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Analyse critique des tests de sensibilité in vitro aux antifongiques
M6d Mal Infect. 1995 ; 25, 6-13
Analyse critique des tests de sensibilit6 in vitro aux antifongiques* A. D A T R Y * * , J. C A R R I E R E * * , M . L E P I T R E * * , H. G R O U S S I N * * , C. S I L B E R S T I E N * *
et M . D A N I S * *
RESUME
L'ascension croissante des infections fongiques, surtout ?~levures, avec en parall61e une augmentation de plus en plus nombreuse des r6sistances aux antifongiques a n6cessit6 la mise en place de tests antifongiques fiables.Les tests de sensibilit6 des levures aux antifongiques ont montr6 un d6faut de reproductibilit6 dfi h l'absence de directives universellement admises. Les sources majeures de variation des tests de sensibilit6 sont dues au choix du milieu et de son pH, h la pr6paration et ?~la taille de l'inoculum, h la temp6rature et au temps d'incubation et ?al'6valuation du point final. Ces diff6rents param~tres ont 6t6 soumis au "National Committee for Clinical Laboratory Standards" (NCCLS) qui a pu proposer un test de r6f6rence (M27.P). Bien que des progr6s majeurs et des adaptations h la m6thode standard aient 6t6 r6alis6s, il n'existe pas encore ?~ce jour une bonne corr61ation entre les r6sultats in vitro et les r6ponses in vivo. Ces tests ne peuvent donc pas &re utilis6s en microbiologie clinique. Quant aux tests concernant les champignons filamenteux, ils n'en sont qu'~t leur balbutiement. Mots-cl6s : Tests de sensibilit6 aux antifongiques - Levures - Moisissures - Correlation in vivo - in vitro.
Ces 20 derni6res ann6es sont le t6moin de progr~s majeurs concernant le diagnostic et le traitement des maladies fongiques. L'utilisation large de traitements cytotoxiques et immunosuppresseurs, de la corticoth6rapie, des cath6ters, des antibiotiques ~t large spectre, l'utilisation de mat6riels implantables et la pratique des greffes d'organes ont provoqu6 une explosion de pathologies iatrogSnes, surtout ?~l'h6pital. La cons6quence est l'6mergence d'une population aux d6fenses immunitaires amoindries, mais avec une esp6rance de vie prolong6e. ParallSlement la litt6rature collige un nombre croissant d'infections fongiques nosocomiales. Ces infections s6v~res sont rapidement 6volutives, de diagnostic difficile et peu sensibles aux antifongiques actuels. Beck-Sagu6 et coll. (1993) d6nombrent en 10 ans 30 477 infections fongiques nosocomiales dont le taux passe de 2 ?~3,8 infections pour 1 000 patients hospitalis6s : Candida sp. 78,3 %, Torulopsis glabrata 7,3 % et Aspergillus sp. 1,3 % (4).
Par ailleurs, l'arriv6e bruyante du virus de l'immunod6ficience humaine (VIH) a entraln6 une explosion d'infections opportunistes h majorit6 fongique (90 % de candidoses oropharyng6es, 5-30 % de cryptococcoses, depuis peu les aspergilloses). Cette croissance alarmante des infections fongiques s'est accompagn6e du d6veloppement de nouvelles drogues, moins toxiques et pouvant 8tre une alternative ~t l'amphot6ricine B e t ~t la flucytosine, telles le fluconazole, l'itraconazole et les formulations vari6es d'amphot6ricine B - lipides. Les choix th6rapeutiques sont donc plus nombreux, mais rendus difficiles par les r6sistances de plus en plus nombreuses 7t un ou plusieurs agents antifongiques. Ces r6sistances n'6tant pas toujours bien contr616es, la disponibilit6 de tests antifongiques fiables s'av6re indispensable. Mais, malheureusement, ils n'en sont qu'h leur balbutiement. De multiples m6thodes ont 6t6 utilis6es, mais sans aucune standardisation et les r6sultats peu er6dibles obtenus, sont sous la d6pendance de facteurs divers : pH, taille de l'inoculum, mileu liquide ou solide, formulation du milieu, dur6e et temp6rature de l'incubation. Une CMI d6termin6e pour un isolat est
* 2e Journ6e de PathologieInfectieuseet Tropicale de Paris-Nord, CREPIT 93, Bobigny, 16 septembre 1994. ** Service de Parasitologie-Mycologie,CHU Piti6-Salp&riSre F-75013 - Paris.
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d'interprdtation difficile. Par ailleurs, certains auteurs ont montr6 des corrtlations in vivo - in vitro avec des modSles animaux ou des isolats de patients (1, 6, 13) et d'autres non (8, 17). Cette situation est manifestement insatisfaisante et des travanx 6normes ont 6t6 entrepris pour rtsoudre ces difficultts. La solution iddale est toujours ~t trouver, mais des progrts considtrables ont 6t6 rtalisds.
rature et de la durte d'incubation. La zone d'inhibition est patrols difficile ?a interprtter et les CMI tendent 8tre plus basses qu'en milieu liquide (7, 28, 29, 33, 40), les proprittts physico-chimiques des antifongiques et leur interaction avec l'agar doivent &re prises en compte. Le milieu agar est mal dtfini et sa composition varie entre les difftrents fournisseurs. L'amB et les azo16s tendent h se dtttriorer quand ils sont stockts sous forme dilute ou s~che dans les disques. Certains azolts insolubles diffusent mal sur agar (23, 50, 55). Certaines esp~ces de Candida, autres que C. albicans ont une croissance inhibte sur agar (12). Cependant des tests reproductibles sont mis au point sur agar permettant de dtterminer les rdsistances ~t 1' araB (57).
HISTORIQUE La ntcessit6 d'antifongigrammes est une prtoccupation rtcente. L'amphottricine B (araB) est n6e vers 1950, seul antifongique disponible jusqu'~ 1' arrivte de la flucytosine (5FC) en 1971, suivie par le miconazole (mic) en 1978, du kttoconazole (ktto)en 1981 et plus rtcemment (1990) du fluconazole (flu) et de l'itraconazole (itra). Tester la sensibilit6 7t la seule amB n'avait pas de sens, mSme si la drogue semblait ne pas agir sur l'infection. Cette ntcessit6 est apparue avec la naissance de la 5 FC et l'apparition de r6sistances croissantes aux antifongiques.
Les mtthodes de dilution largement utilistes aux USA ont 6t6 stlectionntes par le sous-comit6 des tests de sensibilit6 aux antifongiques du NCCLS. De nombreuses 6tudes multicentriques ont permis d'identifier les probltmes inhtrant ~tcette technique et une mEthode standard a pu 8tre proposte par le NCCLS pour tester exclusivement Candida sp. et Cryptococcus neoformans. Des mtthodes reproductibles pour les autres organismes sont toujours en dtveloppement.
Au dtpart, seuls de rares laboratoires pratiquent ces tests et les rtsultats interlaboratoires sont tr~s disparates. Galgiani et coll. (1987) rapportent une 6tude portant sur des tests de sensibilit6 de Candida rtalists par 3 laboratoires contre l'amB, la 5FC et le ktto. Aucune mtthodologie n'est indiqu6e. Alors que les CMI interlaboratoires varient de 50 000 lois, les rtsultats obtenus ~t l'inttrieur d'un mSme laboratoire varient peu (19).
