Analyse critique des peroxydases de la racine de mais

Plant Science Letters, 13 (1978) 213--218

213

© Elsevier/North-Holland Scientific Publishers Ltd.

ANALYSE CRITIQUE DES PEROXYDASES DE LA RACINE DE MAIS

RENE GRISON and PAUL-EMILE PILET Institut de Biologie et de Physiologie vgg~tales de I'Universitg, 6, Place de la Riponne, 1005 Lausanne (Switzerland)

(Requ le 4 Mai, 1978) (R~vis~ le 22 Juin, 1978) (Accept~ le 22 Juin, 1978)

SUMMARY Free peroxidases (PL) and ionically (PPI) and covalently bound (PPC) peroxidases were extracted from different parts (cap, meristem, elongation and differentiation zones, cortex and stele) of the maize root. Free peroxidases are characterised by an optimum pH which was related to the region from which they were obtained. Peroxidase activity of the cortex was found greater than that of the stele. The relative activity of the three kinds of peroxidases clearly depends on the physiological states of the tissues.

RESUME Les peroxydases libres (PL), pari~tales ioniques (PPI) et pari6tales covalentes (PPC) sont extraites de diff~rentes r6gions (coiffe, m~rist~me, zones d'glongation et de diff6rentiation, cortex et st~le) de racines de Mais. Les peroxydases libres sont caract6ris6es par un pH optimum qui d6pend des r6gi~ms dont elles sont extraites. L'activit6 peroxydasique du cortex est plus grand que celle de la st~le. L'activit6 relative des trois types de peroxydases d~pend de l'6tat physiologique des tissus.

INTRODUCTION

Les peroxydases ont de multiples fonctions et peuvent, notamment, contrSler l'oxydation des auxines [1], des ph6nols [2,3] et la polym~risation des pr~curseurs de la lignine [4]. Ces enzymes sont libres (PL) ou associ~s certaines organelles [5,6] dont les dictyosomes [7,8] qui pourraient jouer un r61e dans l'incorporation de constituants [9] -- les peroxydases [ 10] entre Abr6viations: PL, peroxydases libres, PPC, peroxydases pari6tales covalentes; PPI, peroxydases pari6tales ioniques.

214 autres -- au niveau des parois. Les peroxydases lides aux patois peuvent ~tre extraites par une solution de force ionique dlevde [11,12] ; elles constituent les peroxydases paridtales ioniques (PPI). Les peroxydases paridtales covalentes (PPC) [11,13,14] sont obtenues par digestion enzymatique. Si les peroxydases ont dt~ dtudides pour les organes diffdrents d'une m~me plante [15--17] ou pour divers tissus d'un m~me organe [18], celles des racines de Mais n'ont donnd lieu, ~ notre connaissance, qu'~ tr~s peu de recherches systdmatiques, l'exception de Lee et Pilet [19]. La r~partition comparde des peroxydases libres et des peroxydases paridtales (ioniques et covalentes) dans les diffdrentes zones de l'extrdmit~ de racines de Mais, font pr~sisdment l'objet des expdriences rapportdes ici. MATERIEL ET METHODES Les caryopses de Zea mays L. cv Orla 264 sont mis ~ imbiber puis ~ germer dans des conditions d~crites ailleurs [20]. Sur les racines principales de 15 +- 2 mm, des segments correspondant aux zones 0.0--0.5 et 0.5--1.0, 1--4 et 4--10 mm sont prdlev~s (le point 0 correspondant au s o m m e t de la racine). De plus, dans certains cas, pour la zone 4--10, le cortex est sdpard du cylindre central. Les fragments sont immddiatement congelds dans l'azote liquide et les enzymes extraits selon une technique ddrivde de celle de Ridge et Osborne [11,21]. Ces segments sont alors broy~s dans un mortier en prdsence de tampon phosphate selon Sorensen 1/15 M, pH 6.1 [22] puis centrifuges (5 mn, 800 g); le culot ~tant dlimin&contient les patois. Le surnageant centrifug~ ~ nouveau (20 min, 20 000 g) -- le culot ~tant ~limin~ -- contient les PL. Les parois sont lav~es successivement par du tampon phosphate (1×), de l'eau bidistill~e (2×), du Triton X-100 h 2% (agitation 15 min) puis de l'eau (2 et 6× ). Les PPI sont extraites par CaC12 1 M (agitation 1 h, 4°C), les parois sont ensuite lav~es h nouveau par CaCl2 1M (1×) et par de l'~au (3× } puis lyophilis~es. Les PPC sont alors obtenues par digestion enzymatique des patois (12 h, agitation, 25°C). Divers enzymes sont employds : la cellulase (BDH) 0.4% et la driselase (Kyowa Hakko, Japan) 0.1% dessalde sur biogel P6 en solution dans un tampon acdtate h pH' 5 selon Walpole [23] contenant du sulfate de streptomycine (500 ug/ml). Le dosage de l'activit~ peroxydassique est rdalis~ ~ 30°C en presence de gaiacolH202 [ 2 4 ] , le pH de la rdaction est ajustd par un tampon dimdthylglutarate [22]. Pour chaque zone considdrde, l'extraction est rdp~t~e 3 ou 4 fois. R E S U L T A T S E T DISCUSSION

