Applications des anticorps anti-médicaments

ANALYSES PROSPECTIVES - REVUES GENERALES

Applications des anticorps anti-m6dicaments J. H o e b e k e Laboratoire d e Biologie Mol6culaire des R6cepteurs, D(~partement de Biotechnologie Institut Pasteur - 28, rue du Dr Roux 75724 Paris c e d e x 15

Introduction Depuis I'introduction par Spector et Parker [22] du dosage radio-immunologique de la morphine, I'utilisation des anticorps en pharmacocin~tique et en toxicoIogie a pris une grande ampleur. En effet les dosages radio-immunologiques ou immuno-enzymatiques peuvent associer une grande sp~cificite et une tr~s forte sensibilitY. Deux revues r~centes [3, 9] d6crivent le mode de production des anticorps monoclonaux, leur utilisation et leur int~r~t dans le dosage immunologique des m6dicaments. De ce fait, cette revue mettra I'accent sur certaines applications moins connues des anticorps monoclonaux dirig~s contre les m~dicaments : I'utilisation en tant qu'agents d~toxifiants, ta recherche des molecules endog~nes correspondant aux molecules m~dicamenteuses de synth~se, enfin I'~tude des macromolecules qui sont la cible des m~dicaments,

La d6toxification De la m~me fagon que les antiserums contre les venins et les toxines, les anticorps anti-m~dicaments peuvent ~tre utilis6s pour neutraliser un surdosage toxique de ces derniers. Une restriction s'impose n6anmoins : la d~toxification in vivo ne peut se faire que pour des drogues se caract6risant par une LD50 [dose provoquant 50 % de mortalit6 dans des animaux trait6s] tr~s faible. En effet, puisque le rapport entre le poids mol~culaire de la fraction Fab [ie fragment poss~dant le site de liaison] d'une immunoglobuline [50,000 daltons] et une molecule pharmacologique [de 300 ~ I 000 daltons] est de.50 (~ 150, 1 mg de drogue n~cessite 50 (~ 150 mg de Fab pour ~tre neutralis~e. La d~toxification immunologique est donc th~oriquement limit~e ~ des substances qui sont toxiques (~ des doses inf~rieures 6 5 mg/kg. L'exemple le mieux ~tudi~ de d~toxification estta r~versibilit~ d'une intoxication I~tale par la digoxine ~ I'aide de fragments Fab d'anticorps anti-digoxine [2 t ]. Le fait de remplacer les fragments Fab d'anticorps polyclonaux de lapin par des fragments Fab d'anticorps monoclonaux de souris [t3] permet I'emploi d'un r~actif

immunologique compl~tement caract~ris~ quant ~ sa stabilit6 et 6 ses propri6t6s de liaison. En outre, il est envisageable de produire un fragment Fv, compos6 uniquement d e la partie variable des cha~nes Iourdes et 16g6res [23,000 daltons], soit par prot6olyse dirig6e (~ partir de I'anticorps monoclonal purifi~, soit par g6nie g~n6tique ~ partir des g~nes codant pour les parties variables de I'anticorps. A cause de sa plus petite taille, le fragment Fv serait mieux to16r6 Iors de I'injection intraveineuse et mieux 61imin6 par voie urinaire. Un autre essai de d6toxification immunologique a permis d'~largir son domaine d'application ~ des substances toxiques dont le site d'action est intracellulaire comme la colchicine [19]. Les exp6riences d6crites au cours de cet essai d6montrent que la limite de capacit~ de neutralisation de la colchicine se situe ~ 3 mg/kg, ce qui correspond aux limites mentionn6es plus haut. Enfin, il est possible d'envisager la d6toxification de substances toxiques contenues dans les aliments par immuno-adsorption sur des anticorps immobilis6s sur un substrat solide. Ainsi Kaveri et al. [12] ont d~montr~ qu'ils pouvaient ~liminer compl~tement les aflatoxines contaminant le lait par un immuno-adsorbant pr~par~ en couplant un anticorps monoclonat anti-aflatoxine (~ I'Uttrogel AcA22 activ~ par la glutarald~hyde.

