L'ingénierie des anticorps et ses applications

I 'INGI NIERIE DES ANTICORPS ET SES APPLICATIONS Jean-Henri Bezian a,b,*, Daniel Moynet a,b, Sytvie C o m e a u b, Jean-Luc C h a g n a u d b

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L~utilisation d'anticorps murins d'abord polyvalents puis monoclonaux en therapeutique humaine n'a pas jusqu'a, cos dernieres annees confirme los espoirs qu'elle suscitait. Ce fait est en grande pattie d~ a I'elaboration par le malade d'anticorps anti-souris et anti-idiotype. Los progres recents d'ingenierie des anticorps permettent d'obtenir des anticorps humanises ou memo humains. Cette technologie a ouvert de nouvelles perspectives pour le deveIoppement de reactifs de diagnostic ou de medicaments. Ingenierie des prot(Hnes - anticorps r e c o m b i n a n t - p h a g e display - a g e n t t h e r a p e u t i q u e .

Summary

The use of murine antibodies, first polyctonal, then monoclonal in human therapy, has not so far ful-filled its promises. This is mostly due to the raise of human anti-mouse or anti-idiotype antibodies. Recent progress made in antibody engineering now allow the development of humanized, or human antibodies. This technology can open wide fields in the development of new diagnostic's tools and even in new medicines. Protein e n g i n e e r i n g - r e c o m b i n a n t a n t i b o d i e s - p h a g e display - t h e r a p e u t i c a g e n t ,

~boduction l utilisation des anticorps en serotherapie ou en seroprophylaxie date du debut du XXe siecle. La protection conferee par los anticorps antidiphteriques, decouverte par yon Behring, a et6 suivie de I'utilisation des immunoglobulines specifiques animales dans le traitement de nombreuses maladies infectieuses. Mais I'injection de cos proteines hetErologues a Ete progressivement abandonnee en raison des progres

aImmunologie moleculaire - Groupement d'interet scientifique b Immunoglobulines recombinantes Universite Victor-Segalen - Bordeaux2 146, rue Leo-Saignat 33076 Bordeaux codex * Correspondance. jean.bezian @immonol.u-bordeaux2.fr article regu le 14 septembre, accept~ le 4 octobre 2000. © Elsevier, Paris.

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de la vaccination et de I'antibiotherapie mais aussi, plus secondairement, par la survenue de la maladie serique. Ce n'est que vers 1960, et a I'initiative du chirurgien M. Woodruf, que f~t relancee I'utilisation d'anticorps hEterologues, en I'occurrence du serum de choral anti-lymphocytaire (SAL), dans la prevention et le traitement du rejet de greffe. Malgre los inconvenients previsibles, I'immunosuppression rEalisee confirma los possibilites de I'utilisation des anticorps en therapeutique. La veritable revolution se situe en 1975 a. la suite de la decouverte par Kehler et Milstein de la possibilite de produire, par hybridation cellulaire, des anticorps d'une seule specificitE car issus d'un clone de lymphocytes B immortalises. Cos anticorps monoclonaux murins eurent leurs premieres applications en 1981 Iors de la mise au point de I'OKT3 utilise dans le traitement des episodes de rejet aigu en transplantation d'organes. Paraltelement los anticorps monoclonaux prirent une place tres importante comme reactifs de laboratoire. IIs sont aussi couramment utilises dans I'industrie biotechnologique. Le developpement de la technologie des hybridomes et t'utilisation potentielle des anticorps monoclonaux en immunotherapie humaine ont provoque un enthousiasme considerable. En effet, los anticorps sont capables de se lier de maniere hautement specifique a. une grande varietE de ligands en particulier aux marqueurs associes aux tumeurs, aux proteines d'enveloppe virale et aux glycoproteines de surface des cellules lymphocytaires. Ce sont donc potentiellement des agents capables d'etre utilises pour le diagnostic et le traitement de maladies humaines. Toutefois, los essais effectues avec cos produits ont le plus souvent donne des resultats decevants. [_'injection d'anticorps monoclonaux de souris entratne invariablement une reponse d'anticorps anti-souris et anti-idiotype qui rend los anticorps inefficaces comme agent cytotoxique, recruteur de cellules ou de molecules effectrices ou de cellos du systeme du complement. Los progres limites de la technologie des hybridomes humains, de spEcificite reduite, instables, de production faible et donc d'un coot Eleve, ont stimule los recherches sur los anticorps construits genEtiquement possedant une immunogEnicite reduite mais des fonctions effectrices conservees. Los travaux genEtiques sont bases sur le fait que la specificitE de I'anticorps est limitee & des regions hypervariables CDR (complementary determining regions) et & une faible partie des regions charpentes FR (framework regions, voir I'article de R. Lesourne et M. DaCron, dans ce numero). II est donc possible de remplacer los regions possedant los fonctions effectrices par des sequences humaines identiques en conservant los regions CDR et parfois une partie de FR d'origine murine (figure 1), d'ou la production d'anticorps chimeriques ou humanises possedant une faible immunogenicite pour I'homme.

