekulargr613enverteilung bei F I I yon Leber und Hefe spricht eher ftir die zweite M6glichkeit. Die Wirkung yon SH-Substanzen auf das Gelfiltrationsverhalten yon ~,'I1 bleibt in ihrer Bedeutung vorl~iufig unklar; eine Parallele bildet die v o n ARLINGHAUS, SHAEFFER AND SCHWEET4 beschriebene SH-Abh~ingigkeit der Reticulozyten-"Peptidsynthetase". Die Wirkungsreinheit der hochmolekularen Transferase I (Lit. 15) steht im Gegensatz zu unseren Gelfiltrationsergebnissen an DEAE-Durchlauffraktionen; * D. RICHTER, unver6ffentlichte Ergebnisse.

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man darf vermuten, dab hier der Reinigungsschritt an Calciumphosphatgel entscheidend ist, der aueh bei Faktor T aus E. coli zur Entfernung des Gegenfaktors ffihrtO ~. Sieht man (tie bisher w~rliegenden Ergebnisse der vers(hiedenen Arbeitsgruppen im Zusammenhang, so ergibt sich - b e i der sicherlich bereehtigten Annahme einer einheitlichen Grundkonzeption des Transfervorganges das folgende Bild: Die GTP-verbrauchende Reaktion, in ihrem Mechanismus noch ungeklSrt, ist weder dem Adaptations- noch dem Peptid-Synthetasesehritt, sondern dem eingangs als •'Transportschritt' bezeichneten Vorgang zuzuordnen. FI ist bei Leber das ffir diese Reaktion benStigte Enzym. FI w~ire damit am Messenger-Transport und m6glicherweise an der Entfernung "entladener" tRNA 2a beteiligt und wiirde die Ribosomen fiir die tRNA-Adaptation vorbereiten, die jedoch nur bei gleichzeitiger Anwesenheit yon F I I erfolgen kann; l"I I diirfte dann die Peptidkniipfung katalysieren. Ob die Bildung eines Komplexes zwischen den Faktoren--iihnlich dem chromatographisch isolierten--ein notwendiger Schritt in der Gesamtreaktion ist, bleibt zu kFiren. Die Frage, in welcher Beziehung die Dissoziation der FI-Funktionen in vitro ((ibersch6ssige GTP-Spaltung!) zu der beobachteten Sulfhydryl-abhfingigen Auftrennung dieses Enzymes in Unterfraktionen steht, wird zur Zeit untersucht.

DANK

Wir m6chten Herrn Professor H. NETTER ffir sein stets waches lnteresse und fiir viele Anregungen herzlieh danken.

Frau I. STRUCK danken wir fiir die sorgfiiltige technische Assistenz, der Deutsehen l:orsehungsgemeinschaft f(ir die Untersttitzung unserer Arbeiten im Rahmen des Schwerpunktprogrammes "Molekulare Biologie".

ZUSAMMENI:ASSUNG

Einige Eigenschaften zweier komplement/ir wirkender, durch Anionenaustauschchromatographie aus Kalbsleber isolierter Aminos~iuretransferfaktoren wurden untersucht. Ihre Transferaktivitfit wurde i~ vilro an Polyribosomen oder an Polv (U)verkn~pften 8o-S-Ribosomen aus Rattenleber gemessen. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: ~. Keiner der Einzelfaktoren erwies sich als "Bindungsenzym": tRNABindung an Ribosomen fand nur in Gegenwart beider Enzyme bei gleichzeitiger Peptidknfipfung start. 2. l;I besaB eine Ribosomcn- und Sulfhydryl-abh~ingige, spezifische GTPaseWirkung, die dutch Zusatz von Ribonuclease oder yon Aminoacyl-tRNA nicht beeinfluBbar war. 3. Bei (;elfiltration yon 1;I an Sephadex G-2oo entstanden 3 Aktivit~tsgipfel. In Abwcsenheit von Sulfhydrylsubstanzen iiberwog mengenmiit3ig die leichteste l:raktion, in Gegenwart von Cysteamin die schwerste. 4. Die Transferaktivit-/it yon VII wurde dutch Gelfiltration in mehrere Gipfel gleicher (;r613enordnung aufgetrennt, Molekulargewichten zwisehen 2oo ooo und iiber 13iochi,.. t~ioph3,x, dora, 134 (1907) 373 387

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3oo ooo entsprechend. Cysteamin bewirkte eine Mengenzunahme der leichteren Fraktionen bis auf So % der eluierten Gesamtaktivit~it. 5- Die Enzyme lagen teihveise in Form eines gegen Gelfiltration stabilen Komplexes vor. 6. FI, an sich weniger hitzelabil als FII, ging bei Gelfiltration an Sephadex G-2oo in eine sehr viel st~trker w~irmeempfindliche Form fiber; die Stabilit~it konnte durch Zusatz wm Cysteamin nur teilweise wieder hergestellt werden.

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