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Asociación entre la inestabilidad de microsatélites y las características clínicas y anatomopatológicas en pacientes con cáncer de colon esporádico
ORIGINALES Asociación entre la inestabilidad de microsatélites y las características clínicas y anatomopatológicas en pacientes con cáncer de colon esporádico
94.809
David Guerreroa, Enrique Balenb, José María Martínez-Peñuelac, Jesús García-Foncillasd, Begoña Larrinagac, María Cristina Caballeroc, Javier Herrerab y José Miguel Lerab a
Centro de Investigación Biomédica. Servicio Navarro de Salud. Pamplona. Navarra. Servicio de Cirugía General y Digestiva. Hospital de Navarra. Servicio Navarro de Salud. Pamplona. Navarra. Servicio de Anatomía Patológica. Hospital de Navarra. Servicio Navarro de Salud. Pamplona. Navarra. d Laboratorio de Biotecnología y Farmacogenómica. Centro de Investigación Médica Aplicada (CIMA). Clínica Universitaria de Navarra. Universidad de Navarra. Pamplona. Navarra. España. b c
FUNDAMENTO Y OBJETIVO: La inestabilidad de microsatélites derivada del fallo en la reparación de los falsos emparejamientos del ADN es la alteración característica de los tumores de la vía mutadora o inestables (MSI). Tales casos parecen presentar diferencias desde el punto de vista clinicopatológico con los tumores de la vía supresora o estables (MSS). Los tumores con alto grado de inestabilidad (MSI-H) parecen constituir una nueva entidad de tumores con diferencias en determinadas características anatomopatológicas y clínicas con respecto a los tumores estables (MSS) e inestables de bajo grado (MSI-L). En el presente estudio se valora la posible asociación entre el alto grado de inestabilidad de microsatélites con la localización, contenido mucinoso, grado de diferenciación, estadio, así como el intervalo libre de enfermedad y supervivencia. PACIENTES Y MÉTODO: Se clasifica a 117 pacientes con cáncer de colon esporádico en las poblaciones MSS/MSI-L y MSI-H (siguiendo las recomendaciones del National Cancer Institute) mediante reacción en cadena de la polimerasa y electroforesis de 7 microsatélites. RESULTADOS: Los tumores MSI-H tendieron a localizarse en el colon derecho (p = 0,022) y a presentar contenido mucinoso (p = 0,04). El conjunto de pacientes MSI-H de estadios II y III no presentó intervalos libres de enfermedad ni períodos de supervivencia más prolongados (p = 0,54, p = 0,37, respectivamente). Los tumores MSI-H de estadio II presentaron períodos de supervivencia más prolongados que los tumores MSS/MSI-L (p = 0,027). No observamos diferencias en la respuesta a quimioterapia con 5-fluorouracilo y leucovorín entre los grupos MSS/MSI-L y MSI-H (p = 0,38). CONCLUSIONES: El alto grado de inestabilidad de microsatélites se asocia con determinadas características patológicas, así como con períodos de supervivencia más prolongados para los tumores de estadios II. Palabras clave: Cáncer de colon. Repeticiones de microsatélites. Alto grado de inestabilidad. Genes. Pronóstico. Intervalo libre de enfermedad.
Association between microsatellite instability and clinico-pathological characteristics in sporadic colon cancer BACKGROUND AND OBJECTIVE: Currently, colon cancer is a leading cause of cancer death worldwide. It progresses according to three molecular pathways, named suppressor, mutador and methylator. Microsatellite instability is a hallmark of the lack of reparation, of DNA mismatches and it characterizes a subset of colon tumors (unstable tumors, MSI). MSI-H patients (high degree of microsatellite instability) seem to share clinico-pathological differences with MSS (microsatellite stable) and MSI-L (low degree of microsatellite instability) patients. In this study, associations between high degree of microsatellite instability and pathological (location, mucinous content, differentiation grade, stages T3N0, stages II and III) and clinical features (response to chemotherapy, disease-free survival and overall survival) were evaluated. PATIENTS AND METHOD: 117 patients with sporadic colon cancer were classified into two populations (MSS/MSI-L and MSI-H) by using PCR and electrophoresis of seven microsatellites, according to the National Cancer Institute recommendations. RESULTS: MSI-H tumors tended to be located in the right colon (p = 0.022) and were of mucinous histologic type (p = 0.04). No differences in disease-free survival and overall survival between group of stage II and III patients with MSS/ MSI-L and corresponding ones with MSI-H colon cancer were found (p = 0.54, p = 0.37, respectively). Conversely, MSI-H patients with stage II colon cancer had a favourable prognosis (p = 0.027). Nevertheless, response to 5-fluorouracil (5-FU) and leucovorin was similar in MSS/ MSI-L and MSI-H groups (p = 0.38). CONCLUSIONS: MSI-H patients are characterized by certain pathological features; those MSI-H patients with a stage II seem to have a better prognosis than MSS/ MSI-L patients. Key words: Colonic neoplasms. Microsatellite repeats. High degree of genomic instability. Genes. Prognosis. Disease-free survival.
Trabajo subvencionado por el Departamento de Salud del Gobierno de Navarra. Correspondencia: Dr. D. Guerrero. Centro de Investigación Biomédica (recinto del Hospital de Navarra). Irunlarrea, 3. 31008. Pamplona. Navarra. España. Correo electrónico: [email protected] Recibido el 29-3-2004; aceptado para su publicación el 2-9-2004. 9
Las tasas de incidencia y de mortalidad, ajustadas a la población mundial, del cáncer de colon y recto obtenidas en España en el año 2000 son, respectivamente, superiores e inferiores a las obtenidas en los países de mayor y menor desarrollo1. En Navarra esta neoplasia constituye el tercer tipo de tumor más frecuente en la población masculina, tras los cánceres de pulmón y próstata, y el segundo tipo en la población femenina, precedido por el cáncer de mama2. Los tumores malignos de colon evolucionan, desde el punto de vista molecular, conforme a 3 modelos de progresión, denominados supresor, mutador y metilador. El modelo supresor, descrito por Fearon y Vogelstein3, está caracterizado por etapas de progresión debidas a la inactivación de genes supresores de tumores, como el gen p53, y a la activación de oncogenes, como k-ras, que favorecen la progresión tumoral. Por otro lado, el fallo del sistema de reparación de falsos emparejamientos introducidos en el ADN por agentes de origen endógeno (proceso de replicación del ADN, etc.) o exógeno (radicales libres de oxígeno, entre otros) constituye la causa de progresión en los casos de cáncer de colon del modelo mutador, descrito por Yamamoto et al4. Esta alteración se debe a las mutaciones e hipermetilaciones de promotores de los genes que codifican para las proteínas de reparación, fundamentalmente hMLH1 y hMSH2, y en menor medida las proteínas hMSH3, hMSH6, hPMS1 y hPMS25. Una de las consecuencias del fallo en la reparación es la inestabilidad de secuencias nucleotídicas repetitivas distribuidas en regiones codificantes (exones) y no codificantes (intrones) del genoma. Los microsatélites son marcadores de secuencias muy conservadas de alto valor informativo en diversos estudios moleculares6. La inestabilidad de microsatélites está presente en un porcentaje que varía del 55 al 86% de los casos de cáncer colorrectal hereditario no polipósico y en una proporción del 15 al 20% de los casos de cáncer de colon esporádico7. Esta alteraMed Clin (Barc). 2005;124(12):441-6
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ADN
C G
A T
C G
A T
C G
A T
C G
A T
PCR T
G
C
A
ADN polimerasa Cebador UP Cebador DOWN
Nucleótidos G
5'
C
A
C
A
C
A
C
3'
G
T
G
T
G
T
G
T
C G
A T
C G
A T
C G
A T
C G
A T
G
T
G
T
G
T
G
T
C
A
C
A
C
A
C
A
3'
A
A
5'
Fig. 1. Esquema del método utilizado en el análisis de los microsatélites. Consiste en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), seguida de la electroforesis en gel desnaturalizante y la detección de bandas mediante tinción de plata. Al comparar en la parte inferior de la figura los patrones de los productos obtenidos desde el ADN de mucosa normal (N) y de tumor (T), se observa a la izquierda un caso inestable (MSI) con bandas adicionales en el patrón T y un caso estable (MSS) en el que los patrones N y T son idénticos (derecha).