2. Techniques d'ingenierie d'anticorps Plusieurs facteurs sont & considerer dans la synthese de molecules d'anticorps et doivent etre determines par los applications particulieres pour lesquelles cos anticorps sont destines. 1 05

scientif que

Dosster Imrnunologie

niere ou se trouvent les ponts di-sulfures, donne un fragment divalent F(ab')2. Bien que ces fragments soient d'une grande utilite dans les applications experimentales, la difficulte de la purification et leur petite taille ont limite les applications des fragments produits par proteolyse.

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Anticorps de souris

Anticorps hybride souris-homme

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L'affinite de I'anticorps ne dolt pas etre modifiee. Sa valence dolt etre prise en compte et peut etre adaptee pour differentes applications. Ainsi la forme courante divalente peut etre transformee en fragments d'anticorps monovalents ou en sites de liaison multiples lies pour augmenter I'avidite de la fixation & I'antigene. Des fragments d'anticorps de differentes tailles peuvent etre prepares et avoir des proprietes in vivo plus appropriees que I'immunoglobuline complete, par exemple un pouvoir penetrant dans les tissus plus important ou des propriEtes pharmacoIogiques modifiees. De plus, des anticorps bi- ou trispecifiques peuvent Etre prepares avec des sites de liaison pour plus d'un antigene. Les fonctions natives effectrices ou de signal de I'anticorps peuvent etre exploitees pour la therapie ou specifiquement supprimees si elles sont indesirables. Alternativement, un certain hombre de molecules effectrices potentiellement therapeutiques comme des drogues, toxines, radionucleides ou des cytokines peuvent etre lies a. I'anticorps, de m~me que des molecules ,, reporter,, pour des usages de diagnostic. Des proprietes specifiques peuvent 6tre ajoutees & la molecule pour une utilisation in vivo, visant & donner une pharmacocinetique appropriee et une immunogenicitE faible pour permettre des utilisaticns rEpetees.

3. Immunogiobufines chimiquement modifiees Une strategie alternative utilisee pour reduire I'immunogEnicite de nombreuses proteines y compris les immunoglobulines est la modification chimique. Uaddition de polymeres comme le PEG (polyethylene glycol) ou de dextrans de faible poids moleculaire a montre qu'ils entratnaient une reduction d'immunogenicite de I'anticorps dans des modeles experimentaux. Le PEG peut Etre attach6 & I'anticorps en utilisant differents couplages chimiques, generalement par attachement du groupement amine des residus lysines & la surface de la proteine. Le PEG non seulement reduit I'immunogenicitE, mais il change egalement certaines proprietes biologiques comme la resistance & la proteolyse et il augmente la demi-vie circulante. Le clivage & la papdfne donne des flagments Fab monovatents. Le clivage par }a pepsine sous la region char1 06

Des anticorps monoclonaux modifies chimiquement ont Ete produits en conservant la region constante humaine et en accolant des regions variables de souris. Ces anticorps conservent doric leur specificite pour I'antigene puisqu'elle est situee sur la partie variable. La partie constante humaine diminue I'immunogenicitE. Malgre ce montage, ces anticorps declenchent des reactions chez I'hOte en particulier la production d'anticorps anti-idiotype, d'ou une nouvelle orientation vers des immunoglobulines genEtiquement modifiees.

