Apport de la biologie moléculaire au diagnostic bactériologique

APPORT DE LA BIOLOGIE MOLI CULAIRE AU DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE Jean-Louis Koeck a,*, Mohammed Chakour a Remy Teyssou a

R6sumd

Uimplantation de la biologie moleculaire dans les laboratoires de bacteriologie medicale est limitee par I'efficacite, la simplicite et le faible cotit des tests phenotypiques. La reaction d'amplification en chatne (PCR) et I'amplification transcriptionnelle (TMA) sont utilisees en routine pour le diagnostic direct de Mycobacterium tuberculosis, de Chlamydia trachomatis et de Neisseria gonorrhoeae. Les sondes d'hybridation permettent I'identification de bacteries en culture. Les puces & ADN sont des outils prometteurs mais & moyenne echeance. Un nombre croissant de laboratoires utilisent la PCR universelle ARNr 16S & des fins d'identification bacterienne.

2. Les techniques de biologie moleculaire disponibles 2.1. G e n e r a l i t e s A partir d'un echantillon (produit pathologique ou culture bacterienne), le diagnostic genomique necessite trois etapes : - etape 1 : extraction du materiel genetique (ADN ou ARN) ; - etape 2 : hybridation entre un reactif constitue d'une sequence nucleotidique connue (amorce, sonde) et complementaire du materiel genetique & detecter, eventuellement prolongee par une synthese nucleotidique complementaire de ce materiel avec amplification ; - etape 3 : revelation du materiel genetique hybride ou amplifie. On distingue deux principaux types de techniques : les sondes nucleiques et les methodes d'amplification.

Bact(~riologie - b i o l o g i e m o l 6 c u l a i r e - P C R - a m p l i f i c a t i o n g6nique - hybridation.

2.2. Les s o n d e s n u c l e i q u e s Summary

The use of molecular biology in the clinical laboratories is limited by the efficiency and by the cost-effectiveness of the phenotypic methods. PCR and TMA are routine tests for the direct detection of Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. Hybridization probes are used for the identification of bacterial cultures. DNA chips are promising techniques in middle term future. Universal PCR is used by an increasing number of laboratories for bacterial identification. Bacteriology - molecular biology - PCR - hybridization.

1. Introduction L

a biologie moleculaire regroupe un ensemble de techniques basees sur I'etude, la detection et la modification des acides nucleiques [1 ]. Developpees depuis la fin des annees 1970, les techniques de biologie moleculaire ont ete indissociables des progres de la virologie medicale. Pourtant, malgre maintes predictions, elles n'ont pas encore supplante le diagnostic phenotypique en bacteriologie [9].

Une sonde nucleique est un fragment d'ADN connu et mis en contact dans des conditions determinees avec le materiel genetique & analyser. Le marquage radioactif, enzymatique ou chimique de la sonde permet de mettre en evidence les hybrides eventuels par la detection d'une radioactivite, d'une reaction colorimetrique ou d'une chemiluminescence. L'utilisation des sondes nucleiques est actuellement bien standardisee pour certaines indications, en particulier pour le diagnostic des mycobacteries qu'elle a contribue & faciliter tout en ameliorant la securite des manipulations. I 'utilisation de sondes plus courtes a permis de reduire les temps d'analyse. La sensibilite de detection des bacteries par les sondes reste neanmoins tres inferieure & la sensibilite des reactions d'amplification. Elles sont surtout utilisees pour effectuer des tests rapides d'identification sur colonie ou sur coupe histologique. Les techniques d'hybridation en phase solide (southern-blot et dot-blot) sont surtout employees dans les laboratoires de recherche. La plupart des trousses commercialisees sont des methodes d'hybridation en phase liquide, qui permettent d'accelerer la vitesse des reactions. La methode de detection des hybrides la plus utilisee est le systeme H PA (hybridization protection assay) qui presente I'avantage d'etre realise en un seul tube. La sonde est marquee avec un ester d'acridinium, molecule capable d'emettre de la lumiere. Awes ajout de peroxyde d'hydrogene, les hybrides sont proteges de I'hydrolyse et emettent donc de la lumi~re, & rinverse des sondes non hybridees qui sont hydrolysees. I 'hybridation in situ est peu utilisee en bacteriologie. Elle presente I'avantage de visualiser le micro-organisme au sein du tissu infecte, ce qui augmente son interet clinique. La sensibilite de la methode est neanmoins limitee.

a Laboratoirede biologie clinique Hbpital d'lnstruction des Armees Val-de-Gr~.ce 74, bd Port-Royal 75230 Paris cedex 05

La sensibilite des sondes peut ~tre augmentee par I'utilisation de syst~mes d'amplification du signal, permettant d'abaisser le seuil de detection & 103-105 copies.