Productos de PCR
Electroforesis y revelado
N
T
MSI
N
T
MSS
ción parece relacionarse con determinadas características anatomopatológicas de los tumores (localización, contenido mucinoso, entre otros), así como con las características clínicas de los pacientes (intervalo libre de enfermedad, supervivencia, etc.)8. Los tumores de colon pueden clasificarse, en función del porcentaje de marcadores con inestabilidad, en 2 poblaciones, estable e inestable, según el modelo de González et al9, o en 3 poblaciones con distintos grados de inestabilidad (estable, inestable de bajo grado, inestable de alto grado), según el modelo de Boland et al10. En el presente trabajo se clasificó de un modo exhaustivo a 117 pacientes en función del grado de inestabilidad, mediante técnicas de biología molecular. Para ello utilizamos 7 marcadores microsatélites constituidos por secuencias mono y dinucleotídicas localizadas en distintas regiones del genoma. Nuestro grupo valoró la
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posible asociación existente entre la presencia de inestabilidad de microsatélites y la localización, estadios y contenido mucinoso del tumor, así como el intervalo libre de enfermedad (ILE) de los pacientes intervenidos de tumores en estadios II y III, tiempo libre de progresión (TLP) de pacientes intervenidos de tumores en estadio IV y la supervivencia de los pacientes. Asimismo valoramos tales asociaciones en los tumores de estadios T3N0, dado que la valoración de posibles marcadores de agresividad tumoral en dicho grupo de pacientes puede ser de gran utilidad clínica. Pacientes y método Se incluyó a 120 pacientes con cáncer de colon esporádico, intervenidos en el Servicio de Cirugía General y Digestiva del Hospital de Navarra durante el período 1999-2002; todos los pacientes fueron informados y firmaron el consentimiento diseñado para el estudio, que aprobó el Comité Ético del centro. Se excluyó a los pacientes con cáncer de colon familiar hereditario
no polipósico, según los criterios de Bethesda11, los que habían recibido quimioterapia y/o radioterapia preoperatorias, y los tumores rectales. El tratamiento con quimioterapia de 5-fluorouracilo (5-FU) y leucovorín se consideró en el 35,2, el 41,9 y el 57,1% de los tumores en estadios II, III y IV, respectivamente. Dicho tratamiento se combinó con irinotecán en el 12,9% de los pacientes de estadio III y en el 9,6% de los pacientes con tumores de estadio IV. Finalmente, la combinación de 5-FU/leucovorín con raltitrexed se consideró en el 1,9 y el 6,5% de los tumores de estadios II y III, respectivamente. La pieza en fresco se enviaba en menos de 30 min desde el quirófano del Hospital de Navarra al Servicio de Anatomía Patológica de dicho centro. Siempre que fuera posible y no interfiriera en el correcto diagnóstico anatomopatológico, el patólogo obtuvo una muestra representativa del tumor con escasa presencia de necrosis y un fragmento de mucosa sana alejada del tumor. Las muestras fueron embebidas en el criopolímero OCT (Tissue Tek®, Sakura, Holanda), que hace posible el mantenimiento de la citoarquitectura tisular, y congeladas en nitrógeno líquido para su posterior conservación en congeladores de –80 °C situados en el Centro de Investigación Biomédica. Para definir el estadio tumoral se emplearon las clasificaciones Dukes (modificada de Astler-Cöller)12, el sistema TNM13 y el sistema del American Joint Committee on Cancer (AJCC)14. Dado el tamaño muestral, se consideraron 2 categorías para la localización de los tumores: tumores del colon derecho (ciego, colon ascendente y colon transverso) y del colon izquierdo (colon descendente, sigma). Desde el punto de vista histológico se observaron cortes teñidos de los tumores con hematoxilina y eosina por 2 patólogos que clasificaron los tumores en mucinosos (contenido superior al 70% de mucopolisacárido) y no mucinosos. Según el grado de diferenciación se catalogaron como grado I (mantenimiento de las estructuras glandulares), grado II (mantenimiento del patrón glandular con acumulación de células) y grado III (pérdida del patrón glandular en más del 70% del área tumoral). Los tumores se clasificaron exhaustivamente según las categorías estable (MSS, microsatellite stability), inestable de bajo grado (MSI, low microsatellite instability) e inestable de alto grado (MSI-H, high microsatellite instability) siguiendo los criterios de Boland et al10. Para ello se empleó una batería de 7 marcadores microsatélites que incluye un marcador mononucleotídico (BAT26) y 6 marcadores dinucleotídicos (D2S123, D4S2948, D12S95, Mfd 26, D21S415, D21S1235). Los pacientes se consideran MSI-H cuando presentan inestabilidad en un porcentaje superior al 40% de los marcadores testados, es decir, en un número mínimo de 3 marcadores. Los casos MSI-L son aquellos que presentan inestabilidad en uno o 2 marcadores analizados, mientras que se consideran MSS si no presentan inestabilidad en ninguno de los marcadores analizados10. Los resultados se plantean comparando los grupos MSS/MSI-L frente a los MSI-H, siguiendo las recomendaciones de Boland et al10. La extracción de ADN se realizó a partir de tejido normal y del tumor, conservados en congelación, mediante digestión con proteinasa K, separación de ácidos nucleicos mediante solventes orgánicos y resuspensión en Tris: ácido etilendiaminotetraacético 10:0,1 mM. Para realizar el análisis de inestabilidad se amplificaron los marcadores mencionados mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la electroforesis de los productos obtenidos, tal como se refleja en la figura 1; las mezclas de reacción consistieron en cloruro magnésico, ddNTPs, ADN polimerasa (5 U/μl) (Roche Diagnostics, F Hoffmann-La Roche Ltd., Basilea, Suiza), agua bidestilada estéril (calidad MilliQ, Millipore, EE.UU.) y parejas de cebadores «sentido» y «antisentido». Las secuencias de cebadores y condiciones de las reacciones de PCR fueron específicas de cada marcador y su secuencia está disponible en la base de datos http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/sts. Los productos de PCR de las parejas normal-tumor de cada caso se separaron mediante electroforesis en gel de acrilamida al 6% desnaturalizante (Hoefer, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido), y las bandas se detectaron mediante tinción con nitrato de plata. El resultado se escaneaba en densitómetro (GS-690, BioRad, Hercules, CA94547, USA) y las 10
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imágenes se procesaron mediante programa informático de análisis de imagen (MultiAnalyst, BioRad, Hercules, CA94547, USA). La inestabilidad se detectaba mediante la presencia de bandas adicionales en el patrón de microsatélite del tumor con respecto al obtenido en la mucosa normal (fig. 1). Durante el seguimiento del paciente se valoraron la presencia de recidiva tumoral, metástasis en los estadios localizados, estado del paciente, ILE para los pacientes de estadios II y III, TLP para los pacientes de estadio IV y supervivencia, para un período de seguimiento de 30 meses. Los datos se analizaron mediante el programa estadístico SPSS 10.0. El estudio de asociación entre variables cualitativas se realizó mediante la prueba de la χ2. Cuando alguno de los valores esperados era menor de 5 se empleaba el test exacto de Fisher, y el valor de probabilidad calculado por el test de 2 colas. Se realizó un análisis de supervivencia, ILE y TLP por el método de Kaplan-Meier; para la comparación de las curvas de supervivencia se utilizó el test no paramétrico de rangos logarítmicos. Se evaluó si hay términos de interacción significativa entre los principales factores mediante el análisis estadístico de regresión logística. El nivel de significación estadística aceptado para todas las pruebas fue del 5% (p < 0,05).
Resultados Se excluyó del estudio a 3 pacientes (2,5%) dado que en estos casos se había detectado previamente cáncer de colon, y las pautas de tratamiento y seguimiento consideradas variaban con respecto a las aplicadas al resto de los pacientes. De los 117 pacientes con cáncer de colon esporádico incluidos en el estudio, 77 eran varones (65,8%) y 40, mujeres (34,2%). La edad media (desviación estándar) de la población de estudio fue de 69,3 (10,7) años. La mediana del tiempo de seguimiento fue de 16 (desviación típica) (8,83) meses. El 78,3% de los pacientes no presentaron recidiva local, mientras que el 1,3 y el 3,7% de los casos clasificados como estadio II presentaron recidiva local y metástasis a distancia (hígado), respectivamente. Por otro lado un 2,5 y un 2,9% de los pacientes clasificados como estadio III sufrieron recidiva local y metástasis a distancia, respectivamente. Un 56,7% de los pacientes estaban libres de enfermedad al finalizar el estudio, y el 10,8% de los pacientes continuaban en tratamiento. Los porcentajes de fallecidos por cáncer u otras causas fueron del 19,2 y el 5%, respectivamente. El valor de la mediana del ILE fue de 28 meses (error estándar: 3,46) y el 75% de pacientes sobrevivió al menos 21 meses (error estándar: 3,11). La mediana del período libre de progresión para los pacientes de estadio IV fue de 11 meses. En un 49,6% de los casos el tumor se localizó en el colon derecho (un 11,1% en el ciego, un 32,5% en colon ascendente y un 6% en colon transverso), mientras que el 50,4% restante se situaba en el colon izquierdo (un 12,8% en colon descendente, y un 37,6% en el sigma). 11
63 N
T
73 N
Fig. 2. Patrón de bandas del microsatélite D2S123 obtenido por tinción con nitrato de plata. Se observan un caso heterocigoto estable (63 N-T), 2 casos estables con el marcador en homocigosis (66 N-T; 70 N-T) y un caso inestable con el marcador en homocigosis (73 N-T). La inestabilidad de este último se debe a la inserción de motivos dinucleotídicos CA que da lugar a la formación de bandas adicionales. N: normal; T: tumor.