FACTEURS I N F L U E N C A N T LES TESTS DE SENSIBILITE AUX A N T I F O N G I Q U E S (38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51) Dtfinition du point final
La dttermination du point final est la source la plus significative de variations interlaboratoires pour les azo16s et la 5FC. Espinel-Ingroff,(1992) et Fromtling, (1993) montrent que "la dtcroissance prononcte de la turbidit6 par rapport au ttmoin", soit une inhibition de 80 % de la croissance fongique, donne une dttermination du point final la plus reproductible et la plus concordante avec les modules in vivo (15, 16, 17, 18). La spectrophotomttrie permet de dtterminer la mrbidit6 (2, 3, 4, 5) dliminant la dtpendance avec l'inoculum, mais ntcessite un 6quipement sptcifique.
I1 apparait clairement que des techniques standards et reproductibles sont indispensables pour la pratique de ces tests. De nombreuses approches sont r6alistes, sans qu' ancune ne se prSte h la standardisation : la mesure du taux d'61ongation des tubes germinatifs est fastidieuse et seulement valable pour C. albicans (33, 58), les mesures de mttabolites radiolabiles ou la rtduction de substrats color6s utilis6es pour C. albicans, Aspergillus fumigatus... (11, 20) ntcessitent un appareillage sophistiqu6 et un inoculum important, les mtthodes utilisant la cytom6trie de flux ou le comptage des colonies viables sont peu appliquables (41, 49), la mesure de la masse biologique pax spectrophotomttrie (49) permet le calcul d'un facteur d'inhibition relative, mais la lourdeur de l'6quipement a limit6 son dtveloppement, - les techniques qui utilisent l'agar sont largement utilistes car simples, 6conomiques et de rtalisation ais6e pour un grand nombre d'organismes. Mais, elles ddpendent 6troitement de la taille de l'inoculum, de la tempt-
Taille de l'inoculum
Les CMI varient avec la taille de l'inoculum (> ~t 512 fois) (7, 22, 37, 40). L'usage d'un petit inoculum de l'ordre de 0,5 x 103 h 2,5 x 103/ml montre le plus de corrtlation inter-laboratoire. Prtparation de l'inoculum
Pfaller et coll. (1988), comparent quatre techniques de prtparation d'inoculum et montrent que la spectophotom6trie est la plus standardisable (42). 7
Dur6e et temp6rature d'incubation
RESULTATS OBTENUS AVEC LA METHODE DE REFERENCE PROPOSEE PAR LE NCCLS
Bien que cet effet soit variable d'une drogue ~t l'autre, les CMI tendent ~t augmenter avec l'allongement de la p6riode d'incubation (7) et restent stables pendant quatre jours (40). Une 6tude multicentrique rapport6e par Fromtling et coll. (1993) et concernant 13 laboratoires montre que les tests de sensibilit6 ~t l'amB, au k6to et ~t la 5FC en milieu RPMI 1640 ~t 35 ° C donnent les r6sultats les plus uniformes apr~s incubation ~t 35°C pendant 48 h pour Candida sp. ou 72 h pour C. neoforroans. Dans les 2 cas, les temps de lecture correspondent au second jour pour lequel la croissance est facilement apparente par rapport au t6moin libre de drogue (18).
Fromtling et coll. (1993) et Espinel-Ingroff et coll. (1992) rapportent les r6sutats de 2 6tudes multicentriques majeures. Ces deux 6tudes pr6sentent des similitudes. Dans l'6tude de Fromtling, 35 souches de C. albicans, 5 de C. glabrata, 10 de C. lusitianae, 10 de C. tropicalis, 15 de C. neoformans sont 6tudides par 13 laboratoires diff6rents pour tester la sensibilit6 ~t l'amB, ~t la 5FC et au k6to alors que Espinel-Ingroff (15) fait tester les mames isolats par 5 des 13 laboratoires avec en plus le flu (15, 18). Le choix de l'inoculum de 0,5 x 103 ~t 2,5 X 103/ml, le point final correspondant ~t l'inhibition de 80 % de la croissance fongique, la lecture ~ 48 h pour Candida sp et a 72 h pour C. neoformans ont donn6 une corr61ation inter-laboratoire optimale (le r6sultat devant se trouver l'intdrieur d'une dilution). Les corr61ations inter-laboratoires obtenues sont de 90 % pour l'amB, de 85 % pour la 5FC, de 88 % pour le flu et de 75 % pour le kdto. I1 est clair que cet ordre de valeur pour la reproductibilit6 d6pend de la drogue test6e et non du syst6me utilis6.
Le milieu Quand des milieux de composition ind6termin6e (agar Sabouraud), sont compar6s avec un milieu totalement synth6tique, le S A A M F (Synthetic Amino Acid Medium Fungal), des diff6rences consid6rables des valeurs de CMI sont observ6es avec la 5FC et dues ~tun antagonisme de la 5FC avec les purines et les pyrimidines du milieu (48). Les st6rols du milieu peuvent interf6rer sur les polyanes et d'autres facteurs encore ind6termin6s semblent interf6rer avec les azol6s (40).
Cette m6thode r6vble une gamme &endue de CMI pour la 5FC (0,125 ~t 64 pg/ml, le k6to (0,03 ?~2 ~tg/ml), le flu (0,12 ~ 64 pg/ml), mais pas pour l'amB (0,25 ?~ 1 pg/ml). Ces r6sultats sont obtenus malgr6 l'inclusion de plusieurs isolats de C. lusitianae pour lesquels des CMI 61ev6es sur milieu agar sont connues en cas de r6sistance ~t l'amB (25). Ces donn6es sugg~rent que soit il n'existe pas de rdsistance dans les souches test6es de C. lusitianae, soit cette m6thode est relativement insensible pour la ddtection des r6sistances ~ l'amB. Le milieu pH = 7 MOPS - yeast nitrogen base est (YNB) pr6f6rable au RPMI 1640 pour tester la sensibilit6 de C. neoformans ~ l'amB (22).
L'utilisation du MOPS-tris (acide morpholine-propanesulfonique) comme tampon dans le S A A M F inhibe l'action de la 5FC, en dehors de son action sur le pH (8). Tousles milieux n'ont pas le mame pH et la croissance d'un organisme test6 peut en ~tre affectde. Ainsi, des conditions acides entra~nent une augmentation des CMI d' amB, du fluco, du k6to, du mico, mais abaissent celles de la 5FC (14, 53). L'insolubilit6 de quelques compos6s peut ~tre aussi source de difficult6s. Ainsi, il est important que les diff6rentes dilutions soient effectu6es dans des solutions ad6quates 6vitant la pr6cipitation des principes actifs (47). Ainsi, le NCCLS sugg~re que l'amB et le k6to soient dissouts dans le dim6thyl sulfoxid e (DMSO).
Ainsi ces observations permettent de conclure que la m6thode proposde par le NCCLS n'est pas adapt6e ~ la d6tection des rdsistances h 1' amB et des am6nagements sont n6cessaires pour all6ger la mdthode de macrodilution.
