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Apport des cultures de moelle dans les syndromes myélodysplasiques
pport des culturesde moelle dansles syndromesmy@lodysplasiques d. Z I T T O U N *
RI=SUMf=
SUMMARY
Les cellules souches (CS) m~dullaires ne sont pas reconnaissables morphologiquement mais ont la capacit~ de produire en milieu semi-solide et en presence de facteurs de croissance (FC), des colonies d'o~ le nom de CFU (colony forming unit). On identifiera sur les cultures de CS de rares CFU-GEMM (granuleux, ~rythroi'des, monocytes, m~gacaryocytes), mais surtout des colonies d~riv~es de prog~niteurs unipotents : de la lign~e ~rythrorde, les CFU-E et leurs pr~curseurs les BFU-E, de la lign~e granulo-monocytaire les CFU-GM, de la lign~e m~gacaryocytaire les CFU-MK. A c6t~ des colonies, on peut identifier quelques clusters constitu~s d'un groupe de 3 d 40 cellules correspondant d des colonies abortives. Les cultures de CS m~dullaires sont une m~thode de choix pour analyser le compartiment des CS, comprendre leur r~gulation et le mode d'action des facteurs impliqu~s dans leur proliferation et leur diff~renciation. Elles constituent un appoint diagnostic dans des affections o~ cette r~gulation est prise en d~faut comme les syndromes my~lodysplasiques (SMD). Les SMD constituent un groupe d'affections clonales de la CS pluripotente pr~sentant un d~s~quilibre entre la proliferation et la diff~renciation, responsable d'une h~matopo'1~se inefficace. Les SMD pr~sentent le plus souvent des anomalies caract~ristiques en culture de moelle. La capacit~ d former des colonies in vitro des CS est soit nulle soit tr~s diminu~e avec predominance de clusters et rapport clusters~colonies ~lev~. Un nombre diminu~ de colonies est frequent et l'analyse de ces colonies montre souvent un exc~s de formes immatures. Parfois, les cultures montrent un nombre de colonies sensiblement normal mais l'aspect morphologique des colonies montre des anomalies m~me d minima. L'effet de plusieurs FC ou d'agents diff~renciants a ~t~ test~ sur la croissance des CS dans les SMD mais les r~ponses d ces FC sont souvent partielles ou nulles comparses d celles observ~es sur les CS normales. En outre, dans les SMD, les FC produits par le microenvironnement (ME) m~dullaire sont diminu~es t~moignant donc d'une anomalie du ME. Les cultures de moelle dans les SMD constituent un compl~ment d'information d l'analyse morphologique et cytog~n~tique et ont un certain degr~ de valeur pronostique. Elles permettront probablement par le choix d'association de FC de d~finir une strat~gie th~rapeutique capable d'induire une diff~renciation et donc de corriger le d~s~quilibre entre proliferation et diff~renciation qui est la l~sion critique dans ce groupe d'affections clonales.
Bone marrow hematopoietic stem cells are not distinguishable from other lymphocyte - like cells morphologically but they can be revealed by marrow culture techniques owing to their ability to form colonies in semisolid medium in presence of growth factors. They are then defined as colony forming unit (CFU). The earliest detectable hematopoietic progenitor cell which gives rise to granulocytes, erythroblasts, monocytes and megacaryocytes is termed CFU-GEMM ; more mature and specialized precursor cells are termed CFU-GM for the granulocyte-monocyte lineage, CFU-E and its earlier progenitor BFU-E (burst-forming unit) for the erythrord lineage and CFU-MK for the megacaryocyte lineage. Besides colonies, some clusters of cells (3 to 40 cells) corresponding to abortive colonies can be also identified. In vitro bone marrow cultures provide a good method to analyze the stem cell compartment and to improve the understanding of the regulation of hemopoiesis and the functional action of growth factors involved in their proliferation and differentiation. Marrow cultures also provide a complementary evaluation of marrow morphology and cytogenetics in diseases in which regulation and differentiation are defective such as myelodysplastic syndromes (MDS). MDS are a group of clonal diseases of the plurfpotent stem cell presenting with an uncoupling between proliferative and differentiative abilities leading to ineffective hemopoiesis. MDS have a defective in vitro colony formation in most of the cases. The ability of progenitors to form colonies is reduced or absent with a predominance of clusters and clusters~colonies ratio increased. The analysis of colonies can show an excess of immature forms. Even if a normal number of colonies is found, the morphology of these colonies is generally abnormal. The effect of growth factors or differentiating agents has been tested on the growth of stem cells in MDS but the responses were often poor or null compared to those observed on normal stem cells. In addition, in MDS, growth factors produced by bone marrow microenvironment are decreased probably due to a concomitant abnormality of the microenvironment. Bone marrow cultures which constitute a model to test the growth factors and other differentiating agents could help to define a therapeutic approach to improve the uncoupling between proliferation and differentiation which is the critical lesion in these clonal diseases.
MOTS-CLf:S
KEY-WORDS
cellules souches - colony forming unit (CFU) - clusters facteurs de croissance - proliferation - diff~renciation.
stem cells - colony forming unit (CFU) - clusters -growth factors - proliferation - differentiation.
*Service d'h~rnatologie biologique - H6pital Henri-Mondor 51, av. du ,Mar~chal-de-Lattre-de-Tassigny 94010 CRETEIL CEDEX Revue frangaise des laboratoires, mai 1996, N ° 284
TIRES A PART : Mine le Dr J. ZITTOUN article regu le 8 d~cembre 1995, accept~ le 11 mars 1996. 39
Introduction Les syndromes my61odysplasiques (SMD) sont un groupe d'affections h6t6rog6nes de l'h6matopo'f6se caract6ris6es par une h6matopo'f6se hyperprolif6ratire mais inefficace associ6e ~ des anomalies morphologiques de la moelle osseuse. Ces maladies acquises de l'h6matopo'i6se sont associ6es ~ des cytop6nies progressives et r6fractaires, refl6tant des anomalies dans la diff6renciation et la maturation 6rythro'/de, granulomonocytaire et m6gacaryocytaire (11). Le groupe coop6ratif franco-am6ricain-britannique (FAB) a propos6 une classification morphologique de ces affections dans laquelle cinq sous-types sont individualis6s : an6mie r6fractaire (AR), an6mie r6fractaire avec sid6roblastes en couronne ou an6mie sid6roblastique acquise idiopathique (ASAI), an6mie r6fractaire avec exc6s de blastes (AREB), AREB en transformation (AREB-T) et enfin leuc6mie my61omonocytaire chronique (LMMC) (2). Ces diff6rents sous-types refl6tent diff6rentes 6tapes dans la leuc6mogen6se, les AREB et AREB-T ayant un risque tr6s 61ev6 de transformation en leuc6mie aigu~ my61o'/de. Ce fait est objectiv6 dans les diff6rences observ6es dans ia progression de l'affection parmi les sousclasses du FAB avec une m6diane de survie variant de 30 ~ 80 mois dans les AR et ASIA ~ 5 mois dans les AREB ou AREB-T (20).
L'anomalie essentielle des SMD se situe au niveau d'une atteinte de la cellule souche pluripotente responsable du d6veloppement de la my61odysplasie. La nature clonale des SMD a 6t6 prouv6e par la d6tection d'anomalies chromosomiques dans pr6s de 70 % des cas de SMD (12). L'analyse de l'inactivation du chromosome X a montr6 chez la plupart des malades 6tudi6es un profil monoclonal d'inactivation de ce chromosome ; en effet, l'6tude des deux iso-enzymes de la G6PD chez les femmes h6t6rozygotes pour cette enzyme et pr6sentant un SMD a r6v616 la pr6sence d'une seule iso-enzyme. Des 6tudes plus r6centes utilisant les techniques d e biologie mol6culaire ont confirm6 le caract6re cional des SMD chez des femmes h6t6rozygotes pour des enzymes situ6es sur le chromosome X, essentiellement G6PD, PGK, HPRT (13). L'atteinte de la cellule souche pluripotente induit un d6s6quilibre entre les capacit6s de prolif6ration et de diff6renciation des pr6curseurs h6matopo'i6tiques aboutissant ~ une h6matopo'i6se inefficace, cons6quence de la diff6renciation d6fectueuse.