70
66 N
Según la clasificación Dukes (modificada de Astler-Cöller), se clasificó en los estadios A, B, C y D a un 2,5, un 53,1, un 26,5 y un 17,9% de los casos, respectivamente. Según la clasificación TNM, el 32,5% de los casos se hallaba en estadio T3N0. De acuerdo con el sistema de clasificación AJCC, el estadio II resultó ser el más frecuente (54 tumores; 46,1% de los casos), seguido por el III (31 tumores; 26,5% de los casos), IV (21 tumores; 17,9% de los casos) y el estadio I (11 tumores; 9,4% de los casos). Se constató evidencia de invasión de vasos linfáticos y sanguíneos en el 27,5 y el 21,7% de la totalidad de los casos, respectivamente. El 16,7, el 13, el 35,5 y el 57,1% de los casos clasificados como estadios I, II, III y IV presentaron evidencia de invasión de vasos linfáticos, mientras que se constató invasión de vasos sanguíneos en el 8,3, el 13, el 25,8 y el 42,9% de los tumores clasificados como estadios I, II, III y IV, respectivamente. De los 18 pacientes
T
N
T
T
con metástasis hepáticas, se practicó una resección hepática a 13, que quedaron libres de enfermedad. Con respecto al grado de diferenciación de los tumores, la mayor parte se incluyó en la categoría de los casos medianamente diferenciados (82,9%), mientras que el 7,7% de los casos presentaron un menor grado de diferenciación (grado III). El contenido mucinoso extracelular estuvo presente en un 27,6% de los tumores, contenido que era superior al 70% del volumen tumoral en el 19,6% de los casos. Se amplificaron la totalidad de las parejas normal-tumor de cada caso para el análisis de la inestabilidad de microsatélites (tabla 1). Detectamos 43 casos con inestabilidad en uno o más microsatélites (36,7%); de ellos, 19 (16,2%) resultaron ser MSI-H y 24 MSI-L, según el criterio de clasificación considerado10 (fig. 2). Los microsatélites con mayor porcentaje de inestabilidad en los casos con alto grado de
TABLA 1 Porcentajes de estabilidad e inestabilidad de los microsatélites analizados en función del grado de inestabilidad de cada paciente BAT26 Estable Inestable D2S123 Estable Inestable D4S2948 Estable Inestable D12S95 Estable Inestable MFD 26 Estable Inestable D21S415 Estable Inestable D21S1235 Estable Inestable
MSS
MSI-L
MSI-H
66 (100%) 0 (0%)
18 (69,3%) 8 (30,7%)
10 (47,6%) 11 (52,4%)
68 (100%) 0 (0%)
20 (69%) 9 (31%)
11 (52,4%) 10 (47,6%)
56 (98,3%) 1 (1,7%)
21 (80,7%) 5 (19,3%)
12 (57,1%) 9 (42,9%)
67 (100%) 0 (0%)
20 (71,4%) 8 (28,6%)
9 (42,9%) 12 (57,1%)
61 (100%) 0 (0%)
26 (92,85%) 2 (7,15%)
12 (60%) 8 (40%)
69 (100%) 0 (0%)
20 (71,4%) 8 (28,6%)
12 (57,1%) 9 (42,9%)
65 (98,5%) 1 (1,5%)
20 (71,4%) 8 (28,6%)
13 (61,9%) 8 (38,1%)
MSS: estables; MSI-L: inestables de bajo grado; MSI-H: inestables de alto grado. La inestabilidad se observa como un patrón de bandas adicionales en el patrón de la muestra tumoral con respecto a la muestra normal.
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MSI-H estadio II 100
Supervivencia acumulada (%)
90 80 70 60 50 MSS/MSI-L estadio II
40 30 20 10
p = 0,027
0 0
6 12 18 24 Meses después de la aleatorización N.° de pacientes en estadio II en riesgo MSS/MSI-L MSI-H
44 10
40 10
37 10
33 10
inestabilidad fueron, en orden descendente, D12S95, BAT26, D2S123, D4S2948, D21S415, Mfd26 y D21S1235 (tabla 1) Los resultados de las asociaciones entre las características clínicas y patológicas de los pacientes y la inestabilidad de microsatélites se reflejan en las tablas 2 y 3. No se obtuvieron interacciones significativas entre los principales factores descritos, para valores de probabilidad inferiores a 0,5. Los tumores MSI-H tendieron a localizarse preferentemente en el colon derecho (p = 0,022) y presentaron estadios de progresión (p = 0,66) y grado de diferenciación (p = 0,15) similares a los tumores MSS/MSI-L. El tipo histológico mucinoso se asoció al fallo en la reparación detectada por el alto grado de inestabilidad de microsatélites (p = 0,04). Con respecto a las características clínicas, los ILE fueron más prolongados para los pacientes intervenidos de tumores en estadios II de progresión frente a los tumores de estadio III (p = 0,032) (tabla 3). Sin embargo no se observaron diferencias estadísticamente significativas con respecto a los ILE de los tumores MSS y MSI-L frente a los tumores MSI-H de estadios II (p = 0,44), III (p = 0,75) y T3N0 (p = 0,31), ni en el TLP de los tumores de estadio IV (p = 0,4). Los pacientes MSI-H de estadio II presentaron períodos de supervivencia más prolongados que los pacientes MSS y MSI-L (p = 0,027) (fig. 3), aunque no encontramos tales diferencias si consideramos globalmente a los pacientes de estadios II y III (p = 0,37) o a los pacientes
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Fig. 3. Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier que indican el valor pronóstico de la inestabilidad de microsatélites en tumores de estadio II. Los pacientes inestables de alto grado (MSI-H) en estadio II presentan un mejor pronóstico que los pacientes estables (MSS) y los inestables de bajo grado (MSI-L) (p = 0,027).
de estadios III (p = 0,78). La localización tumoral y el grado de diferenciación no tienen valor pronóstico en nuestra población de estudio (p = 0,86 y p = 0,95, respectivamente), ni en el TLP de los pacientes de estadio IV (p = 0,57 y p = 0,82, respectivamente). Asimismo no se observan diferencias en la respuesta al tratamiento de las 2 categorías de tumores consideradas (p = 0,38). Discusión El cáncer de colon constituye una de las neoplasias más frecuentes en nuestra sociedad. Un 90% de los pacientes no tie-
ne antecedentes familiares y, con frecuencia, los síntomas de la enfermedad aparecen tardíamente. Por ello, es posible que los tumores se diagnostiquen en estadios avanzados, lo que implica un peor pronóstico y un mayor índice de recidivas y metástasis a distancia. Asimismo, la falta de criterios para la caracterización de tumores colorrectales de mayor agresividad dentro del grupo de estadio II y T3N0 hace necesaria la búsqueda de parámetros clínicos, patológicos o moleculares implicados en la progresión tumoral15. Por tanto, se hace preciso complementar las técnicas habituales de clasificación de los tumores de colon con técnicas de biología molecular e inmunohistoquímica que ayuden a caracterizar grupos de tumores más agresivos o de peor pronóstico. En este sentido, en el presente trabajo hemos analizado las posibles asociaciones entre determinados parámetros clínicos y morfológicos, con alteraciones moleculares –como la inestabilidad de microsatélites–, que pudieran tener valor como marcadores de agresividad tumoral. La población de estudio incluye únicamente tumores localizados en colon, dado que la práctica totalidad de los tumores de recto en nuestro servicio reciben radioquimioterapia preoperatoria, cuyos efectos sobre el ADN constituirían un sesgo en el estudio molecular. Asimismo, el comportamiento de los tumores localizados en colon y recto parece variar en relación con la inestabilidad de los microsatélites16 y con la implicación del componente displásico en lesiones adenomatosas. El estudio se diseñó como un análisis prospectivo que permitiera estandarizar las condiciones de recogida y posterior almacenamiento de las muestras de tejido normal y tumoral en óptimas condiciones para el estudio molecular. Debemos destacar que el período considerado ópti-
TABLA 2 Relación de las características clinicopatológicas y la estabilidad de microsatélites Grupos de tumores N.º de pacientes
Estadio II III IV Total Localización Colon derecho Colon izquierdo Total Grado de diferenciación I II III Total Histología Mucinoso No mucinoso Total
p MSS/MSI-L
MSI-H
54 31 21 106
46 (85,2%) 24 (77,4%) 17 (80,9%)
8 (15,4%) 7 (22,6%) 4 (19,1%)
58 59 117
44 (75,8%) 54 (91,5%)
14 (24,2%) 5 (8,4%)
11 97 9 117
7 (63,6%) 83 (85,5%) 8 (88,9%)
4 (36,3%) 14 (14,5%) 1 (11,1%)
23 94 117
16 (69,6%) 82 (87,2%)
7 (30,4%) 12 (17,8%)
0,66 (NS)
0,022
0,15 (NS)
0,04
MSS: estables; MSI-L: inestables de bajo grado; MSI-H: inestables de alto grado; NS: no significativo. Estadios II, III y IV según sistema de clasificación del American Joint Committee on Cancer (AJCC).
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TABLA 3 Análisis univariante del intervalo libre de enfermedad (ILE) y la supervivencia en relación a las características anatomopatológicas de los pacientes de estadios II y III en un período de seguimiento de 2 años y medio ILE acumulado a 2,5 años N.º de pacientes
Estadio II III Localización Colon derecho Colon izquierdo Grado de diferenciación I II III Estabilidad de microsatélites Tumores MSS/MSI-L Tumores MSI-H Estabilidad microsatélitesestadio II Tumores MSS/MSI-L Tumores MSI-H Estabilidad microsatélitesestadio III Tumores MSS/MSI-L Tumores MSI-H
N.º de pacientes sin enfermedad (% ILE-a)
Supervivencia acumulada a 2,5 años p
N.º de pacientes que sobreviven n (% S-a)
p
54 31
51 (94,5%) 20 (64,5%)
0,032
43 (65,5%) 25 (62,8%)
0,83 (NS)
37 48
30 (80,2%) 44 (85,9%)
0,92 (NS)
30 (76,9%) 38 (59,3%)
0,86 (NS)
4 76 5
4 (100%) 70 (87,3%) 4 (66,6%)
70 15
64 (85,7%) 14 (80%)
0,54 (NS)
55 (59,2%) 13 (86,7%)
0,37 (NS)
44 10
42 (93,2%) 10 (100%)
0,44 (NS)
29 (45,1%) 10 (100%)
0,027
26 5
22 (72,2%) 4 (66,6%)
0,75 (NS)
20 (58,4%) 4 (80%)
0,78 (NS)
0,73 (NS)
3 (75%) 61 (61,3%) 4 (80%)
0,95 (NS)
MSS: estables; MSI-L: inestables de bajo grado; MSI-H inestables de alto grado; ILE-a: ILE acumulada; S-a: supervivencia acumulada; NS: no significativo. Estadios II y III según sistema de clasificación del American Joint Committee on Cancer (AJCC).