Sur la base de ces donn6es, le NCCLS propose un milieu synth6tique RPMI 1640 tamponn6 ?~pH 7,0 par le MOPS. Le RPMI 1640 est facilement disponible dans le commerce et relativement bon march& Des r6sultats similaires peuvent &re obtenus avec d'autres milieux, comme le milieu synth6tique HR (43). Le milieu de Casitone repr6sente 6galement une bonne alternative pour 6valuer la sensibilit6 des levures au flu, quoique pour C. tropicalis et C. glabrata les CMI sont plus 61ev6es (16).
NOUVELLES ADAPTATIONS DE LA METHODE DE REFERENCE L'utilisation de la m~me m6thode en microdilution donnerait des r6sultats comparables (15). Le E test (test de diffusion en milieu agar) de maniabilit6 tout ?~fait ais6e donne des r6sultats encourageants comparativement aux m6thodes de macrodilution et de microdilution (56).
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Le milieu liquide antibiotique 3 tamponn6 ~ pH 5 ou 7 donne des r6sultats sup6rieurs et d6tecte r6ellement les isolats de Candida sp. r6sistants ~tl'amB (52).
facilement comptables. Cependant, dans les formes invasives, il existe une forme filamenteuse qui ne peut atre compt6e avec pr6cision ~t cause de l'adh6rence rapide des hyphes aux surfaces. En raison de ces difficult6s, de nombreuses 6tudes sur les moisissures publi6es ?~ce jour ont d6but6 avec un inoculum de conidies et sont 6valu6es sur la pr6sence ou l'absence de croissance des hyphes (10, 50, 26).
La m6thode prdconis6e par le NCCLS paraissant fastidieuse, lourde et r6serv6e ~ certaines 6quipes en recherche, Hacek (1995) apporte des modifications pour qu'elle puisse ~tre adopt6e par les laboratoires de microbiologie clinique. Deux milieux de culture sont utilisds sur plaque de microtitration, le RPMI 1640 et le EMEM (Eagle's minimum essentiel medium) et deux temp6ratures d'incubation sont test6es 30°C et 35°C. L'EMEM est en particulier s61ectionn6 car il permet la croissance des champignons filamenteux et am61iore la croissance de C. neoformans et de C. guillermondii. Par ailleurs des corr6lations in vivo - in vitro ont pu &re r6alis6es prouvant l'exactitude de ce proc6d6 (27).
Un d6faut de croissance dans de telles 6tudes peut &re dfi ~t l'inhibition de la germination plut6t qu'g celle de l'hyphe et il n'est pas certain que de telles approches corr61eraient avec la r6ponse clinique. Les tests de sensibilit6 aux Aspergillus sont revus r6cemment (10); un proc6d6 reproductible s'avbre difficile et semble li6 ?~ l'utilisation de conidies(15,36). Le Pitre (SFMM, Angers 1995) 6value un nouvel antifongigramme pour l'6tude de la sensibilit6 des Aspergillus sp 5 l'itra et ~ l'amB. I1 s'agit de d6terminer la CMI des antifongiques sur Aspergillus sp. par l'emploi de bandelettes de plastiques contenant un gradient exponentiel d'itra et d'amB (E-test). Les r6sultats pr61iminaires compar6s ~t ceux obtenus en m6thode de microdilution sont prometteurs (34).
Les m6thodes de microdilution qui utilisent une m6thode visuelle sous agitation ou la spectrophotom6trie pour d6finir le point final sont comparables (46). Les tests de sensibilit6 utilisant un r6actif colorim6trique, tel que le bleu Alamar, clarifient nettement le point final et ont une excellente corr61ation ax~ec les tests pr6conisds par le NCCLS pour l'amB, la 5FC, le flu (45) mais pas pour l'itra (60).
De m4me que pour C. albicans, il est possible de r6aliser des tests de sensibilit6 sur Aspergillus sp. en mesurant la respiration mitochondriale par la d6termination de la r6duction du MTT en formazan (32).
Une m6thode de microtitration pour d6terminer la sensibilit6 de C. albicans ~ l'amB, au flu et ~t l'itra est bas6e sur la mesure de la respiration mitochondriale en d6terminant la r6duction du 3- (4,5 dimethyl -2-thiazolyl) - 2,5 - diphenyl - 2H- tetrazolium bromide (MTT) en formazan, processus qui est accru en pr6sence de menadione. Les r6sultats concordent parfaitement avec les CMI obtenues en m6thodes de macrodilution standard. Cette 6tude confirme 6galement que le flu est incapable d'induire son action fongistatique sur une souche sensible de C. albicans en pr6sence de s 6 r u m (32).
C O R R E L A T I O N E N T R E LES TESTS I N VITRO ET LES RESISTANCES IN VIVO La n6cessit6 d'un test de sensibilit6 reproductible n' est n6cessaire que s'il existe une r6sistance clinique et si elle peut ~tre pr6vue par ce test.
Etudes animales Les relations entre les r6sistances in vitro et l'efficacit6 in vivo pour les poly6nes sont 6tudi6es sur un grand nombre de modOles animaux. Les CMI obtenues en microdilution sur milieu liquide produisent une excellente corr61ation avec l'amB et la namycine alors que les CML obtenues en microm6thode liquide et sur diffusion en agar sont moins pr6dictives et tendent ~ classer incorrectement les isolats (39). Des r6sultats similaires sont obtenus sur un module souris IV (1).
AUTRES ORGANISMES Tester les organismes autres que Candida sp. et C. neoformans pose une s6rie de probl6mes. Les champignons dimorphiques existent dans la nature sous forme illamenteuse et sous forme levure chez l'homme infect& Des pr6cautions sp6ciales sont requises au laboratoire et la technique devrait ~tre modifi6e pour s'accomrnoder la croissance lente de ces microorganismes (9, 19).