I. Les cellules souches h6matopoT6tiques et les facteurs de r6gulation (3o) 1. L e s c e l l u l e s s o u c h e s h6matopo'i6tiques
et les prog6niteurs
FIGURE 1 Sch6ma simplifi6 de l'h~matopo'/6se et site d'action des principaux facteurs de croissance
iuiiiiei°iii'iiii' Totipotent~
CFU-S
Pr6cellulesT
l
Pr~cellulesB
'
CellulesT
CellulesB
//.3 GM-CSF
CellulesSouchespluripotentes CFU-GEMM CFU-mix
CFU-baso
BFU-Eprimitives
BFU-MK
CFU-GM I GM-CSF
CFU-~osino
BFu/.L~E!atures
P°~I~F~ "E Pro~rythroblaste
I
CFU-MK
CFU-G
CFU-M
M~gacaryocyte My61oblaste Monoblaste
I
]
I
11 existe une hi~rarchie de cellules souches h~matopo'f~tiques (figure 1) : - l e s cellules souches totipotentes & potentialit~ my~Io'fde et lympho'fde sont des cellules souches tr~s primitives & haut pouvoir d'auto-renouvellement, capables apr~s irradiation totale de reconstituer l'h~matopo'f~se. Ces cellules souches totipotentes, ceUules hors cycle pour la quasi-totalitY, constituent un pool tr~s faible ; - l e s cellules souches multipotentes & potentialit~ my~Io'fde, communes aux lign~es granuleuses, ~rythro'fde, monocytaire et m~gacaryocytaire, sont des cellules ayant une plus forte capacit~ de proliferation que d'auto-renouvellement, la majeure partie des cellules ~tant aussi hors cycle ; - l e s cellules souches d~termin~es ou engag~es irr~versiblement vers une seule lign~e sont aussi appel~es cellules "commises" par analogie avec le terme anglo-saxon "committed stem cells". Ce sont les prog~niteurs h~matopdf~tiques qui poss~dent des capacit~s d'auto-renouvellement tr~s faibles voir nulles, la plupart ~tant dans le cycle cellulaire. Les cellules souches ne sont pas reconnaissables morphologiquement contrairement aux pr~curseurs m~dullaires identifiables sur un frottis de moelle. Les cellules souches ne sont d~tect~es que par leur aptitude & former in vitro des colonies en milieu semi-solide d'o~ le nom de CFU pour colony forming unit, en presence de facteurs de croissance polyvalents ou multilign~es ou plus sp~cifiques & l'une des lign~es. Les cellules souches totipotentes ont ~t~ mises en ~vidence par la technique des colonies spl~niques d'o~ le nom de CFU-s pour spleen, dues & leur capacit~ & former des colonies sur rates de souris totalement irradi~es apr~s injection de cellules m~dullaires en suspension. Les cellules multipotentes d~nomm~es CFU-GEMM (granuleux, ~rythro'fde, monocyte/macrophage, m~gacaryocyte) ou encore appel~es CFU-mix sont d~tect~es en milieu semisolide apr~s 15 & 21 jours de culture en presence de facteurs de croissance multilign~es notamment I'lL3 et le GM-CSF. Les cellules souches d~termin~es sont sp~cifiques de chacune des lign~es.
1.1. Les prog~niteurs ~rythroides Polynucleaire Basophile
40
Globule rouge
Plaquette
Polynucl6aire Monocyte/ Neutrophile Macrophage
Polynucl6aire Eosinophile
Identifies in vitro, ils sont de deux types : - l e s CFU-E, colonies de petite taille (10 A 50 cellules) bien h~moglobinis~es apparaissant apr~s 7 jours de culture en Revuefrangaisedes laboratoires,mai 1996,N° 284
presence d'~rythropo'i~tine ; ce sont les CFU-E qui, apr~s quelques divisions cellulaires, donneront naissance au premier pr~curseur ~rythro'~de morphologiquement reconnaissable sur un frottis de moelle, le pro~rythroblaste ; - ]es BFU-E, ascendants des CFU-E, sont des ceUules souches plus immatures, dont une partie est hors cycle. Elles apparaissent d~s le 14 ~jour de culture sous forme de grosses colonies constitutes par plusieurs agr~gats ou sous-colonies ; au sein des BFU-E, il faut distinguer les BFU-E primitives, d'apparition tardive et d~pendant de facteurs de croissance multilign~es comme I'lL3 ou multi CSF et les BFU-E matures d'apparition plus pr~coce, entre le 10 ~ et le 15 ' jour de culture, partiellement d~pendantes de l'~rythropo'i~tine.
1.2. Les ceilules souches granulo-monocytaires Au sein desquelles, on distingue les CFU-G (granuleuse) qui apparaissent d~s le 8" jour de cultures et sont d~pendantes de facteurs de croissance tel que le G-CSF et le GM-CSF ; ces colonies sont constitutes de plus de 50 cellules & diff~rents stades de maturation allant du my~Ioblaste au polynucl~aire neutrophile. Les CFU-M (monocyte/macrophage) sont d'apparition plus tardive, vers le 14 ~ jour de culture et sont d~pendants du GM-CSF et du M-CSF. Ces derni~res sont constitutes essentiellement de monocytes plus ou moins matures et de macrophages. En pratique, on regr0upe les CFU-G et les CFU-M sous le terme de CFU-GM. A c6t~ des CFU-GM, il faut noter la presence dans les cultures de moelle osseuse, m~me de moelle normale, de quelques dusters constitu~s par des petits agr~gats de cellules allant de 3 & 50 cellules correspondant & des colonies abortives.
1.3. Les cellules s o u c h e s m(~gacaryocytaires Elles forment des colonies d~nomm~es CFU-MK et BFU-MK : - les CFU-MK sont difficiles ~ reconna~tre dans les conditions habituelles de culture. Elles sont constitutes de m~gacaryocytes, de 3 & 50 cellules, et apparaissent chez l'homme apr~s 10 & 12 jours de culture. EUes sont sensibles & I'lL-3, moins au GM-CSF et & l'~rythropo'i~tine, mais surtout au Mpl ligand anciennement d~nomm~ thrombopo~'~tine (31) ; -les BFU-MK sont les prog~niteurs les plus primitifs de la lign~e m~gacaryocytaire. Elles sont constitutes de colonies plus grosses organis~es en plusieurs sous-colonies apparaissant chez l'homme vers le 21 ° jour de culture. Les ~tapes de la diff~renciation cellulaire au sein des ceilules souches sont r~gul~es par diff~rents facteurs de croissance h~matopo'i~tiques qui deviennent d'autant plus sp~cifiques qu'ils concernent des cellules plus diff~renci~es. En fait, cette diff~renciation assur~e par les compartiments des cellules souches engag~es permet une ~norme amplification du pool des cellules souches.
action plus polyvalente et agit sur cliff,rents types de prog~niteurs. II est synth~tis~ par plusieurs types cellulaires dont les macrophages. Le G-CSF est essentiellement actif sur la lign~e granuleuse neutrophile. II exerce une activit~ de differentiation plus que de proliferation. Le M-CSF stimule la formation de colonies de monocyte/macrophage chez la souris mais non chez l'homme. Le Mpl ligand, Iongtemps appel~ thrombopo'i~tine avant son r~cent isolement et clonage, est le facteur stimulant sp~cifiquement la lign~e m~gacaryocytaire (31). L'~rythropo~tine, synth~tis~e par les ceUules p~ritubulaires ou les cellules interstitielles du rein, est un facteur stimulant les prog~niteurs matures de la lign~e ~rythroYde surtout les CFU-E et, & un degr~ moindre, les BFU-E matures. EUe agit aussi sur les temps tardifs de la diff~renciation de la lign~e rouge au niveau des pr~curseurs de l'~rythrocyte. A c6t~ des facteurs de croissance multilign~s ou sp~cifiques, il existe des facteurs de croissance qui agissent en synergie en exerqant une action soit sur les temps pr~coces soit sur les temps tardifs de l'h~matopdi~se. - L ' I L I est synergique des autres facteurs de croissance h~matopo'i~tiques. Elle a une action sur les cellules du stroma m~dullaire et induit la synth~se du GM-CSF et de I'lL3. - L ' I I 6 est synergique de I'lL3 et du GM-CSF. Elle a une action proche de I'lL1 sur les temps pr~coces de l'h~matopo'i~se. - Le c-Kit l i g a n d o u s t e m c e l l f a c t o r ou mast cell factor a une action synergique des autres facteurs de croissance sur les cellules souches totipotentes et tr~s immatures, les CFU-mix mais aussi sur les pr0g~niteurs d~termin~s notamment les BFU-E. II augmente le nombre et la taille des colonies. A c6t~ des facteurs de croissance stimulants et synergiques, il existe des facteurs inhibiteurs de l'h~matopo'i~se qui modulent l'action des facteurs stimulants. On peut citer les prostaglandines, les gamma-interferons, la lactoferrine ou le LIA (leukemia associated inhibitory activity) (8). Des r~cepteurs distincts ont ~t~ identifies pour chacun des facteurs de croissance. L'expression de ces r~cepteurs & la surface des cellules souches varie avec l'~tat de diff~renciation de la ceUule. Ainsi la diminution des r~cepteurs & la surface des cellules souches tr~s immatures coincide avec une augmentation des r~cepteurs sp~cifiques de ceUules souches plus matures. Par exemple, le nombre de r~cepteurs & l'~rythropo'i~tine, tr~s faible & la surface des BFU-E primitives, augmente sur les BFU-E matures pour atteindre son expression maximale sur les CFU-E. L'activation des r~cepteurs par les facteurs de croissance initie la transduction du message jusqu'au noyau. Les facteurs de croissance stimulent l'entr~e en cycle des cellules et la division celiulaire en agissant surtout sur la phase G I .