mo para el seguimiento de los pacientes y la valoración del ILE y la supervivencia en el cáncer colorrectal tiene una duración aproximada de 5 años17,18. El valor de la mediana del tiempo de seguimiento de nuestros pacientes es inferior a 3 años, por lo que las conclusiones del estudio, en relación con el valor pronóstico de los parámetros estudiados, deben contrastarse considerando un período de seguimiento en torno a 5 años. Los casos MSS y MSI-L parecen presentar diferencias con los casos MSI-H desde el punto de vista clínico y anatomopatológico10. En este sentido, diversos grupos de investigación han descrito la asociación entre la inestabilidad de microsatélites y el contenido mucinoso de los tumores, así como la edad de aparición de la enfermedad más temprana y la forma de crecimiento exofítica19. En el presente estudio, la inestabilidad está asociada con el carácter mucinoso del tumor, debido posiblemente a la presencia de los mucopolisacáridos MUC2 y MUC5A descritos recientemente en casos inestables de cáncer de colon esporádico20. Actualmente no hay consenso con respecto al valor pronóstico de la inestabilidad de microsatélites. Liang et al21 observaron un mejor pronóstico de los casos inestables, mientras que Gervaz et al22 concluyeron que los casos inestables localizados a lo largo de todo el colon o únicamente en el colon izquierdo presen13
taban un pronóstico peor. En este sentido, Gryfe et al23 obtienen períodos de supervivencia más prolongados para los pacientes MSI-H y edades inferiores a 50 años. Sin embargo, Watanabe et al24 no obtuvieron tales diferencias en su población de estudio. Nuestro grupo describe períodos de supervivencia más prolongados para los tumores MSI de estadios II, lo que confirma resultados previos descritos en pacientes MSI-H10,25.. Cabe destacar que se ha descrito la asociación entre MSI-H y una mejor respuesta al tratamiento con 5-FU/leucovorín en pacientes intervenidos de tumores de estadio IV26. Se postula que este hecho no se debe a una menor agresividad de los tumores MSI-H de dicho estadio, sino a una mejor respuesta al tratamiento, debida posiblemente a la puesta en marcha de procesos apoptóticos independientes del fallo en la reparación. Sin embargo Ribic et al27 han demostrado recientemente una peor respuesta al tratamiento con 5-FU en los pacientes MSI-H y estadios II y III. En el presente estudio no hemos obtenido diferencias significativas entre ambos grupos ni hemos valorado el efecto del tratamiento por estadios, dado que el número de pacientes por estadio con MSI-H es reducido. Las diferencias descritas desde el punto de vista fisiológico, inmunológico y embriológico para las células de la mucosa del colon derecho e izquierdo, así como
para la respuesta a la quimioterapia con 5-FU de los tumores localizados en colon derecho o izquierdo, llevan a postular la existencia de 2 categorías de tumores en función de la localización, tal como sostienen Iacopetta et al28. Nuestro trabajo apoya tal hipótesis, dado que encontramos una clara tendencia a la localización de los tumores MSI-H en el colon derecho con respecto al colon izquierdo, así como la tendencia a presentar contenido mucinoso. A la vista de los resultados obtenidos en nuestro estudio, cabe destacar la necesidad de analizar la inestabilidad de microsatélites en poblaciones más numerosas y con períodos de seguimiento más prolongados, con el fin de contrastar el posible valor pronóstico de dicho parámetro. En nuestra opinión, es conveniente la clasificación molecular de los tumores de colon según las vías de progresión supresora o mutadora en grados de inestabilidad, con el fin de realizar un seguimiento más estrecho de los casos de estadio II o de estadio T3N0 de mayor agresividad tumoral. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. GLOBOCAN 2000. Cancer incidence, mortality and prevalence worldwide, Version 1.0; IARC CancerBase N.º 5. 2. Registro de Cáncer de Navarra. Sección de Enfermedades no Transmisibles y Estadísticas Vitales. Incidencia y mortalidad por cáncer en Navarra, 1993-1997. Tendencias en los últimos 25 años. Anales Sis San Navarra. 2001;24:339-62. 3. Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 1990;61:759-67. 4. Yamamoto H, Sawai H, Perucho M. Frameshift somatic mutations in gastrointestinal cancer of the microsatellite mutator phenotype. Cancer Res. 1997;57:4420-6. 5. Esteller M. Epigenetic lesions causing genetic lesions in human cancer: promoter hypermethylation of DNA repair genes. Eur J Cancer. 2000;36:2294-300. 6. Ionov Y, Peinado MA, Malkhosyan S, Shibata D, Perucho M. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis. Nature 1993; 363:558-61. 7. Chaves P, Cruz C, Lage P, Claro I, Cravo M, Leitao CN, et al. Immunohistochemical detection of mismatch repair gene proteins as a useful tool for the identification of colorectal carcinoma with the mutator phenotype. J Pathol. 2000;191:355-60. 8. Goel A, Arnold CN, Niedzwiecki D, Chang DK, Ricciardiello L, Carethers JM, et al. Characterization of sporadic colon cancer by patterns of genomic instability. Cancer Res. 2003;63:1608-14. 9. González-García I, Moreno V, Navarro M, MartíRague J, Marcuello E, Benasco C, et al. Standardized approach for microsatellite instability detection in colorectal carcinomas. J Natl Cancer Inst. 2000;92:544-9. 10. Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, Sidransky D, Eshleman JR, Burt RW, et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 1998; 58:5248-57. 11. Rodríguez Bigas MA, Boland CR, Hamilton SR, Henson DE, Jass. JR, Khan PM, et al. A National Cancer Institute Workshop on Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer Syndrome: meeting highlights and Bethesda guidelines. J Natl Cancer Inst. 1997;89:1758-62. Med Clin (Barc). 2005;124(12):441-6
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GUERRERO D, ET AL. ASOCIACIÓN ENTRE LA INESTABILIDAD DE MICROSATÉLITES Y LAS CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS Y ANATOMOPATOLÓGICAS EN PACIENTES CON CÁNCER DE COLON ESPORÁDICO
12. Sarma DP. The Dukes classification of colorectal cancer. JAMA. 1986;256:1447. 13. Compton CC. Colorectal carcinoma: diagnostic, prognostic and molecular features. Mod Pathol. 2003;16:376-88. 14. American Joint Committee on cancer. AJCC cancer staging manual. 5th ed. Philadelphia: Lippincott-Raven; 1997. 15. Graziano F, Cascinu S. Prognostic molecular markers for planning adjuvant chemotherapy trials in Dukes’ B colorectal cancer patients: how much evidence is enough? Ann Oncol. 2003;14: 1026-38. 16. Ikeda Y, Mori M, Akagi K, Iwashita A, Haraguchi Y, Maehara Y, et al. Differences between features of adenoma in the rectum versus sigmoid colon. Am J Gastroenterol. 2000;95:3620-3. 17. De Goede E, Filez L, Janssens J, Van Cutsem E. Follow-up of colon cancer: detection of liver metastases: benefit and periodicity. Acta Gastroenterol Belg. 1998;61:8-10. 18. Peethambaram P, Weiss M, Loprinzi CL, Novotny P, O’Fallon JR, Erlichman C, et al. An evaluation of postoperative follow-up tests in colon cancer patients treated for cure. Oncology. 1997;54:287-92.
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Med Clin (Barc). 2005;124(12):441-6
19. Messerini L, Ciantelli M, Baglioni S, Palomba A, Zampi G, Papi L. Prognostic significance of microsatellite instability in sporadic mucinous colorectal cancers. Hum Pathol. 1999;30:629-34. 20. Biemer-Huttmann AE, Walsh MD, McGuckin MA, Simms LA, Young J, Leggett BA, et al. Mucin core protein expression in colorectal cancers with high levels of microsatellite instability indicates a novel pathway of morphogenesis. Clin Cancer Res. 2000;6:1909-16. 21. Liang JT, Chang KJ, Chen JC, Lee CC, Cheng YM, Hsu HC, et al. Clinicopathologic and carcinogenetic appraisal of DNA replication error in sporadic T3N0M0 stage colorectal cancer after curative resection. Hepatogastroenterology. 1999; 46:883-90. 22. Gervaz P, Cerottini JP, Bouzourene H, Hahnloser D, Doan CL, Benhattar J, et al. Comparison of microsatellite instability and chromosomal instability in predicting survival of patients with T3N0 colorectal cancer. Surgery. 2002;131:190-7. 23. Gryfe R, Kim H, Hsieh ET, Aronson MD, Holowaty EJ, Bull SB, et al. Tumor microsatellite instavility and clinical outcome in young patients with colorectal cancer. N Engl J Med. 2000;342: 69-77.
24. Watanabe T, Wu TT, Catalano PJ, UEKI T, Satriano R, Haller DG, et al. Molecular predictors of survival after adjuvant chemotherapy for colon cancer. N Engl J Med. 2001;344:1196-206. 25. Samowitz WS, Curtin K, Ma KN, Schaffer D, Coleman LW, Leppert M, et al. Microsatellite instability in sporadic colon cancer is associated with an improved prognosis at the population level. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2001;10: 917-23. 26. Liang JT, Huang KC, Lai HS, Lee PH, Cheng YM, Hsu HC, et al. High-frequency microsatellite instability predicts better chemosensitivity to high-dose 5-fluorouracil plus leucovorin chemotherapy for stage IV sporadic colorectal cancer after palliative bowel resection. Int J Cancer. 2002;101:519-25. 27. Ribic CM, Sargent DJ, Moore MJ, Thibodeau SN, French AJ, Goldberg RM, et al. Tumor microsatellite-instability status as a predictor of bene-fit from Fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer. N Engl J Med. 2003;349: 247-57. 28. Iacopetta B. Are there two sides to colorectal cancer? Int J Cancer. 2002;101:403-8.