Une autre 6tude ofJ 40 isolats sont test6s d6montre une corr61ation statistique 6vidente, mais malheureusement il existe un recouvrement important entre les doses requises de 5FC pour contr61er l'infection caus6e par les
Les champignons filamenteux comme Aspergillusfumigatus pr6sentent des probl6mes diff6rents. Ces organismes poss6dent des conidies rondes, petites,
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isolats ~t CMI basses de 5FC par rapport ~tceux avec des CMI 61eyries. Ainsi, il n'existe pas de limites nettes entre les souches sensibles et r6sistantes. I1 est conclu que ces isolats ne contenaient pas un sous-ensemble distinct d'isolats r6sistants, mais 6taient plut6t compos6s d'un groupe de sous-isolats avec un spectre continu de sensibilit6 (59). Un nombre d'6tudes plus important est fait avec les azol6s. I1 en r6sulte : - le degr6 de corr61ation d6pend de la technique in vitro utilis6e. Deux isolats r6sistants au k6to sont 6tudi6s chez deux patients et trois modules animaux diff6rents. Les isolats se sont r6v616s r6sistants par deux m6thodes sur milieu liquide et deux m6thodes de diffusion en agar, mais par une m6thode de diffution sur agar les CMI pour les isolats sont identiques aux isolats t6moins (54); - le test in vitro peut montrer des diff6rences pr6dictives entre les isolats. Trois isolats de Candida sp. ont des CMI au fluco > 100 jag/ml. Le flu est actif in vivo sur deux de ces trois isolats. Sans aucune diff6rence de CMI, il n'est pas possible de discerner une corr61ation. Donc, un chiffre 61ev6 de CMI n'implique pas obligatoirement une r6sistance in vivo. I1 est clair que des variations techniques peuvent ~tre manipul6es pour produire des CMI d'un ordre d6sir6 (17); - l'interpr6tation des r6sultats doit tenir compte de la pharmacologie de la drogue. Deux isolats de C. albicans ont des CMI du flu et du k6to basse pour l'une et 61ev6e pour l'autre. Le flu est effectif pour l'isolat ~t CMI basse, mais pas pour l'autre. Malgr6 une CMI 16 fois plus basse que le flu contre l'isolat sensible, le k6to s'est montr6 ineffectif dans le module d'infection IV (53). Ces diff6rences pourraient &re dues g u n portage plus important par les prot6ines et ~ une demi-vie plus courte du k6to. Le rein 6tant le premier organe cible dans ce module exp6rimental, le fait que le flu soit concentr6 et excr6t6 dans l'urine alors que le k6to ne l'est pas, est aussi important. D~monstration clinique de la r~sistance primaire et acquise La r6sistance aux poly~nes est dite rare, mais son incidence exacte est difficile ~t d6terminer. Hughes et coll. (ICAAC, 1992), 6tudient 60 isolats de Candida sp. provenant d'h6mocultures pour leur sensibilit6 ~t l'amB par une m6thode en milieu R P M I 1640 avec 5 x 104 levures/ml ~ 37 ° x 48 h d'incubation. Alors que les CMI pour tous les isolats sont de 0,5 ~ 2 tag/ml, celles pour C. parapsilosis sont de 1 h 2 ~tg/ml et celles pour C. albicans de 0,5 ~ 1 ~tg/ml. Malgr6 la baisse des sen-
sibilit6s pour C. parapsilosis, les patients infect6s par ces levures ont un pourcentage plus important de gu6rison (31). I1 est difficile d'interpr6ter ces donn6es contradictoires sur la r6sistance aux poly~nes. Bien que les CMI d'amB ne semblent pas augmenter en cours de traitement, les micro-organismes les plus r6sistants peuvent atre moins virulents, et il est souvent difficile de d6crire un r6el 6chec fi la drogue &ant donn6 l'existence de d6ficits multiples du syst~me immunitaire chez ces patients. La 5FC est rarement utilis6e en monoth6rapie pour traiter les patients malgr6 une efficacit6 d6montr6e sur module animal. Ainsi, des cas bien structur6s d6crivant une relation in vivo-in vitro ne sont pas disponibles. Les r6sistances aux azol6s sont en revanche largement d6crites. Trois isolats de C. albicans provenant d'6chec clinique apr6s une cure prolong6e de k6to chez des patients atteints de candidose mucocutan6e chronique et un isolat provenant d'un patient n'ayant jamais gu6ri sont test6s (30, 58). Ces isolats de C. albicans sont clairement plus r6sistants au k6to par de multiples techniques. Trois des quatre isolats montrent une r6sistance crois6e avec le mico, le k6to, le fluco et l'itra. Deux des isolats se sont montr6s plus r6sistants sur mod61es animaux. I1 est int6ressant d'observer qu'un plus grand inoculum d'isolat r6sistant 6tait n6cessaire pour produire une infection, impliquant donc une virulence plus faible. Cette baisse de virulence n'est pas unanime. Ainsi, d' autres auteurs testent un isolat r6sistant sur un module rat et traitent par le flu; l'inoculum requis est identique ~ celui n6cessaire pour traiter une souche sensible (37). Comme pour le k6to, des r6sistances cliniques au flu sont apparues et l'6tude des isolats de C. albicans a montr6 une relative r6sistance in vitro. Quatre isolats de C. albicans de patients infect6s par le VIH pr6sentent une r6sistance clinique au flu. Les CMI des isolats d6termin6es par une m6thode sur milieu liquide non sp6cifique sont quatre fois plus 61ev6es que celles des t6moins (61). Les isolats r6sistants semblent moins virulents sur un module rat (13). D'un int6r~t particulier sont les 6tudes qui rapportent des 6checs prophylactiques et th6rapeutiques du flu contre C. kruzei. Dans une 6tude r6trospective portant sur 463 greff6s de moelle ou leuc6miques, il existe une incidence 7 lois plus 61ev6e de C. krusei (8,3 versus 1,2) chez 84 patients qui ont requ une prophylaxie au flu par rapport ?~355 patients qui ont requ du k6to, du mico, de l'amB ou rien (62). Alors que des CMI de flu sur
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C. kruzei sont dites augmenttes par certains auteurs, seul un rapport comparant les CMI du flu sur C. krusei celles d' autres esptces de Candida dtmontre des CMI plus 61evtes pour C. kruzei (35).
concentration critique par la mtthode proposte par le NCCLS n'est pas disponible et il n'est pas raisonnable de choisir arbitrairement des concentrations critiques sur la base des concentrations striques attendues d'un antifongique. Bien que la rtpttition des CMI durant un traitement antifongique au long cours puisse montrer leur 616vation et suggtrer une rtsistance, la rtponse clinique plus que les rtsultats des tests de sensibilit6 reste le guide le plus fiable pour la conduite thtrapeutique ce jour.
Par ailleurs, nous avons rtalis6 une 6tude r6trospective de la sensibilit6 h l'amB et au flu de 108 souches de C. neoformans chez 61 patients. La corrtlation entre l'efficacit6 clinique et la sensibilit6 in vitro est tr~s mauvalse sans qu' aucune explication ne puisse atre avancte
(24). CONCLUSION
Des techniques de biologie moltculaire ne semblent pas non plus adapttes ~t la dttection des rtsistances acquises au flu (3).
Les tests de sensibilit6 aux antifongiques sont prometteurs, du moins en ce qui concerne Candida sp et C. neoformans, mais restent toujours un outil de recherche. L'information exigte pour dtterminer la
Enfin quelques rtsultats prometteurs ont vu le jour ces derniers mois pour les tests de sensiblit6 des filamenteux mais les travaux actuels en sont toujours ~t leur balbutiement (34).
SUMMARY
CRITICAL ANALYSIS OF ANTIFUNGAL SUSCEPTIBILITY TESTING
Yeast infections are an increasingly important problem and the recognition of antifungal resistance stresses the need for improved susceptibility testing. Antifungal susceptibility testing has lacked reproductibility because of the absence of universally accepted guidelines. The major sources of variation in susceptibility testing have been attributed to the choice of medium and pH, inoculum prepm'ation and size, incubation temperature and time, and end-point criteria. These parameters have been addressed by the National Commmittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) and proposed guidelines have recently been published (M27- P). Although major advances in fungal susceptibility testing have been achieved, the results of studies to date do not support a correlation between the results of in vitro susceptibility testing and in vivo response. Routine antifungal susceptibility testing of yeasts should therefore be discouraged. Susceptibifity testing of the filamentous fungi is currently poorly developed. Key-words : Antifungal susceptibility - Yeasts - Molds - In vivo-in vitro correlation.