2. Les facteurs h~matopo'i~tiques (30,31) Les facteurs de croissance ont ~t~ identifies par leur aptitude stimuler la formation de colonies in vitro d'oe leur nom de CSF (colony stimulating factor), lls sont pour la plupart synth~tis~s par les cellules accessoires dans la moelle osseuse (macrophages, lymphocytes T, cellules NK, cellules endoth~liales, fibroblastes,...), lls agissent Iocalement (action para-
crine) sur les cellules adjacentes. Seule l'~rythropo'f~tine, sp~cifique de la lign~e ~rythro'fde est une hormone synth~tis~e par le rein et qui agit & distance. Certains facteurs de croissance ont une action polymorphe : c'est le cas de l'interleukine 3 (IL3) ou multi CSF. L'IL3, essentiellement produite par les cellules T, a des propri~t~s de stimulation des CFU-s, des CFU-mix ou des CFUGEMM mais aussi des prog~niteurs d~termin~s & l'exception des CFU-E enti~rement d~pendantes de l'~rythropo'i~tine. L'IL3 est capable & lui seul d'induire des colonies de granuleux, monocytes/macrophages, ~osinophiles, m~gacaryocytes, mais l'addition d'~rythropo'~'~tine est indispensable & la formation de CFU-E. Le GM-CSF, originellement connu comme un facteur plus sp~cifique de la lign~e granulo-monocytaire, a en fait une Revue frangaise des laboratoires, mai 1996, N ° 284
3. M~thodes d'~tude des cellules s o u c h e s h~matopo'i~tiques Le syst~me de culture de cellules clonog~niques m~dullaires, cellules capables de former des colonies in vitro, fournit une m~thode de choix pour analyser les compartiments des cellules souches/prog~niteurs m~dullaires, pour comprendre leur r~gulation et le mode d'action des facteurs impliqu~s dans leur proliferation et leur diff~renciation. II constitue aussi une aide diagnostique utile dans des affections oe cette r~gulation est prise en d~faut telle que les SMD ou les syndromes my~Ioprolif~ratifs. La technique la plus couramment utilis~e est la culture de cellules m~dullaires en milieu semi-solide, agar, methyl cellulose ou plasma coagul~. Les cellules m~dullaires sont pr~lev~es sur anticoagulant sans conservateur puis les cellules mononucl~es sont isol~es apr~s centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque, lav~es, num~r~es et raises en culture en petites bootes de P~tri ou en puits dans un milieu appropri~. Ce milieu de culture appel~ IMDM (iscove's modified dulbecco's medium) contient habi41
tuellement 20 % de s~rum de veau foetal enrichi en facteurs de croissance sous forme de PHA-LCM (phytohemagglutinim-stimulated leucocyte conditioned medium) (1). Le LCM est pr~par~ & partir de culture de cellules du sang p~riph~rique obtenu d e donneurs volontaires. Un milieu conditionn~ placentaire peut @tre utilis~ & la place du PHA-LCM comme source de CSF (27). Les cellules m o n o n u c l ~ e s ensemenc~es dans ces milieux sont incub~es & 37 °C en atmosphere de 5 % de CO 2 et les colonies form~es sont num~r~es habituellement entre le 7 ~ et le 14 ~ ou parfois le 21 ° jour de culture. Pour ~tudier l'effet des facteurs de croissance sp~cifiques, ]a culture est pratiqu~e dans un milieu sans s~rum qui est remplac~ par un milieu contenant de la transferrine satur~e en fer et/ou de l'insuline ainsi qu'une suspension de lipides (25). Chacun des facteurs de croissance peut @tre alors ajout~ individueUement et l'effet stimulant de ces facteurs sur la formation de colonies est appr~ci~ apr~s incubation dans les conditions indiqu~es pr~c~demment. Le nombre des colonies est habituellement rapport~ & 105 cellules m o n o n u c l ~ e s ensemenc~es. Dans les moelles normales, ce nombre varie selon les sujets et les conditions de culture. Pour les colonies ~rythro'fdes et granulomonocytaires, il est g~n~ralement sup~rieur & 50 colonies pour 105 cellules. A c6t~ des colonies granuleuses, constitutes de plus de 50 cellules, il faut noter la presence de clusters, agr~gats de cellules allant de 3 & 40 cellules. Le nombre de clusters est aussi tr~s variable mais exc~de rarement 50 pour 105 cellules mononucl~es. Les valeurs sus cities sont tr~s approximatives et ne sont donn~es qu'& titre indicatif pour permettre la comparaison avec les r~sultats obtenus dans les SMD. Alors que les CFU-GM, les CFU-E et BFU-E sont ais~ment reconnaissables, les colonies d'~osinophiles, de basophiles et de m~gacaryocytes ne peuvent ~tre reconnues qu'apr~s coloration sp~ciale soit cytochimique pour les CFU-eosino et baso soit immunoperoxydasique pour les CFU-MK utilisant des anticorps monoclonaux dirig~s contre la glycoprot~ine liB/IliA situ~e & la surface des m~gacaryocytes. A c6t~ des cultures en milieu semi-solide, il est possible d'effectuer des cultures en milieu liquide mais ces derni~res ne permettent qu'un certain nombre de divisions cellulaires et n'ont d'int~r~t que pour ~tudier la diff~renciation des cellules notamment sous l'effet de certains facteurs de croissance. Enfin les cultures & long terme de moelle osseuse (LTBMC ou long term bone marrow culture) peuvent ~tre utilis~es pour des indications plus sp~cifiques notamment l'~tude du microenvironnement m~dullaire. Elle consiste & reconstituer in vitro le micro-environnement m~dullaire par ensemencement de cellules m~dullaires dans des flacons contenant un milieu sp& cifique pour culture & long terme ; le micro-environnement une fois reconstitu& apr~s quelques semaines de culture, fournit les facteurs de croissance sp~cifiques & la croissance de colonies & partir de prog~niteurs ensemenc~s sur ces cellules adh~rentes.
2. Les culturesde cellulessouches/ prog niteurs h matopdf6tiques dans lesSMD Les SMD pr~sentent, dans la majorit~ des cas, des aspects de culture.in vitro tr~s anormaux t~moignant d'anomalies des cellules souches au niveau de la proliferation et de la diff~renciation (14, 19). La capacit~ & former des colonies de tous les prog~niteurs h~matopo'f~tiques est diminu~e ou absente dans la majorit~ des cas de SMD (8). Ce profil in vitro ressemble & celui observ~ dans les leuc~mies aigu~s my~Io'fdes, comportant une diff~renciation et une maturation my~Io'fde d~fectueuse, avec g~n~ration de clusters my~Io'fdes abortifs, microclusters de 3 42
10 cellules ou macroclusters de I 0 & 40 cellules. La plupart des prog~niteurs sont hors cycle et une proportion importante de colonies de densit~ l~g~re semblables & celles des colonies form~es dans les leuc~mies aigu~s my~Io'fdes est observ~e (9). Concernant les CFU-GM, l'aspect de culture le plus couramment observ~ est une formation r~duite de colonies granulomonocytaires voire une disparition de ces colonies. Dans certains cas, une pousse excessive de colonies est observ~e mais l'analyse morphologique de ces colonies montre une pr~dominance de formes immatures avec anomal~s de maturation
(3, 5, 9).
Aussi importante que la faible capacit~ & former in vitro des colonies granulomonocytaires est l'augmentation du nombre de clusters ainsi que le rapport nombre de clusters/nombre de colonies. Cette augmentation dans la capacit~ & former des clusters associ~e & une baisse du nombre des colonies accompagne voire precede la transformation en leuc~mie aigu~ (9). Ce profil anomal de culture est surtout le fait des AREB et des AREB-T. Un nombre normal ou m~me ~lev~ de colonies peut @tre observ~ dans les cytop~nies r~fractaires sans exc~s de blastes, AR ou ASAI ou encore dans les LMMC (7, 8) ; dans ce dernier cas, l'incidence ~lev~e de colonies et m~me de clusters est possiblement due & des taux ~lev~s de cytokines associ~e au nombre ~lev~ de monocytes de la moelle. Le nombre de colonies d~rivant des prog~niteurs ~rythro'fdes est variable (4). La diminution du nombre de CFU-E est discr~te dans les AR mais beaucoup plus marquee dans les AREB allant jusqu'& l'absence de colonies ~rythro'fdes (19, 23). Dans une ~tude portant sur 44 cas de malades pr~sentant un SMD, 3 seulement avaient un nombre normal de colonies BFU-E alors que la formation de colonies CFU-E a ~t~ trouv~e anormale dans tousles cas (23). L'aspect des colonies granulomonocytaires et ~rythro'fdes est aussi un ~l~ment important. Dans les SMD, nous avons observe, outre la diminution du nombre des colonies CFUGM, des aspects anormaux de ces colonies constitutes de cellules r~tract~es ou d'agr~gats de clusters. Les colonies ~rythro'fdes, notamment les BFU-E sont souvent de taille inf~rieure & la normale et plus faiblement h~moglobinis~es que les BFU-E form~es & partir de prog~niteurs ~rythro'fdes normaux.