* Correspondance. E-mail : [email protected]

2.3. L'amplification g e n i q u e

artide re~u le 28 juin 2001, accept6 le 2 ao,~t 2001.

© Elsevier,Paris. RevueFrangaisedes Laboratoires,septembre2001, N° 335

Elle consiste & generer, & partir d'une matrice cible, un nombre considerable de copies identiques, jusqu'& 109 environ, dont la detection 37

Dossier sc entifique Bact~riologie

et I'analyse seront ainsi simplifiees. Le premier avantage de I'amplification genique est une grande sensibilite de detection des acides nucleiques. Le risque de faux positif par contamination peut etre reduit par I'utilisation de protocoles de decontamination, consistant & modifier les amplicons pour les differencier de la cible (emploi de I'uracileN-glycosylase ou de I'isopsoralene).

2.3.5. Amplification du signal : ADN branch~ (bDNA)

2.3.1. Ampfification g~nique en chaine ou PCR (polymerase chain reaction)

Elles constituent une miniaturisation de la technique du reverse dotblot. Le support est une substance chimiquement inerte comme le polypropylene, le nylon, le verre ou le silicium. Un nombre eleve de sondes (de 1 000 & 100 000) peut etre immobilise sur un support de 1 c m 2. Les sondes ADN peuvent etre preparees puis greffees sur le support ou etre directement synthetisees sur la puce [2].

La PCR est une succession cyclique de trois etapes. - La premiere etape consiste & denaturer I'ADN cible par la chaleur. - La deuxieme etape correspond & I'hybridation d'amorces complementaires de sequences encadrant la zone & amplifier. - Au cours de la troisieme etape, I'elongation des amorces permet de synthetiser un brin complementaire de la zone cible. L'amplification est donc exponentielle et permet la fabrication d'une grande quantite d'ADN. De tres nombreuses variantes ont ete decrites. Pour etudier I'ARN, une transcription inverse est effectuee au prealable (RT-PCR). Dans la PCR nichee, I'amplicon obtenu awes une premiere PCR est amplifie & I'aide d'un second couple d'amorces internes. La PCR multiplex utilise plusieurs jeux d'amorces compatibles, permettant d'amplifier simultanement des sequences differentes. Un jeu d'amorces peut etre utilise comme temoin interne (ADNr 16S par exemple). Bans le domaine de la bacte~riologie, la PCR universelle ARN ribosomal (ARNr) 16S, suivie de la d6termination de la s(~quence g6ne~tique amplifi6e, est une technique de plus en plus souvent utilis(~e [7]. En effet, la sequence nucleotidique de I'ARNr 16S presente des regions hautement conservees et communes & toutes les bacteries, tandis que d'autres regions sont specifiques d'espece. L'amplification par PCR de I'ADNr 16S peut etre effectuee & partir d'une colonie bacterienne sans extraction prealable. Cette amplification du genome bacterien dite, universelle ,, peut egalement etre realisee directement & partir de produits pathologiques.

2.3.2. Amplification transcriptionnelle de YARN La TMA (transcription mediated amplification), la NASBA (nucleic acid sequence based amplification) et le 3SR (self-sustained sequence replication) sont des methodes d'amplification isothermes generant des copies multiples d'ARN. La TMA est la technique la plus utilisee en bacteriologie. La detection de molecules d'ARN par rapport & I'ADN aurait pour avantage une meilleure sensibilite, Nee& I'existence d'un plus grand nombre de molecules par cellule bacterienne. De plus, la presence d'ARN serait mieux correlee avec le caractere viable des bacteries. L'amplification de I'ARNr 16S est theoriquement plus sensible que celle de I'ADN genomique, puisqu'il existe plus de 1 000 copies d'ARNr 16S par cellule bacterienne. L'ARN est en revanche plus facilement degradable que I'ADN Iorsqu'il est libere & I'extefieur des cellules bacteriennes.