Caract~risation d'agents pharmacologiques endog(~nes L'existence de r6cepteurs pharmacologiques, qui reconnaissent d'une mani~re hautement sp~cifique des mol6cules synth~tiques n'ayant, de prime abord, aucune analogie structurale avec les hormones ou les neurotransmetteurs, pose le probl~me de I'existence de mol6cules endog~nes ayant les m~mes propri~t~s pharmacologiques que les mol6cules synth~tiques. La d~couverte des enc6phalines [I t] ayant une activit6 morphinique a donn~ un nouvel essor ~ la recherche de ces molecules endog~nes. Une des approches possibles de cette recherche se base sur I'existence d e r~actions crois6es entre molecules endog~nes et molecules pharmacologiques vis-(~-vis des anticorps antim~dicaments. Le succ~s de cette approche est illustr~

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par la caract~risation de la cardiodigine, un inhibiteur endog~ne de I'ATPase Na +, K+ d~pendante et d'une benzodiaz~pine endog~ne, isol~e du cerveau, L'intuition g~niale de Szent-Gyorgy [23] que les ~ glycosides digitaliques ne sont pas des drogues mais qu'ils se substituent (~ une vis manquant ~ notre machinerie, ayant un r61e essentiel dans des r~gulations physiologiques fondamentales ~, s'est av~r~ ~tre exacte apr~s I'isolement, ~ partir d'homog~nats de cceurs de cobaye, d'une substance non peptidique, qui ales caract6ristiques pharmacologiques des glycosides digitaliques [6]. L'existence d'une r~action crois~e de la cardiodigine avec des anticorps anti-digitoxine a sugg~r~ que cette molecule a au moins certains d6terminants structuraux communs avec la digitoxine. La comparaison d e la r6action crois~e de la cardiodigine avec certains anticorps sp~cifiques de la digitoxine d'une part et d'autres sp~cifiques de la digoxine d'autre part indique que celte molecule se rapproche plut6t de la digoxine mais que, malgr~ I'existence de propri~t~s biologiques et immunologiques communes, elle est diff~rente des glycosides digitaliques [51,

des substances qui inhibent la liaison des benzodi, pines radiomarqu6es sur leurs r6cepteurs sp6cifiq et cette inhibition est modifi6e par la presence de I'a( -y-aminobutyrique, le neurotransmetteur connu r~cepteurs aux benzodiaz6pines ['17], La purification de la substance inhibitrice et sa cat t6risation par spectrographie de masse ont mol qu'elle correspond ~ la N-desmethyldiazepam, un, m6tabolites des benzodiaz6pines [Figure 2]. L'origine cette molecule dans le cerveau n'a pas ~t~ enc d~finie. II pourrait s'agir de la concentration IocaD d'un m~tabolite de drogues couramment utilis6s th~rapie humaine et v~f6rinaire. N6anmoins, la I~ sence de cette molecule dans des cerveaux humai datant de 1940, semble aller contre cette hypoth~ puisque la premiere molecule d e benzodiaz~pi synth6tique ne date que de t955. La pr6sence benzodiaz6pines dans une esp~ce de Penicillium SL g6re que cette substance psychotrope pourrait d'origine alimentaire, L'utilisation ofiginale des anticol anti-benzodiaz~pine ouvre donc de nouvelles perspE tives dans l a r6gulation du psychisme humain par s, environnement,