14
94.809
David Guerreroa, Enrique Balenb, José María Martínez-Peñuelac, Jesús García-Foncillasd, Begoña Larrinagac, María Cristina Caballeroc, Javier Herrerab y José Miguel Lerab a
Centro de Investigación Biomédica. Servicio Navarro de Salud. Pamplona. Navarra. Servicio de Cirugía General y Digestiva. Hospital de Navarra. Servicio Navarro de Salud. Pamplona. Navarra. Servicio de Anatomía Patológica. Hospital de Navarra. Servicio Navarro de Salud. Pamplona. Navarra. d Laboratorio de Biotecnología y Farmacogenómica. Centro de Investigación Médica Aplicada (CIMA). Clínica Universitaria de Navarra. Universidad de Navarra. Pamplona. Navarra. España. b c
FUNDAMENTO Y OBJETIVO: La inestabilidad de microsatélites derivada del fallo en la reparación de los falsos emparejamientos del ADN es la alteración característica de los tumores de la vía mutadora o inestables (MSI). Tales casos parecen presentar diferencias desde el punto de vista clinicopatológico con los tumores de la vía supresora o estables (MSS). Los tumores con alto grado de inestabilidad (MSI-H) parecen constituir una nueva entidad de tumores con diferencias en determinadas características anatomopatológicas y clínicas con respecto a los tumores estables (MSS) e inestables de bajo grado (MSI-L). En el presente estudio se valora la posible asociación entre el alto grado de inestabilidad de microsatélites con la localización, contenido mucinoso, grado de diferenciación, estadio, así como el intervalo libre de enfermedad y supervivencia. PACIENTES Y MÉTODO: Se clasifica a 117 pacientes con cáncer de colon esporádico en las poblaciones MSS/MSI-L y MSI-H (siguiendo las recomendaciones del National Cancer Institute) mediante reacción en cadena de la polimerasa y electroforesis de 7 microsatélites. RESULTADOS: Los tumores MSI-H tendieron a localizarse en el colon derecho (p = 0,022) y a presentar contenido mucinoso (p = 0,04). El conjunto de pacientes MSI-H de estadios II y III no presentó intervalos libres de enfermedad ni períodos de supervivencia más prolongados (p = 0,54, p = 0,37, respectivamente). Los tumores MSI-H de estadio II presentaron períodos de supervivencia más prolongados que los tumores MSS/MSI-L (p = 0,027). No observamos diferencias en la respuesta a quimioterapia con 5-fluorouracilo y leucovorín entre los grupos MSS/MSI-L y MSI-H (p = 0,38). CONCLUSIONES: El alto grado de inestabilidad de microsatélites se asocia con determinadas características patológicas, así como con períodos de supervivencia más prolongados para los tumores de estadios II. Palabras clave: Cáncer de colon. Repeticiones de microsatélites. Alto grado de inestabilidad. Genes. Pronóstico. Intervalo libre de enfermedad.
Association between microsatellite instability and clinico-pathological characteristics in sporadic colon cancer BACKGROUND AND OBJECTIVE: Currently, colon cancer is a leading cause of cancer death worldwide. It progresses according to three molecular pathways, named suppressor, mutador and methylator. Microsatellite instability is a hallmark of the lack of reparation, of DNA mismatches and it characterizes a subset of colon tumors (unstable tumors, MSI). MSI-H patients (high degree of microsatellite instability) seem to share clinico-pathological differences with MSS (microsatellite stable) and MSI-L (low degree of microsatellite instability) patients. In this study, associations between high degree of microsatellite instability and pathological (location, mucinous content, differentiation grade, stages T3N0, stages II and III) and clinical features (response to chemotherapy, disease-free survival and overall survival) were evaluated. PATIENTS AND METHOD: 117 patients with sporadic colon cancer were classified into two populations (MSS/MSI-L and MSI-H) by using PCR and electrophoresis of seven microsatellites, according to the National Cancer Institute recommendations. RESULTS: MSI-H tumors tended to be located in the right colon (p = 0.022) and were of mucinous histologic type (p = 0.04). No differences in disease-free survival and overall survival between group of stage II and III patients with MSS/ MSI-L and corresponding ones with MSI-H colon cancer were found (p = 0.54, p = 0.37, respectively). Conversely, MSI-H patients with stage II colon cancer had a favourable prognosis (p = 0.027). Nevertheless, response to 5-fluorouracil (5-FU) and leucovorin was similar in MSS/ MSI-L and MSI-H groups (p = 0.38). CONCLUSIONS: MSI-H patients are characterized by certain pathological features; those MSI-H patients with a stage II seem to have a better prognosis than MSS/ MSI-L patients. Key words: Colonic neoplasms. Microsatellite repeats. High degree of genomic instability. Genes. Prognosis. Disease-free survival.
Trabajo subvencionado por el Departamento de Salud del Gobierno de Navarra. Correspondencia: Dr. D. Guerrero. Centro de Investigación Biomédica (recinto del Hospital de Navarra). Irunlarrea, 3. 31008. Pamplona. Navarra. España. Correo electrónico: [email protected] Recibido el 29-3-2004; aceptado para su publicación el 2-9-2004. 9
Las tasas de incidencia y de mortalidad, ajustadas a la población mundial, del cáncer de colon y recto obtenidas en España en el año 2000 son, respectivamente, superiores e inferiores a las obtenidas en los países de mayor y menor desarrollo1. En Navarra esta neoplasia constituye el tercer tipo de tumor más frecuente en la población masculina, tras los cánceres de pulmón y próstata, y el segundo tipo en la población femenina, precedido por el cáncer de mama2. Los tumores malignos de colon evolucionan, desde el punto de vista molecular, conforme a 3 modelos de progresión, denominados supresor, mutador y metilador. El modelo supresor, descrito por Fearon y Vogelstein3, está caracterizado por etapas de progresión debidas a la inactivación de genes supresores de tumores, como el gen p53, y a la activación de oncogenes, como k-ras, que favorecen la progresión tumoral. Por otro lado, el fallo del sistema de reparación de falsos emparejamientos introducidos en el ADN por agentes de origen endógeno (proceso de replicación del ADN, etc.) o exógeno (radicales libres de oxígeno, entre otros) constituye la causa de progresión en los casos de cáncer de colon del modelo mutador, descrito por Yamamoto et al4. Esta alteración se debe a las mutaciones e hipermetilaciones de promotores de los genes que codifican para las proteínas de reparación, fundamentalmente hMLH1 y hMSH2, y en menor medida las proteínas hMSH3, hMSH6, hPMS1 y hPMS25. Una de las consecuencias del fallo en la reparación es la inestabilidad de secuencias nucleotídicas repetitivas distribuidas en regiones codificantes (exones) y no codificantes (intrones) del genoma. Los microsatélites son marcadores de secuencias muy conservadas de alto valor informativo en diversos estudios moleculares6. La inestabilidad de microsatélites está presente en un porcentaje que varía del 55 al 86% de los casos de cáncer colorrectal hereditario no polipósico y en una proporción del 15 al 20% de los casos de cáncer de colon esporádico7. Esta alteraMed Clin (Barc). 2005;124(12):441-6
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ADN
C G
A T
C G
A T
C G
A T
C G
A T
PCR T
G
C
A
ADN polimerasa Cebador UP Cebador DOWN
Nucleótidos G
5'
C
A
C
A
C
A
C
3'
G
T
G
T
G
T
G
T
C G
A T
C G
A T
C G
A T
C G
A T
G
T
G
T
G
T
G
T
C
A
C
A
C
A
C
A
3'
A
A
5'
Fig. 1. Esquema del método utilizado en el análisis de los microsatélites. Consiste en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), seguida de la electroforesis en gel desnaturalizante y la detección de bandas mediante tinción de plata. Al comparar en la parte inferior de la figura los patrones de los productos obtenidos desde el ADN de mucosa normal (N) y de tumor (T), se observa a la izquierda un caso inestable (MSI) con bandas adicionales en el patrón T y un caso estable (MSS) en el que los patrones N y T son idénticos (derecha).