Une ~tude plus fine a ~t~ r~cemment r~alis~e pour tenter d'expliquer le m~canisme responsable de la croissance anormale in vitro des prog~niteurs h~matopo'f~tiques chez les malades atteints de SMD (26). Cette ~tude a ~t~ r~alis~e sur une population purifi~e de cellules souches CD34+ isol~es par immunoph~notypage & l'aide d'anticorps monoclonaux. L'antig~ne CD34 est exprim~ & la surface de la majorit~ des cellules souches multipotentes formant des colonies, CFUblast, CFU-GEMM ainsi que sur les cellules clonog~nes bipotentes ou unipotentes, CFU-GM, CFU-MK, BFU-E et aussi sur les pr~curseurs lympho'fdes. L'expression de l'antig~ne CD34 d~cro~t au fur et & mesure de la maturation et les prog~niteurs les plus tardifs ~rythro'fdes, granuleux, m~gacaryocytaires sont faiblement positifs ou n~gatifs pour le CD34. Cet antigone n'est pas d~tect~ sur les cellules plus matures de la moelle ou du sang. Cette ~tude a ~t~ r~alis~e sur les cellules CD34+ de 12 patients atteints de SMD dont 3 ont ~t~ ~tudi~s & deux reprises et la croissance a ~t~ compar~e & celle de ceUules CD34+ normales : il est apparu une grande diversit~ dans le profil de cultures in vitro des CD34+ provenant de SMD ; dans 7 cas, le nombre total de colonies et clusters d~riv~s des CD34+ de SMD ne diff~rait pas statistiquement de celui des CD34+ normales. Dans 6 cas, le nombre de colonies et de clusters ~tait bas tandis qu'un nombre ~lev~ de colonies et de clusters ~tait observ~ chez 2 cas. Le rapport nombre de clusters/nombre de colonies variait d'un patient & l'autre avec une majorit~ de clusters par rapport aux colonies. Cette ~tude a eu le m~rite de mettre en relief la capacit~ anormale de diff~renciation des cellules CD34+ dans les SMD. Alors que la composition des colonies ou des clusters des CD34+ normaux comportait un m~lange de CFU-GEMM, de CFU-GM, de BFU-E, de CFU-E, en nombre relativement constant, seul un malade pr~sentant un SMD avait un nombre de colonies & composition sensiblement comparables & celles Revue frangaise des laboratoires, mai 1996, N ° 284
des CD34 normaux. Une croissance anormale des colonies ~tait observ~e dans les 14 autres cas ~tudi~s soit sous forme d'un nombre augment~ de clusters ou d'une absence de colonies et de clusters ou encore dans 9 cas un nombre diminu~ de colonies ~rythro'fdes voire une absence, avec un nombre augment~ de clusters. L'analyse morphologique a montr~ une proportion accrue de colonies constitutes par des blastes dans 70 % des cas. Si globalement l'aspect de cultures in vitro est anormal dans les SMD, il faut ~tablir une hi~rarchie dans le degr~ d'anomalies. On peut sch~matiquement observer cinq types de profils de cultures dans les SMD : - un aspect tr~s voisin de celui observ~ dans les moelles normales : c'est parfois le cas de certains malades pr~sentant des AR sans exc~s de blastes ou des ASAI mais un examen minutieux de l'aspect des colonies r~v~le des anomalies m~me minima ; - une diminution tr~s importante de colonies my~IoYdes avec un rapport clusters/colonies ~lev~. Cet aspect peut se voir dans des AR en voie d'~volution ; - u n e absence compl~te de colonies associ~e soit & une absence de clusters, soit & un nombre ~lev~ de clusters ; - u n e expression de colonies constitutes essentiellement de blastes avec une proportion infime ou nulle de colonies compos~es de cellules matures. Ces deux derni~res situations sont couramment observ~es dans les AREB ou les AREB-T. II a ~t~ trouv~ une correlation entre la croissance my~Io'fde in vitro de type "leuc~mique", ]es anomalies cytog~n~tiques et le mauvais pronostic (6). D'ailleurs les ~tudes cytog~n~tiques pratiqu~es dans les SMD ont montr~ des anomalies chromosomiques dans plus de 80 % des AREB et AREB-T (12). Six ~tudes regroupant 179 malades pr~sentant un SMD et incluant les diff~rents sous-types morphologiques du FAB ont montr~ une correlation entre l'~volution clinique et la croissance des prog~niteurs m~dullaires in vitro (9). Les sousgroupes de patients avec des profils de croissance non leuc~miques c'est-&-dire un nombre normal ou r~duit de colonies avaient une incidence de transformation en leuc~mie aigu~ my~Io'fde comprise entre 21 et 40 % avec une m~diane de survie entre 9 et 50 mois, alors que les patients avec profils de culture de type leuc~mique avaient une incidence de transformation entre 50 et 80 % et une m~diane de survie entre 5 et 10 mois.
3. L'effet des facteurs de croissance sur les cellules souches/prog( niteurs h rnatopdk tiques dans les SMD Actuellement les travaux sur les cultures de prog~niteurs dans les SMD tentent d'~tudier l'effet de diff~rents agents diff~rentiants ou de diff~rentes cytokines pour mieux comprendre la physiopathologie de cette affection au niveau des cellules souches et essayer de d~finir une meilleure strat~gie th~rapeutique. En effet la l~sion critique sous-tendant cette affection repose sur le d~s~quilibre entre proliferation et diff~renciation au niveau de la cellule souche h~matopo'f~tique (24). La finalit~ des agents diff~renciants et des facteurs de croissance est d'induire une diff~renciation afin de r~duire la capacit~ des cellules souches leuc~miques & s'autorenouveler in vitro et de contr61er ainsi la leuc~mogen~se. Une ~tude ~valuant l'effet des agents diff~renciants tel que l'acide 13 cis r~tino'fque, le 1,25 dihydroxy vitamine D3 sur les cellules clonog~nes de moelles de sujets atteints de SMD a montr~ une augmentation du nombre de CFU-GM mais une diminution du nombre de BFU-E alors que celui des CFUGEMM restait stable (28). L'acide r~tino'fque pouvait induire une diff~renciation du clone leuc~mique. L'effet du GM-CSF et du G-CSF a ~t~ ~valu~ sur la capacit~ de proliferation et de diff~renciation de cellules m~dullaires Revue frangaise des laboratoires, rnai 1996, N ° 284
immatures provenant de patients pr~sentant un SMD compar~e & celles de sujets normaux (15, 21). Cette ~tude a montr~ une clonog~nicit~ des pr~curseurs my~Io'fdes (CFU-GM) et ~rythro'fdes (BFU-E) diminu~e m~me en presence de ces facteurs dans les SMD compar~e & celle des cellules contr61es. Cependant, le GM-CSF avait des propri~t~s de stimulation plus puissantes que le G-CSF sur les CFU-GM de sujets ayant un SMD. Cette stimulation ~tait encore plus nette chez les malades pr~sentant des anomalies cytog~n~tiques que chez ceux qui avaient un caryotype normal (22). La proliferation cellulaire ~tudi~e en culture en milieu liquide chez des patients atteints de SMD n'~tait pas augment~e en presence de GM-CSF ou de G-CSF. Toutefois, le G-CSF induisait une diff~renciation granulocytaire sup~rieure au GMCSF que ce soit A partir de cellules my~Io'fdes immatures de sujets normaux ou de patients ayant un SMD. Cette capacit~ de diff~renciation induite par le G-CSF ~tait particuli~rement nette dans les AREB et AREB-T (22). Dans les cultures en milieu liquide, le GM-CSF et le G-CSF diminuaient aussi la r~g~n~ration clonale my~Io'fde et favorisaient la diff~renciation my~Io'~de dans les SMD. Chez des malades mis en r~mission par un traitement au GM-CSF, il a ~t~ constat~ que l'h~matopo'i~se non clonale ~tait r~apparue et le clone n~oplasique avait disparu (10, 29). Dans une autre ~tude, l'effet du G-CSF, du GM-CSF et de l'IL3 test~ sur une population purifi~e de cellules CD34+ obtenues & partir de 11 malades atteints de SMD a montr~ une r~ponse diminu~e, voire une absence de r~ponse des CD34+ & la stimulation par ces cytokines compar~e & celle observ~e chez les sujets t~moins (25). La croissance des colonies ~rythro'fdes dans les SMD a aussi montr~ des r~ponses anormales ~ l'~rythropo'i~tine (16, 17), ce qui indique que l'an~mie dans les SMD n'est pas due & une anomalie dans la capacit~ de l'~rythropo'~'~tine & g~n~rer des CFU-E mais plut6t & un compartiment r~duit de BFU-E. Les effets de I'lL1 et I'lL6 en association avec le GM-CSF ont ~t~ aussi ~valu~s sur la formation des colonies provenant de prog~niteurs my~Io'fdes de malades ayant des SMD. Dans la majorit~ des cas analys~s, un effet de potentialisation de I'lL1 et I'lL6 sur le GM-CSF a ~t~ observe. L'IL1 et I'lL6 ont probablement des effets indirects en augmentant la production de GM-CSF et d'IL3 par les cellules accessoires de la moelle osseuse (18). La production des facteurs de croissance h~matopdf~tiques a ~t~ aussi analys~e dans les SMD par les m~thodes de culture long termeo Les cellules m~dullaires et les cellules du sang p~riph~rique de malades souffrant de SMD produisaient des taux diminu~s de GM-CSF, d'IL3, de G-CSF, de M-CSF et d'IL6 (16, 32). Ainsi la production d~fectueuse de certains facteurs de croissance ajout~e & la r~ponse diminu~e des prog~niteurs Aces facteurs contribue ~ l'h~matopo'i~se inefficace dans les SMD.