L'analyse chimique de substances endog~nes ~ effef digitalique a montr~ qu'elles appartiennent au groupe des lignanes des mammif~res [Figure I]. Ces molecules ont certaines analogies structurales avec les glycosides digitaliques, expliquant la r~action crois~e avec certains anticorps anti-digoxine [1]. Ainsi I'approche immunologique au moyen d'anticorps anti-digoxine a permis de faire progresser I'~tude structurale d'un nouveau groupe de molecules pharmacologiques. :. Le deuxi~me exemple de I'utilisation des antioorps monoclonaux anti-m~dicaments a ~t~ la d~couverte insolite du N-methyldiazepam dans les cerveaux bovins et humains [18]. Un anticorps monoclonal dirig~ sp~cifiquement contre les agonistes du r~cepteur des benzodiaz~pines a ~t~ utilis~ pour fabriquer un immuno-adsorbant sur lequel ont ~t~ incubus des homog~nats de cerveau, Apr~s lavage, I'~luat acide de cet immuno-adsorbant contient

ModUles de r6cepteurs pharmacologiques L'induction d'anticorps reconnaissant des agents phc macologiques a rapidement conduit ~ I'hypoth~ que ces anticorps peuvent partager des propri~t~ tonctionnelles et structurales avec les r6cepteurs men branaires, responsables de la reconnaissance de c~ m~mes agents au niveau cellulaire, Puisqu'il est pl~ facile d'obtenir de grandes quantit6s d'antioorps monc clonaux que de purifier des r~cepteurs membranaire qui ne sont pr6sents sur les membranes plasmiques qu'( des concentrations tr~s faibles, les anticorps anti m~dicaments ont ~t6 6tudi6s en rant que modules de r6cepteurs membranaires. Un premier rapport dans ce sens a 6t~ publi6 d~s 197' par Van Vunakis et al. [261, indiquant qu'un anticorp,~

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DIGO~O~E

ENTEFIOLAG'TONE~(UG,~ANE)

Figure t Structure chimique de la digoxine et d'un lignane des mammif~res, I'ent~rolactone, qui pourrait 6tre un exemple d'une cardiodigine endeg~ne, [D'apr~s r6f. I].

CLONAZEPAM

N.DESMI~I'HyLDIAZEPAM

Figure 2 Structure ehimique du clonazepam, la benzodiazepine qui a ~t6 utilis6e comme hapt~ne et le N-desmethyldiazepam qui correspondraif la benzodiazepine endog~ne,

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polyclonal dirig~ contre la D-lysergamide reconna?t d'autres substances psychomim6tiques r~agissant avec le r6cepteur physiotogique d e ia di6thylamide d e I'acide lysergique (LSD]. L'hypoth~se que les auteurs ont a v a n c 6 e afin d'expliquer leurs r6sultats 6tait que I'anticorps fixait les molecules reconnues dans une conformation a n a l o g u e a celle n6cessaire a la reconnaissance du r~cepteur [26]. Quelques ann6es plus tard, il a ~t~ d6montr6 que des anticorps potyclonaux induits contre un antagoniste du r6cepteur ~-adr~nergique, I'alprenolol, semblaient reconna?tre non seulement les autres antagonistes /~-adr~nergiques d e ta classe des ph~noxypropylamines, mais ~galement les agonistes naturels d e ce r~cepteur c o m m e I'adr~naline et la noradr~naline [8 et 20]. La technologie des anticorps monoclonaux a permis d'approfondir nos connaissances sur les analogies qui existent entre les propri~t~s fonctionnelles des anticorps anti-m~dicaments et celles des r~cepteurs p h a r m a c o Iogiques correspondants. En effet, g r a c e a ta fusion somatique il devient possible d e s@ectionner I'anticorps monoctonal qui a l e s propri~t~s les plus proches d e celles du r~cepteur dont il est le mod~te. En outre, p a r le biais d e la g~n~tique mol~culaire, une comparaison peut ~tre faite entre les s~quences en acides amines qui sont impliqu~es dans la liaison du m ~ d i c a m e n t sur le recepteur et celles des parties hypervariables d e I'anticorps constituant le site d e liaison pour le m ~ m e m~dicament. Enfin, I'homog~n@t~ chimique des anticorps monoclonaux permet I'~tude physicochimique des m~canismes d'interaction entre le m ~ d i c a m e n t et le site d e liaison d e I'anticorps. Ainsi, parmi une batterie d'anticorps monoclonaux antialprenolol, celui qui a l e s propri~t~s d e liaison les plus similaires a celles du r~cepteur ~-adr~nergique a ~t~ choisi pour une ~tude plus a p p r o f o n d i e au niveau fonctionnel et structural [2]. Cet anticorps p a r t a g e une propri~t~ structurale int~ressante avec le r~cepteur /~-adr~nergique a savoir la pr~s~ence d'un tryptophane dans te site d e liaison. Bien que I'analyse g~n~tique ait pu Iocaliser c e tryptophane dans la troisi~me r~gion hypervariable d e la cha~ne Iourde d e I'anticorps [~ 6], aucune s~quence superposable n'a pu ~tre trouv~e dans la cha~ne p o l y p e p t i d i q u e du r~cepteur ~-adr~nergique.