4. immunogtobulines genetiquernent rnodifiees Les premiers anticorps monoclonaux recombinants produits etaient semblables aux anticorps chimiquement modifies decrits precedemment. Pour diminuer les reponses immunologiques de I'h6te, on s'est donc oriente vers une plus grande humanisation par greffe des CDR. II faut rappeter que I'interaction avec I'antigene se produit au niveau des CDR mais que parfois interviennent quelques acides amines du FR (voir I'article de R. Lesourne et M. Daeron, dans ce numero). Deux possibilites sont offertes : soit on choisit un FR humain ayant une sequence tres proche du FR murin puis on greffe ensuite le CDR, soit, en raison des diffioultes & prevoir I'efficacite de la technique precEdente, on peut greffer le CDR ainsi qu'un & trois residus murins qui font le pont avec le FR humain. II est enfin possible pour ameliorer la tolerance d'employer une technique aite de ,, re-surfagage ,, qui consiste dans la region Fv (fragment variable, voir figure 1) & enlever les residus d'acides amines responsables de I'immunogenicite tout en conservant la specificitE.

5. isotement des g e n e s d'anticorps a partir d ' h y b r i d o m e s Plusieurs approches ont ete decrites. Initialement les genes des anticorps provenant des hybridomes etaient clones dans des vecteurs plasmidiques et exprimes comme anticorps complet dans des cellules de mammiferes ou sous forme de fragments dans des bacteries. Une des strategies pour I'expressien des genes d'anticorps a Ete de cloner I'ADN genomique rearrange de I'anticorps avec son propre promoteur et ses sequences regulatrices et de le transfecter dans des cellules pour I'expression d'une immunoglobuline. Le clonage genomique dans le bacteriophage lambda presente un certain nombre d'inconvenients et les domaines variables clones sous forme d'ADNc necessitent d'importantes modifications avant d'etre lies & leurs vecteurs d'expression. Pour ces raisons, la methode la plus frequemment employee est d'amplifier par PCR (polymerase chain reaction) les sequences d'ADN des regions variables VH et VL. Les amorces utilisees sont specifiques des regions conservees & I'extrEmite de chaque gene. II est ainsi possible de cloner les genes anticorps cibles sans connaftre parfaitement leur sequence. Des vecteurs de transfection de genes chimeres humain-souris conduisant & la production d'anticorps chimeres ont ainsi ete developpes. Dans le gene anticorps fonctionnel, une sequence separe la region variable de la region constante. Des sites de restriction se trouvent de part et d'autre de I'exon de la region constante. II est facile, apres avoir clone la region variable dans un vecteur d'expression, de changer I'isotype de la region constante & laquelle il est associ& Ainsi les genes obtenus codent pour une molecule d'anticorps qui presente la meme spEcificite avec des fonctions effectrices differentes. La region variable d'une espece peut etre exprimee avec ies differentes regions constantes d'une autre esp¢ce. Revue Frangaise des Laboratoires, novembre 2000, N° 327

Dossier .....

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Immunologie

6. Isoiement {Jes ger~es d'anticorps partir de lymphocytes Une approche plus recente propose de passer outre I'hybridorne. Les sequences codant pour les anticorps sont directement clonees & partir des lymphocytes spleniques ou du sang peripherique des animaux immunises, et exprimees dans des bacteries. Un des interets de cette approche est que les anticorps peuvent egalement ~tre obtenus de lymphocytes humains issus d'individus immunises ou de donneurs sains. Les anticorps produits sont ensuite selectionnes par criblage sur leur antigene. Le developpement de banques combinatoires est une importante extension du repertoire des anticorps. Des banques de genes variables sont produites en amplifiant par PCR des ARNm de cellules 13 provenant directement de donneurs humains ou murins imrnunises ou non. Les banques VH et VL peuvent etre reassemblees pour generer une nouvelle banque combinatoire VH-VL. Dans le cas de donneurs imrnunises, cette technologie est utilisee pour exprimer des fragments d'anticorps solubles de haute affinite. Dans le cas de donneurs non imrnunises, on obtient un repertoire naff de genes d'anticorps qui represente le repertoire normal du systeme irnmunitaire sans stimulation antigenique. Les combinaisons au hasard des chatnes VH et VL augmentent la probabilite de detecter des anticorps avec des activites particulieres. II semblerait que cette methode soit le rneilleur moyen d'obtenir des anticorps catalytiques.