Conclusion En conclusion, les cultures de cellules donog~niques m~dullaires dans les S M D constituent des m~thodes d'analyse du compartiment des cellules souches h~matopo'i~tiques et des facteurs humoraux impliqu~s dans la r~gulation de ia proliferation et de la diff~renciation de ces cellules souches. Elles fournissent un compl~ment d'informations l'analyse morphologique et cytog~n~tique de la moelle dans ces affections h~t~rog~nes et ont un certain degr~ de valeur pronostique. En outre, les ~tudes concernant l'effet des facteurs de croissance sur la formation de colonies et l'induction de la diff~renciation peut ~tre une aide au choix th~rapeutique en sachant que la l~sion critique sous-tendant ce groupe h~t~rog/me d'affections de nature clonale est un d~s~quilibre entre la proliferation et la diff~renciation. 43
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Revuefrangaisedes laboratoires,mai 1996, N° 284
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SUMMARY
Les cellules souches (CS) m~dullaires ne sont pas reconnaissables morphologiquement mais ont la capacit~ de produire en milieu semi-solide et en presence de facteurs de croissance (FC), des colonies d'o~ le nom de CFU (colony forming unit). On identifiera sur les cultures de CS de rares CFU-GEMM (granuleux, ~rythroi'des, monocytes, m~gacaryocytes), mais surtout des colonies d~riv~es de prog~niteurs unipotents : de la lign~e ~rythrorde, les CFU-E et leurs pr~curseurs les BFU-E, de la lign~e granulo-monocytaire les CFU-GM, de la lign~e m~gacaryocytaire les CFU-MK. A c6t~ des colonies, on peut identifier quelques clusters constitu~s d'un groupe de 3 d 40 cellules correspondant d des colonies abortives. Les cultures de CS m~dullaires sont une m~thode de choix pour analyser le compartiment des CS, comprendre leur r~gulation et le mode d'action des facteurs impliqu~s dans leur proliferation et leur diff~renciation. Elles constituent un appoint diagnostic dans des affections o~ cette r~gulation est prise en d~faut comme les syndromes my~lodysplasiques (SMD). Les SMD constituent un groupe d'affections clonales de la CS pluripotente pr~sentant un d~s~quilibre entre la proliferation et la diff~renciation, responsable d'une h~matopo'1~se inefficace. Les SMD pr~sentent le plus souvent des anomalies caract~ristiques en culture de moelle. La capacit~ d former des colonies in vitro des CS est soit nulle soit tr~s diminu~e avec predominance de clusters et rapport clusters~colonies ~lev~. Un nombre diminu~ de colonies est frequent et l'analyse de ces colonies montre souvent un exc~s de formes immatures. Parfois, les cultures montrent un nombre de colonies sensiblement normal mais l'aspect morphologique des colonies montre des anomalies m~me d minima. L'effet de plusieurs FC ou d'agents diff~renciants a ~t~ test~ sur la croissance des CS dans les SMD mais les r~ponses d ces FC sont souvent partielles ou nulles comparses d celles observ~es sur les CS normales. En outre, dans les SMD, les FC produits par le microenvironnement (ME) m~dullaire sont diminu~es t~moignant donc d'une anomalie du ME. Les cultures de moelle dans les SMD constituent un compl~ment d'information d l'analyse morphologique et cytog~n~tique et ont un certain degr~ de valeur pronostique. Elles permettront probablement par le choix d'association de FC de d~finir une strat~gie th~rapeutique capable d'induire une diff~renciation et donc de corriger le d~s~quilibre entre proliferation et diff~renciation qui est la l~sion critique dans ce groupe d'affections clonales.
Bone marrow hematopoietic stem cells are not distinguishable from other lymphocyte - like cells morphologically but they can be revealed by marrow culture techniques owing to their ability to form colonies in semisolid medium in presence of growth factors. They are then defined as colony forming unit (CFU). The earliest detectable hematopoietic progenitor cell which gives rise to granulocytes, erythroblasts, monocytes and megacaryocytes is termed CFU-GEMM ; more mature and specialized precursor cells are termed CFU-GM for the granulocyte-monocyte lineage, CFU-E and its earlier progenitor BFU-E (burst-forming unit) for the erythrord lineage and CFU-MK for the megacaryocyte lineage. Besides colonies, some clusters of cells (3 to 40 cells) corresponding to abortive colonies can be also identified. In vitro bone marrow cultures provide a good method to analyze the stem cell compartment and to improve the understanding of the regulation of hemopoiesis and the functional action of growth factors involved in their proliferation and differentiation. Marrow cultures also provide a complementary evaluation of marrow morphology and cytogenetics in diseases in which regulation and differentiation are defective such as myelodysplastic syndromes (MDS). MDS are a group of clonal diseases of the plurfpotent stem cell presenting with an uncoupling between proliferative and differentiative abilities leading to ineffective hemopoiesis. MDS have a defective in vitro colony formation in most of the cases. The ability of progenitors to form colonies is reduced or absent with a predominance of clusters and clusters~colonies ratio increased. The analysis of colonies can show an excess of immature forms. Even if a normal number of colonies is found, the morphology of these colonies is generally abnormal. The effect of growth factors or differentiating agents has been tested on the growth of stem cells in MDS but the responses were often poor or null compared to those observed on normal stem cells. In addition, in MDS, growth factors produced by bone marrow microenvironment are decreased probably due to a concomitant abnormality of the microenvironment. Bone marrow cultures which constitute a model to test the growth factors and other differentiating agents could help to define a therapeutic approach to improve the uncoupling between proliferation and differentiation which is the critical lesion in these clonal diseases.
MOTS-CLf:S
KEY-WORDS
cellules souches - colony forming unit (CFU) - clusters facteurs de croissance - proliferation - diff~renciation.
stem cells - colony forming unit (CFU) - clusters -growth factors - proliferation - differentiation.
*Service d'h~rnatologie biologique - H6pital Henri-Mondor 51, av. du ,Mar~chal-de-Lattre-de-Tassigny 94010 CRETEIL CEDEX Revue frangaise des laboratoires, mai 1996, N ° 284
TIRES A PART : Mine le Dr J. ZITTOUN article regu le 8 d~cembre 1995, accept~ le 11 mars 1996. 39
Introduction Les syndromes my61odysplasiques (SMD) sont un groupe d'affections h6t6rog6nes de l'h6matopo'f6se caract6ris6es par une h6matopo'f6se hyperprolif6ratire mais inefficace associ6e ~ des anomalies morphologiques de la moelle osseuse. Ces maladies acquises de l'h6matopo'i6se sont associ6es ~ des cytop6nies progressives et r6fractaires, refl6tant des anomalies dans la diff6renciation et la maturation 6rythro'/de, granulomonocytaire et m6gacaryocytaire (11). Le groupe coop6ratif franco-am6ricain-britannique (FAB) a propos6 une classification morphologique de ces affections dans laquelle cinq sous-types sont individualis6s : an6mie r6fractaire (AR), an6mie r6fractaire avec sid6roblastes en couronne ou an6mie sid6roblastique acquise idiopathique (ASAI), an6mie r6fractaire avec exc6s de blastes (AREB), AREB en transformation (AREB-T) et enfin leuc6mie my61omonocytaire chronique (LMMC) (2). Ces diff6rents sous-types refl6tent diff6rentes 6tapes dans la leuc6mogen6se, les AREB et AREB-T ayant un risque tr6s 61ev6 de transformation en leuc6mie aigu~ my61o'/de. Ce fait est objectiv6 dans les diff6rences observ6es dans ia progression de l'affection parmi les sousclasses du FAB avec une m6diane de survie variant de 30 ~ 80 mois dans les AR et ASIA ~ 5 mois dans les AREB ou AREB-T (20).
L'anomalie essentielle des SMD se situe au niveau d'une atteinte de la cellule souche pluripotente responsable du d6veloppement de la my61odysplasie. La nature clonale des SMD a 6t6 prouv6e par la d6tection d'anomalies chromosomiques dans pr6s de 70 % des cas de SMD (12). L'analyse de l'inactivation du chromosome X a montr6 chez la plupart des malades 6tudi6es un profil monoclonal d'inactivation de ce chromosome ; en effet, l'6tude des deux iso-enzymes de la G6PD chez les femmes h6t6rozygotes pour cette enzyme et pr6sentant un SMD a r6v616 la pr6sence d'une seule iso-enzyme. Des 6tudes plus r6centes utilisant les techniques d e biologie mol6culaire ont confirm6 le caract6re cional des SMD chez des femmes h6t6rozygotes pour des enzymes situ6es sur le chromosome X, essentiellement G6PD, PGK, HPRT (13). L'atteinte de la cellule souche pluripotente induit un d6s6quilibre entre les capacit6s de prolif6ration et de diff6renciation des pr6curseurs h6matopo'i6tiques aboutissant ~ une h6matopo'i6se inefficace, cons6quence de la diff6renciation d6fectueuse.