2.3.3. Amplification par d~placement de brin (SDA) II s'agit d'une methode d'amplification recente, isotherme, mettant en jeu I'action simultanee de deux enzymes et ne necessitant pas d'equipement de laboratoire specialis&

2.3.4. Amplification de sonde

2.3.4.1. Ligase chain reaction (LCR) Uamplification est obtenue par des cycles de ligation de deux sondes oligonucleotidiques, choisies de maniere & etre juxtaposees Iorsqu'elles s'hybrident & I'ADN cible.

2.3.4.2. Qt6 replicase II s'agit d'un systbme fonde sur I'incorporation d'un oligonucleotide simple brin dans la sequence d'une molecule d'ARN, qui peut etre amplifiee exponentiellement par une enzyme, la Q~ replicase. 38

La cible nucleique est capturee par une sonde composite qui possede un autre site permettant la constitution d'un edifice moleculaire branche & I'ofigine d'une amplification du signal. 2.4. Les p u c e s a A D N

Le materiel genetique & etudier est generalement marque avec un fluorochrome au cours d'une reaction d'amplification. La revelation des sondes hybridant avec le produit d'amplification est alors effectuee & I'aide d'un laser. II est egalement possible de recourir & une methode de revelation plus classique derivee de la technique - sandwich ,,. Certains auteurs tentent de reveler I'hybridation par un signal electrique amplifie puis analyse directement par la puce. Enfin, les puces & ADN egalement permettent la determination de sequences d'acides nucleiques. Les puces a ADN devraient faciliter le diagnostic bacteriologique dans certaines indications, en autorisant la detection et I'identification simultanee d'un grand nombre d'especes bacteriennes, de genes de resistance aux antibiotiques ou de genes de virulence. L'analyse des donnees par un systeme d'intelligence artificielle permettrait d'optimiser les conduites diagnostiques et therapeutiques & tenir pour le malade. L'analyse simultanee du terrain genetique du patient, en particulier des elements pouvant favoriser I'infection par certaines bacteries, peut egalement etre envisagee. Uetude de prelevements environnementaux permettrait aussi d'ameliorer la prevention des infections nosocomiales. Les applications en epidemiologie des maladies infectieuses semblent trbs prometteuses. Certains defauts inherents aux techniques de biologie moleculaire ne sont pas resolus par les puces & ADN : variabilite genetique des bacteries, production de nouveaux facteurs de virulence ou de resistance aux antibiotiques (dont la detection serait plus difficile sans le recours aux methodes phenotypiques classiques), absence de traduction automatique du genotype par un phenotype (la presence du gene n'impliquant pas celle de la proteine correspondante), et difficultes de quantification des microorganismes bacteriens. ,&, I'heure actuelle, le coet des puces & ADN demeure tres eleve et leur sensibilite est encore faible.

3. Modalites de mise en oeuvre d'une technique de diagnostic moleculaire en bacteriologie Le choix d'une technique de biologie moleculaire repose tout d'abord sur la comparaison des avantages et des inconvenients entre les techniques conventionnelles et les techniques de biologie moleculaire. Neanmoins, ceux-ci sont tres variables selon les applications considerees. 3.1. A v a n t a g e s d e s t e c h n i q u e s de b i o l o g i e m o l e c u l a i r e - D'une maniere generale, I'ADN est resistant. Les prelbvements & etudier en biologie moleculaire sont donc faciles & transporter et & conserver. - Les techniques d'amplification genique sont tres sensibles, parfois davantage que la culture (PCR Chlamydia trachomatis par exemple). Utilisees sur les produits pathologiques, elles permettent un diagnostic direct rapide, autorisant une prise en charge adaptee du patient plus precoce. RevueFran?aisedes Laboratoires,septembre2001,N° 335

Les techniques de biologie mol6culaire sont habituellement tres specifiques, particuli6rement les sondes moleculaires commercialis~es pour I'identification des esp6ces bacteriennes en culture. II est possible d'automatiser ces techniques. Neanmoins, il n'existe pas encore d'automate d'extraction des acides nucleiques ~.un coet abordable. -