Le pH optimum d'activit~ des PL varie suivant la zone d o n t elles sont extraites. Les optima se situent h pH 6.5 pour la zone 0.0--0.5 mm (Fig. 1A) correspondant h la coiffe et h pH 6 pour la zone 0.5--1.0 mm (Fig. 1B) constitu~e essentiellement du centre quiescent et du mdrist~me. La zone comprise entre 1 et 4 mm -- celle des cellules en ~longation [25] -- comporte une activit~ peroxydasique ~ deux optima (Fig. 2A) situ~s respectivement h pH 5.5 et

215 1.2

E

I

[

I

'

I

1.o 0.8

E

0.6

i

l

I

c

I

I

0.6

PL 0/.

A

-

0.~

PPI

Z

~m 0.2

0.2

n-

°°

O ~n

PPC

(33

<

0.0 I

A

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I

L

5

I

t

6

0.0 I

I

7

i

I

4

L

I

5

A

I

6

7 pN

pH

Fig. 1. Activit~ (± ~cart-type sur la m o y e n n e ) des PL, PPI et PPC e x t r a i t e s des z o n e s 0 . 0 - 0.5 m m ( A ) et 0 . 5 - - 1 . 0 m m (B) de racines de Mais, e n f o n c t i o n du pH d ' i n c u b a t i o n .

6.5. Dans la zone 4--10 mm, off les cellules sont bien diff~renci~es, l'optimum est situ~ ~ pH 6. Dans cette zone, il est relativement facile de s~parer le cortex du cylindre central : l'activit~ maximale est h pH 6.5 pour le cortex (Fig. 3A) et h pH 6 pour le cylindre central (Fig. 3B). Les PPI sont extraites h t o u s l e s niveaux de la racine; il en est de m~me pour 1./, 'A

'

i

,

,

~_

i

1.2 1.0

0.8

0.8

I

'

r

i

l

L

I

,

I

,

I

B

0.6

o.~

0.~ PPC z

0.2

0.2

0.0

0.0 I

4

,

1

5

~

I

6

L

I

7

I

4

,

5

6

I

7

pH pH Fig. 2. Activit~ (± ~cart-type sur la m o y e n n e ) des PL, PPI et PPC e x t r a i t e s des z o n e s 1--4 m m (A) et 4 - - 1 0 m m (B) de racines de Mais, e n f o n c t i o n d u pH d ' i n c u b a t i o n .

216

0.6

Q.

i

i

I

i

l

i

I

PL

0.2 O (.n ,n

v.~

1

,.,

J

I

I

I

,

i

'

I

~

I I

B

~ 0.2

PPI 0.0

L, I

i

5 I

I

6 I

A

I

pH

7

Fig. 3. A c t i v i t ~ (~_ 4 c a r t - t y p e s u r la m o y e n n e ) d e s P L , PPI et PPC e x t r a i t e s d u c o r t e x ( A ) et d u c y l i n d r e c e n t r a l ( B ) d e la z o n e 4 - - 1 0 m m d e r a c i n e s d e Mais, e n f o n c t i o n d u p H d'incubation.

les PPC. L'optimum d'activit6 des PPI et d6s PPC est situ6 ~ pH 6; les variations observ6es ne sont pas significativement diff6rentes dans les zones 0.0--0.5 (Fig. 1A), 0.5--1.0 (Fig. 1B), 1--4 (Fig. 2A) et 4--10 mm {Fig. 2B) ainsi qu'au niveau du cortex (Fig. 3A) et du cylindre central (Fig. 3B). L'activit6 des PPI est, pour toutes les zones 6tudi6es, inf6rieure ~ celle des PL mais sup6rieure ~ celle des PPC. L'activit~ enzymatique est r6partie suivant un gradient : faible dans la coiffe {Fig. 1A), elle augmente consid6rablement au niveau du centre quiescent et du m6rist6me {Fig. 1B) pour atteindre une valeur maximale dans la zone d'61ongation (Fig. 2A) et diminuer dans les tissus off la diff6renciation est r6alis6e (Fig. 2B}. L'activit6 du cortex (Fig. 3A) est sup6rieure ~ celle du cylindre central (Fig. 3B). Les variations de pH optimum observ6es pour les PL, le long de l'axe racinTABLEAU

l:

ACTIVIT~ RELATIVE(EN %+ ~CART-TYPE) DES PL, PPI et PPC, MESUR]~E .~ pH 6, POUR DIFF~RENTES ZONES (EN mm COMPT~S A PARTIR DU SOMMET) DE RACINES DE MAIS. Distances des zones en mm Peroxydases