I. Les cellules souches h6matopoT6tiques et les facteurs de r6gulation (3o) 1. L e s c e l l u l e s s o u c h e s h6matopo'i6tiques
et les prog6niteurs
FIGURE 1 Sch6ma simplifi6 de l'h~matopo'/6se et site d'action des principaux facteurs de croissance
iuiiiiei°iii'iiii' Totipotent~
CFU-S
Pr6cellulesT
l
Pr~cellulesB
'
CellulesT
CellulesB
//.3 GM-CSF
CellulesSouchespluripotentes CFU-GEMM CFU-mix
CFU-baso
BFU-Eprimitives
BFU-MK
CFU-GM I GM-CSF
CFU-~osino
BFu/.L~E!atures
P°~I~F~ "E Pro~rythroblaste
I
CFU-MK
CFU-G
CFU-M
M~gacaryocyte My61oblaste Monoblaste
I
]
I
11 existe une hi~rarchie de cellules souches h~matopo'f~tiques (figure 1) : - l e s cellules souches totipotentes & potentialit~ my~Io'fde et lympho'fde sont des cellules souches tr~s primitives & haut pouvoir d'auto-renouvellement, capables apr~s irradiation totale de reconstituer l'h~matopo'f~se. Ces cellules souches totipotentes, ceUules hors cycle pour la quasi-totalitY, constituent un pool tr~s faible ; - l e s cellules souches multipotentes & potentialit~ my~Io'fde, communes aux lign~es granuleuses, ~rythro'fde, monocytaire et m~gacaryocytaire, sont des cellules ayant une plus forte capacit~ de proliferation que d'auto-renouvellement, la majeure partie des cellules ~tant aussi hors cycle ; - l e s cellules souches d~termin~es ou engag~es irr~versiblement vers une seule lign~e sont aussi appel~es cellules "commises" par analogie avec le terme anglo-saxon "committed stem cells". Ce sont les prog~niteurs h~matopdf~tiques qui poss~dent des capacit~s d'auto-renouvellement tr~s faibles voir nulles, la plupart ~tant dans le cycle cellulaire. Les cellules souches ne sont pas reconnaissables morphologiquement contrairement aux pr~curseurs m~dullaires identifiables sur un frottis de moelle. Les cellules souches ne sont d~tect~es que par leur aptitude & former in vitro des colonies en milieu semi-solide d'o~ le nom de CFU pour colony forming unit, en presence de facteurs de croissance polyvalents ou multilign~es ou plus sp~cifiques & l'une des lign~es. Les cellules souches totipotentes ont ~t~ mises en ~vidence par la technique des colonies spl~niques d'o~ le nom de CFU-s pour spleen, dues & leur capacit~ & former des colonies sur rates de souris totalement irradi~es apr~s injection de cellules m~dullaires en suspension. Les cellules multipotentes d~nomm~es CFU-GEMM (granuleux, ~rythro'fde, monocyte/macrophage, m~gacaryocyte) ou encore appel~es CFU-mix sont d~tect~es en milieu semisolide apr~s 15 & 21 jours de culture en presence de facteurs de croissance multilign~es notamment I'lL3 et le GM-CSF. Les cellules souches d~termin~es sont sp~cifiques de chacune des lign~es.
1.1. Les prog~niteurs ~rythroides Polynucleaire Basophile
40
Globule rouge
Plaquette
Polynucl6aire Monocyte/ Neutrophile Macrophage
Polynucl6aire Eosinophile
Identifies in vitro, ils sont de deux types : - l e s CFU-E, colonies de petite taille (10 A 50 cellules) bien h~moglobinis~es apparaissant apr~s 7 jours de culture en Revuefrangaisedes laboratoires,mai 1996,N° 284
presence d'~rythropo'i~tine ; ce sont les CFU-E qui, apr~s quelques divisions cellulaires, donneront naissance au premier pr~curseur ~rythro'~de morphologiquement reconnaissable sur un frottis de moelle, le pro~rythroblaste ; - ]es BFU-E, ascendants des CFU-E, sont des ceUules souches plus immatures, dont une partie est hors cycle. Elles apparaissent d~s le 14 ~jour de culture sous forme de grosses colonies constitutes par plusieurs agr~gats ou sous-colonies ; au sein des BFU-E, il faut distinguer les BFU-E primitives, d'apparition tardive et d~pendant de facteurs de croissance multilign~es comme I'lL3 ou multi CSF et les BFU-E matures d'apparition plus pr~coce, entre le 10 ~ et le 15 ' jour de culture, partiellement d~pendantes de l'~rythropo'i~tine.
1.2. Les ceilules souches granulo-monocytaires Au sein desquelles, on distingue les CFU-G (granuleuse) qui apparaissent d~s le 8" jour de cultures et sont d~pendantes de facteurs de croissance tel que le G-CSF et le GM-CSF ; ces colonies sont constitutes de plus de 50 cellules & diff~rents stades de maturation allant du my~Ioblaste au polynucl~aire neutrophile. Les CFU-M (monocyte/macrophage) sont d'apparition plus tardive, vers le 14 ~ jour de culture et sont d~pendants du GM-CSF et du M-CSF. Ces derni~res sont constitutes essentiellement de monocytes plus ou moins matures et de macrophages. En pratique, on regr0upe les CFU-G et les CFU-M sous le terme de CFU-GM. A c6t~ des CFU-GM, il faut noter la presence dans les cultures de moelle osseuse, m~me de moelle normale, de quelques dusters constitu~s par des petits agr~gats de cellules allant de 3 & 50 cellules correspondant & des colonies abortives.
1.3. Les cellules s o u c h e s m(~gacaryocytaires Elles forment des colonies d~nomm~es CFU-MK et BFU-MK : - les CFU-MK sont difficiles ~ reconna~tre dans les conditions habituelles de culture. Elles sont constitutes de m~gacaryocytes, de 3 & 50 cellules, et apparaissent chez l'homme apr~s 10 & 12 jours de culture. EUes sont sensibles & I'lL-3, moins au GM-CSF et & l'~rythropo'i~tine, mais surtout au Mpl ligand anciennement d~nomm~ thrombopo~'~tine (31) ; -les BFU-MK sont les prog~niteurs les plus primitifs de la lign~e m~gacaryocytaire. Elles sont constitutes de colonies plus grosses organis~es en plusieurs sous-colonies apparaissant chez l'homme vers le 21 ° jour de culture. Les ~tapes de la diff~renciation cellulaire au sein des ceilules souches sont r~gul~es par diff~rents facteurs de croissance h~matopo'i~tiques qui deviennent d'autant plus sp~cifiques qu'ils concernent des cellules plus diff~renci~es. En fait, cette diff~renciation assur~e par les compartiments des cellules souches engag~es permet une ~norme amplification du pool des cellules souches.
action plus polyvalente et agit sur cliff,rents types de prog~niteurs. II est synth~tis~ par plusieurs types cellulaires dont les macrophages. Le G-CSF est essentiellement actif sur la lign~e granuleuse neutrophile. II exerce une activit~ de differentiation plus que de proliferation. Le M-CSF stimule la formation de colonies de monocyte/macrophage chez la souris mais non chez l'homme. Le Mpl ligand, Iongtemps appel~ thrombopo'i~tine avant son r~cent isolement et clonage, est le facteur stimulant sp~cifiquement la lign~e m~gacaryocytaire (31). L'~rythropo~tine, synth~tis~e par les ceUules p~ritubulaires ou les cellules interstitielles du rein, est un facteur stimulant les prog~niteurs matures de la lign~e ~rythroYde surtout les CFU-E et, & un degr~ moindre, les BFU-E matures. EUe agit aussi sur les temps tardifs de la diff~renciation de la lign~e rouge au niveau des pr~curseurs de l'~rythrocyte. A c6t~ des facteurs de croissance multilign~s ou sp~cifiques, il existe des facteurs de croissance qui agissent en synergie en exerqant une action soit sur les temps pr~coces soit sur les temps tardifs de l'h~matopdi~se. - L ' I L I est synergique des autres facteurs de croissance h~matopo'i~tiques. Elle a une action sur les cellules du stroma m~dullaire et induit la synth~se du GM-CSF et de I'lL3. - L ' I I 6 est synergique de I'lL3 et du GM-CSF. Elle a une action proche de I'lL1 sur les temps pr~coces de l'h~matopo'i~se. - Le c-Kit l i g a n d o u s t e m c e l l f a c t o r ou mast cell factor a une action synergique des autres facteurs de croissance sur les cellules souches totipotentes et tr~s immatures, les CFU-mix mais aussi sur les pr0g~niteurs d~termin~s notamment les BFU-E. II augmente le nombre et la taille des colonies. A c6t~ des facteurs de croissance stimulants et synergiques, il existe des facteurs inhibiteurs de l'h~matopo'i~se qui modulent l'action des facteurs stimulants. On peut citer les prostaglandines, les gamma-interferons, la lactoferrine ou le LIA (leukemia associated inhibitory activity) (8). Des r~cepteurs distincts ont ~t~ identifies pour chacun des facteurs de croissance. L'expression de ces r~cepteurs & la surface des cellules souches varie avec l'~tat de diff~renciation de la ceUule. Ainsi la diminution des r~cepteurs & la surface des cellules souches tr~s immatures coincide avec une augmentation des r~cepteurs sp~cifiques de ceUules souches plus matures. Par exemple, le nombre de r~cepteurs & l'~rythropo'i~tine, tr~s faible & la surface des BFU-E primitives, augmente sur les BFU-E matures pour atteindre son expression maximale sur les CFU-E. L'activation des r~cepteurs par les facteurs de croissance initie la transduction du message jusqu'au noyau. Les facteurs de croissance stimulent l'entr~e en cycle des cellules et la division celiulaire en agissant surtout sur la phase G I .