structurale d e 1'6pitope reconnu par cet anticorps a permis d e d~finir une conformation particuli~re n6cessaire a la liaison des mot6cules tricycliques et qui correspond a celle d e la trans-doxepine [14]. Puisque les antid6presseurs tricycliques ont une activit6 pleiotrope au niveau du syst~me nerveux central, a savoir qu'its interragissent au niveau d e plusieurs sites d e liaison pour tes neurotransmetteurs, it 6tait int6ressant d e savoir si la conformation reconnue par un r~cepteur donn6 6tait particuli~re et sp6cifique pour un effet pharmacologique. A cet effet, une correlation a 6t6 recherch~e entre ies affinit~s relatives d e treize anti-d6presseurs tricycliques diff~rents pour l'anticorps monoclonal d'une part, et celles mesur©es pour un certain nombre d e sites r6cepteurs : sites d e r e c a p t a g e d e la s6rotonine et des monoamines, r6cepteurs histaminiques H I e t H2, r~cepteurs cholinergiques muscariniques, r6cepteurs c~-adr~nergiques et r6cepteurs pour tes opiac6es. Une seule corr@ation significative a 6t6 trouv~e, avec I'affinit~ a p p a r e n t e des anti-d6presseurs tricycliques pour le r6cepteur muscarinique d e I'ac6tylcholine. A la suite d e cette constatation il semblait Iogique d e verifier si I'anticorps monoclonal anti-nortriptyline avait 6galement une affinit6 pour les ligands antagonistes et agonistes muscariniques. Paradoxalement, aucune d e ces molecules n'inhibe la liaison d e la desm6thylimipramine radiomarqu~e sur I'anticorps. M~me ta pirenz~pine, une molecule tricyclique qui a une structure voisine d e celle des antid~presseurs tricycliques [Figure 3] mais qui a une acti o vit6 exclusivement cholinergique, n'est pas inhibitrice, Afin d'expliquer ces r6sultats a p p a r e m m e n t contradictoires une nouvetle hypoth~se a 6t6 6mise,

NORTRIFTYLINE

N~anmoins, I'existence d'anticorps anti-idiotypiques monoctonaux, reconnaissant des d~terminants antig~niques partag~s par I'anticorps anti-aiprenolol et par te r~cepteur /~-adr~nergique, indique que ces deux molecules ont des structures conformationnelles communes [7]. L'~tude physicochimique des m~canismes d'interaction entre I'alprenolol et I'anticorps monoclonal sugg~re que ces structures seraient induites par un c h a n g e m e n t d e conformation d e I'anticorps apr~s la fixation du ligand [~0], Une application directe du p a r t a g e potentiel des propri~t~s d e liaison entre un anticorps monoclonal antim ~ d i c a m e n t et un r~cepteur p h a r m a c o l o g i q u e est donn~e dans I'exemple suivant. Un anticorps monoclonal anti-nortriptyline [un antid~presseur tricyclique] a ~t~ produit pour la mise au point du d o s a g e immuno-enzymatique des antid~presseurs tricycliques dans ie s~rum [4]. L'analyse