REFERENCES 1. 2.
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Analyse critique des tests de sensibilit6 in vitro aux antifongiques* A. D A T R Y * * , J. C A R R I E R E * * , M . L E P I T R E * * , H. G R O U S S I N * * , C. S I L B E R S T I E N * *
et M . D A N I S * *
RESUME
L'ascension croissante des infections fongiques, surtout ?~levures, avec en parall61e une augmentation de plus en plus nombreuse des r6sistances aux antifongiques a n6cessit6 la mise en place de tests antifongiques fiables.Les tests de sensibilit6 des levures aux antifongiques ont montr6 un d6faut de reproductibilit6 dfi h l'absence de directives universellement admises. Les sources majeures de variation des tests de sensibilit6 sont dues au choix du milieu et de son pH, h la pr6paration et ?~la taille de l'inoculum, h la temp6rature et au temps d'incubation et ?al'6valuation du point final. Ces diff6rents param~tres ont 6t6 soumis au "National Committee for Clinical Laboratory Standards" (NCCLS) qui a pu proposer un test de r6f6rence (M27.P). Bien que des progr6s majeurs et des adaptations h la m6thode standard aient 6t6 r6alis6s, il n'existe pas encore ?~ce jour une bonne corr61ation entre les r6sultats in vitro et les r6ponses in vivo. Ces tests ne peuvent donc pas &re utilis6s en microbiologie clinique. Quant aux tests concernant les champignons filamenteux, ils n'en sont qu'~t leur balbutiement. Mots-cl6s : Tests de sensibilit6 aux antifongiques - Levures - Moisissures - Correlation in vivo - in vitro.
Ces 20 derni6res ann6es sont le t6moin de progr~s majeurs concernant le diagnostic et le traitement des maladies fongiques. L'utilisation large de traitements cytotoxiques et immunosuppresseurs, de la corticoth6rapie, des cath6ters, des antibiotiques ~t large spectre, l'utilisation de mat6riels implantables et la pratique des greffes d'organes ont provoqu6 une explosion de pathologies iatrogSnes, surtout ?~l'h6pital. La cons6quence est l'6mergence d'une population aux d6fenses immunitaires amoindries, mais avec une esp6rance de vie prolong6e. ParallSlement la litt6rature collige un nombre croissant d'infections fongiques nosocomiales. Ces infections s6v~res sont rapidement 6volutives, de diagnostic difficile et peu sensibles aux antifongiques actuels. Beck-Sagu6 et coll. (1993) d6nombrent en 10 ans 30 477 infections fongiques nosocomiales dont le taux passe de 2 ?~3,8 infections pour 1 000 patients hospitalis6s : Candida sp. 78,3 %, Torulopsis glabrata 7,3 % et Aspergillus sp. 1,3 % (4).
Par ailleurs, l'arriv6e bruyante du virus de l'immunod6ficience humaine (VIH) a entraln6 une explosion d'infections opportunistes h majorit6 fongique (90 % de candidoses oropharyng6es, 5-30 % de cryptococcoses, depuis peu les aspergilloses). Cette croissance alarmante des infections fongiques s'est accompagn6e du d6veloppement de nouvelles drogues, moins toxiques et pouvant 8tre une alternative ~t l'amphot6ricine B e t ~t la flucytosine, telles le fluconazole, l'itraconazole et les formulations vari6es d'amphot6ricine B - lipides. Les choix th6rapeutiques sont donc plus nombreux, mais rendus difficiles par les r6sistances de plus en plus nombreuses 7t un ou plusieurs agents antifongiques. Ces r6sistances n'6tant pas toujours bien contr616es, la disponibilit6 de tests antifongiques fiables s'av6re indispensable. Mais, malheureusement, ils n'en sont qu'h leur balbutiement. De multiples m6thodes ont 6t6 utilis6es, mais sans aucune standardisation et les r6sultats peu er6dibles obtenus, sont sous la d6pendance de facteurs divers : pH, taille de l'inoculum, mileu liquide ou solide, formulation du milieu, dur6e et temp6rature de l'incubation. Une CMI d6termin6e pour un isolat est
* 2e Journ6e de PathologieInfectieuseet Tropicale de Paris-Nord, CREPIT 93, Bobigny, 16 septembre 1994. ** Service de Parasitologie-Mycologie,CHU Piti6-Salp&riSre F-75013 - Paris.
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d'interprdtation difficile. Par ailleurs, certains auteurs ont montr6 des corrtlations in vivo - in vitro avec des modSles animaux ou des isolats de patients (1, 6, 13) et d'autres non (8, 17). Cette situation est manifestement insatisfaisante et des travanx 6normes ont 6t6 entrepris pour rtsoudre ces difficultts. La solution iddale est toujours ~t trouver, mais des progrts considtrables ont 6t6 rtalisds.
rature et de la durte d'incubation. La zone d'inhibition est patrols difficile ?a interprtter et les CMI tendent 8tre plus basses qu'en milieu liquide (7, 28, 29, 33, 40), les proprittts physico-chimiques des antifongiques et leur interaction avec l'agar doivent &re prises en compte. Le milieu agar est mal dtfini et sa composition varie entre les difftrents fournisseurs. L'amB et les azo16s tendent h se dtttriorer quand ils sont stockts sous forme dilute ou s~che dans les disques. Certains azolts insolubles diffusent mal sur agar (23, 50, 55). Certaines esp~ces de Candida, autres que C. albicans ont une croissance inhibte sur agar (12). Cependant des tests reproductibles sont mis au point sur agar permettant de dtterminer les rdsistances ~t 1' araB (57).
HISTORIQUE La ntcessit6 d'antifongigrammes est une prtoccupation rtcente. L'amphottricine B (araB) est n6e vers 1950, seul antifongique disponible jusqu'~ 1' arrivte de la flucytosine (5FC) en 1971, suivie par le miconazole (mic) en 1978, du kttoconazole (ktto)en 1981 et plus rtcemment (1990) du fluconazole (flu) et de l'itraconazole (itra). Tester la sensibilit6 7t la seule amB n'avait pas de sens, mSme si la drogue semblait ne pas agir sur l'infection. Cette ntcessit6 est apparue avec la naissance de la 5 FC et l'apparition de r6sistances croissantes aux antifongiques.
Les mtthodes de dilution largement utilistes aux USA ont 6t6 stlectionntes par le sous-comit6 des tests de sensibilit6 aux antifongiques du NCCLS. De nombreuses 6tudes multicentriques ont permis d'identifier les probltmes inhtrant ~tcette technique et une mEthode standard a pu 8tre proposte par le NCCLS pour tester exclusivement Candida sp. et Cryptococcus neoformans. Des mtthodes reproductibles pour les autres organismes sont toujours en dtveloppement.
Au dtpart, seuls de rares laboratoires pratiquent ces tests et les rtsultats interlaboratoires sont tr~s disparates. Galgiani et coll. (1987) rapportent une 6tude portant sur des tests de sensibilit6 de Candida rtalists par 3 laboratoires contre l'amB, la 5FC et le ktto. Aucune mtthodologie n'est indiqu6e. Alors que les CMI interlaboratoires varient de 50 000 lois, les rtsultats obtenus ~t l'inttrieur d'un mSme laboratoire varient peu (19).