2. Les facteurs h~matopo'i~tiques (30,31) Les facteurs de croissance ont ~t~ identifies par leur aptitude stimuler la formation de colonies in vitro d'oe leur nom de CSF (colony stimulating factor), lls sont pour la plupart synth~tis~s par les cellules accessoires dans la moelle osseuse (macrophages, lymphocytes T, cellules NK, cellules endoth~liales, fibroblastes,...), lls agissent Iocalement (action para-
crine) sur les cellules adjacentes. Seule l'~rythropo'f~tine, sp~cifique de la lign~e ~rythro'fde est une hormone synth~tis~e par le rein et qui agit & distance. Certains facteurs de croissance ont une action polymorphe : c'est le cas de l'interleukine 3 (IL3) ou multi CSF. L'IL3, essentiellement produite par les cellules T, a des propri~t~s de stimulation des CFU-s, des CFU-mix ou des CFUGEMM mais aussi des prog~niteurs d~termin~s & l'exception des CFU-E enti~rement d~pendantes de l'~rythropo'i~tine. L'IL3 est capable & lui seul d'induire des colonies de granuleux, monocytes/macrophages, ~osinophiles, m~gacaryocytes, mais l'addition d'~rythropo'~'~tine est indispensable & la formation de CFU-E. Le GM-CSF, originellement connu comme un facteur plus sp~cifique de la lign~e granulo-monocytaire, a en fait une Revue frangaise des laboratoires, mai 1996, N ° 284
3. M~thodes d'~tude des cellules s o u c h e s h~matopo'i~tiques Le syst~me de culture de cellules clonog~niques m~dullaires, cellules capables de former des colonies in vitro, fournit une m~thode de choix pour analyser les compartiments des cellules souches/prog~niteurs m~dullaires, pour comprendre leur r~gulation et le mode d'action des facteurs impliqu~s dans leur proliferation et leur diff~renciation. II constitue aussi une aide diagnostique utile dans des affections oe cette r~gulation est prise en d~faut telle que les SMD ou les syndromes my~Ioprolif~ratifs. La technique la plus couramment utilis~e est la culture de cellules m~dullaires en milieu semi-solide, agar, methyl cellulose ou plasma coagul~. Les cellules m~dullaires sont pr~lev~es sur anticoagulant sans conservateur puis les cellules mononucl~es sont isol~es apr~s centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque, lav~es, num~r~es et raises en culture en petites bootes de P~tri ou en puits dans un milieu appropri~. Ce milieu de culture appel~ IMDM (iscove's modified dulbecco's medium) contient habi41
tuellement 20 % de s~rum de veau foetal enrichi en facteurs de croissance sous forme de PHA-LCM (phytohemagglutinim-stimulated leucocyte conditioned medium) (1). Le LCM est pr~par~ & partir de culture de cellules du sang p~riph~rique obtenu d e donneurs volontaires. Un milieu conditionn~ placentaire peut @tre utilis~ & la place du PHA-LCM comme source de CSF (27). Les cellules m o n o n u c l ~ e s ensemenc~es dans ces milieux sont incub~es & 37 °C en atmosphere de 5 % de CO 2 et les colonies form~es sont num~r~es habituellement entre le 7 ~ et le 14 ~ ou parfois le 21 ° jour de culture. Pour ~tudier l'effet des facteurs de croissance sp~cifiques, ]a culture est pratiqu~e dans un milieu sans s~rum qui est remplac~ par un milieu contenant de la transferrine satur~e en fer et/ou de l'insuline ainsi qu'une suspension de lipides (25). Chacun des facteurs de croissance peut @tre alors ajout~ individueUement et l'effet stimulant de ces facteurs sur la formation de colonies est appr~ci~ apr~s incubation dans les conditions indiqu~es pr~c~demment. Le nombre des colonies est habituellement rapport~ & 105 cellules m o n o n u c l ~ e s ensemenc~es. Dans les moelles normales, ce nombre varie selon les sujets et les conditions de culture. Pour les colonies ~rythro'fdes et granulomonocytaires, il est g~n~ralement sup~rieur & 50 colonies pour 105 cellules. A c6t~ des colonies granuleuses, constitutes de plus de 50 cellules, il faut noter la presence de clusters, agr~gats de cellules allant de 3 & 40 cellules. Le nombre de clusters est aussi tr~s variable mais exc~de rarement 50 pour 105 cellules mononucl~es. Les valeurs sus cities sont tr~s approximatives et ne sont donn~es qu'& titre indicatif pour permettre la comparaison avec les r~sultats obtenus dans les SMD. Alors que les CFU-GM, les CFU-E et BFU-E sont ais~ment reconnaissables, les colonies d'~osinophiles, de basophiles et de m~gacaryocytes ne peuvent ~tre reconnues qu'apr~s coloration sp~ciale soit cytochimique pour les CFU-eosino et baso soit immunoperoxydasique pour les CFU-MK utilisant des anticorps monoclonaux dirig~s contre la glycoprot~ine liB/IliA situ~e & la surface des m~gacaryocytes. A c6t~ des cultures en milieu semi-solide, il est possible d'effectuer des cultures en milieu liquide mais ces derni~res ne permettent qu'un certain nombre de divisions cellulaires et n'ont d'int~r~t que pour ~tudier la diff~renciation des cellules notamment sous l'effet de certains facteurs de croissance. Enfin les cultures & long terme de moelle osseuse (LTBMC ou long term bone marrow culture) peuvent ~tre utilis~es pour des indications plus sp~cifiques notamment l'~tude du microenvironnement m~dullaire. Elle consiste & reconstituer in vitro le micro-environnement m~dullaire par ensemencement de cellules m~dullaires dans des flacons contenant un milieu sp& cifique pour culture & long terme ; le micro-environnement une fois reconstitu& apr~s quelques semaines de culture, fournit les facteurs de croissance sp~cifiques & la croissance de colonies & partir de prog~niteurs ensemenc~s sur ces cellules adh~rentes.
2. Les culturesde cellulessouches/ prog niteurs h matopdf6tiques dans lesSMD Les SMD pr~sentent, dans la majorit~ des cas, des aspects de culture.in vitro tr~s anormaux t~moignant d'anomalies des cellules souches au niveau de la proliferation et de la diff~renciation (14, 19). La capacit~ & former des colonies de tous les prog~niteurs h~matopo'f~tiques est diminu~e ou absente dans la majorit~ des cas de SMD (8). Ce profil in vitro ressemble & celui observ~ dans les leuc~mies aigu~s my~Io'fdes, comportant une diff~renciation et une maturation my~Io'fde d~fectueuse, avec g~n~ration de clusters my~Io'fdes abortifs, microclusters de 3 42
10 cellules ou macroclusters de I 0 & 40 cellules. La plupart des prog~niteurs sont hors cycle et une proportion importante de colonies de densit~ l~g~re semblables & celles des colonies form~es dans les leuc~mies aigu~s my~Io'fdes est observ~e (9). Concernant les CFU-GM, l'aspect de culture le plus couramment observ~ est une formation r~duite de colonies granulomonocytaires voire une disparition de ces colonies. Dans certains cas, une pousse excessive de colonies est observ~e mais l'analyse morphologique de ces colonies montre une pr~dominance de formes immatures avec anomal~s de maturation
(3, 5, 9).
Aussi importante que la faible capacit~ & former in vitro des colonies granulomonocytaires est l'augmentation du nombre de clusters ainsi que le rapport nombre de clusters/nombre de colonies. Cette augmentation dans la capacit~ & former des clusters associ~e & une baisse du nombre des colonies accompagne voire precede la transformation en leuc~mie aigu~ (9). Ce profil anomal de culture est surtout le fait des AREB et des AREB-T. Un nombre normal ou m~me ~lev~ de colonies peut @tre observ~ dans les cytop~nies r~fractaires sans exc~s de blastes, AR ou ASAI ou encore dans les LMMC (7, 8) ; dans ce dernier cas, l'incidence ~lev~e de colonies et m~me de clusters est possiblement due & des taux ~lev~s de cytokines associ~e au nombre ~lev~ de monocytes de la moelle. Le nombre de colonies d~rivant des prog~niteurs ~rythro'fdes est variable (4). La diminution du nombre de CFU-E est discr~te dans les AR mais beaucoup plus marquee dans les AREB allant jusqu'& l'absence de colonies ~rythro'fdes (19, 23). Dans une ~tude portant sur 44 cas de malades pr~sentant un SMD, 3 seulement avaient un nombre normal de colonies BFU-E alors que la formation de colonies CFU-E a ~t~ trouv~e anormale dans tousles cas (23). L'aspect des colonies granulomonocytaires et ~rythro'fdes est aussi un ~l~ment important. Dans les SMD, nous avons observe, outre la diminution du nombre des colonies CFUGM, des aspects anormaux de ces colonies constitutes de cellules r~tract~es ou d'agr~gats de clusters. Les colonies ~rythro'fdes, notamment les BFU-E sont souvent de taille inf~rieure & la normale et plus faiblement h~moglobinis~es que les BFU-E form~es & partir de prog~niteurs ~rythro'fdes normaux.