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DOXEPINE

oA--KDQ PIRENZEPlNE

Figure 3 Structure chimique de la nortriptyline qui a ~t~ utilis6e comme hapt~ne pour la production de I'anticorps monoclonal contre les anti-d~presseurs tricycliques ; la doxepine dans laquelle I'introduction d'un atome d'oxyg~ne donne naissance a deux isom~res, ia cis-doxepine et la trans-doxepine ; la pirenz6pine, molecule tricyclique qui est exclusivement un antagoniste du r6cepteur muscarinique et qui n'est pas reconnue par I'anticorps monoclonal anti-norlriptyline.

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Les anti-d6presseurs tricycliques i n t e r a g i r a i e n t a v e c le r 6 c e p t e u r m u s c a r i n i q u e a u n i v e a u d'un site diff6rent d e celui qui lie agonistes et a n t a g o n i s t e s muscariniques. Cette h y p o t h 6 s e a 6t6 v6rifi6e en m o n t r a n t q u e I'inhibition d e la liaison des ligands muscariniques sur le r6cepteur m u s c a r i n i q u e p a r les anti-d6presseurstrycicliques est d e n a t u r e n o n - c o m p e t i t i v e [t5]. De plus, c e t t e inhibition n o n - c o m p 6 t i t i v e est e n c o r e possible apr6s solubilisation d u r ~ c e p t e u r p a r la digitonine. Ceci s u g g 6 r e q u e le site p o u r les anti-d~presseurs tricycliques fait p a r t i e i n t 6 g r a n t e soit du r~cepteur, soit du c o m p l e x e solubilis6,

Conclusion Dans cette b r 6 v e revue sur les applications des anticorps m o n o c l o n a u x a n t i - m 6 d i c a m e n t s , je m e suis efforc6 d e sortir des sentiers battus des d o s a g e s i m m u n o e n z y m a t i q u e s ou r a d i o - i m m u n o l o g i q u e s , J'esp6re q u e les nouvelles voies ouvertes inspireront le lecteur d a n s ses travaux d e recherche et qu'elles I'inciteront (~ d 6 c o u vrir d'autres a p p l i c a t i o n s , c o r r e s p o n d a n t ~ la g r a n d e diversit6 q u e la n a t u r e nous offre p a r I'interm6diaire d e la r 6 p o n s e i m m u n o l o g i q u e ,

Ainsi, I'analyse a p p r o f o n d i e des propri~t~s d e liaison d'un anticorps m o n o c l o n a l dirig6 contre les anti-d6presseurs tricycliques a permis d e pr~ciser le m 6 c a n i s m e d ' a c t i o n d e ces a g e n t s p h a r m a c o l o g i q u e s sur le r6cepteur m u s o a r i n i q u e d e I'ac6tylcholine,

Je r e m e r c i e le Dr S. M a r u l l o p o u r ses critiques pertinentes d a n s la r6vision du texte.