Productos de PCR
Electroforesis y revelado
N
T
MSI
N
T
MSS
ción parece relacionarse con determinadas características anatomopatológicas de los tumores (localización, contenido mucinoso, entre otros), así como con las características clínicas de los pacientes (intervalo libre de enfermedad, supervivencia, etc.)8. Los tumores de colon pueden clasificarse, en función del porcentaje de marcadores con inestabilidad, en 2 poblaciones, estable e inestable, según el modelo de González et al9, o en 3 poblaciones con distintos grados de inestabilidad (estable, inestable de bajo grado, inestable de alto grado), según el modelo de Boland et al10. En el presente trabajo se clasificó de un modo exhaustivo a 117 pacientes en función del grado de inestabilidad, mediante técnicas de biología molecular. Para ello utilizamos 7 marcadores microsatélites constituidos por secuencias mono y dinucleotídicas localizadas en distintas regiones del genoma. Nuestro grupo valoró la
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Med Clin (Barc). 2005;124(12):441-6
posible asociación existente entre la presencia de inestabilidad de microsatélites y la localización, estadios y contenido mucinoso del tumor, así como el intervalo libre de enfermedad (ILE) de los pacientes intervenidos de tumores en estadios II y III, tiempo libre de progresión (TLP) de pacientes intervenidos de tumores en estadio IV y la supervivencia de los pacientes. Asimismo valoramos tales asociaciones en los tumores de estadios T3N0, dado que la valoración de posibles marcadores de agresividad tumoral en dicho grupo de pacientes puede ser de gran utilidad clínica. Pacientes y método Se incluyó a 120 pacientes con cáncer de colon esporádico, intervenidos en el Servicio de Cirugía General y Digestiva del Hospital de Navarra durante el período 1999-2002; todos los pacientes fueron informados y firmaron el consentimiento diseñado para el estudio, que aprobó el Comité Ético del centro. Se excluyó a los pacientes con cáncer de colon familiar hereditario
no polipósico, según los criterios de Bethesda11, los que habían recibido quimioterapia y/o radioterapia preoperatorias, y los tumores rectales. El tratamiento con quimioterapia de 5-fluorouracilo (5-FU) y leucovorín se consideró en el 35,2, el 41,9 y el 57,1% de los tumores en estadios II, III y IV, respectivamente. Dicho tratamiento se combinó con irinotecán en el 12,9% de los pacientes de estadio III y en el 9,6% de los pacientes con tumores de estadio IV. Finalmente, la combinación de 5-FU/leucovorín con raltitrexed se consideró en el 1,9 y el 6,5% de los tumores de estadios II y III, respectivamente. La pieza en fresco se enviaba en menos de 30 min desde el quirófano del Hospital de Navarra al Servicio de Anatomía Patológica de dicho centro. Siempre que fuera posible y no interfiriera en el correcto diagnóstico anatomopatológico, el patólogo obtuvo una muestra representativa del tumor con escasa presencia de necrosis y un fragmento de mucosa sana alejada del tumor. Las muestras fueron embebidas en el criopolímero OCT (Tissue Tek®, Sakura, Holanda), que hace posible el mantenimiento de la citoarquitectura tisular, y congeladas en nitrógeno líquido para su posterior conservación en congeladores de –80 °C situados en el Centro de Investigación Biomédica. Para definir el estadio tumoral se emplearon las clasificaciones Dukes (modificada de Astler-Cöller)12, el sistema TNM13 y el sistema del American Joint Committee on Cancer (AJCC)14. Dado el tamaño muestral, se consideraron 2 categorías para la localización de los tumores: tumores del colon derecho (ciego, colon ascendente y colon transverso) y del colon izquierdo (colon descendente, sigma). Desde el punto de vista histológico se observaron cortes teñidos de los tumores con hematoxilina y eosina por 2 patólogos que clasificaron los tumores en mucinosos (contenido superior al 70% de mucopolisacárido) y no mucinosos. Según el grado de diferenciación se catalogaron como grado I (mantenimiento de las estructuras glandulares), grado II (mantenimiento del patrón glandular con acumulación de células) y grado III (pérdida del patrón glandular en más del 70% del área tumoral). Los tumores se clasificaron exhaustivamente según las categorías estable (MSS, microsatellite stability), inestable de bajo grado (MSI, low microsatellite instability) e inestable de alto grado (MSI-H, high microsatellite instability) siguiendo los criterios de Boland et al10. Para ello se empleó una batería de 7 marcadores microsatélites que incluye un marcador mononucleotídico (BAT26) y 6 marcadores dinucleotídicos (D2S123, D4S2948, D12S95, Mfd 26, D21S415, D21S1235). Los pacientes se consideran MSI-H cuando presentan inestabilidad en un porcentaje superior al 40% de los marcadores testados, es decir, en un número mínimo de 3 marcadores. Los casos MSI-L son aquellos que presentan inestabilidad en uno o 2 marcadores analizados, mientras que se consideran MSS si no presentan inestabilidad en ninguno de los marcadores analizados10. Los resultados se plantean comparando los grupos MSS/MSI-L frente a los MSI-H, siguiendo las recomendaciones de Boland et al10. La extracción de ADN se realizó a partir de tejido normal y del tumor, conservados en congelación, mediante digestión con proteinasa K, separación de ácidos nucleicos mediante solventes orgánicos y resuspensión en Tris: ácido etilendiaminotetraacético 10:0,1 mM. Para realizar el análisis de inestabilidad se amplificaron los marcadores mencionados mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la electroforesis de los productos obtenidos, tal como se refleja en la figura 1; las mezclas de reacción consistieron en cloruro magnésico, ddNTPs, ADN polimerasa (5 U/μl) (Roche Diagnostics, F Hoffmann-La Roche Ltd., Basilea, Suiza), agua bidestilada estéril (calidad MilliQ, Millipore, EE.UU.) y parejas de cebadores «sentido» y «antisentido». Las secuencias de cebadores y condiciones de las reacciones de PCR fueron específicas de cada marcador y su secuencia está disponible en la base de datos http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/sts. Los productos de PCR de las parejas normal-tumor de cada caso se separaron mediante electroforesis en gel de acrilamida al 6% desnaturalizante (Hoefer, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido), y las bandas se detectaron mediante tinción con nitrato de plata. El resultado se escaneaba en densitómetro (GS-690, BioRad, Hercules, CA94547, USA) y las 10
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imágenes se procesaron mediante programa informático de análisis de imagen (MultiAnalyst, BioRad, Hercules, CA94547, USA). La inestabilidad se detectaba mediante la presencia de bandas adicionales en el patrón de microsatélite del tumor con respecto al obtenido en la mucosa normal (fig. 1). Durante el seguimiento del paciente se valoraron la presencia de recidiva tumoral, metástasis en los estadios localizados, estado del paciente, ILE para los pacientes de estadios II y III, TLP para los pacientes de estadio IV y supervivencia, para un período de seguimiento de 30 meses. Los datos se analizaron mediante el programa estadístico SPSS 10.0. El estudio de asociación entre variables cualitativas se realizó mediante la prueba de la χ2. Cuando alguno de los valores esperados era menor de 5 se empleaba el test exacto de Fisher, y el valor de probabilidad calculado por el test de 2 colas. Se realizó un análisis de supervivencia, ILE y TLP por el método de Kaplan-Meier; para la comparación de las curvas de supervivencia se utilizó el test no paramétrico de rangos logarítmicos. Se evaluó si hay términos de interacción significativa entre los principales factores mediante el análisis estadístico de regresión logística. El nivel de significación estadística aceptado para todas las pruebas fue del 5% (p < 0,05).
Resultados Se excluyó del estudio a 3 pacientes (2,5%) dado que en estos casos se había detectado previamente cáncer de colon, y las pautas de tratamiento y seguimiento consideradas variaban con respecto a las aplicadas al resto de los pacientes. De los 117 pacientes con cáncer de colon esporádico incluidos en el estudio, 77 eran varones (65,8%) y 40, mujeres (34,2%). La edad media (desviación estándar) de la población de estudio fue de 69,3 (10,7) años. La mediana del tiempo de seguimiento fue de 16 (desviación típica) (8,83) meses. El 78,3% de los pacientes no presentaron recidiva local, mientras que el 1,3 y el 3,7% de los casos clasificados como estadio II presentaron recidiva local y metástasis a distancia (hígado), respectivamente. Por otro lado un 2,5 y un 2,9% de los pacientes clasificados como estadio III sufrieron recidiva local y metástasis a distancia, respectivamente. Un 56,7% de los pacientes estaban libres de enfermedad al finalizar el estudio, y el 10,8% de los pacientes continuaban en tratamiento. Los porcentajes de fallecidos por cáncer u otras causas fueron del 19,2 y el 5%, respectivamente. El valor de la mediana del ILE fue de 28 meses (error estándar: 3,46) y el 75% de pacientes sobrevivió al menos 21 meses (error estándar: 3,11). La mediana del período libre de progresión para los pacientes de estadio IV fue de 11 meses. En un 49,6% de los casos el tumor se localizó en el colon derecho (un 11,1% en el ciego, un 32,5% en colon ascendente y un 6% en colon transverso), mientras que el 50,4% restante se situaba en el colon izquierdo (un 12,8% en colon descendente, y un 37,6% en el sigma). 11
63 N
T
73 N
Fig. 2. Patrón de bandas del microsatélite D2S123 obtenido por tinción con nitrato de plata. Se observan un caso heterocigoto estable (63 N-T), 2 casos estables con el marcador en homocigosis (66 N-T; 70 N-T) y un caso inestable con el marcador en homocigosis (73 N-T). La inestabilidad de este último se debe a la inserción de motivos dinucleotídicos CA que da lugar a la formación de bandas adicionales. N: normal; T: tumor.