Une ~tude plus fine a ~t~ r~cemment r~alis~e pour tenter d'expliquer le m~canisme responsable de la croissance anormale in vitro des prog~niteurs h~matopo'f~tiques chez les malades atteints de SMD (26). Cette ~tude a ~t~ r~alis~e sur une population purifi~e de cellules souches CD34+ isol~es par immunoph~notypage & l'aide d'anticorps monoclonaux. L'antig~ne CD34 est exprim~ & la surface de la majorit~ des cellules souches multipotentes formant des colonies, CFUblast, CFU-GEMM ainsi que sur les cellules clonog~nes bipotentes ou unipotentes, CFU-GM, CFU-MK, BFU-E et aussi sur les pr~curseurs lympho'fdes. L'expression de l'antig~ne CD34 d~cro~t au fur et & mesure de la maturation et les prog~niteurs les plus tardifs ~rythro'fdes, granuleux, m~gacaryocytaires sont faiblement positifs ou n~gatifs pour le CD34. Cet antigone n'est pas d~tect~ sur les cellules plus matures de la moelle ou du sang. Cette ~tude a ~t~ r~alis~e sur les cellules CD34+ de 12 patients atteints de SMD dont 3 ont ~t~ ~tudi~s & deux reprises et la croissance a ~t~ compar~e & celle de ceUules CD34+ normales : il est apparu une grande diversit~ dans le profil de cultures in vitro des CD34+ provenant de SMD ; dans 7 cas, le nombre total de colonies et clusters d~riv~s des CD34+ de SMD ne diff~rait pas statistiquement de celui des CD34+ normales. Dans 6 cas, le nombre de colonies et de clusters ~tait bas tandis qu'un nombre ~lev~ de colonies et de clusters ~tait observ~ chez 2 cas. Le rapport nombre de clusters/nombre de colonies variait d'un patient & l'autre avec une majorit~ de clusters par rapport aux colonies. Cette ~tude a eu le m~rite de mettre en relief la capacit~ anormale de diff~renciation des cellules CD34+ dans les SMD. Alors que la composition des colonies ou des clusters des CD34+ normaux comportait un m~lange de CFU-GEMM, de CFU-GM, de BFU-E, de CFU-E, en nombre relativement constant, seul un malade pr~sentant un SMD avait un nombre de colonies & composition sensiblement comparables & celles Revue frangaise des laboratoires, mai 1996, N ° 284
des CD34 normaux. Une croissance anormale des colonies ~tait observ~e dans les 14 autres cas ~tudi~s soit sous forme d'un nombre augment~ de clusters ou d'une absence de colonies et de clusters ou encore dans 9 cas un nombre diminu~ de colonies ~rythro'fdes voire une absence, avec un nombre augment~ de clusters. L'analyse morphologique a montr~ une proportion accrue de colonies constitutes par des blastes dans 70 % des cas. Si globalement l'aspect de cultures in vitro est anormal dans les SMD, il faut ~tablir une hi~rarchie dans le degr~ d'anomalies. On peut sch~matiquement observer cinq types de profils de cultures dans les SMD : - un aspect tr~s voisin de celui observ~ dans les moelles normales : c'est parfois le cas de certains malades pr~sentant des AR sans exc~s de blastes ou des ASAI mais un examen minutieux de l'aspect des colonies r~v~le des anomalies m~me minima ; - une diminution tr~s importante de colonies my~IoYdes avec un rapport clusters/colonies ~lev~. Cet aspect peut se voir dans des AR en voie d'~volution ; - u n e absence compl~te de colonies associ~e soit & une absence de clusters, soit & un nombre ~lev~ de clusters ; - u n e expression de colonies constitutes essentiellement de blastes avec une proportion infime ou nulle de colonies compos~es de cellules matures. Ces deux derni~res situations sont couramment observ~es dans les AREB ou les AREB-T. II a ~t~ trouv~ une correlation entre la croissance my~Io'fde in vitro de type "leuc~mique", ]es anomalies cytog~n~tiques et le mauvais pronostic (6). D'ailleurs les ~tudes cytog~n~tiques pratiqu~es dans les SMD ont montr~ des anomalies chromosomiques dans plus de 80 % des AREB et AREB-T (12). Six ~tudes regroupant 179 malades pr~sentant un SMD et incluant les diff~rents sous-types morphologiques du FAB ont montr~ une correlation entre l'~volution clinique et la croissance des prog~niteurs m~dullaires in vitro (9). Les sousgroupes de patients avec des profils de croissance non leuc~miques c'est-&-dire un nombre normal ou r~duit de colonies avaient une incidence de transformation en leuc~mie aigu~ my~Io'fde comprise entre 21 et 40 % avec une m~diane de survie entre 9 et 50 mois, alors que les patients avec profils de culture de type leuc~mique avaient une incidence de transformation entre 50 et 80 % et une m~diane de survie entre 5 et 10 mois.
3. L'effet des facteurs de croissance sur les cellules souches/prog( niteurs h rnatopdk tiques dans les SMD Actuellement les travaux sur les cultures de prog~niteurs dans les SMD tentent d'~tudier l'effet de diff~rents agents diff~rentiants ou de diff~rentes cytokines pour mieux comprendre la physiopathologie de cette affection au niveau des cellules souches et essayer de d~finir une meilleure strat~gie th~rapeutique. En effet la l~sion critique sous-tendant cette affection repose sur le d~s~quilibre entre proliferation et diff~renciation au niveau de la cellule souche h~matopo'f~tique (24). La finalit~ des agents diff~renciants et des facteurs de croissance est d'induire une diff~renciation afin de r~duire la capacit~ des cellules souches leuc~miques & s'autorenouveler in vitro et de contr61er ainsi la leuc~mogen~se. Une ~tude ~valuant l'effet des agents diff~renciants tel que l'acide 13 cis r~tino'fque, le 1,25 dihydroxy vitamine D3 sur les cellules clonog~nes de moelles de sujets atteints de SMD a montr~ une augmentation du nombre de CFU-GM mais une diminution du nombre de BFU-E alors que celui des CFUGEMM restait stable (28). L'acide r~tino'fque pouvait induire une diff~renciation du clone leuc~mique. L'effet du GM-CSF et du G-CSF a ~t~ ~valu~ sur la capacit~ de proliferation et de diff~renciation de cellules m~dullaires Revue frangaise des laboratoires, rnai 1996, N ° 284
immatures provenant de patients pr~sentant un SMD compar~e & celles de sujets normaux (15, 21). Cette ~tude a montr~ une clonog~nicit~ des pr~curseurs my~Io'fdes (CFU-GM) et ~rythro'fdes (BFU-E) diminu~e m~me en presence de ces facteurs dans les SMD compar~e & celle des cellules contr61es. Cependant, le GM-CSF avait des propri~t~s de stimulation plus puissantes que le G-CSF sur les CFU-GM de sujets ayant un SMD. Cette stimulation ~tait encore plus nette chez les malades pr~sentant des anomalies cytog~n~tiques que chez ceux qui avaient un caryotype normal (22). La proliferation cellulaire ~tudi~e en culture en milieu liquide chez des patients atteints de SMD n'~tait pas augment~e en presence de GM-CSF ou de G-CSF. Toutefois, le G-CSF induisait une diff~renciation granulocytaire sup~rieure au GMCSF que ce soit A partir de cellules my~Io'fdes immatures de sujets normaux ou de patients ayant un SMD. Cette capacit~ de diff~renciation induite par le G-CSF ~tait particuli~rement nette dans les AREB et AREB-T (22). Dans les cultures en milieu liquide, le GM-CSF et le G-CSF diminuaient aussi la r~g~n~ration clonale my~Io'fde et favorisaient la diff~renciation my~Io'~de dans les SMD. Chez des malades mis en r~mission par un traitement au GM-CSF, il a ~t~ constat~ que l'h~matopo'i~se non clonale ~tait r~apparue et le clone n~oplasique avait disparu (10, 29). Dans une autre ~tude, l'effet du G-CSF, du GM-CSF et de l'IL3 test~ sur une population purifi~e de cellules CD34+ obtenues & partir de 11 malades atteints de SMD a montr~ une r~ponse diminu~e, voire une absence de r~ponse des CD34+ & la stimulation par ces cytokines compar~e & celle observ~e chez les sujets t~moins (25). La croissance des colonies ~rythro'fdes dans les SMD a aussi montr~ des r~ponses anormales ~ l'~rythropo'i~tine (16, 17), ce qui indique que l'an~mie dans les SMD n'est pas due & une anomalie dans la capacit~ de l'~rythropo'~'~tine & g~n~rer des CFU-E mais plut6t & un compartiment r~duit de BFU-E. Les effets de I'lL1 et I'lL6 en association avec le GM-CSF ont ~t~ aussi ~valu~s sur la formation des colonies provenant de prog~niteurs my~Io'fdes de malades ayant des SMD. Dans la majorit~ des cas analys~s, un effet de potentialisation de I'lL1 et I'lL6 sur le GM-CSF a ~t~ observe. L'IL1 et I'lL6 ont probablement des effets indirects en augmentant la production de GM-CSF et d'IL3 par les cellules accessoires de la moelle osseuse (18). La production des facteurs de croissance h~matopdf~tiques a ~t~ aussi analys~e dans les SMD par les m~thodes de culture long termeo Les cellules m~dullaires et les cellules du sang p~riph~rique de malades souffrant de SMD produisaient des taux diminu~s de GM-CSF, d'IL3, de G-CSF, de M-CSF et d'IL6 (16, 32). Ainsi la production d~fectueuse de certains facteurs de croissance ajout~e & la r~ponse diminu~e des prog~niteurs Aces facteurs contribue ~ l'h~matopo'i~se inefficace dans les SMD.
Conclusion En conclusion, les cultures de cellules donog~niques m~dullaires dans les S M D constituent des m~thodes d'analyse du compartiment des cellules souches h~matopo'i~tiques et des facteurs humoraux impliqu~s dans la r~gulation de ia proliferation et de la diff~renciation de ces cellules souches. Elles fournissent un compl~ment d'informations l'analyse morphologique et cytog~n~tique de la moelle dans ces affections h~t~rog~nes et ont un certain degr~ de valeur pronostique. En outre, les ~tudes concernant l'effet des facteurs de croissance sur la formation de colonies et l'induction de la diff~renciation peut ~tre une aide au choix th~rapeutique en sachant que la l~sion critique sous-tendant ce groupe h~t~rog/me d'affections de nature clonale est un d~s~quilibre entre la proliferation et la diff~renciation. 43
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