-

3.2. Inconvenients des techniques de biologie moleculaire Uapparition de mutations dans les sequences cible peut etre responsable de faux negatifs. Uexistence d'inhibiteurs des polym~rases dans les echantillons peut ~galement entraTner I'apparition de faux negatifs. - Le risque de contamination des echantillons & analyser par de I'ADN amplifie peut etre & I'origine de faux positifs. L'absence de methodes quantitatives adaptees est un obstacle & I'utilisation des techniques de biologie mol6culaire en bacteriologie a partir de prelevements contamines par la flore commensale. - Le coot des reactifs commercialises reste eleve. Le coot des 6quipements et de I'amenagement du laboratoire est tres variable selon la m6thode utilisee. La mattrise de la qualite des analyses de biologie mol6culaire est encore delicate & obtenir. La mise en place de contrSles de qualite est difficile & mettre en place et elle alourdit les coQts. - Les personnels doivent avoir un niveau eleve de formation. La sensibilite des sondes nucl~iques est limitee et autorise rarement leur emploi pour le diagnostic direct. La r~alisation d'un diagnostic direct mol~culaire ne dispense pas de la culture. -

-

-

-

-

-

II faut donc prendre coin de preciser I'objectif avant de realiser des analyses de biologie moleculaire : identification d'une bacterie (laqueUe et dans quel prelevement), d'un facteur de virulence ou d'un m~canisme de resistance aux antibiotiques. La realisation d'une PCR universelle n'a de sens que pour les prelevements non contamines par la flore commensale (LCR, liquide articulaire, humeur aqueuse, etc.). La d6tection d'une esp~ce bact6rienne ou d'un gene de virulence & I'aide d'amorces tres specifiques pourra au contraire etre effectuee dans un produit polymicrobien (detection de genes de virulence chez Escherichia coil par exemple). Par ailleurs, il est preferable & I'heure actuelle d'effectuer les analyses pour lesquelles une reponse qualitative est pertinente : c'est le cas par exemple de la detection mol~culaire de M. tuberculosis dans un crachat, alors que la detection de Streptococcus pneumoniae par PCR dans ce pr61evement n'a pas d'int6ret clinique. Concernant le choix de la m6thode, il est preferable d'utiliser une technique commercialis6e ; dans ce cas, le biologiste b6n6ficie de produits contr616s et peut comparer son experience & celle d'autres utilisateurs. Le choix de la methode dolt aussi etre adapte au contexte : on d~cidera par exemple d'une analyse par sonde moleculaire ou par amplification genique selon le seuil de detection souhaite. Enfin, il est important d'informer le clinicien sur les modalit~s de prelevement, les examens & prescrire et I'interpretation des resultats des tests de biologie moleculaire.

4. Preparation des echantillons pour I'analyse moleculaire La liberation des acides nucleiques des bact~ries & detecter est un prealable indispensable. Par ailleurs, il faut empecher la d~gradation des acides nucl6iques libres, eliminer les inhibiteurs des r~actions d'amplification ou d'hybridation et utiliser un tampon appropri~ aux reactions de biologie moleculaire & effectuer [6].