FACTEURS I N F L U E N C A N T LES TESTS DE SENSIBILITE AUX A N T I F O N G I Q U E S (38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51) Dtfinition du point final
La dttermination du point final est la source la plus significative de variations interlaboratoires pour les azo16s et la 5FC. Espinel-Ingroff,(1992) et Fromtling, (1993) montrent que "la dtcroissance prononcte de la turbidit6 par rapport au ttmoin", soit une inhibition de 80 % de la croissance fongique, donne une dttermination du point final la plus reproductible et la plus concordante avec les modules in vivo (15, 16, 17, 18). La spectrophotomttrie permet de dtterminer la mrbidit6 (2, 3, 4, 5) dliminant la dtpendance avec l'inoculum, mais ntcessite un 6quipement sptcifique.
I1 apparait clairement que des techniques standards et reproductibles sont indispensables pour la pratique de ces tests. De nombreuses approches sont r6alistes, sans qu' ancune ne se prSte h la standardisation : la mesure du taux d'61ongation des tubes germinatifs est fastidieuse et seulement valable pour C. albicans (33, 58), les mesures de mttabolites radiolabiles ou la rtduction de substrats color6s utilis6es pour C. albicans, Aspergillus fumigatus... (11, 20) ntcessitent un appareillage sophistiqu6 et un inoculum important, les mtthodes utilisant la cytom6trie de flux ou le comptage des colonies viables sont peu appliquables (41, 49), la mesure de la masse biologique pax spectrophotomttrie (49) permet le calcul d'un facteur d'inhibition relative, mais la lourdeur de l'6quipement a limit6 son dtveloppement, - les techniques qui utilisent l'agar sont largement utilistes car simples, 6conomiques et de rtalisation ais6e pour un grand nombre d'organismes. Mais, elles ddpendent 6troitement de la taille de l'inoculum, de la tempt-
Taille de l'inoculum
Les CMI varient avec la taille de l'inoculum (> ~t 512 fois) (7, 22, 37, 40). L'usage d'un petit inoculum de l'ordre de 0,5 x 103 h 2,5 x 103/ml montre le plus de corrtlation inter-laboratoire. Prtparation de l'inoculum
Pfaller et coll. (1988), comparent quatre techniques de prtparation d'inoculum et montrent que la spectophotom6trie est la plus standardisable (42). 7
Dur6e et temp6rature d'incubation
RESULTATS OBTENUS AVEC LA METHODE DE REFERENCE PROPOSEE PAR LE NCCLS
Bien que cet effet soit variable d'une drogue ~t l'autre, les CMI tendent ~t augmenter avec l'allongement de la p6riode d'incubation (7) et restent stables pendant quatre jours (40). Une 6tude multicentrique rapport6e par Fromtling et coll. (1993) et concernant 13 laboratoires montre que les tests de sensibilit6 ~t l'amB, au k6to et ~t la 5FC en milieu RPMI 1640 ~t 35 ° C donnent les r6sultats les plus uniformes apr~s incubation ~t 35°C pendant 48 h pour Candida sp. ou 72 h pour C. neoforroans. Dans les 2 cas, les temps de lecture correspondent au second jour pour lequel la croissance est facilement apparente par rapport au t6moin libre de drogue (18).
Fromtling et coll. (1993) et Espinel-Ingroff et coll. (1992) rapportent les r6sutats de 2 6tudes multicentriques majeures. Ces deux 6tudes pr6sentent des similitudes. Dans l'6tude de Fromtling, 35 souches de C. albicans, 5 de C. glabrata, 10 de C. lusitianae, 10 de C. tropicalis, 15 de C. neoformans sont 6tudides par 13 laboratoires diff6rents pour tester la sensibilit6 ~t l'amB, ~t la 5FC et au k6to alors que Espinel-Ingroff (15) fait tester les mames isolats par 5 des 13 laboratoires avec en plus le flu (15, 18). Le choix de l'inoculum de 0,5 x 103 ~t 2,5 X 103/ml, le point final correspondant ~t l'inhibition de 80 % de la croissance fongique, la lecture ~ 48 h pour Candida sp et a 72 h pour C. neoformans ont donn6 une corr61ation inter-laboratoire optimale (le r6sultat devant se trouver l'intdrieur d'une dilution). Les corr61ations inter-laboratoires obtenues sont de 90 % pour l'amB, de 85 % pour la 5FC, de 88 % pour le flu et de 75 % pour le kdto. I1 est clair que cet ordre de valeur pour la reproductibilit6 d6pend de la drogue test6e et non du syst6me utilis6.
Le milieu Quand des milieux de composition ind6termin6e (agar Sabouraud), sont compar6s avec un milieu totalement synth6tique, le S A A M F (Synthetic Amino Acid Medium Fungal), des diff6rences consid6rables des valeurs de CMI sont observ6es avec la 5FC et dues ~tun antagonisme de la 5FC avec les purines et les pyrimidines du milieu (48). Les st6rols du milieu peuvent interf6rer sur les polyanes et d'autres facteurs encore ind6termin6s semblent interf6rer avec les azol6s (40).
Cette m6thode r6vble une gamme &endue de CMI pour la 5FC (0,125 ~t 64 pg/ml, le k6to (0,03 ?~2 ~tg/ml), le flu (0,12 ~ 64 pg/ml), mais pas pour l'amB (0,25 ?~ 1 pg/ml). Ces r6sultats sont obtenus malgr6 l'inclusion de plusieurs isolats de C. lusitianae pour lesquels des CMI 61ev6es sur milieu agar sont connues en cas de r6sistance ~t l'amB (25). Ces donn6es sugg~rent que soit il n'existe pas de rdsistance dans les souches test6es de C. lusitianae, soit cette m6thode est relativement insensible pour la ddtection des r6sistances ~ l'amB. Le milieu pH = 7 MOPS - yeast nitrogen base est (YNB) pr6f6rable au RPMI 1640 pour tester la sensibilit6 de C. neoformans ~ l'amB (22).
L'utilisation du MOPS-tris (acide morpholine-propanesulfonique) comme tampon dans le S A A M F inhibe l'action de la 5FC, en dehors de son action sur le pH (8). Tousles milieux n'ont pas le mame pH et la croissance d'un organisme test6 peut en ~tre affectde. Ainsi, des conditions acides entra~nent une augmentation des CMI d' amB, du fluco, du k6to, du mico, mais abaissent celles de la 5FC (14, 53). L'insolubilit6 de quelques compos6s peut ~tre aussi source de difficult6s. Ainsi, il est important que les diff6rentes dilutions soient effectu6es dans des solutions ad6quates 6vitant la pr6cipitation des principes actifs (47). Ainsi, le NCCLS sugg~re que l'amB et le k6to soient dissouts dans le dim6thyl sulfoxid e (DMSO).
Ainsi ces observations permettent de conclure que la m6thode proposde par le NCCLS n'est pas adapt6e ~ la d6tection des rdsistances h 1' amB et des am6nagements sont n6cessaires pour all6ger la mdthode de macrodilution.