70
66 N
Según la clasificación Dukes (modificada de Astler-Cöller), se clasificó en los estadios A, B, C y D a un 2,5, un 53,1, un 26,5 y un 17,9% de los casos, respectivamente. Según la clasificación TNM, el 32,5% de los casos se hallaba en estadio T3N0. De acuerdo con el sistema de clasificación AJCC, el estadio II resultó ser el más frecuente (54 tumores; 46,1% de los casos), seguido por el III (31 tumores; 26,5% de los casos), IV (21 tumores; 17,9% de los casos) y el estadio I (11 tumores; 9,4% de los casos). Se constató evidencia de invasión de vasos linfáticos y sanguíneos en el 27,5 y el 21,7% de la totalidad de los casos, respectivamente. El 16,7, el 13, el 35,5 y el 57,1% de los casos clasificados como estadios I, II, III y IV presentaron evidencia de invasión de vasos linfáticos, mientras que se constató invasión de vasos sanguíneos en el 8,3, el 13, el 25,8 y el 42,9% de los tumores clasificados como estadios I, II, III y IV, respectivamente. De los 18 pacientes
T
N
T
T
con metástasis hepáticas, se practicó una resección hepática a 13, que quedaron libres de enfermedad. Con respecto al grado de diferenciación de los tumores, la mayor parte se incluyó en la categoría de los casos medianamente diferenciados (82,9%), mientras que el 7,7% de los casos presentaron un menor grado de diferenciación (grado III). El contenido mucinoso extracelular estuvo presente en un 27,6% de los tumores, contenido que era superior al 70% del volumen tumoral en el 19,6% de los casos. Se amplificaron la totalidad de las parejas normal-tumor de cada caso para el análisis de la inestabilidad de microsatélites (tabla 1). Detectamos 43 casos con inestabilidad en uno o más microsatélites (36,7%); de ellos, 19 (16,2%) resultaron ser MSI-H y 24 MSI-L, según el criterio de clasificación considerado10 (fig. 2). Los microsatélites con mayor porcentaje de inestabilidad en los casos con alto grado de
TABLA 1 Porcentajes de estabilidad e inestabilidad de los microsatélites analizados en función del grado de inestabilidad de cada paciente BAT26 Estable Inestable D2S123 Estable Inestable D4S2948 Estable Inestable D12S95 Estable Inestable MFD 26 Estable Inestable D21S415 Estable Inestable D21S1235 Estable Inestable
MSS
MSI-L
MSI-H
66 (100%) 0 (0%)
18 (69,3%) 8 (30,7%)
10 (47,6%) 11 (52,4%)
68 (100%) 0 (0%)
20 (69%) 9 (31%)
11 (52,4%) 10 (47,6%)
56 (98,3%) 1 (1,7%)
21 (80,7%) 5 (19,3%)
12 (57,1%) 9 (42,9%)
67 (100%) 0 (0%)
20 (71,4%) 8 (28,6%)
9 (42,9%) 12 (57,1%)
61 (100%) 0 (0%)
26 (92,85%) 2 (7,15%)
12 (60%) 8 (40%)
69 (100%) 0 (0%)
20 (71,4%) 8 (28,6%)
12 (57,1%) 9 (42,9%)
65 (98,5%) 1 (1,5%)
20 (71,4%) 8 (28,6%)
13 (61,9%) 8 (38,1%)
MSS: estables; MSI-L: inestables de bajo grado; MSI-H: inestables de alto grado. La inestabilidad se observa como un patrón de bandas adicionales en el patrón de la muestra tumoral con respecto a la muestra normal.
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MSI-H estadio II 100
Supervivencia acumulada (%)
90 80 70 60 50 MSS/MSI-L estadio II
40 30 20 10
p = 0,027
0 0
6 12 18 24 Meses después de la aleatorización N.° de pacientes en estadio II en riesgo MSS/MSI-L MSI-H
44 10
40 10
37 10
33 10
inestabilidad fueron, en orden descendente, D12S95, BAT26, D2S123, D4S2948, D21S415, Mfd26 y D21S1235 (tabla 1) Los resultados de las asociaciones entre las características clínicas y patológicas de los pacientes y la inestabilidad de microsatélites se reflejan en las tablas 2 y 3. No se obtuvieron interacciones significativas entre los principales factores descritos, para valores de probabilidad inferiores a 0,5. Los tumores MSI-H tendieron a localizarse preferentemente en el colon derecho (p = 0,022) y presentaron estadios de progresión (p = 0,66) y grado de diferenciación (p = 0,15) similares a los tumores MSS/MSI-L. El tipo histológico mucinoso se asoció al fallo en la reparación detectada por el alto grado de inestabilidad de microsatélites (p = 0,04). Con respecto a las características clínicas, los ILE fueron más prolongados para los pacientes intervenidos de tumores en estadios II de progresión frente a los tumores de estadio III (p = 0,032) (tabla 3). Sin embargo no se observaron diferencias estadísticamente significativas con respecto a los ILE de los tumores MSS y MSI-L frente a los tumores MSI-H de estadios II (p = 0,44), III (p = 0,75) y T3N0 (p = 0,31), ni en el TLP de los tumores de estadio IV (p = 0,4). Los pacientes MSI-H de estadio II presentaron períodos de supervivencia más prolongados que los pacientes MSS y MSI-L (p = 0,027) (fig. 3), aunque no encontramos tales diferencias si consideramos globalmente a los pacientes de estadios II y III (p = 0,37) o a los pacientes
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29 10
30
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Fig. 3. Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier que indican el valor pronóstico de la inestabilidad de microsatélites en tumores de estadio II. Los pacientes inestables de alto grado (MSI-H) en estadio II presentan un mejor pronóstico que los pacientes estables (MSS) y los inestables de bajo grado (MSI-L) (p = 0,027).
de estadios III (p = 0,78). La localización tumoral y el grado de diferenciación no tienen valor pronóstico en nuestra población de estudio (p = 0,86 y p = 0,95, respectivamente), ni en el TLP de los pacientes de estadio IV (p = 0,57 y p = 0,82, respectivamente). Asimismo no se observan diferencias en la respuesta al tratamiento de las 2 categorías de tumores consideradas (p = 0,38). Discusión El cáncer de colon constituye una de las neoplasias más frecuentes en nuestra sociedad. Un 90% de los pacientes no tie-
ne antecedentes familiares y, con frecuencia, los síntomas de la enfermedad aparecen tardíamente. Por ello, es posible que los tumores se diagnostiquen en estadios avanzados, lo que implica un peor pronóstico y un mayor índice de recidivas y metástasis a distancia. Asimismo, la falta de criterios para la caracterización de tumores colorrectales de mayor agresividad dentro del grupo de estadio II y T3N0 hace necesaria la búsqueda de parámetros clínicos, patológicos o moleculares implicados en la progresión tumoral15. Por tanto, se hace preciso complementar las técnicas habituales de clasificación de los tumores de colon con técnicas de biología molecular e inmunohistoquímica que ayuden a caracterizar grupos de tumores más agresivos o de peor pronóstico. En este sentido, en el presente trabajo hemos analizado las posibles asociaciones entre determinados parámetros clínicos y morfológicos, con alteraciones moleculares –como la inestabilidad de microsatélites–, que pudieran tener valor como marcadores de agresividad tumoral. La población de estudio incluye únicamente tumores localizados en colon, dado que la práctica totalidad de los tumores de recto en nuestro servicio reciben radioquimioterapia preoperatoria, cuyos efectos sobre el ADN constituirían un sesgo en el estudio molecular. Asimismo, el comportamiento de los tumores localizados en colon y recto parece variar en relación con la inestabilidad de los microsatélites16 y con la implicación del componente displásico en lesiones adenomatosas. El estudio se diseñó como un análisis prospectivo que permitiera estandarizar las condiciones de recogida y posterior almacenamiento de las muestras de tejido normal y tumoral en óptimas condiciones para el estudio molecular. Debemos destacar que el período considerado ópti-
TABLA 2 Relación de las características clinicopatológicas y la estabilidad de microsatélites Grupos de tumores N.º de pacientes
Estadio II III IV Total Localización Colon derecho Colon izquierdo Total Grado de diferenciación I II III Total Histología Mucinoso No mucinoso Total
p MSS/MSI-L
MSI-H
54 31 21 106
46 (85,2%) 24 (77,4%) 17 (80,9%)
8 (15,4%) 7 (22,6%) 4 (19,1%)
58 59 117
44 (75,8%) 54 (91,5%)
14 (24,2%) 5 (8,4%)
11 97 9 117
7 (63,6%) 83 (85,5%) 8 (88,9%)
4 (36,3%) 14 (14,5%) 1 (11,1%)
23 94 117
16 (69,6%) 82 (87,2%)
7 (30,4%) 12 (17,8%)
0,66 (NS)
0,022
0,15 (NS)
0,04
MSS: estables; MSI-L: inestables de bajo grado; MSI-H: inestables de alto grado; NS: no significativo. Estadios II, III y IV según sistema de clasificación del American Joint Committee on Cancer (AJCC).
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TABLA 3 Análisis univariante del intervalo libre de enfermedad (ILE) y la supervivencia en relación a las características anatomopatológicas de los pacientes de estadios II y III en un período de seguimiento de 2 años y medio ILE acumulado a 2,5 años N.º de pacientes
Estadio II III Localización Colon derecho Colon izquierdo Grado de diferenciación I II III Estabilidad de microsatélites Tumores MSS/MSI-L Tumores MSI-H Estabilidad microsatélitesestadio II Tumores MSS/MSI-L Tumores MSI-H Estabilidad microsatélitesestadio III Tumores MSS/MSI-L Tumores MSI-H
N.º de pacientes sin enfermedad (% ILE-a)
Supervivencia acumulada a 2,5 años p
N.º de pacientes que sobreviven n (% S-a)
p
54 31
51 (94,5%) 20 (64,5%)
0,032
43 (65,5%) 25 (62,8%)
0,83 (NS)
37 48
30 (80,2%) 44 (85,9%)
0,92 (NS)
30 (76,9%) 38 (59,3%)
0,86 (NS)
4 76 5
4 (100%) 70 (87,3%) 4 (66,6%)
70 15
64 (85,7%) 14 (80%)
0,54 (NS)
55 (59,2%) 13 (86,7%)
0,37 (NS)
44 10
42 (93,2%) 10 (100%)
0,44 (NS)
29 (45,1%) 10 (100%)
0,027
26 5
22 (72,2%) 4 (66,6%)
0,75 (NS)
20 (58,4%) 4 (80%)
0,78 (NS)
0,73 (NS)
3 (75%) 61 (61,3%) 4 (80%)
0,95 (NS)
MSS: estables; MSI-L: inestables de bajo grado; MSI-H inestables de alto grado; ILE-a: ILE acumulada; S-a: supervivencia acumulada; NS: no significativo. Estadios II y III según sistema de clasificación del American Joint Committee on Cancer (AJCC).