techniques sp6cifiques doivent etre utilis~es pour les mycobact~ries ou pour certaines bacteries ~. coloration de Gram positive (emploi du lysozyme ou de la lysostaphine pour I'extraction de I'ADN des staphylocoques par exemple). II faudra 6galement tenir compte de la nature du materiel g~n~tique cible, ARN ou ADN, et 6viter les r~actions non sp~cifiques en realisant une extraction adapt~e des acides nucleiques. Par exemple, 1'6bullition ou la lyse alcaline peuvent entra~'ner la formation d'ADN simple brin, plus sujet & etre fixe de mani6re non sp6cifique dans des conditions de basse stringence. Nous donnerons ici quelques exemples concernant des prOl~vements particuliers. 4.1. L i q u i d e c e p h a l o - r a c h i d i e n Des volumes de LCR inferieurs & 10 pl peuvent etre utilis6s sans extraction prealable dans des reactions d'amplification. N6anmoins, I'extraction au prealable de I'ADN permet de reduire la fr6quence des inhibiteurs des ADN polym6rases qui sont souvent pr6sents dans ce type de prelevement. 4.2. P r e t e v e m e n t s s a n g u i n s L'anticoagulant utilise est en g6n6ral le tripotassium ethylene diamine t~tra acetate (EDTA) ou le citrate trisodique. II faut eviter I'h6parine, qui inhibe les polym6rases. Uheme et ses produits d6riv6s sont aussi des inhibiteurs. Une lyse globulaire simple ou le recueil de la couche leucocytaire par centrifugation en gradient de densit6 peuvent etre r~alises pour obtenir la fraction & extraire. 12ADN est extrait apr6s lyse cellulaire par action d'un d6tergeant, eventuellement compl6t~e par une digestion avec la proteinase K. Dans les cas ou la bact6rie se trouve & i'exterieur des ceiiuies sanguines, i'extraction des acides nucieiques du s~rum ou du plasma par les procedes classiques est suffisante. 4.3. P r e l e v e m e n t s respiratoires La detection des acides nucl~iques de M. tuberculosis necessite des m6thodes permettant la lyse de la paroi bacterienne, particulierement r~sistante. Apr6s une etape de decontamination, par exemple par la m6thode & la N-acetyI-L-cysteine-soude, la lyse peut etre r6alis6e par sonication. Les acides polysaccharidiques contenus dans les crachats sont des inhibiteurs connus des polym6rases. Uutilisation de silice fixant I'ADN favorise leur elimination. 4.4. Urines Elles contiennent fr~quemment des inhibiteurs dont la nature exacte n'est pas connue. 4.5. Autres p r e l e v e m e n t s De nombreux autres prelevements (biopsies, pus, abc~s, ulceres, selles, etc.) peuvent faire I'objet d'une d~tection d'ADN sp~cifique. II est possible de realiser des tests de biologie mol~culaire sur des prelevements fixes, formoles ou paraffin~s. Les pr~l~vements conserves dans le liquide de Bouin ne sont pas analysables.

5. Les applications au diagnostic bacteriologique 5.1. Les p r i n c i p a u x t y p e s d ' i n d i c a t i o n sont les suivants Bact6ries non cultivables ou de culture difficile : M. leprae, Treponema pallidum, Chlamydiae, mycoplasmes, rickettsies, Bartonella sp., Borrelia burgdorferi. - Bact6ries & croissance lente : M. tuberculosis, Helicobacter pylori, Bordetella pertussis. -

II est n6cessaire d'adapter le volume d'~chantillon et de le concentrer eventuellement selon la sensibilit6 de la technique utilis6e et selon le nombre de bacteries presentes dans I'echantillon s'il est connu. La procedure de lyse bacterienne dolt etre adapt~e & I'esp6ce-cible. Des RevueFran?aisedes Laboratoires,septembre2001, N° 335

39

Dossier scientifique Bacteriologie

P 3703 2

Abbott

LCX Chlamydia trachomatis-kit amplification/detection

P 42952

Abbott

LCX Neisseria gonorrhoeae-kit amplification/detection BD Probetec et Chlamydia trachomatis (CT)

T8~82

Becton Dickinson

M08332

Genprobe

Accuprobe Mycobacterium tuberculosis complex

M 0887 2

Genprobe

Complexe M. tuberculosis identification directe par amplification (TMA)

R 5444 2

Genprobe

Complexe M. tuberculosis identification directe par amplification 2 e vemion

M 0841 2

Genprobe

Accuprobe Mycobactedum avium complex

M 0840 2

Genprobe

Accuprobe Mycobacterium avium

M 0832 2

Genprobe

Accuprobre Mycobacterium intracellutaire

M 0842 2

Genprobe

Accuprobe Mycobacterium gordonae

M 0845 2

Genprobe

Accuprobe Mycobacterium kansasii

MON12

Genprobe

Accuprobe Streptococcus pneumoniae

M 0853 2

Genprobe

Accuprobe-strepto B

M 0854 2

Genprobe

Accuprobe Staphylococcus aureus

R 5819 2

Genprobe

Accuprobe Listeria monocytogenes

R 5020 2

Genprobe

Accuprobe Campylobacter

P 4234 2

Genprobe

Coffret amplified Chlamydia trachomatis

S 6199 2

Genprobe

Pace 2 Chlamydia trachomatis

S 6200 2

Genprobe

Pace 2/PCA Chlamydia trachomatis (test de competition par sonde)