0.0---O.5

0.5--1.0

1 --4

4--10

PL PPI PPC

75.5±7.6 15.0' 3.6 9 . 3 * 1.6

6 8 . 5 ~ 5.4 1 9 . 8 , 2.2 11.7 * 2.3

54.1 ~ 2.4 3 5 . 3 ~ 1.2 1 0 . 6 + 1.8

52.7 ~ 4.3 3 6 . 4 , 2.0 1 0 . 6 ~ 1.1

217 TABLEAU

II:

ACTIVITI~ R E L A T I V E (EN % + I~CART-TYPE) D E S PL, PPI et PPC, M E S U R I ~ E pH 6, P O U R LE C O R T E X ET LE C Y L I N D R E C E N T R A L D E L A Z O N E 4--10 m m D E RACINES DE MAIS

Peroxyd~es

Cortex

Cylindrecentral

PL PPI PPC

47.3~3.4 42.7~ 2.1 10.0±1.2

78.7 ~ 7.9 18.0±4.8 3.3 ~0.7

aire, p o u r r a i e n t d ~ p e n d r e de la p r e s e n c e d ' i s o e n z y m e s [26] : la c o m p o s i t i o n et l'activit~ relative de c h a c u n de ces i s o e n z y m e s v a r i e r a i e n t dans les diff~rentes zones de la racine c o m m e c ' e s t p a r e x e m p l e le cas des ATP-ases de la racine de Mais [ 2 7 ] . De plus, il a ~t~ ~tabli [ 2 8 , 2 9 ] q u e les i s o p e r o x y d a s e s , p o u r un m ~ m e s u b s t r a t , p r ~ s e n t e r a i e n t des pH o p t i m a d'activit~ d i f f & e n t s . D ' a u t r e p a r t , le g r a d i e n t observ~ le long de l ' a x e racinaire est t o u t ~ fait c o m p a r a b l e h celui qui a ~t~ d~crit p o u r les p e r o x y d a s e s d ' u n e a u t r e vari~t~ de Mais [ 1 9 ] . Si l'activit~ p e r o x y d a s i q u e est e x p r i m ~ e en valeurs relatives, il c o n v i e n t de r e m a r q u e r ( T a b l e a u I) q u e celle des PL d i m i n u e du s o m m e t vers la base de la racine, celle des PPI a u g m e n t e alors q u e celle des PPC ne varie pas de fa~;on significative. C e p e n d a n t , au niveau de la z o n e de d i f f ~ r e n c i a t i o n ( T a b l e a u II), l'activit(~ des p e r o x y d a s e s pari~tales est i m p o r t a n t e d a n s le c o r t e x e t faible dans le c y l i n d r e central. Il est d o n c clair que l'activit~ des p e r o x y d a s e s d ' u n e p a r t , leur d i s t r i b u t i o n de l ' a u t r e , s o n t lides d ' u n e fad;on significative ~ l'~tat p h y s i o l o g i q u e des tissus racinaires analys~s. REFERENCES 1 P.E. Pilet et P. Lavanchy, Physiol. v~g., 7 (1969) 19. 2 J.W. Picketing, B.L. Powell, S.H. Wender et E.C. Smith, Phytochemistry, 12 (1973) 2639. 3 D.L. Reigh, S.H. Wender et E.C. Smith, Phytochemistry, 12 (1973) 1265. 4 J.M. Harkin et J.R. Obst, Science, 180 (1973) 296. 5 E. Darimont et R. Baxter, Planta, 110 (1973) 205. 6 N. Poux, J. Microscopie, 21 (1974) 265. 7 H. Bireeka, J.L. Catalfamo et P. Urban, Plant Physiol., 55 (1975) 611. 8 C.W. Golf, Amer. J. Bot., 62 (1975) 280. 9 P.E. Pilet, Les patois eellulaires, Doin, Paris, 1971, p. 125. 10 F.G. Brinkman et T. Sminia, Z. Pflanzenphysiol., 84 (1977) 407. 11 I. Ridge et D.J. Osborne, J. Exp. Bot., 21 (1970) 843. 12 N.F. Haard, Phytochemistry, 12 (1973) 555. 13 N.M. Barnett, Can. J. Bot., 52 (1974) 265. 14 C.P. Vance, J.O. Anderson et R.T. Sherwood, Plant Physiol., 42 (1967) 221. 15 B.Z. Siegel et A.W. Galston, Plant Physiol., 42 (1967) 221. 16 S.J. Sheen, Phytochemistry, 8 (1969) 1839. 17 M. Mader, Planta, 131 (1976) 11. 18 H.A. Stafford et S. Bravinder-Bree, Plant Physiol., 49 (1972) 950.

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