mo para el seguimiento de los pacientes y la valoración del ILE y la supervivencia en el cáncer colorrectal tiene una duración aproximada de 5 años17,18. El valor de la mediana del tiempo de seguimiento de nuestros pacientes es inferior a 3 años, por lo que las conclusiones del estudio, en relación con el valor pronóstico de los parámetros estudiados, deben contrastarse considerando un período de seguimiento en torno a 5 años. Los casos MSS y MSI-L parecen presentar diferencias con los casos MSI-H desde el punto de vista clínico y anatomopatológico10. En este sentido, diversos grupos de investigación han descrito la asociación entre la inestabilidad de microsatélites y el contenido mucinoso de los tumores, así como la edad de aparición de la enfermedad más temprana y la forma de crecimiento exofítica19. En el presente estudio, la inestabilidad está asociada con el carácter mucinoso del tumor, debido posiblemente a la presencia de los mucopolisacáridos MUC2 y MUC5A descritos recientemente en casos inestables de cáncer de colon esporádico20. Actualmente no hay consenso con respecto al valor pronóstico de la inestabilidad de microsatélites. Liang et al21 observaron un mejor pronóstico de los casos inestables, mientras que Gervaz et al22 concluyeron que los casos inestables localizados a lo largo de todo el colon o únicamente en el colon izquierdo presen13
taban un pronóstico peor. En este sentido, Gryfe et al23 obtienen períodos de supervivencia más prolongados para los pacientes MSI-H y edades inferiores a 50 años. Sin embargo, Watanabe et al24 no obtuvieron tales diferencias en su población de estudio. Nuestro grupo describe períodos de supervivencia más prolongados para los tumores MSI de estadios II, lo que confirma resultados previos descritos en pacientes MSI-H10,25.. Cabe destacar que se ha descrito la asociación entre MSI-H y una mejor respuesta al tratamiento con 5-FU/leucovorín en pacientes intervenidos de tumores de estadio IV26. Se postula que este hecho no se debe a una menor agresividad de los tumores MSI-H de dicho estadio, sino a una mejor respuesta al tratamiento, debida posiblemente a la puesta en marcha de procesos apoptóticos independientes del fallo en la reparación. Sin embargo Ribic et al27 han demostrado recientemente una peor respuesta al tratamiento con 5-FU en los pacientes MSI-H y estadios II y III. En el presente estudio no hemos obtenido diferencias significativas entre ambos grupos ni hemos valorado el efecto del tratamiento por estadios, dado que el número de pacientes por estadio con MSI-H es reducido. Las diferencias descritas desde el punto de vista fisiológico, inmunológico y embriológico para las células de la mucosa del colon derecho e izquierdo, así como
para la respuesta a la quimioterapia con 5-FU de los tumores localizados en colon derecho o izquierdo, llevan a postular la existencia de 2 categorías de tumores en función de la localización, tal como sostienen Iacopetta et al28. Nuestro trabajo apoya tal hipótesis, dado que encontramos una clara tendencia a la localización de los tumores MSI-H en el colon derecho con respecto al colon izquierdo, así como la tendencia a presentar contenido mucinoso. A la vista de los resultados obtenidos en nuestro estudio, cabe destacar la necesidad de analizar la inestabilidad de microsatélites en poblaciones más numerosas y con períodos de seguimiento más prolongados, con el fin de contrastar el posible valor pronóstico de dicho parámetro. En nuestra opinión, es conveniente la clasificación molecular de los tumores de colon según las vías de progresión supresora o mutadora en grados de inestabilidad, con el fin de realizar un seguimiento más estrecho de los casos de estadio II o de estadio T3N0 de mayor agresividad tumoral. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. GLOBOCAN 2000. Cancer incidence, mortality and prevalence worldwide, Version 1.0; IARC CancerBase N.º 5. 2. Registro de Cáncer de Navarra. Sección de Enfermedades no Transmisibles y Estadísticas Vitales. Incidencia y mortalidad por cáncer en Navarra, 1993-1997. Tendencias en los últimos 25 años. Anales Sis San Navarra. 2001;24:339-62. 3. Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 1990;61:759-67. 4. Yamamoto H, Sawai H, Perucho M. Frameshift somatic mutations in gastrointestinal cancer of the microsatellite mutator phenotype. Cancer Res. 1997;57:4420-6. 5. Esteller M. Epigenetic lesions causing genetic lesions in human cancer: promoter hypermethylation of DNA repair genes. Eur J Cancer. 2000;36:2294-300. 6. Ionov Y, Peinado MA, Malkhosyan S, Shibata D, Perucho M. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis. Nature 1993; 363:558-61. 7. Chaves P, Cruz C, Lage P, Claro I, Cravo M, Leitao CN, et al. Immunohistochemical detection of mismatch repair gene proteins as a useful tool for the identification of colorectal carcinoma with the mutator phenotype. J Pathol. 2000;191:355-60. 8. Goel A, Arnold CN, Niedzwiecki D, Chang DK, Ricciardiello L, Carethers JM, et al. Characterization of sporadic colon cancer by patterns of genomic instability. Cancer Res. 2003;63:1608-14. 9. González-García I, Moreno V, Navarro M, MartíRague J, Marcuello E, Benasco C, et al. Standardized approach for microsatellite instability detection in colorectal carcinomas. J Natl Cancer Inst. 2000;92:544-9. 10. Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, Sidransky D, Eshleman JR, Burt RW, et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 1998; 58:5248-57. 11. Rodríguez Bigas MA, Boland CR, Hamilton SR, Henson DE, Jass. JR, Khan PM, et al. A National Cancer Institute Workshop on Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer Syndrome: meeting highlights and Bethesda guidelines. J Natl Cancer Inst. 1997;89:1758-62. Med Clin (Barc). 2005;124(12):441-6
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GUERRERO D, ET AL. ASOCIACIÓN ENTRE LA INESTABILIDAD DE MICROSATÉLITES Y LAS CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS Y ANATOMOPATOLÓGICAS EN PACIENTES CON CÁNCER DE COLON ESPORÁDICO
12. Sarma DP. The Dukes classification of colorectal cancer. JAMA. 1986;256:1447. 13. Compton CC. Colorectal carcinoma: diagnostic, prognostic and molecular features. Mod Pathol. 2003;16:376-88. 14. American Joint Committee on cancer. AJCC cancer staging manual. 5th ed. Philadelphia: Lippincott-Raven; 1997. 15. Graziano F, Cascinu S. Prognostic molecular markers for planning adjuvant chemotherapy trials in Dukes’ B colorectal cancer patients: how much evidence is enough? Ann Oncol. 2003;14: 1026-38. 16. Ikeda Y, Mori M, Akagi K, Iwashita A, Haraguchi Y, Maehara Y, et al. Differences between features of adenoma in the rectum versus sigmoid colon. Am J Gastroenterol. 2000;95:3620-3. 17. De Goede E, Filez L, Janssens J, Van Cutsem E. Follow-up of colon cancer: detection of liver metastases: benefit and periodicity. Acta Gastroenterol Belg. 1998;61:8-10. 18. Peethambaram P, Weiss M, Loprinzi CL, Novotny P, O’Fallon JR, Erlichman C, et al. An evaluation of postoperative follow-up tests in colon cancer patients treated for cure. Oncology. 1997;54:287-92.
446
Med Clin (Barc). 2005;124(12):441-6
19. Messerini L, Ciantelli M, Baglioni S, Palomba A, Zampi G, Papi L. Prognostic significance of microsatellite instability in sporadic mucinous colorectal cancers. Hum Pathol. 1999;30:629-34. 20. Biemer-Huttmann AE, Walsh MD, McGuckin MA, Simms LA, Young J, Leggett BA, et al. Mucin core protein expression in colorectal cancers with high levels of microsatellite instability indicates a novel pathway of morphogenesis. Clin Cancer Res. 2000;6:1909-16. 21. Liang JT, Chang KJ, Chen JC, Lee CC, Cheng YM, Hsu HC, et al. Clinicopathologic and carcinogenetic appraisal of DNA replication error in sporadic T3N0M0 stage colorectal cancer after curative resection. Hepatogastroenterology. 1999; 46:883-90. 22. Gervaz P, Cerottini JP, Bouzourene H, Hahnloser D, Doan CL, Benhattar J, et al. Comparison of microsatellite instability and chromosomal instability in predicting survival of patients with T3N0 colorectal cancer. Surgery. 2002;131:190-7. 23. Gryfe R, Kim H, Hsieh ET, Aronson MD, Holowaty EJ, Bull SB, et al. Tumor microsatellite instavility and clinical outcome in young patients with colorectal cancer. N Engl J Med. 2000;342: 69-77.
24. Watanabe T, Wu TT, Catalano PJ, UEKI T, Satriano R, Haller DG, et al. Molecular predictors of survival after adjuvant chemotherapy for colon cancer. N Engl J Med. 2001;344:1196-206. 25. Samowitz WS, Curtin K, Ma KN, Schaffer D, Coleman LW, Leppert M, et al. Microsatellite instability in sporadic colon cancer is associated with an improved prognosis at the population level. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2001;10: 917-23. 26. Liang JT, Huang KC, Lai HS, Lee PH, Cheng YM, Hsu HC, et al. High-frequency microsatellite instability predicts better chemosensitivity to high-dose 5-fluorouracil plus leucovorin chemotherapy for stage IV sporadic colorectal cancer after palliative bowel resection. Int J Cancer. 2002;101:519-25. 27. Ribic CM, Sargent DJ, Moore MJ, Thibodeau SN, French AJ, Goldberg RM, et al. Tumor microsatellite-instability status as a predictor of bene-fit from Fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer. N Engl J Med. 2003;349: 247-57. 28. Iacopetta B. Are there two sides to colorectal cancer? Int J Cancer. 2002;101:403-8.
14