M 0839 2

Pace 2 Neisseria gonorrhoeae

Genprobe

N3~72

Roche Diagnostics

Amplicor Mycobacterium tuberculosis d~tection

P 4702 2

Roche Diagnostics

Amplicor Mycobecterium amplification kit ,

Cobas Amplicor M. tuberculosis d~tection kit

P 4704 2

Roche Diagnostics

P 4705 2

Roche Diagnostics

Cobas Amplicor detection kit

R4833 2

Roche Diagnostics

Amplicor CTING amplification kit

R 4834 2

Roche Diagnostics

Cobas Amplicor ct d~tection

R0~62

Roche Diagnostics

Amplicor CTING Chlamydia trachomatis detection kit

- Bacteries presentes en petite quantite dans les produits pathologiques, infections decapitees par un traitement antibiotique : Neisseria gonorrhoeae chez la femme, Neisseria meningitidis. - Bacteries difficiles & identifier avec les tests conventionnels : mycobacteries atypiques. - Toxines bacteriennes : Corynebacterium diphtheriae, Clostridium difficile, souches de Staphylococcus aureus toxinogenes.

et la specificite des techniques commercialisees sont tr¢s elevees et proches de 100 %, la sensibilite etant nettement superieure & celle de la culture. L'amplification genique est ainsi devenue la methode de choix pour le depistage des infections & Chlamydia trachomatis. Les reactifs commercialises permettent d'associer & cette analyse la detection de Neisseria gonorrhoeae. 5.2.3. Autres

5.2. En France, les reactifs commercialises ne sont pas nombreux 5.2.1. D6tection directe de M. tuberculosis

Detection directe de M. tuberculosis par amplification genique (PCR, TMA ou LCR) dans des produits pathologiques divers, notamment respiratoires. Les taux de sensibilite et de specificite de la PCR et de la TMA sont equivalents et superieurs & 90 % dans la plupart des etudes. Dans certaines etudes oe le gold standard est I'existence ou non d'une tuberculose (definie par des arguments cliniques, radiologiques et bioIogiques), I'amplification genique apparait plus sensible que la culture. II semble que la LCR soit moins sensible que la PCR ou la TMA. 5.2.2. D~tection directe de Chlamydia trachomatis

Chez I'homme, un simple prelevementd'urine suffit, ce qui permet d'eviter la realisation d'un prelevement uretral desagreable. La sensibilite 40

Les sondes moleculaires permettent d'identifier un eventail plus large d'especes bacteriennes awes I'obtention d'une culture. Elles ont notamment permis de simplifier et d'accelerer les procedures d'identification des mycobacteries. Seul un petit nombre de reactifs de biologie moleculaire permettant d'effectuer un diagnostic bacteriologique est enregistre & I'Agence frangaise de securite sanitaire des produits de sante, conformement au decret 96-351 du 19 avri11996 (tableau I). 5.3. Autres applications D'autres techniques de biologie moleculaire ont un grand interet en bacteriologie, mais elles ne sont pas repandues dans les laboratoires car les affections concernees sent peu frequentes. Le tableau II cite les agents infectieux identifiables en biologie moleculaire en fonction du type de prelevement. RevueFran?aisedes Laboratoiree,septembre2001,N° 335

La PCR universelle ARNr 16S tend & 6tre utilis6e plus fr~quemment en cas d'infection d'un site normalement stdrile, notamment Iorsque des bact6ries rares et & croissance difficile peuvent ~tre en cause : endocardite, prostatite, infection oculaire, arthrite ou m~ningite. Dans le cadre des infections respiratoires, nous disposons actuellement de tests permettant I'identification de plusieurs bact6ries responsables de pneumopathie atypique : Mycoplasma pneumoniae, Ch/amydia pneumoniae, et Legionella pneumophila [4]. Concernant cette derni~re esp~ce, la plupart des biologistes pr6f~rent se contenter du test de d6tection de I'antig~ne urinaire. Pour I'etude de pr~16vements d'environnement, il faudrait pouvoir disposer de tests quantitatifs pour appr~cier le degre de colonisation par Legione//a