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Banque de Phages ScFv

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Phage Helper Induction Pronloteur

7, Le phage disp[ay La presentation a la surface de phages de proteines, le phage display, est un puissant outil de selection de proteines combinatoires. Les phages peuvent presenter & leur surface des fragments d'anticorps scFv (single chain Fv voir figure 1), Fab et Fv. Un element essentiel de cette technologie est la construction de banques combinatoires d'anticorps (figure 2). Les domaines variables des immunoglobulines peuvent 6tre exprimes soit sous forme scFv dans lesquds les domaines VH et VL rearranges sont lies de maniere covalente par un court peptide, soit sous forme de Fab. Avant tout isolement d'anticorps recombinants en utilisant la technologie du phage display, il est necessaire de realiser des banques de phages presentant des anticorps, ou plus exactement des fragments d'anticorps, de tallies et de complexites convenables. Un des elements determinants pour atteindre cet objectif est le choix de la source des genes d'immunoglobulines. Pour amplifier par PCR les regions V des differentes classes d'immunoglobulines, il est possible d'utiliser des lymphocytes d'individus immunises. En effet, de tels individus auront une reponse immunitaire qui aura rnultiplie, par expansion clonale, les lymphocytes B possedant les regions V irnpliquees dans la reponse immunitaire dirigee contre I'antigene d'interet. De fagon naturelle, le repertoire de ces individus est enrichi en immunoglobulines possedant une bonne affinite, augmentant ainsi la probabilite d'isoler un anticorps de haute affinite. Des banques peuvent egalement etre assemblees apres amplification de genes provenant d'individus non immunises ou naffs afin d'obtenir une diversite maximale. En effet chez des sujets ,, ndlfs ,, des genes d'immunoglobulines ne seront pas surrepresentes, comme dans le cas d'individus fortement repondeurs, offrant la possibilite d'amplifier et de cloner un vaste panel de genes donnant naissance a une banque de phages plus uniforme. II faut noter ici que la constitution de banques a partir d'individus immunises ou nai'fs ne refletera jamais la diversite obtenue dans les lymphocytes qui est le resultat de mecanismes de rearrangements, de mutations, d'insertions..., qui seront absents Iors du clonage des Revue Frangaise des Laboratoires, novembre 2000, N° 32?

seules regions V. La diversite des banques (surtout naTves) peut etre tres largement augmentee en utilisant un grand nombre de donneurs. Une autre methode d'obtention d'une banque possedant une grande diversite est d'en construire une, dite alors semi-synthetique, par mutation aleatoire par PCR des regions CDR. II est ainsi possible d'obtenir des anticorps qui auraient ete elimines par la selection naturelle. II est donc envisageable par cette technique d'isoler des anticorps qui n'ont jamais existe chez le donneur de lymphocytes. Dans la litterature, il a ere decrit de nombreuses banques obtenues par ies diverses rnethodes et d'apres les resultats, il sernble que la complexite de la banque soit un des elements clef pour I'obtention d'anticorps de bonne affinit& Des phages exprimant des anticorps de specificites interessantes peuvent 6tre isoles & partir de banques selon un protocole schematique (figure 3) : - liaison des phages sur I'antigene d'interet, - e l i r n i n a t i o n , par lavages, des phages non fixes ou ayant une faible affinite, - elution des phages avec determination du hombre de phages elues, - infection de E.cofi et multiplication des phages afin de produire la premiere sous-banque. Ces quatre etapes constituent un tour de bio-panning qui sera repete plusieurs fois. Le nombre de phages mis en contact avec I'antigene etant connu, te suivi du nombre de phages Clues apres chaque tour de bio-panning permet de rnesurer I'enrichissement en clones positifs au cours des etapes de bio-panning. Un des facteurs importants pour la reussite de I'isolement d'anticorps est I'antigene : la grande majorite des experiences ont ete faites a I'aide d'antigenes purifies fixes sur une surface de plastique (comme dans une reaction ELISA classique). La purete et la conformation de I'antigene vont jouer dans I'obtention de clones positifs : si I'antigene est peu represente, il sera difficile voire impossible d'identifier des clones positifs car [es phages presentant des fragments d'irnmunoglobulines ne pourront etre enrichis Iors des tours de selection successifs. La 1 07