Sur la base de ces donn6es, le NCCLS propose un milieu synth6tique RPMI 1640 tamponn6 ?~pH 7,0 par le MOPS. Le RPMI 1640 est facilement disponible dans le commerce et relativement bon march& Des r6sultats similaires peuvent &re obtenus avec d'autres milieux, comme le milieu synth6tique HR (43). Le milieu de Casitone repr6sente 6galement une bonne alternative pour 6valuer la sensibilit6 des levures au flu, quoique pour C. tropicalis et C. glabrata les CMI sont plus 61ev6es (16).
NOUVELLES ADAPTATIONS DE LA METHODE DE REFERENCE L'utilisation de la m~me m6thode en microdilution donnerait des r6sultats comparables (15). Le E test (test de diffusion en milieu agar) de maniabilit6 tout ?~fait ais6e donne des r6sultats encourageants comparativement aux m6thodes de macrodilution et de microdilution (56).
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Le milieu liquide antibiotique 3 tamponn6 ~ pH 5 ou 7 donne des r6sultats sup6rieurs et d6tecte r6ellement les isolats de Candida sp. r6sistants ~tl'amB (52).
facilement comptables. Cependant, dans les formes invasives, il existe une forme filamenteuse qui ne peut atre compt6e avec pr6cision ~t cause de l'adh6rence rapide des hyphes aux surfaces. En raison de ces difficult6s, de nombreuses 6tudes sur les moisissures publi6es ?~ce jour ont d6but6 avec un inoculum de conidies et sont 6valu6es sur la pr6sence ou l'absence de croissance des hyphes (10, 50, 26).
La m6thode prdconis6e par le NCCLS paraissant fastidieuse, lourde et r6serv6e ~ certaines 6quipes en recherche, Hacek (1995) apporte des modifications pour qu'elle puisse ~tre adopt6e par les laboratoires de microbiologie clinique. Deux milieux de culture sont utilisds sur plaque de microtitration, le RPMI 1640 et le EMEM (Eagle's minimum essentiel medium) et deux temp6ratures d'incubation sont test6es 30°C et 35°C. L'EMEM est en particulier s61ectionn6 car il permet la croissance des champignons filamenteux et am61iore la croissance de C. neoformans et de C. guillermondii. Par ailleurs des corr6lations in vivo - in vitro ont pu &re r6alis6es prouvant l'exactitude de ce proc6d6 (27).
Un d6faut de croissance dans de telles 6tudes peut &re dfi ~t l'inhibition de la germination plut6t qu'g celle de l'hyphe et il n'est pas certain que de telles approches corr61eraient avec la r6ponse clinique. Les tests de sensibilit6 aux Aspergillus sont revus r6cemment (10); un proc6d6 reproductible s'avbre difficile et semble li6 ?~ l'utilisation de conidies(15,36). Le Pitre (SFMM, Angers 1995) 6value un nouvel antifongigramme pour l'6tude de la sensibilit6 des Aspergillus sp 5 l'itra et ~ l'amB. I1 s'agit de d6terminer la CMI des antifongiques sur Aspergillus sp. par l'emploi de bandelettes de plastiques contenant un gradient exponentiel d'itra et d'amB (E-test). Les r6sultats pr61iminaires compar6s ~t ceux obtenus en m6thode de microdilution sont prometteurs (34).
Les m6thodes de microdilution qui utilisent une m6thode visuelle sous agitation ou la spectrophotom6trie pour d6finir le point final sont comparables (46). Les tests de sensibilit6 utilisant un r6actif colorim6trique, tel que le bleu Alamar, clarifient nettement le point final et ont une excellente corr61ation ax~ec les tests pr6conisds par le NCCLS pour l'amB, la 5FC, le flu (45) mais pas pour l'itra (60).
De m4me que pour C. albicans, il est possible de r6aliser des tests de sensibilit6 sur Aspergillus sp. en mesurant la respiration mitochondriale par la d6termination de la r6duction du MTT en formazan (32).
Une m6thode de microtitration pour d6terminer la sensibilit6 de C. albicans ~ l'amB, au flu et ~t l'itra est bas6e sur la mesure de la respiration mitochondriale en d6terminant la r6duction du 3- (4,5 dimethyl -2-thiazolyl) - 2,5 - diphenyl - 2H- tetrazolium bromide (MTT) en formazan, processus qui est accru en pr6sence de menadione. Les r6sultats concordent parfaitement avec les CMI obtenues en m6thodes de macrodilution standard. Cette 6tude confirme 6galement que le flu est incapable d'induire son action fongistatique sur une souche sensible de C. albicans en pr6sence de s 6 r u m (32).
C O R R E L A T I O N E N T R E LES TESTS I N VITRO ET LES RESISTANCES IN VIVO La n6cessit6 d'un test de sensibilit6 reproductible n' est n6cessaire que s'il existe une r6sistance clinique et si elle peut ~tre pr6vue par ce test.
Etudes animales Les relations entre les r6sistances in vitro et l'efficacit6 in vivo pour les poly6nes sont 6tudi6es sur un grand nombre de modOles animaux. Les CMI obtenues en microdilution sur milieu liquide produisent une excellente corr61ation avec l'amB et la namycine alors que les CML obtenues en microm6thode liquide et sur diffusion en agar sont moins pr6dictives et tendent ~ classer incorrectement les isolats (39). Des r6sultats similaires sont obtenus sur un module souris IV (1).
AUTRES ORGANISMES Tester les organismes autres que Candida sp. et C. neoformans pose une s6rie de probl6mes. Les champignons dimorphiques existent dans la nature sous forme illamenteuse et sous forme levure chez l'homme infect& Des pr6cautions sp6ciales sont requises au laboratoire et la technique devrait ~tre modifi6e pour s'accomrnoder la croissance lente de ces microorganismes (9, 19).