pneumophila. Dans certains cas, une pathologie sp6cifique est ~voqu~e. Par exemple, la maladie de Whipple est une maladie de syst~me pouvant affecter le tube digestif, le ceeur et le syst~me nerveux central. R6cemment encore, le diagnostic reposait uniquement sur les signes cliniques et I'examen anatomopathologique des 16sions. La PCR a permis d'identifier la bact6rie responsable. Tropheryma whippe/ii [8] en amplifiant I'ARNr 16S de pr61~vements biopsiques. De m~me. la PCR est un examen de choix pour le diagnostic des bartonelloses [5]. Elle peut 6tre r~alis~e & partir de cliff, rents prdl~vements (l~sions cutan~es, ad~nopathies, valves cardiaques), en utilisant des amorces sp~cifiques des Bartonel/a (r6g ions uniques de I'ARNr 16S par exemple) ou non sp6cifiq ues. Dans ce cas, la PCR doit ~tre compl~t6e par une RFLP ou une d~termination de la s~quence du produit amplifi6. En raison de la resurgence de la coqueluche observ6e en France chez les nourrissons non vaccines et contamin~s par des adultes pr6sentant une symptomatologie atypique, le diagnostic de la coqueluche est indispensable [3]. La PCR ;~ermet un diagnostic rapide, sans dispenser toutefois de la culture.

6. Conclusion E

| I ne faut pas utiliser les techniques de biologie mol6culaire Iorsque I les techniques traditionnelles font mieux et & un moindre coot. En effet, malgr~ des imperfections, les techniques usuelles poss~dent un avantage d~cisif de simplicit~ de mise en eeuvre et sont bien corr~16es avec les donn~es cliniques. C'est seulement en cas d'insuffisance de ces techniques que la bioIogie mol~culaire doit ~.tre utilis~e - bact6ries non cultivables ou n~ces-

Tableau II/Identifications bactdriennes r~alisables par detection gdnomique directe, selon le type de pr~l~vemenL Pr61bvement

Tous prtY~ements respiratoires

Lavage bronc~-alv6olaire, liquidepleural, aspiration bronchk:lue ~ d e gorge ~ Aspiration n a s o - p ~ - U ~ g~itale, liquide a m n ~

- UIc~ation g~dtale Urine, endocol et ur6tm

Pr~Wernent vaginal SeUes

ad~nopathies,

valves card~ques - Plasma, LCR, liquide articulaire, ~ - Resma, LCR, urines formof6es

Biopsies

[3] Guiao N;, Le diagnostic bioiogique de la coqueluche, Spectra BIOL 18 (101) (1999) 31-32.

I Streptococcus pyogenes

Bordetella pertussis Treponema pallidum . Haemophilus ducreyi Chlamydia trachomatis ; Neisseda gonorrhoeae ; Ureaplasma ureNyticum ; Mycop/asma genitalium ; Mycoplasma hominis Gardnerella vaginalis

Helicobacter pylori Ehdichia Rickettsia ~

,

Bartonella Borrelia burgdorfeti Leptospira Tropheryma whippe//i

sitant un temps d'incubation prolong6, difficult6s d'identification - ou pour diff~rencier une souche virulente d'une souche non pathog~ne. La g6n~ralisation des tests de biologie mol~culaire ne se fera probablement que Iorsque leur degr6 d'automatisation sera suffisant pour permettre une r~duction des co0ts financiers ou une 6conomie en personnels.

Remerciements : Nous remercions le d6partement diagnostique in vitro de I'Agence fran?aise de s6curit6 sanitaire des produits de sant6.

[4] levenM., Gocesens H., Relevanceof n u ~ acid amplification techniquesfor diagnosis of respiratory tract infections in She clinical laboratory, Ctin.

58 (2001) 29,38.

Mycobecterium tuberculosis ; M. avium ; M. xenopi ; Chlamydia pneumoniae ; Mycoplasma pneumoniae LegioneUapneumophila

~ dE. co// responsab~s de diatrh~

Biopsie gastrique - Sang total - Sang (couc~ l e ~ a i r e ) , b l o k e cutan~e (t~d~ noire)

L~ons c ~

F.spbco b a c t ~ e n n e

:

:

5

¸

!

[7] R e i ~ l U., Molecular diagnosis of infectious diseases,Methods in molecular medicine, Humane Prees (199e).

[(3] Persing D.H., Smith T.F.,TenoverEC,, White TJ,, Diagnostic molecular miombio!ogy : principles and applications, American society for m~bioiogy, Washington D;C. (1993). I

RevueFran?aisedes Laboratoires,septembre2001, N° 335

41