Dossier scientifique ,

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lmmunologie

9. Anticorps monocionaux conjugues a des enzymes Banque de phages ScFv

Cette technologie appelee ADEPT (antibody directed enzyme prodrug therapy) precede en deux etapes : des pro-drogues non toxiques sent d'abord conjuguees & I'anticorps, puis I'anticorps se fixe a la tumeur cible en transformant la pro-drogue en drogue active. Carboxypeptidases, phosphatase alcaline, glucuronidase et I}-Iactamase ont ete ainsi conjuguees. Recemment gr&ce aux technologies de genie genetique des proteines de fusion scFv-phosphatase alcaline, ou ~-Iactamase ont ete produites et experimentees.

10. Les systemes d'expression

26me tour de Panning

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~Lavages

Banque amplifiee

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Les molecules d'anticorps ,, ingenierees ,, et leurs fragments sent de plus en plus exploites comme outils scientifiques et cliniques. Toutefois, un des facteurs qui peut limiter I'application de cette technelogie est la possibilite d'obtenir de grandes quantites de proteine active. II existe des avantages et des inconvenients divers de I'utilisation pour la production de bacteries, levures, cellules d'insectes & I'aide du baculovirus, cellules de mammiferes CHO (chinese hamster ovary) ou COS (lignee de cellules de rein de singe transformees par le virus SV40), les animaux transgeniques et les plantes. II n'existe en fair pas de systeme universel et chaque anticorps peut 6tre exprime dans un systeme particulier qui lui convient le mieux. Toutefois, quelques systemes commencent & acquerir une certaine faveur (d'un point de vue theorique) : les plantes, en particulier le tabac, les levures, et les animaux transgeniques. Les premiers resultats obtenus chez la chevre sent tres prometteurs. Uidee est de faire exprimer te gene de la proteine que l'on desire obtenir dans la glande mammaire (gr&ce & un promoteur conditionnel adequat) afin de recuperer la proteine produite dans le lait de I'animal.

Phage Helper

11. Les applications conformation de I'antigene fixe sur la surface plastique ne doit pas etre trop eloignee de la conformation de la molecule active si on veut eviter I'obtention de clones reconnaissants de pseudo-epitopes.

8. Modification des g e n e s La connaissance des sequences des regions variables d'un anticorps permet de predire des modeles pour la structure des regions de fixation et ainsi de definir les interactions possibles entre I'anticorps et I'antigene. Des fragments Fv d'anticorps monoclonaux ont ete & I'origine de modeles pour la comprehension de I'interaction antigene-anticorps. De plus, la petite taille de ces fragments les rend attractifs pour les etudes structurales par diffraction des rayons X (cristallographie) ou en RMN (resonance magnetique nucleaire). Cette technologie a aussi conduit & la production de nombreux anticorps dent le site de liaison I'antigene a ete modifie par mutagenese dirigee pour augmenter leur affinite. Des anticorps bispecifiques (anticorps entier ou deux scFv lies ensemble) portant deux specificites antigeniques differentes ont ete generes a I'aide de ces methodes. Finalement, les sequences en acides amines des regions CDR d'un anticorps monoclonal peuvent 6tre une importante source d'information pour faciliter la preparation de peptides biologiquement actifs. De cette maniere ces elements conjugues ou fusionnes avec des molecules effectrices ~ visee diagnostique ou therapeutique sont en train de constituer une nouvelle classe d'outils pharmacologiques. 108