Anticorps catalytiques Les propri~t6s <> des anticorps ont ~t6 d 6 m o n t r 6 e s d a n s un d o m a i n e tout (] fait different d e celui des r6cepteurs p h a r m a c o l o g i q u e s mais qui pourrait n 6 a n m o i n s a v o i r des a p p l i c a t i o n s t e c h n o l o g i q u e s et t h 6 r a p e u t i q u e s tr~s int6ressantes, ~ savoir la p r o d u c tion d ' a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x p o s s 6 d a n t une activit6 e n z Y m a t i q u e sp6cifique. Le p r i n c i p e qui est ~ la b a s e d e la p r o d u c t i o n d ' a n t i c o r p s 6 activit6 c a t a l y t i q u e est le suivant : en utilisant c o m m e h a p t 6 n e des a n a l o g u e s d e I'~tat d e transition a u cours d e I'hydrolyse des esters carboxyliques [les esters m o n o a r y l p h o s p h o n a t e ] [Figure 4], il est possible d ' i n d u i r e des a n t i c o r p s sp6cifiques d e ces structures, et qui poss~dent au niveau du site d e liaison certains a c i d e s amin6s p o u v a n t r6aliser des c a t a l y ses n u c l 6 o p h i l i q u e s ou basiques [24]. L'obtention d'anticorps m o n o c l o n a u x a n t i - p h o s p h o n a m i d a t e d o u 6 s d ' a c t i v i t e e n z y m a t i q u e a d ' a b o r d c o n f i r m 6 q u e 1'6tat d e transition t ~ t r a 6 d r i q u e , postul6 p o u r e x p l i q u e r le m 6 c a n i s m e d ' a c t i o n d e certaines enzymes esterasiques, est bien r~el. C e t t e a p p r o c h e i m m u n o l o g i q u e p o u r r a i t 6tre e n v i s a g 6 e p o u r 1'61ucidation d'autres m 6 c a n i s m e s enzymatiques. Enfin, la h a u t e sp6cificit6 des a n t i c o p r s m o n o c l o n a u x pourrait ~tre mise (~ profit pour la p r o d u c tion d ' a n t i c o r p s a n t i - p e p t i d e (~ activit6 h y d r o l y t i q u e et qui c o r r e s p o n d r a i e n t pour les prot~ines aux enzymes d e restriction utilis~es en g ~ n ~ t i q u e m o l ~ c u l a i r e [25].

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Remerciements

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Figure 4 Structure de I'~tat de transition dans les m~tallopeptidases. [A) La coordination bident6e de I'amide partiellement hydrat6e est un mod61e d'une interaction stabilisante. [B] La configuration d'un phosphonamidate simulant 1'6tat de transition du module, [D'apr6s r~f, 25)

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R@sum6

- Summary

- Zusammenfassung

L'auteur met l'accent sur certaines applications moins connues des anticorps monoclonaux dirig@s contre les m~dicarnents : l'utillsation en tant qu'agents de d@toxification et la recherche des mol@cules endog@nes correspondant aux mol@cules m@dicamenteuses de synth@se, l'6tude des macromol@cules qui sont la cible des m6dicaments. Pour chacune de ces rubriques, le lecteur trouvera des exempies d'applicatlon : intoxication par la digoxine, la colchicine, l'aflatoxine, utilisation d'anticorps antibenzodiaz@pine dans la r@gulation du psychisme humain, 6tude du m6canisme d'action d'agents pharmacologiques sur les r6cepteurs.

Applications of a n t i b o d i e s to drugs The author insists on some of the less known applications of monoclonal antibodies directed against drugs. Those can b e used as detoxification means, make possible the detection of endogenous molecules corresponding to fhe synthetic drugs, and allow for a study of those very macromolecules which are the targets of the drugs, The reader will be given examples of application for e a c h previously listed section. Those will detail: intoxications due to digoxin, colchicine, aflatoxin, the use of antibodies to benzodiazepine in the regulation of human psychism, and the action of pharmacologic agents on receptors.

Anwendungsgebiete fiJr a n t i m e d i k a m e n t b s e A n t i k b r p e r Der Autor stellt weniger bekannte, g e g e n Medikamente gerichtete monoklonale AntikOrper und deren Anwendungsm~glichkeiten vor : als Detoxikationsmittel, zum Nachweis endogener Verbindungen, die synthetisch hergestellten medikament~sen Verbindungen entsprechen, sowie zur Untersuchung yon Makromolek01en, die Medikamenten als Zielorte dienen. Zu j e d e m dieser Punkte findet der Leser Anwendungsbeispiele, z.B. Intoxikationen durch Digoxin, Colchicin und Aflatoxin, Einsatz von Benzodiazepin-AntikOrpern bei der Regulierung von psychischen St(Srungen des Menschen und Untersuchung des Wirkungsmechanismus von pharmakologisch wirkasem Stoffen an den Rezeptoren,

Trait d ' U n i o n n ° 9 - p a g e

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