Une autre 6tude ofJ 40 isolats sont test6s d6montre une corr61ation statistique 6vidente, mais malheureusement il existe un recouvrement important entre les doses requises de 5FC pour contr61er l'infection caus6e par les
Les champignons filamenteux comme Aspergillusfumigatus pr6sentent des probl6mes diff6rents. Ces organismes poss6dent des conidies rondes, petites,
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isolats ~t CMI basses de 5FC par rapport ~tceux avec des CMI 61eyries. Ainsi, il n'existe pas de limites nettes entre les souches sensibles et r6sistantes. I1 est conclu que ces isolats ne contenaient pas un sous-ensemble distinct d'isolats r6sistants, mais 6taient plut6t compos6s d'un groupe de sous-isolats avec un spectre continu de sensibilit6 (59). Un nombre d'6tudes plus important est fait avec les azol6s. I1 en r6sulte : - le degr6 de corr61ation d6pend de la technique in vitro utilis6e. Deux isolats r6sistants au k6to sont 6tudi6s chez deux patients et trois modules animaux diff6rents. Les isolats se sont r6v616s r6sistants par deux m6thodes sur milieu liquide et deux m6thodes de diffusion en agar, mais par une m6thode de diffution sur agar les CMI pour les isolats sont identiques aux isolats t6moins (54); - le test in vitro peut montrer des diff6rences pr6dictives entre les isolats. Trois isolats de Candida sp. ont des CMI au fluco > 100 jag/ml. Le flu est actif in vivo sur deux de ces trois isolats. Sans aucune diff6rence de CMI, il n'est pas possible de discerner une corr61ation. Donc, un chiffre 61ev6 de CMI n'implique pas obligatoirement une r6sistance in vivo. I1 est clair que des variations techniques peuvent ~tre manipul6es pour produire des CMI d'un ordre d6sir6 (17); - l'interpr6tation des r6sultats doit tenir compte de la pharmacologie de la drogue. Deux isolats de C. albicans ont des CMI du flu et du k6to basse pour l'une et 61ev6e pour l'autre. Le flu est effectif pour l'isolat ~t CMI basse, mais pas pour l'autre. Malgr6 une CMI 16 fois plus basse que le flu contre l'isolat sensible, le k6to s'est montr6 ineffectif dans le module d'infection IV (53). Ces diff6rences pourraient &re dues g u n portage plus important par les prot6ines et ~ une demi-vie plus courte du k6to. Le rein 6tant le premier organe cible dans ce module exp6rimental, le fait que le flu soit concentr6 et excr6t6 dans l'urine alors que le k6to ne l'est pas, est aussi important. D~monstration clinique de la r~sistance primaire et acquise La r6sistance aux poly~nes est dite rare, mais son incidence exacte est difficile ~t d6terminer. Hughes et coll. (ICAAC, 1992), 6tudient 60 isolats de Candida sp. provenant d'h6mocultures pour leur sensibilit6 ~t l'amB par une m6thode en milieu R P M I 1640 avec 5 x 104 levures/ml ~ 37 ° x 48 h d'incubation. Alors que les CMI pour tous les isolats sont de 0,5 ~ 2 tag/ml, celles pour C. parapsilosis sont de 1 h 2 ~tg/ml et celles pour C. albicans de 0,5 ~ 1 ~tg/ml. Malgr6 la baisse des sen-
sibilit6s pour C. parapsilosis, les patients infect6s par ces levures ont un pourcentage plus important de gu6rison (31). I1 est difficile d'interpr6ter ces donn6es contradictoires sur la r6sistance aux poly~nes. Bien que les CMI d'amB ne semblent pas augmenter en cours de traitement, les micro-organismes les plus r6sistants peuvent atre moins virulents, et il est souvent difficile de d6crire un r6el 6chec fi la drogue &ant donn6 l'existence de d6ficits multiples du syst~me immunitaire chez ces patients. La 5FC est rarement utilis6e en monoth6rapie pour traiter les patients malgr6 une efficacit6 d6montr6e sur module animal. Ainsi, des cas bien structur6s d6crivant une relation in vivo-in vitro ne sont pas disponibles. Les r6sistances aux azol6s sont en revanche largement d6crites. Trois isolats de C. albicans provenant d'6chec clinique apr6s une cure prolong6e de k6to chez des patients atteints de candidose mucocutan6e chronique et un isolat provenant d'un patient n'ayant jamais gu6ri sont test6s (30, 58). Ces isolats de C. albicans sont clairement plus r6sistants au k6to par de multiples techniques. Trois des quatre isolats montrent une r6sistance crois6e avec le mico, le k6to, le fluco et l'itra. Deux des isolats se sont montr6s plus r6sistants sur mod61es animaux. I1 est int6ressant d'observer qu'un plus grand inoculum d'isolat r6sistant 6tait n6cessaire pour produire une infection, impliquant donc une virulence plus faible. Cette baisse de virulence n'est pas unanime. Ainsi, d' autres auteurs testent un isolat r6sistant sur un module rat et traitent par le flu; l'inoculum requis est identique ~ celui n6cessaire pour traiter une souche sensible (37). Comme pour le k6to, des r6sistances cliniques au flu sont apparues et l'6tude des isolats de C. albicans a montr6 une relative r6sistance in vitro. Quatre isolats de C. albicans de patients infect6s par le VIH pr6sentent une r6sistance clinique au flu. Les CMI des isolats d6termin6es par une m6thode sur milieu liquide non sp6cifique sont quatre fois plus 61ev6es que celles des t6moins (61). Les isolats r6sistants semblent moins virulents sur un module rat (13). D'un int6r~t particulier sont les 6tudes qui rapportent des 6checs prophylactiques et th6rapeutiques du flu contre C. kruzei. Dans une 6tude r6trospective portant sur 463 greff6s de moelle ou leuc6miques, il existe une incidence 7 lois plus 61ev6e de C. krusei (8,3 versus 1,2) chez 84 patients qui ont requ une prophylaxie au flu par rapport ?~355 patients qui ont requ du k6to, du mico, de l'amB ou rien (62). Alors que des CMI de flu sur
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C. kruzei sont dites augmenttes par certains auteurs, seul un rapport comparant les CMI du flu sur C. krusei celles d' autres esptces de Candida dtmontre des CMI plus 61evtes pour C. kruzei (35).
concentration critique par la mtthode proposte par le NCCLS n'est pas disponible et il n'est pas raisonnable de choisir arbitrairement des concentrations critiques sur la base des concentrations striques attendues d'un antifongique. Bien que la rtpttition des CMI durant un traitement antifongique au long cours puisse montrer leur 616vation et suggtrer une rtsistance, la rtponse clinique plus que les rtsultats des tests de sensibilit6 reste le guide le plus fiable pour la conduite thtrapeutique ce jour.
Par ailleurs, nous avons rtalis6 une 6tude r6trospective de la sensibilit6 h l'amB et au flu de 108 souches de C. neoformans chez 61 patients. La corrtlation entre l'efficacit6 clinique et la sensibilit6 in vitro est tr~s mauvalse sans qu' aucune explication ne puisse atre avancte
(24). CONCLUSION
Des techniques de biologie moltculaire ne semblent pas non plus adapttes ~t la dttection des rtsistances acquises au flu (3).
Les tests de sensibilit6 aux antifongiques sont prometteurs, du moins en ce qui concerne Candida sp et C. neoformans, mais restent toujours un outil de recherche. L'information exigte pour dtterminer la
Enfin quelques rtsultats prometteurs ont vu le jour ces derniers mois pour les tests de sensiblit6 des filamenteux mais les travaux actuels en sont toujours ~t leur balbutiement (34).
SUMMARY
CRITICAL ANALYSIS OF ANTIFUNGAL SUSCEPTIBILITY TESTING
Yeast infections are an increasingly important problem and the recognition of antifungal resistance stresses the need for improved susceptibility testing. Antifungal susceptibility testing has lacked reproductibility because of the absence of universally accepted guidelines. The major sources of variation in susceptibility testing have been attributed to the choice of medium and pH, inoculum prepm'ation and size, incubation temperature and time, and end-point criteria. These parameters have been addressed by the National Commmittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) and proposed guidelines have recently been published (M27- P). Although major advances in fungal susceptibility testing have been achieved, the results of studies to date do not support a correlation between the results of in vitro susceptibility testing and in vivo response. Routine antifungal susceptibility testing of yeasts should therefore be discouraged. Susceptibifity testing of the filamentous fungi is currently poorly developed. Key-words : Antifungal susceptibility - Yeasts - Molds - In vivo-in vitro correlation.
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