Les anticorps monoclonaux classiques ont pris I'importance que I'on salt comme reactif d'analyse en biologie medicale. Une neuvelle classe de ces reactifs devrait provenir de la technologie des anticorps recombinants et de nombreux projets sent en cours d'etude. La majerite des applications des anticorps recombinants vise la therapeutique des maladies humaines et ce domaine, depuis la mise au point d'anticorps humains ou humanises, est en pleine expansion. Une vingtaine d'anticorps sont commercialises aux I~tats-Unis et une centaine sont en cours de developpement. On peut citer parmi ceux commercialises en France : Zenapax®' (Roche) anti-lL2R, utilise dans le rejet de transplant renal, Simulect® (Novartis Pharma) de meme specificite que le precedent (voir I'article de A. VVinckel et .I.-H.M. Cohen dans ce numero), Mabthera® (Roche) anti-CD20 pour le traitement des lymphomes B post transplantation, et en autorisation temporaire Herceptin® (Genentech) anti-HER2 (human epidermial growth factor receptor) pour celui des cancers du sein metastases. D'autres sent dej& commercialises dans certains pays ou sent en cours de developpement et on peut noter qu'ils s'adressent b. des pathologies aussi variees que : - l u p u s erythemateux dissemine : Antova (Biogen) anti-CD40L, 5G1.1 (Alexion Pharm) anti-C5 ; - sclerese en plaques : Anti-GRAN (Elan) anti-LVA.4 - asthme et allergies : RhuMab-E25 (Genentech/Novartis) anti-lgE, IDEC-152 (1DEC Pharm) anti-CD23 ; - anti-coagulant : Reopro (Centocor) anti-gpllalllb, Corsevim (Centocor) anti-Fact. VII ; Revue Frangaise des Laboratoires, novernbre 2000, N° 327

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- maladies autoimmunes : O K T 4 A (OrthoBiotech) anti-CD4, S m a r t anti-CD3 (Protein Design Lab) a n t i - C D 3 ; - maladie de C r o h n : InflixiMab (Centocor) anti-TNFo~ ; - polyarthrite rhumato'lde : les anti-TNFcq C5 ou C D 4 ; - psoriasis : I C A M 3 ( I C O S Pharm) a n t H C A M 3 , ABX-IL8 (Abgemix) anti-lL8 ; - reaction du greffon contre I'h6te : MEDI-50? (Medimmune) anti-CD2 ; infections virales : Protovir (Ncvartis) anti-CMV, Ostavir (Novartis) anti-hepatite B ; sarcome : Vitaxin (Medimmune) anti-integrine (zV~3 ; - leucemie lymphd(de chronique : Campath IH (Leukosite) anti-CD52 ; - leucemie aigue myeloTde : S m a r t M 2 9 5 (Kanebo) a n t i - C D 3 3 ; - lymphomes non hodgkiniens : LymphoCide (Immunomedics) antiCD22 ; - etc. -

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r :~;; ; ( . T v o i i p t u s II ne semble pas utile pour [e lecteur de donner ici une tr~s importante bibliographie sur le sujet, en revanche nous indiquons, ci-dessous, ies references de quelques articles essentiels, des revues g6n~tales et des ouvrages de base.

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On assiste ainsi & I'eclosion d ' u n e nouvelle classe de medicaments, bien toleres, et qui suscitent de ,, solides ,, espoirs.

12. Conclusion a possibilite d'obtenir par vole genetique des anticorps humanises voire humains a considerablement modifie la capacite d'utiliser [es anticorps c o m m e outils de diagnostic et c o m m e agent therapeutique. C'est ainsi qu'un tres grand nombre de projets sont en cours d'etude ou ont m~me abouti & une commercialisation. Un des facteurs limitant qui persiste est 1a difficulte & produire ces anticorps en quantite importante eta un coet eonvenable. Les etudes actuelles sur le systeme d'expression, animaux transgeniques et plantes, aboutiront peut-etre & la solution de ce probleme residuel.

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